一种培养基及其制备方法

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，具体涉及一种培养基及其制备方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌在自然界中分布广泛，且适应不同环境的能力较强，金黄色葡萄球菌是引发细菌性食物中毒的主要致病菌之一，对人类及动物生命健康、食品安全和公共卫生造成潜在威胁，还可以引起多种人体感染，主要为皮肤或黏膜感染以及败血性感染。因此对金黄色葡萄球菌进行快速而准确的检测十分重要。

现行GB4789.10分离金黄色葡萄球菌通常采用血平板、Baird-Parke培养基分离葡萄球菌，但因血平板需要新鲜羊血，通常食品检测、防疫检测站都不具备相应条件。而目前Baird-Parke培养基配方中均含有氯化锂。氯化锂是白色的晶体，具有潮解性，味咸，易溶于水、乙醇、丙酮、吡啶等有机溶剂，尽管其属于低毒类物质，但对眼睛和粘膜具有强烈的刺激和腐蚀作用，因此，氯化锂在一定程度上对于培养基的生产安全，使用安全都有影响。另外，培养基的透明度对实验结果的判断有很大影响，而现有的培养基的透明度使得在判断实验结果时需要仔细甄别，容易产生误判。因此，有必要对培养基进行进一步的改进。

发明内容

本发明通过反复实验对Baird-Parker培养基进行优化改进，去除了氯化锂的使用，让培养基配制起来更简单安全。因此，本发明的第一方面提供了一种培养基，其组成包括：胰蛋白胨、牛肉膏粉、酵母膏粉、丙酮酸钠、甘氨酸和琼脂，但不包括氯化锂。

进一步优化的，本发明提供的培养基还包括卡拉胶。

在本发明的一个具体实施方式中，本发明第一方面的培养基包括基础培养基和增菌剂，其中每升基础培养基的组分及含量为：胰蛋白胨12-14g，牛肉膏粉2-3g，酵母膏粉5-7g，丙酮酸钠10-12g，甘氨酸10-12g，琼脂12-15g，卡拉胶0.2-0.4g。

同时，本发明提供了一种基础培养基，该基础培养基为粉末状，包括：胰蛋白胨、牛肉膏粉、酵母膏粉、丙酮酸钠、甘氨酸和琼脂，且不包括氯化锂。

进一步优化的，上述基础培养基还包括卡拉胶。

在本发明的一种具体实施方式中，上述基础培养基包括：20.6-24％的胰蛋白胨、3.4％-5％的牛肉膏粉、8.6％-12％的酵母膏粉、17.2％-20.6％的丙酮酸钠、17.2％-20.6％的甘氨酸、20.6％-25.8％的琼脂、0.34％-0.69％的卡拉胶，按质量分数计。

本发明的第二方面提供了一种培养基的制备方法，该方法具体包括：将第一方面中的各成分加到蒸馏水或去离子水中，加热煮沸至完全溶解，再调节pH值至7.0±0.2，后分装灭菌保存。

本发明的有益效果在于：通过实验验证，本发明优化后的培养基中去除了氯化锂，解决了生产安全、使用安全、环境污染等由氯化锂所带来的相关问题，实现并优于原有效果。此外，本发明加入卡拉胶后的优化方案能进一步改善培养基平板的致密性问题，在接上金黄色葡萄球菌后，使得含有卵磷脂酶的葡萄球菌降解卵黄使菌落产生的透明圈更容易识别，从而更加容易判断实验结果，不容易出错，节省时间避免出错。

附图说明

图1为实施例二中优化Baird-Parke培养基(无氯化锂)后有卡拉胶组和未无卡拉胶组的金黄色葡萄球菌ATCC 25923的24小时生长状态图，其中，A和B为无卡拉胶组，C和D为有卡拉胶组。

具体实施方式

现行标准GB4789.10中分离金黄色葡萄球菌中采用的Baird-Parke琼脂平板(Baird-Parke培养基)的基础培养基成分为胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、丙酮酸钠、甘氨酸、氯化锂(LiCl·6H

为解决氯化锂的安全性问题，在研究氯化锂的可替代性方案时，本发明设计并使用了多种替代方法，并在替换实验中意外地发现：添加氯化锂而不含亚碲酸钾(仅含氯化锂)的培养基中金色葡萄球菌、表皮葡萄球菌菌落明显较小，这一研究结果显示氯化锂对球菌生长性有影响；同时，仅含有氯化锂的培养基中大肠埃希氏菌也并不能完全被抑制，这显示出氯化锂对大肠埃希氏菌仅部分抑制。

基于上述实验中的发现：氯化锂对球菌生长性有影响，且对大肠埃希氏菌仅部分抑制，本发明对Baird-Parke培养基的成分进行了调整，并发现采用去除氯化锂的基础培养基搭配增菌剂即可实现葡萄球菌的高效培养(或检测)。应理解，在去除氯化锂后，可适当调整培养基原有组分的比例，例如一个简单的调整思路如下：当不使用氯化锂时，培养基总量发生变化，氯化锂减掉重量可转化为其他营养成份的部分增加。

同时，在对培养基进行优化的过程中，本发明还发现通过添加少量的卡拉胶可提升培养基的不透明度。研究发现，卡拉胶可起絮凝、增加粘性的作用。添加卡拉胶的基础培养基与其配套试剂增菌剂(亚碲酸钾卵黄液)可形成致密不透明的培养基，而这种状态下的培养基可让实验结果更容易判断，从而减少误判率。

在本发明的一种具体实施方式中，每升基础培养基的组成及含量包括：胰蛋白胨12-14g，牛肉膏粉2-3g，酵母膏粉5-7g，丙酮酸钠10-12g，甘氨酸10-12g，琼脂12-15g，卡拉胶0.2-0.4g。应理解，上述各组分可在各自范围内进行组合，组成的混合物与蒸馏水或去离子水(通常为950mL)加热混合制备成一升左右的基础培养基。具体的，将上述各固体组分加到蒸馏水或去离子水中，加热煮沸至完全溶解，测pH值并将其调整到7.0±0.2。优选的，pH值的调整方式为：如果溶解后的原液pH值小于7就添加碳酸钠、或者氢氧化钠溶液调节pH至7.0±0.2；如果溶解后的原液pH大于7，添加磷酸二氢钾或者盐酸溶液调节pH至7.0±0.2。上述基础培养基pH值调整好后即可分装(例如每瓶95mL)，在121℃高压灭菌15min。

适用于本发明的添加剂(增菌剂)可采用现有的通用配方成分，将其添加到上述基础培养基后组合成完整的培养基即可使用。在本发明的一种具体实施方中，增菌剂的具体配方为每60ml亚碲酸盐卵黄增菌液可采用30％卵黄盐水50mL，过滤除菌的1％亚碲酸钾溶液10mL，混合制备得到，其各组分的制备步骤如下所示：

1)无菌生理盐水的制备：称取8.5g氯化钠，溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min；

2)30％卵黄盐水的制备：将新鲜鸡蛋洗净，浸泡于70％～75％酒精中半小时，然后用无菌纱布拭干后，于蛋壳两端对开两小孔，使蛋清及蛋白全部流出后，再将蛋黄倾入已灭菌盛玻璃珠的烧瓶内，用力振摇使分散均匀，量取30ml卵黄液及上述1)中70ml无菌生理盐水混匀，即成30％卵黄盐水。需要在百级洁净区操作，无需高温灭菌(也不能高温灭菌)，储存于冰箱内；

3)1％亚碲酸钾溶液的制备：将1.0g亚碲酸钾充分溶解于100ml蒸馏水中，在洁净区操作，通过0.22μm孔径滤膜进行过滤除菌。

在本发明的一种具体实施方式中，将上述基础培养基的各成分加到蒸馏水或去离子水中，加热煮沸至完全溶解，并调节pH值至7.0±0.2。分装每瓶95mL，121℃高压灭菌15min。临用时加热溶化基础培养基，冷至50℃，每95mL基础培养基加入预热至50℃的卵黄亚碲酸钾增菌剂5mL摇匀后倾注平板。冷却固化后得到本发明优化的Baird-Parke琼脂平板(Baird-Parke培养基)即可使用。

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。

实施例一：Baird-Parke培养基中去除氯化锂的对照实验

依据国标GB4789.10配方成份，按照是否添加氯化锂和/或亚碲酸钾进行对照实验。其中Baird-Parke培养基包括增菌剂的制备和组成参见GB4789.10，下文中仅做简要说明。

1、GB4789.10、Baird-Parke培养基制备

1..1成分

胰蛋白胨10.0g

牛肉膏5.0g

酵母膏1.0g

丙酮酸钠10.0g

甘氨酸12.0g

氯化锂(LiCl·6H

琼脂20.0g

蒸馏水950mL

1..2增菌剂的配法

30％卵黄盐水50mL与通过0.22μm孔径滤膜进行过滤除菌的1％亚碲酸钾溶液10mL混合，保存于冰箱内。

1.3制法

将各成分加到蒸馏水中,加热煮沸至完全溶解,调节pH至7.0±0.2。分装每瓶95mL，121℃高压灭菌15min。临用时加热溶化琼脂，冷至50℃，每95mL加入预热至50℃的卵黄亚碲酸钾增菌剂5mL摇匀后倾注平板。培养基应是致密不透明的。使用前在冰箱储存不得超过48h。

参考上述配方及制备方法分别配置4组培养基，包括：第一组无氯化锂、第二组无亚碲酸钾、第三种组无氯化锂无亚碲酸钾、第四组有氯化锂、有亚碲酸钾，这四组培养基除上述差别外，其他组分不变。

2、进行对照实验并分析结果

1)实验依据GB4789.28-2013表D2固体培养基质量控制标准中的相关内容，如表1所示。

表1 Baird-Parker琼脂培养基质量控制标准

2)将上述1中的四组培养基进行对照实验。为降低实验误差，实验重复三次，对三种质控菌株进行观察，三次重复实验的结果如表2-4所示。

表2第一次实验的对照结果

表3第二次实验的对照结果

表4第三次实验的对照结果

3)实验结果分析与结论

表2-4中菌落状态大小及生长率体现生长状态，可知添加氯化锂的培养基金色葡萄球菌、表皮葡萄球菌菌落明显较小，大肠埃希氏菌也不能完全抑制，实验说明氯化锂对球菌生长性有影响，对大肠埃希氏菌部分抑制。

表2-4中的特征性结果发现，只有添加亚碲酸钾才能使金色葡萄球菌、表皮葡萄球菌变成黑色菌落。而金色葡萄球菌变黑有混浊地带并有透明圈则可有效区别金色葡萄球菌与表皮葡萄球菌。

上述三次重复性实验的结果保持一致，说明其实验特征重复性高，有效避免了对氯化锂添加应用结果的误判的可能，充分证明培养基中氯化锂的添加对球菌生长性有影响，对大肠埃希氏菌也不能完全抑制，即在同样的条件下，氯化锂对葡萄球菌生长有抑制作用，阻碍代谢酶的合成。因此去除氯化锂，葡萄球菌的生长速度会加快，缩短培养时间。同时，上述实验结果也也验证了仅保留亚碲酸钾也可有效实现金色葡萄球菌的培养(或检测)。

实施例二：Baird-Parke培养基添加卡拉胶(无氯化锂)的对照实验

本例中进一步对培养基成分进行优化，在去除氯化锂的基础上，进一步添加了卡拉胶，增菌剂的组分与培养基的制备均同实施例一。仅在基础培养基的组分上做如下调整，胰蛋白胨12-14g，牛肉膏粉2-3g，酵母膏粉5-7g，丙酮酸钠10-12g，甘氨酸10-12g，琼脂12-15g，卡拉胶0.2-0.4g。

为更好的说明有无卡拉胶对培养基的影响，本例中设置两组培养基，分别为有卡拉胶组和无卡拉胶组，两组除卡拉胶组分的差异外，其他组成和制备方法均相同。

同时实施例一，实验依据GB4789.28-2013表D2固体培养基质量控制标准中的相关内容，如上文中的表1所示。其中，有卡拉胶组的重复实验结果如表5所示。

表5有卡拉胶组的优化配方的三次实验结果

根据上述表5的结果可知，优化后的添加有卡拉胶而无氯化锂的Baird-Parke培养基，其金黄色葡萄球菌ATCC 25923的特征菌落明显，24小时就能判断结果，提升了检验效率，无氯化锂的添加大肠埃希氏菌ATCC 25922不生长培养基的性能不变。

图1给出了在有卡拉胶组和无卡拉胶组中，金黄色葡萄球菌ATCC 25923生长24小时的状态，由图1可知，较无卡拉胶组(上排两组培养基A和B)，有卡拉胶组(下排两组培养基C和D)中金黄色葡萄球菌ATCC 25923的浑浊带透明圈明显。这主要是由于卡拉胶具有起絮凝、增加粘性的作用。添加卡拉胶的基础培养基与配套试剂亚碲酸钾卵黄液形成致密不透明的培养基，让实验结果更容易判断，减少误判率。

以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。