产生改进的免疫细胞的群体的方法

本申请要求于2021年5月19日提交的AU2021901496的优先权，所述申请的全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及产生经改进的免疫细胞的群体的方法。

背景技术

嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法在治疗患有难治治疗的癌症的患者方面取得了显著进步，然而，CAR-T的持久性差仍然是严峻的挑战。在患有癌症的患者中，输注CAR-T细胞的持久性差与持久临床缓解呈负相关。已证明具有原初中枢记忆细胞(T

因此，需要改进免疫细胞的群体，如在CAR-T疗法中供使用的CAR-T细胞的群体。

发明内容

本发明人已经证明，AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂当体内施用时可以改进常规CAR-T疗法在需要其治疗的受试者中的功效。本发明人还证明，AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂可以用于改善经培养的免疫细胞的特性。

因此，一方面，本发明提供了一种改变受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用免疫细胞的群体，其中所述免疫细胞是使用包括以下的方法来产生的：在包括AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的培养基中培养免疫细胞，优选地其中所述免疫细胞是T细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞、髓系细胞、巨噬细胞或其组合。

在一实施例中，所述方法用于改变受试者的T细胞免疫应答、树突状细胞免疫应答、自然杀伤细胞免疫应答或髓系细胞或巨噬细胞免疫应答。

在另外的方面中，本发明提供了一种免疫细胞的群体的用途，其用于制备用于改变受试者的免疫应答的药物，其中所述免疫细胞是使用包括以下的方法来产生的：在包括AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的培养基中培养免疫细胞，优选地其中所述免疫细胞是T细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞、髓系细胞、巨噬细胞或其组合。

在另外的方面中，本发明提供了一种用于改变受试者的免疫应答的免疫细胞的群体，其中所述免疫细胞是使用包括以下的方法来产生的：在包括AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的培养基中培养免疫细胞，优选地其中所述免疫细胞是T细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞、髓系细胞、巨噬细胞或其组合。

在另外的方面中，本发明提供了一种改变受试者的T细胞应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用包括嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T细胞)的群体，其中所述CAR-T细胞是使用包括以下的方法来产生的：在包括AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的培养基中培养CAR-T细胞。

在另外的方面中，本发明提供了一种群体的用途，其用于制备用于改变受试者的T细胞应答的药物，所述群体包括嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T细胞)，其中所述CAR-T细胞是使用包括以下的方法来产生的：在包括AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的培养基中培养CAR-T细胞。

在另外的方面中，本发明提供了一种群体的用途，其用于改变受试者的T细胞应答，所述群体包括嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T细胞)，其中所述CAR-T细胞是使用包括以下的方法来产生的：在包括AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的培养基中培养CAR-T细胞。

在另外的方面中，本发明提供了一种改变受试者的免疫应答，优选地T细胞应答的方法，所述方法包括：

a)向所述受试者施用AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂；以及

b)在步骤a)之后至少约18小时向所述受试者施用免疫细胞，优选地包括包含嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T细胞)的群体。

在另外的方面中，本发明提供了一种AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的用途，其用于制备用于改变受试者的免疫应答，优选地T细胞应答的药物，所述治疗包括：

a)向所述受试者施用AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂；以及

b)在步骤a)之后至少约18小时向所述受试者施用免疫细胞，优选地包括包含嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T细胞)的群体。

在另外的方面中，本发明提供了一种AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂，其用于改变受试者的免疫应答，优选地T细胞应答，所述治疗包括：

a)向所述受试者施用AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂；以及

b)在步骤a)之后至少约18小时向所述受试者施用免疫细胞，优选地包括包含嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T细胞)的群体。

在一实施例中，免疫应答的改变或T细胞应答的改变包括中枢记忆细胞(T

在另外的方面中，本发明提供了一种改变受试者的树突状细胞和/或自然杀伤细胞应答的方法，所述方法包括：

a)向所述受试者施用AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂；以及

b)向所述受试者施用包括树突状细胞和/或自然杀伤细胞的细胞群体。

在一实施例中，所述细胞群体在所述AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂之后约18小时至约72小时施用。在一实施例中，所述细胞群体在所述AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂之后约24小时至约72小时施用。在一实施例中，所述细胞群体在所述AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂之后约24小时至约48小时施用。

本发明人已确定，AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂降低了CAR-T细胞的杀伤活性，并且因此可以用于降低细胞因子释放综合征(CRS)的发生率。因此，在另外的方面中，本发明提供了一种减少经历CAR-T细胞疗法的受试者的细胞因子释放综合征(CRS)的方法，所述方法包括向所述受试者施用AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂和/或所述CAR-T细胞，其中所述CAR-T细胞已经在包括所述AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的培养基中培养。

在另外的方面中，本发明提供了一种AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂和/或CAR-T细胞的用途，其用于制备用于减少经历CAR-T细胞疗法的受试者的细胞因子释放综合征(CRS)的药物，其中所述CAR-T细胞已经在包括所述AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的培养基中培养。

在另外的方面中，本发明提供了一种AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂和/或CAR-T细胞，其用于减少经历CAR-T细胞疗法的受试者的细胞因子释放综合征(CRS)，其中所述CAR-T细胞已经在包括所述AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的培养基中培养。

在一实施例中，所述嵌合抗原受体包括CD28z共刺激结构域。

可以用于本发明的AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的实例包含但不限于选自以下中的一种或多种：曲西立滨(triciribine，TCN)、曲西立滨5'-单磷酸酯(TCN-P)、AKT抑制剂VIII、MK-2206、AZD5363、GDC-0068、GSK2141795和GSK2110183盐酸盐。

在一实施例中，所述AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂是TCN或TCN-P。

在一实施例中，所述免疫细胞或CAR-T细胞以以下剂量施用：约20万/kg、约50万/kg、约70万/kg、约100万/kg、约120万/kg、约150万/kg、约170万/kg、约200万/kg、约220万/kg、约250万/kg、约270万/kg、约300万/kg或更高。在另一实施例中，所述免疫细胞或CAR-T细胞以以下剂量施用：介于约20-50万/kg之间、介于约50万-70万/kg之间、介于约70万-100万/kg之间、介于约100万-120万/kg之间、介于约120万-150万/kg之间、介于约150万-170万/kg之间、介于约170万-200万/kg之间、介于约200万-220万/kg之间、介于约220万-250万/kg之间、介于约250万-270万/kg之间或介于约270万-300万/kg之间。在另一实施例中，所述免疫细胞或CAR-T细胞以介于50万-200万/kg之间的剂量施用。

在一实施例中，所述受试者是免疫耗竭的。提供免疫耗竭的方法的实例包含但不限于淋巴细胞清除化疗或放射疗法。

在一实施例中，所述受试者患有癌症、感染或炎性疾病。

在一实施例中，所述感染是细菌感染、真菌感染、原生动物感染或病毒感染。在一实施例中，所述感染是病毒感染。在一实施例中，所述病毒感染是慢性病毒感染，如感染丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HCB)、人乳头状瘤病毒(HPV)、巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus，EBV)、水痘带状疱疹病毒、柯萨奇病毒或人类免疫缺陷病毒(HIV)。

在一实施例中，所述受试者患有癌症。在一实施例中，所述受试者患有实体瘤，如乳腺癌或结肠癌。

在一实施例中，所述受试者患有与低抗原丰度相关的癌症。在一实施例中，所述受试者患有以下：

i)低CD33+未成熟细胞占主导地位的急性髓系白血病；或者

ii)具有低水平的CD19和/或CD20的弥漫大B细胞淋巴瘤或非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)。

在一实施例中，所述受试者是动物。在一实施例中，所述受试者是哺乳动物。在一实施例中，所述受试者是人。

还提供了一种AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的用途，其用于制备用于改变受试者的免疫应答，优选地T细胞应答的药物，其中在所述药物之后至少18小时将向所述受试者施用免疫细胞，优选地包括包含嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T细胞)的群体。

还提供了一种免疫细胞，优选地包括包含嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T细胞)的群体的用途，其用于制备用于改变受试者的免疫应答，优选地T细胞应答的药物，其中在所述药物之前至少18小时将向或已经向所述受试者施用AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂。

还提供了一种AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的用途，其用于制备用于改变受试者的免疫应答，优选地T细胞应答的药物，其中所述药物是CAR-T细胞。

还提供了一种AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的用途，其用于制备用于改变受试者的树突状细胞和/或自然杀伤细胞应答的药物。

还提供了一种免疫细胞的群体的用途，其用于制备用于改变受试者的树突状细胞和/或自然杀伤细胞应答的药物，所述免疫细胞包括树突状细胞和/或自然杀伤细胞，其中已经向或将向所述受试者施用AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂。

还提供了一种AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂，其用于产生免疫细胞，优选地包括包含嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T细胞)的群体，所述抑制剂用于改变受试者的免疫应答，优选地T细胞应答。

还提供了一种AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂，其用于改变受试者的免疫应答，优选地受试者的T细胞应答，其中在所述药物之后至少18小时将向所述受试者施用免疫细胞，优选地包括包含嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T细胞)的群体。

在一实施例中，本文所描述的方法进一步包括施用检查点抑制剂，优选地抗PD-1抗体。有利地，将检查点抑制剂与本发明的CAR-T细胞，优选地用AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂预处理的CAR-T细胞组合施用，对患有或疑似患有癌症的受试者的肿瘤生长和/或生存期表现出协同作用。

因此，一方面，提供了一种用于改变受试者的免疫应答，优选地受试者的T细胞应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用免疫细胞，优选地包括嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T细胞)的群体和检查点抑制剂，优选地抗PD-1抗体，优选地其中所述免疫细胞是使用包括以下的方法来产生的：在包括AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的培养基中培养免疫细胞。优选地，所述免疫细胞是T细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞、髓系细胞、巨噬细胞或其组合。在一实施例中，所述方法包括任选地同时或依次施用已用AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂和检查点抑制剂预处理的CAR-T细胞。在此实施例中，与每种治疗的单独效果相比，所述治疗的效果(即肿瘤生长和/或生存期)是协同的。

在另一实施例中，所述方法包括任选地同时或依次施用CAR-T细胞、AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂和检查点抑制剂。在此实施例中，当与单独的每种治疗的单独效果相比，所述治疗的效果(对肿瘤生长和/或生存期)是协同的。在一实施例中，所述CAR-T细胞未使用AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂进行预处理。

另一方面，提供了一种用于改变受试者的免疫应答，优选地受试者的T细胞应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用检查点抑制剂，优选地抗PD-1抗体以及AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂。在此实施例中，当与单独的每种治疗的单独效果相比，所述治疗的效果(对肿瘤生长和/或生存期)是协同的。

另一方面，提供了一种免疫细胞，优选地包括嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T细胞)的群体和检查点抑制剂，优选地抗PD-1抗体的用途，其用于制备用于改变受试者的免疫应答，优选地受试者的T细胞应答的药物，其中所述免疫细胞是使用包括以下的方法来产生的：在包括AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的培养基中培养免疫细胞。

另一方面，提供了一种免疫细胞，优选地包括嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T细胞)的群体的用途，其用于制备用于改变受试者的免疫应答，优选地受试者的T细胞应答的药物，其中已经向或将向所述受试者施用检查点抑制剂，优选地抗PD-1抗体，其中所述免疫细胞是使用包括以下的方法来产生的：在包括AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的培养基中培养免疫细胞。

另一方面，提供了一种检查点抑制剂，优选地抗PD-1抗体的用途，其用于制备用于改变受试者的免疫应答，优选地受试者的T细胞应答的药物，其中已经向或将向所述受试者施用免疫细胞，优选地包括嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T细胞)的群体，其中所述免疫细胞是使用包括以下的方法来产生的：在包括AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的培养基中培养免疫细胞。

另一方面，提供了一种免疫细胞，优选地包括嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T细胞)的群体和检查点抑制剂，优选地抗PD-1抗体，其用于改变受试者的免疫应答，优选地受试者的T细胞应答，其中所述免疫细胞是使用包括以下的方法来产生的：在包括AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的培养基中培养免疫细胞。

在一实施例中，当与未接受CAR-T细胞和/或AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的受试者相比，所述免疫应答或T细胞免疫应答的改变增加所述受试者的生存期。在一实施例中，当与未接受本发明的CAR-T细胞和/或AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的受试者相比，所生存期延长了3个月、6个月、9个月、12个月、24个月、36个月、48个月、60个月、72个月、84个月、96个月或更长时间。

在一实施例中，所述受试者已被诊断为患有或疑似患有疾病或病症，如癌症、感染或炎性疾病。在一实施例中，所述受试者已被诊断为患有或疑似患有结肠癌或乳腺癌。因此，在一实施例中，本文所描述的方法包括将所述受试者诊断为患有或疑似患有疾病或病症，如优选地结肠癌或乳腺癌等癌症、感染或炎性疾病的步骤。

在一实施例中，所述方法或用途可以进一步包括施用另外的治疗剂，任选地选自由以下组成的组：化疗、放射疗法、手术、骨髓移植、药物疗法、冷冻消融或射频消融。

在一实施例中，所述免疫细胞、CAR-T细胞、AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂和/或检查点抑制剂可以依次或同时施用。

本发明人还有利地发现，除了在制备CAR-T细胞的过程期间之外，还可以通过使用AKT抑制剂作为辅助剂来增加治疗癌症的功效。

因此，一方面，提供了一种用于改变受试者的免疫应答优选地T细胞免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用以下：

(i)免疫细胞，优选地包括嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T细胞)的群体；以及

(ii)AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂，

其中所述免疫细胞是使用包括以下的方法来产生的：在包括AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的培养基中培养免疫细胞。

在一实施例中，所述方法进一步包括产生包括本发明的免疫细胞的细胞群体的步骤。

在一实施例中，以以下剂量向所述受试者施用AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂：约0.5mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约2mg/kg、约2.5mg/kg、约3.0mg/kg或更大。在另一实施例中，以介于以下之间的剂量向所述受试者施用AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂：约0.5mg/kg-1.0mg/kg、约1.0mg/kg-1.5mg/kg、约1.5mg/kg-2.0mg/kg、约2.0mg/kg-2.5mg/kg、约2.5mg/kg-3.0mg/kg或更大。优选地，向所述受试者施用AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的剂量是约2mg/kg。

在一实施例中，所述受试者每周一次、每周两次、每周三次、每周四次或更多次地静脉内施用所述AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂。在另一实施例中，所述AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂、免疫细胞抑制剂或检查点抑制剂可以依次或同时施用。优选地，在施用所述免疫细胞和/或检查点抑制剂的同时，施用第一剂量的AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂。

在一实施例中，所述方法增加脾中的CD4+和/或CD8+CAR-T细胞。在另一实施例中，当与在不存在AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的情况下培养并且未与AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂一起施用的T细胞相比，所述方法产生较低百分比的调节性(T

另一方面，提供了一种免疫细胞，优选地包括嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T细胞)的群体和AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的用途，其用于制备用于改变受试者的免疫应答，优选地T细胞免疫应答的药物，其中所述免疫细胞是使用包括以下的方法来产生的：在包括AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的培养基中培养免疫细胞。

另一方面，提供了一种免疫细胞，优选地包括嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T细胞)的群体的用途，其用于制备用于改变受试者的免疫应答，优选地受试者的T细胞应答的药物，其中已经向或将向所述受试者施用AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂，其中所述免疫细胞是使用包括以下的方法来产生的：在包括AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的培养基中培养免疫细胞。

另一方面，提供了一种AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的用途，其用于制备用于改变受试者的免疫应答，优选地受试者的T细胞应答的药物，其中已经向或将向所述受试者施用免疫细胞，优选地包括嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T细胞)的群体，其中所述免疫细胞是使用包括以下的方法来产生的：在包括AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的培养基中培养免疫细胞。

另一方面，提供了一种免疫细胞，优选地包括嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T细胞)的群体和AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂，其用于改变受试者的免疫应答，优选地T细胞免疫应答，其中所述免疫细胞是使用包括以下的方法来产生的：在包括AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的培养基中培养免疫细胞。

还提供了一种免疫细胞，优选地包括包含嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T细胞)的群体，其用于改变受试者的免疫应答，优选地T细胞应答，其中在所述药物之前至少18小时将向或已经向所述受试者施用AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂。

还提供了一种AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂，其用于改变受试者的树突状细胞和/或自然杀伤细胞应答。

还提供了一种细胞群体的用途，其用于改变受试者的树突状细胞和/或自然杀伤细胞应答，所述细胞包括树突状细胞和/或自然杀伤细胞，其中已经向或将向所述受试者施用AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂。

另一方面，本发明提供了一种产生细胞群体的方法，所述细胞群体包括免疫细胞，所述方法包括在包括AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的培养基中培养免疫细胞，优选地其中所述免疫细胞是T细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、髓系细胞或其组合。

在一实施例中，所述免疫细胞是转基因的。在一实施例中，所述免疫细胞包括嵌合抗原受体。在一实施例中，所述免疫细胞是包括嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T细胞)。

在一实施例中，所述方法包括：

a)由从受试者分离的免疫细胞的群体产生富含T细胞的细胞群体；

b)用编码嵌合T细胞受体的载体转化所述富含T细胞的细胞群体；以及

c)在包括AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的培养基中培养在步骤b)中获得的所述细胞。

在一实施例中，使用所述方法产生的所述CAR-T细胞包括中枢记忆(T

在一实施例中，使用所述方法产生的所述CAR-T细胞中的至少约10％是T

在一实施例中，使用所述方法产生的所述CD8+T细胞中的至少约0.8％是T

在一实施例中，使用所述方法产生的总淋巴细胞中的至少约0.37％是T

在一实施例中，所述T

在一实施例中，所述T

在一实施例中，所述方法进一步包括使经培养的细胞富集所述T

在一实施例中，所述方法产生的T

在一实施例中，所述方法产生的调节性(T

在一实施例中，所述T

在一实施例中，与在不存在所述AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的情况下的相同条件下培养的相同细胞相比，所述方法产生的细胞群体表达较少的一种或多种炎性细胞因子。在一实施例中，所述一种或多种炎性细胞因子是TNFα、IFNγ或两者。

在一实施例中，所述方法产生的原初T细胞的百分比高于在不存在所述AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的情况下的相同条件下培养的T细胞的百分比。

本发明人已确定，本发明的方法可以用于产生靶向病毒感染的改进的CAR-T细胞。因此，在一实施例中，所述嵌合抗原受体与病毒抗原结合。在一实施例中，所述方法产生的CAR-T细胞的群体比在不存在所述AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的情况下的相同条件下培养的CAR-T细胞的群体具有更强的抗病毒活性。

在替代性实施例中，所述T细胞不是转基因的，并且所述T细胞比在不存在所述AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的情况下的相同条件下培养的T细胞的群体具有更强的抗病毒活性。

在另一实施例中，所述方法包括：

a)由从受试者分离的免疫细胞的群体产生富含树突状细胞的细胞群体；

b)将来自步骤a)的所述细胞暴露于抗原；以及

c)在包括AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的培养基中培养所述细胞。因此，本发明的方法可以用于产生树突状细胞疫苗。在一实施例中，所述抗原是癌症抗原或病原体的抗原，如病毒抗原。

在一实施例中，所述方法产生的树突状细胞多于在不存在所述AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的情况下的相同条件下培养的树突状细胞。

在另外的实施例中，所述方法包括：

a)由从受试者分离的免疫细胞的群体产生富含自然杀伤细胞(NK)的细胞群体；

b)在包括AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的培养基中培养来自步骤a)的所述细胞。

在一实施例中，所述方法产生的NK细胞的群体比在不存在所述AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的情况下的相同条件下培养的NK细胞的群体具有更强的细胞毒性活性。

在一实施例中，所述NK细胞包括嵌合抗原受体，并且所述方法进一步包括用编码嵌合抗原受体的载体转化富含所述自然杀伤细胞(NK)的细胞群体。

在一实施例中，所述培养基中的所述AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的浓度介于约0.5μM与9μM之间、介于约1μM与约7μM之间、介于约1μM与约5μM之间或介于约1μM与3μM之间。在另一实施例中，所述培养基中的所述AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的浓度是约2μM、约3μM、约4μM、约5μM、约6μM、约7μM、约8μM或约9μM。

在一实施例中，所述细胞是动物细胞。在一实施例中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一实施例中，所述细胞是人细胞。

在一实施例中，向所述受试者施用所述经培养的细胞或其包括所述免疫细胞的亚群体(如已进一步使用于所关注的具体细胞类型富集)。

另一方面，本发明提供了使用本发明的方法产生的细胞群体，优选地其中所述免疫细胞是使用包括以下的方法来产生的：在包括AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂的培养基中培养免疫细胞。

在另外的方面，本发明提供了一种细胞群体，其包括CAR-T细胞，其中所述CAR-T细胞中的至少10％是CD8+T

在一实施例中，所述细胞群体尚未分类，如在培养后未进行分类。

在一实施例中，所述CAR-T细胞中的少于25％是T

在一实施例中，所述免疫细胞的群体，优选地包括本发明的嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T细胞)的群体、AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂和/或检查点抑制剂以药物组合物的形式施用。一方面，因此提供了一种药物组合物，其包括本发明的免疫细胞的群体。

在一实施例中，所述药物组合物包括免疫细胞，优选地包括本发明的嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T细胞)的群体和AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂。在一实施例中，所述药物组合物包括免疫细胞，优选地包括本发明的嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T细胞)的群体和检查点抑制剂。

除非另有明确说明，否则本文中的任何实施例在进行必要的修改后应被视为适用于任何其它实施例。

本发明的范围不受本文所描述的具体实施例的限制，所述具体实施例旨在仅用于例示的目的。如本文所描述，功能等效的产物、组合物和方法显然在本发明的范围内。

贯穿本说明书，除非另有明确说明或上下文另有要求，否则对单个步骤、物质组合物、步骤组或物质组合物组的提及应被视为涵盖这些步骤、物质组合物、步骤组或物质组合物组中的一个和多个(即一种或多种)。

在下文中通过以下非限制性实例并参考附图来描述本发明。

附图说明

图1-不同TCN和TCN-P浓度对鼠类T细胞活力的影响。

图2-重复TCN暴露对鼠类CAR-T细胞转导后增殖的影响。

图3-重复TCN暴露对鼠类CD8+CAR-T细胞中枢记忆表型(CD44+CD62L

图4-TCN处理对鼠类CD8+CAR-T细胞产生的IFNγ和TNFα的影响。用TCN暴露预处理的CAR-T细胞以2:1和1:1的效应子:靶标比率产生相当水平的IFNγ(A)。在相同的效应子:靶标比率下，观察到TNFα释放的类似趋势(B)。

图5-在未暴露于肿瘤抗原的情况下，重复TCN暴露对鼠类CAR-T细胞的早期激活标记物的表达的影响。TCN预处理增加了鼠类CD8+CAR-T细胞表面的PD-1(A)和CD69(B)的表达。

图6-用TCN预处理的鼠类CAR-T细胞的肿瘤抗原定向细胞毒性减弱(A)，但TCN预处理不会影响CAR-T细胞的持续存活。

图7-CAR-T转导效率(Her2

图8-流式细胞术等高线图显示在用TCN或TCN-P处理CD8+CAR-T细胞时向中枢记忆表型的转变。

图9-从图8(24小时)得出的定量流式细胞术数据。CD8+CAR-T细胞的中枢记忆T(TCM)细胞表型(CD45RO+CD62L+)从平均11％(对照组，媒剂)增加到17％(TCN，TCN-P)，同时效应T(TE)细胞减少(8％相对于5％，n＝3)(A)。这种对TCN/TCN-P处理的应答模式在所有3个供体中均保持不变(B)。

图10-CAR-T细胞短时间(24小时)暴露于TCN或TCN-P导致效应T(T

图11-由图10得出的定量流式细胞仪数据(3天)。在24小时处理期之后，CD8+CAR-T细胞的中枢记忆T(T

图12-用TCN/TCN-P预处理使CCR7+T

图13-处理后24小时，用TCN或TCN-P预处理对CD4 T

图14-由图14(24小时)得出的定量流式细胞术数据，其中用TCN/TCN-P预处理不影响CD4+T

图15-在处理后24小时，用TCN/TCN-P预处理对CD4 T

图16-由图15得出的定量流式细胞术数据(3天)，其中用TCN/TCN-P预处理不影响CD4+T

图17-TCN预处理减少了CAR-T细胞中的调节性T(T

图18-测量TCN或TCN-P预处理对CAR-T细胞功能的体内影响的方案概述。

图19-在CAR-T制备期间的TCN-P预处理导致中枢记忆T细胞的富集。E0771-hHer2乳腺癌模型的说明性图示，将200,000个肿瘤细胞原位移植到乳腺脂肪垫中，并且6天后通过尾静脉注射施用2000万个CAR-T细胞。当肿瘤面积>120mm

图20-肿瘤生长的减少对应于CAR-T施用后持续的中枢记忆表型。单独队列的动物接受了相同的乳腺肿瘤模型，并且所有动物在CAR-T处理后第8天被处死，每2-3天测量一次肿瘤(A)。代表性流式细胞术分析表明，与CD8+T细胞相比，用TCN-P预调理增加了循环CD4+T细胞的比例(B，上图)，减少了CD8+CAR-T细胞(中图)，同时中枢记忆表型持续(下图)。瘤内CD4+和CD8+T细胞没有显著改变(C)，然而，在预调理组中观察到更多数量的脾内CD4+T细胞(D)。肿瘤对照的变化与IFN-γ和TNF-α产生(E)的显著变化无关。

图21-TCN-P预调理对循环T细胞的影响。预调理对CD4+或CD8+T细胞数量没有显著的影响(A-B)。在CD8+CAR-T细胞(C)中没有观察到显著变化，但在接受预调理的CAR-T细胞的动物中观察到CD4+CAR-T的数量显著增加(D，p＝0.0009)。CD8+和CD4+中枢记忆T细胞的百分比在接受预调理的CAR-T细胞的动物中更高(E-F，p<0.0001)。与此同时，CD8+(G，p<0.0001)和CD4+(H，p＝0.0029)效应记忆T细胞减少。

图22-TCN-P预调理对肿瘤内和脾内T细胞的影响。没有观察到肿瘤内和脾内CD4+和CD8+中枢记忆T细胞的百分比的显著变化(A，C)。没有观察到肿瘤内CD101+CD8+T细胞百分比的变化(B)，而预调理组的脾内CD101+CD8+T细胞水平较低，这表明预调理对CD8+T细胞的耗竭具有保护作用(D)。

图23-TCN-P预调理的CAR-T细胞与PD-1检查点阻断剂组合使用提高针对实体瘤的抗肿瘤功效。A)Her2+转基因小鼠接种有2.5

图24-测量TCN和TCN-P作为CAR-T新佐剂的体内疗效的方案概述。

图25-TCN-P的佐剂效力。Her2+转基因小鼠接种有2.5

图26-TCN-P增强了CAR-T细胞疗法针对实体瘤的功效。A)Her2+转基因小鼠接种有2.5

图27-TCN-P作为CAR-T处理的佐剂。MC-38结肠癌模型的说明性图示，其中250,000个MC-38肿瘤细胞在CAR-T处理开始前大约6天皮下移植，并且每3天辅助TCN-P共施用(A)。初步数据表明，TCN-P辅助疗法显著改善CAR-T定向肿瘤减少(

图28-A)TCN-P预处理和TCN-P辅助疗法的组合导致了治疗后第14天脾中CD4+和CD8+CAR-T细胞的明显累积和/或扩增(p<0.0001)。b)施用TCN-P使肿瘤内Treg减少50％。

具体实施方式

一般技术和定义

除非另外特别说明，否则本文所使用的所有技术和科学术语应被视为具有与本领域(例如，在细胞培养、分子遗传学、CAR-T技术、免疫学和生物化学)的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。

除非另有说明，否则本发明中使用的重组蛋白、细胞培养和免疫学技术是本领域技术人员熟知的标准程序。此类技术在以下来源的文献中进行了描述和解释：如J.Perbal,《分子克隆实用指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)》,约翰威利父子出版公司(John Wiley and Sons)(1984)；J.Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(MolecularCloning:A Laboratory Manual)》,冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarbourLaboratory Press)(1989)；T.A.Brown(编辑),《基本分子生物学：实用方法(EssentialMolecular Biology:A Practical Approach)》,第1卷和第2卷,IRL出版社(IRL Press)(1991)；D.M.Glover和B.D.Hames(编辑),《DNA克隆：实用方法(DNA Cloning:A PracticalApproach)》,第1-4卷,IRL出版社(1995和1996)；以及F.M.Ausubel等人(编辑),《当代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》,格林出版协会(GreenePub.Associates)和威利国际科学出版公司(Wiley-Interscience)(1988，包含迄今为止的所有更新)；Ed Harlow和David Lane(编辑)《抗体：实验室手册(Antibodies:A LaboratoryManual)》,冷泉港实验室,(1988)；以及J.E.Coligan等人(编辑),《当代免疫学指南(Current Protocols in Immunology)》,约翰威利父子出版公司(包含迄今为止的所有更新)。

术语“和/或”，例如“X和/或Y”应被理解为意指“X和Y”或“X或Y”，并且应被视为对两个含义或任一含义提供明确支持。

如本文所使用的，除非相反地说明，否则术语“约”是指指定值的+/-10％，更优选地+/-5％。

贯穿本说明书，词语“包括(comprise)”或如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”等变体应当被理解为暗示包含所陈述要素、整数或步骤或要素组、整数组或步骤组，但不排除任何其它要素、整数或步骤或要素组、整数组或步骤组。

如本申请中所使用的，术语“或”旨在意味着包容性“或”而不是排他性的“或”。也就是说，除非另外指明或根据上下文清楚的，“X采用A或B”旨在意指自然的包含性排列中的任何自然的包含性排列。也就是说，如果X采用A；X采用B；或X采用A和B两者，则“X采用A或B”在前述情况的任何情况下都满足。进一步地，A和B中的至少一个和/或类似表达通常意指A或B或A和B两者。另外，本申请和所附权利要求中使用的冠词“一个(a)”和“一种(an)”总体上可以被解释为意指“一个或多个”，除非另有指定或根据上下文清楚的是针对单数形式。

如本文所使用的，术语“受试者”可以是任何动物。在一个实施例中，动物是脊椎动物。例如，动物可以是哺乳动物、禽类、脊索动物、两栖动物或爬行动物。示例性受试者包含但不限于人、灵长类动物、家畜(例如，羊、牛、鸡、马、驴、猪)、伴侣动物(例如，狗、猫)、实验室测试动物(例如，小鼠、兔子、大鼠、豚鼠、仓鼠)、圈养野生动物(例如，狐狸、鹿)。在一个实施例中，哺乳动物是人。在一实施例中，本发明的方法用于兽医用途。

术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”受试者包含应用或施用本发明的免疫细胞的群体或其组合物，其目的是延缓、减缓、稳定、治愈、愈合、减轻、缓解、改变、补救、减少恶化、改良、改善或影响疾病或病状、疾病或病状的症状或疾病或病状的风险(或易感性)。术语“治疗”是指成功治疗或改善损伤、病理或病状的任何指标，包含任何客观或主观参数，如减轻；缓解；减少恶化的速度；减轻疾病的严重程度；稳定、减少症状或使得损伤、病理或病状对受试者而言更易忍受；减缓恶化或衰退的速率；使恶化末期不那么衰弱；或改善受试者的身体或精神健康。

如本文所使用的，“预防(preventing或prevention)”是指至少降低获得疾病或病症的风险(或易感性)的可能性(即，使可以暴露于或易患疾病但还未经历或显示疾病的症状的患者不产生疾病的临床症状中的至少一个临床症状)。本文提供了用于鉴定此类患者的生物学和生理学参数，并且所述参数也是医师所熟知的。例如，在疑似患有乳腺癌的受试者的情况下，受试者可能有癌症家族史，并且已被鉴定为具有可能导致癌症的突变，但尚未表现出任何明显的疾病症状。在这种情况下，可以认为本发明的免疫细胞或其组合物将在预防受试者出现与疾病(例如，乳腺癌)相关的一种或多种症状方面具有实用性。

如本文所使用的，“细胞因子释放综合征”(CRS)是指以发热和多器官功能障碍为特征的急性全身炎症综合征，这与嵌合抗原受体(CAR)-T细胞疗法、治疗性抗体和单倍同一性同种异体移植相关。

如本文所使用的，“富集群体”或其变体是指已经处理以从细胞的起始群体中去除或至少减少一些类型的细胞的细胞群体，如从受试者体内分离出的外周血单核细胞(PBMC)群体。阳性或阴性选择具体细胞类型的方法在本领域是众所周知的，如使用包括与要富集或去除的具体细胞类型的细胞表面蛋白选择性地结合的抗体的磁珠。在一实施例中，当与起始细胞群体(如PBMC)相比时，所述群体已富集的细胞类型在富集群体中的代表性比起始群体的代表性高例如高1.5倍、2倍、5倍、10倍、20倍或50倍。

如本文所使用的，术语“相同条件”是相对的术语，意指相同的细胞群体，例如分成两个完全相同的亚群体，除了其中一个亚群体存在抑制剂外，暴露于完全相同的培养程序。

如本文所使用的，术语“组合疗法”、“联合施用”或“共施用”等意指涵盖对单个受试者施用所选的治疗剂，并且意指包含其中所述药剂通过相同或不同施用途径或在相同或不同时间施用的治疗方案。

抑制剂

如本文所使用的，术语“PH结构域蛋白”是指包括PH结构域的蛋白质。普列克底物蛋白同源结构域(PH结构域)或(PHIP)是大约100-120个氨基酸的蛋白质结构域，其存在于在许多参与细胞内信号传导或作为细胞骨架成分的蛋白质中。所有都具有在N端普列克底物蛋白PH结构域的NMR结构中首次观察到的相同的β-夹心折叠。蛋白质的氨基端一半形成四链β折叠结构，在β3/β4环中有另外的短的α螺旋(对β-血影蛋白PH结构域具有特异性)。蛋白质的后半部分形成与第一折叠接近正交的β-折叠曲折(β5-β7链)。这两个折叠形成了其中填充了结构域的疏水性核的“夹心”。在一个实施例中，PH结构域蛋白是小G蛋白。在另一实施例中，PH结构域蛋白是丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶。在另一实施例中，PH结构域蛋白是氧甾醇结合蛋白(OSBP)。在另一实施例中，PH结构域蛋白是G蛋白受体激酶。可以使用本发明的方法抑制的PH结构域蛋白的实例包含但不限于：氧甾醇结合蛋白1、氧甾醇结合蛋白2、血影蛋白β链、非红细胞1、Rho GTP酶激活蛋白27、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)、AKT或其一种或多种的组合。用于本发明的PH结构域蛋白抑制剂的实例包含但不限于磷脂酰肌醇醚脂质类似物(PIA)，如D-3-脱氧-肌醇，例如D-3-脱氧-磷脂酰基-肌醇1-[(R)-2-甲氧基-3-十八烷基氧基丙基磷酸氢酯](DPIEL，PX-316)；烷基-磷脂(APL)，如依地福新(edelfosine)、米替福新(miltefosine)和哌立福辛(perifosine)；肌醇磷酸酯(IP)，如Ins(1,3,4,5,6)五磷酸酯(IP5)、Ins(1,4,5,6)四磷酸酯(IP4)、植酸(IP6)、2-O-苄基-肌醇1,3,4,5,6-五磷酸酯(2-O-Bn-InsP

AKT又称蛋白激酶B(PKB)，是一种丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶，其在如葡萄糖代谢、细胞凋亡、细胞增殖、转录和细胞迁移等多个细胞过程中发挥着关键作用。AKT1参与PI3K/AKT/mTOR通路和其它信号通路。用于本发明的AKT抑制剂的实例包含但不限于MK-2206 2HCl(8-[4-(1-氨基环丁基)苯基]-9-苯基[1,2,4]三唑并[3,4-f][1,6]萘啶-3(2H)-酮二盐酸盐)；哌立福辛(1,1-二甲基-4[(十八烷基氧基)羟基氧膦基]氧基]-哌啶鎓内盐，KRX-0401)；GSK690693(4-[2-(4-氨基-1,2,5-噁二唑-3-基)-1-乙基-7-[[(3S)-哌啶-3-基]甲氧基]咪唑[4,5-c]吡啶-4-基]-2-甲基丁-3-炔-2-醇)；帕塔色替(ipatasertib)((2S)-2-(4-氯苯基)-1-{4-[(5R,7R)-7-羟基-5-甲基-6,7-二氢-5H-环五[d]嘧啶-4-基]-1-哌嗪基}-3-(异丙基氨基)-1-丙酮-，GDC-0068)；AZD5363(4-氨基-N-[(1S)-1-(4-氯苯基)-3-羟丙基]-1-(7H-吡咯并[2,3-d]-嘧啶-4-基)哌啶-4-甲酰胺)；PF-04691502(2-氨基-8-[4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基吡啶-3-基)-4-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮)；AT7867(4-(4-氯苯基)-4-[4-(1H-吡唑-4-基)苯基]哌啶)；曲西立滨(5-甲基-1-(β-D-呋喃核糖基)-1,5-二氢-1,4,5,6,8-五氮杂苊烯-3-胺)；曲西立滨-5'-单磷酸酯；CCT128930(4-(4-氯苄基)-1-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-4-哌啶胺)-；A-674563((2S)-1-[5-(3-甲基-2H-吲唑-5-基)吡啶-3-基]氧基-3-苯基丙-2-胺)；PHT-427(4-十二烷基-N-(1,3,4-噻二唑-2-基)苯磺酰胺)；AKTi-1/2(3-[1-[[4-(7-苯基-3H-咪唑[4,5-g]喹喔啉-6-基)苯基]甲基]哌啶-4-基]-1H-苯并咪唑-2-酮)；阿氟色替(Afuresertib)(GSK2110183，N-[(2s)-1-氨基-3-(3-氟苯基)丙-2-基]-5-氯-4-(4-氯-2-甲基吡唑-3-基)噻吩-2-甲酰胺)；AT13148((1S)-2-氨基-1-(4-氯苯基)-1-[4-(1H-吡唑-4-基)苯基]乙醇)；[0189]米替福新(磷酸十六烷基酯2-(三甲基铵基)乙酯)；和厚朴酚(Honokiol)(2-(4-羟基-3-丙-2-烯基苯基)-4-丙-2-烯基苯酚)；TIC10类似物(2,6,7,8,9,10-六氢-10-[(2-甲基苯基)甲基]-7-(苯基甲基)-咪唑并[1,2-a]吡啶[4,3-d]嘧啶-5(3H)-酮)；AKT抑制剂VIII(1,3-二氢-1-(1-((4-(6-苯基-1H-咪唑[4,5-g]喹喔啉-7-基)苯基)甲基)-4-哌啶基)-2H-苯并咪唑-2-酮)；优泼色替(uprosertib)(GSK2141795)；TIC10(2,4,6,7,8,9-六氢-4-[(2-甲基苯基)甲基]-7-(苯基甲基)-咪唑-o[1,2-a]吡啶并[3,4-e]嘧啶-5(1H)-酮)；卡皮法塞替(Capivasertib)(AZD5363)和MS-222(乙基-3-氨基苯甲酸甲磺酸盐)和其盐、酯、类似物、变体和衍生物。在一实施例中，AKT抑制剂为曲西立滨、曲西立滨5'-单磷酸酯、AKT抑制剂VIII、MK-2206、AZD5363、GDC-0068、GSK2141795和GSK2110183盐酸盐以及其盐、酯、类似物、变体和衍生物。在一实施例中，AKT抑制剂是曲西立滨(TCN)或曲西立滨-5'-单磷酸酯(TCN-P)。

对AKT和/或PH结构域蛋白的活性的抑制可以小于100％，例如，约10％至约95％，例如约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或以另一百分比抑制活性，例如约10％至约95％。抑制剂可以是例如小分子、肽、蛋白质(如抗体)、核酸或其组合。

免疫细胞

如本文所使用的，短语“免疫细胞”是指在识别抗原时能够影响或诱导免疫应答的细胞。在一些实施例中，免疫细胞是T细胞、自然杀伤细胞(NK)、巨噬细胞、髓系细胞或树突状细胞。在一些实施例中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些实施例中，所述细胞是人细胞。所述细胞对于所施用的受试者可以是自体的或同种异体的。在一实施例中，本发明提供了一种表达CAR的细胞，如CAR-T细胞的群体。

如本文所使用的，短语“改变免疫应答”或“改变T细胞免疫应答”是指免疫细胞或T细胞在识别抗原时诱导或增加免疫应答的能力。免疫应答或T细胞应答的此类改变将被理解为足以用于治疗如本文所描述的癌症、感染或炎性疾病。

如本文所使用的，短语“细胞毒性活性”是指免疫细胞，如NK细胞破坏活细胞的能力。

如本文所使用的，术语“免疫应答”在本领域中具有其普通含义，并且包含体液免疫和细胞免疫两者。免疫应答可以表现为以下一种或多种：抗原抗体的产生、抗原特异性T细胞的扩增、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的增加、抗肿瘤或抗肿瘤抗原迟发型超敏(DTH)应答的产生、病原体的清除、病原体和/或肿瘤生长和/或扩散的抑制、肿瘤的缩小、转移的减少或消除、复发时间的延长、无病原体或无肿瘤生存时间的延长以及生存时间的延长。免疫应答可以由以下一种或多种方式介导：B细胞激活、T细胞激活、自然杀伤细胞激活、抗原呈递细胞(例如，B细胞、DC、单核细胞和/或巨噬细胞)激活、细胞因子产生、趋化因子产生、特异性细胞表面标志物表达，具体地共刺激分子的表达。免疫应答可以通过体液应答、细胞应答、Th1或Th2应答或其组合来表征。在一实施例中，免疫应答是先天免疫应答。

T细胞

在一些实施例中，所述免疫细胞是T细胞，例如CAR-T细胞。T细胞或T淋巴细胞是在细胞介导的免疫中起关键作用的淋巴细胞类型。其可以通过在细胞表面上存在T细胞受体(TCR)而与其它淋巴细胞，如B细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)区分开。存在T细胞的几个子集，每个子集都具有不同的功能。

在一实施例中，T细胞是或包含中枢记忆(T

在一实施例中，T细胞是或包含中枢记忆干细胞(T

在一实施例中，所述方法产生的T

如本文所使用的，调节性T细胞(T

在一实施例中，所述方法产生的调节性(T

如本文所使用的，术语“原初T细胞”是指已经成熟并由胸腺释放但尚未遇到其对应抗原的T细胞群体。换句话说，原初T细胞处于介于成熟与激活之间的阶段。原初T细胞通常通过以下表征：L-选择素(CD62L)和C-C趋化因子受体7型(CCR7)的表面表达；不存在激活标志物CD25、CD44或CD69；并且不存在记忆CD45RO同种型。其还表达由亚基IL-7受体-α，CD127和共同γ链，CD132组成的功能IL-7受体。

缺乏功能性内源性T细胞受体(TCR)的T细胞可以例如进行工程化使其表面不表达任何功能性TCR，进行工程化使其不表达包括功能性TCR的一个或多个亚基，或进行工程化使其表面产生很少的功能性TCR。可替代地，T细胞可以例如通过表达TCR的亚基中的一个或多个亚基的突变或截短形式来表达明显受损的TCR。术语“明显受损的TCR”意指此TCR不会在宿主中引发不利免疫应答。

本文所描述的T细胞可以例如被工程化为使得其不在其表面上表达功能性HLA。例如，本文所描述的T细胞可以被工程化为使得细胞表面表达HLA，例如HLA 1类和/或HLA II类被下调。在一些实施例中，T细胞可以缺乏功能性TCR和功能性HLA，例如HLA I类和/或HLAII类。

缺乏功能性TCR和/或HLA的表达的经修饰的T细胞可以通过任何合适的方式获得，包含敲除或敲低TCR或HLA的一个或多个亚基。例如，T细胞可以包含使用siRNA、shRNA、成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)、转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)或锌指核酸内切酶(ZFN)敲低TCR和/或HLA。

自然杀伤细胞

在一些实施例中，免疫细胞是自然杀伤细胞。自然杀伤(NK)细胞是CD56 CD3大颗粒淋巴细胞，其可以杀死感染和转化的细胞，并且构成先天免疫系统的关键细胞子集。与细胞毒性CD8+T淋巴细胞不同，NK细胞无需事先致敏即可对肿瘤细胞产生细胞毒性，并且还可以根除MHC-I阴性细胞。在一实施例中，NK细胞是CD3-CD56+CD7+CD127-NKp46+T-bet+Eomes+。在一实施例中，细胞毒性NK细胞是CD56

树突状细胞

在一些实施例中，免疫细胞是树突状细胞。树突状细胞是一组异质性的专门的抗原呈递细胞，在骨髓中起源于CD34+干细胞并且表达主要组织相容性复合体(MHC)II类分子。成熟的树突状细胞能够刺激、激活和扩增效应免疫细胞，如T细胞和NK细胞。树突状细胞疗法在本领域是众所周知的(参见Sabado等人,2017年)。简而言之，树突状细胞可以从患者体内分离，暴露于疾病特异性抗原，例如癌症特异性抗原，或者经基因修饰以表达CAR或疾病特异性抗原，并且然后再输注回致敏、激活和扩增效应免疫细胞，例如T细胞的患者体内。

髓系细胞

在一些实施例中，免疫细胞是髓系细胞。粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞代表白细胞的亚群，统称为髓系细胞。所述细胞通过血液和淋巴系统循环，并且通过各种趋化因子受体迅速募集到损伤和感染的组织部位。在组织内，所述细胞被激活进行吞噬并分泌炎性细胞因子，由此在保护性免疫中发挥重要作用。髓系细胞疗法是本领域已知的疗法，并且可用于治疗癌症、感染或疾病。例如，已知髓系细胞在肿瘤基质中大量存在，并且这些细胞的存在可能影响许多癌症类型患者结果。简而言之，髓系细胞可以从患者体内分离，暴露于疾病特异性抗原，例如癌症特异性抗原，或者经基因修饰以表达CAR或疾病特异性抗原，并且然后再输注回致敏、激活和扩增效应免疫细胞，例如T细胞的患者体内。

巨噬细胞

在一些实施例中，免疫细胞是巨噬细胞。巨噬细胞是髓系谱系细胞，由骨髓衍生的单核细胞祖细胞产生，所述单核细胞祖细胞分化成组织巨噬细胞、抗原递呈树突状细胞和骨吸收破骨细胞。巨噬细胞疗法是本领域已知的疗法，并且可用于治疗癌症、感染或疾病。简而言之，巨噬细胞可以从患者体内分离，暴露于疾病特异性抗原，例如癌症特异性抗原，或者经基因修饰以表达CAR或疾病特异性抗原，并且然后再输注回致敏、激活和扩增效应免疫细胞，例如T细胞的患者体内。

嵌合抗原受体

术语“嵌合抗原受体”或可替代地“CAR”是指一种多肽或一组多肽，当进入免疫细胞后，可使细胞对靶T细胞，例如癌细胞具有特异性，并且产生细胞内信号。

CAR可以用于生成对所选靶标具有特异性的免疫细胞，如T细胞、树突状细胞或自然杀伤(NK)细胞。用于产生CAR的合适构建体描述于US 5,843,728；US 5,851,828；US 5,912,170；US 6,004,811；US 6,284,240；US 6,392,013；US 6,410,014；US 6,753,162；US8,211,422；和WO9215322中。替代性CAR构建体的特征在于可以属于连续几代。第一代CAR通常由对抗原具有特异性的抗体的单链可变片段组成，例如包括与特异性抗体的VH连接的VL，通过柔性接头，例如通过CD8a铰链结构域和CD8a跨膜结构域连接到CD3C或FcRy或scFv-FcRy的跨膜和细胞内信号结构域(参见例如US 7,741,465；US 5,912,172；和US 5,906,936)。第二代CAR将一种或多种共刺激分子，如CD28、CD28z、OX40(CD134)或4-1BB(CD137)的细胞内结构域并入到胞内域内，例如scFv-CD28/OX40/4BB-CD3(参见例如US 8,911,993；US8,916,381；US 8,975,071；US 9,101,584；US 9,102,760；US 9,102,761)。第三代CAR包含共刺激胞内域的组合，例如CD3C-链、CD97、GDI la-CD18、CD2、ICOS、CD27、CD154、CDS、OX40、4-1BB或CD28信号结构域，例如scFv-CD28-4BB-CD3C或scFv-CD28-OX40-CD3Q(参见例如US8,906,682；US 8,399,645；US 5,686,281；WO 2014134165；和WO 2012079000)。在一些实施例中，可以通过在抗原特异性T细胞中表达CAR来协调共刺激，在共刺激的情况下，所述抗原特异性T细胞被选择以使得在例如与专业抗原呈递细胞上的抗原相互作用后被激活和扩增。可以在免疫细胞上提供另外的工程化受体，例如，提高T细胞攻击的靶向性和/或将副作用降至最低。

制备表达CAR的细胞的方法

细胞来源

在扩增和可能的基因修饰或其它修饰之前，可以从受试者中获得包括免疫细胞，如T细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞(NK)或其组合或由其组成的细胞群体。可以从多个来源获得免疫细胞，包含外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。

在本公开的某些实施例中，免疫细胞(例如，T细胞)可以使用本领域技术人员已知的任何数量的技术(如FicollTM分离)从受试者收集的血液单元获得。在一个优选实施例中，通过单采血液成分术获得来自个体的循环血液的细胞。单采术产物通常含有淋巴细胞，包含T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、树突状细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。在一个实施例中，可以洗涤通过单采术收集的细胞以去除血浆级分，并且任选地，将细胞放置于适当的缓冲液或培养基中以用于后续处理步骤。在一个实施例中，细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。在替代性实施例中，洗涤溶液缺乏钙，并且可能缺乏镁，或者可能缺乏许多(如果不是全部的话)二价阳离子。

在没有钙的情况下，初始的激活步骤可能导致激活放大。如本领域普通技术人员将容易理解的，洗涤步骤可以通过本领域的人员已知的方法来完成，如根据制造商的说明使用半自动“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器巴克斯特公司CytoMate或Haemonetics公司细胞保存器5(Haemonetics Cell Saver 5))。在洗涤之后，可以将细胞重新悬浮于多种生物相容性缓冲液中，例如，不含Ca、不含Mg PBS、勃脉力A(PlasmaLyte A)或具有或不具有缓冲液的其它盐水溶液中。可替代地，可以去除单采术样品的不期望组分并且将细胞直接重新悬浮于培养基中。

应认识到，本申请的方法可以利用包括5％或更少，例如2％的人AB血清的培养基条件，并且使用已知的培养基条件和组合物，例如Smith等人(2015)中所描述的培养基条件和组合物。

在一个实施例中，通过裂解红细胞并耗尽单核细胞，例如通过PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘析，从外周血淋巴细胞分离T细胞。

本文所描述的方法可以包含例如选择免疫细胞例如，T细胞的特定亚群体，其是T调节性细胞耗竭的群体。例如，可以使用例如本文所描述的阴性选择技术等方法获得CD25+耗竭的细胞群体。优选地，T调节性耗竭的细胞的群体含有少于30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞。然而，如本文所讨论的，在本发明的方法中单独使用的AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂能够在培养期间降低T

在一个实施例中，使用抗CD25抗体或其片段或CD25结合配体IL-2从群体中去除T调节性(T

不希望受特定理论的束缚，在单采术前或制备表达CAR的细胞产品期间，降低受试者的免疫细胞的负调节因子水平(例如，减少不期望的免疫细胞的数量，例如T

在一些实施例中，制备方法包括在制备表达CAR的细胞之前减少(例如，耗竭)T

在一实施例中，本发明的方法不包括分选经培养的细胞，以分离CD45RO-CCR7-CD62L-T记忆细胞。

用于刺激的T细胞也可以在洗涤步骤之后冷冻。不希望受理论束缚，冷冻和随后的解冻步骤通过去除细胞群体中的粒细胞和在一定程度上去除单核细胞而提供更均匀的产物。在去除血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮于冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数是本领域已知的并且在此上下文中将是有用的，但是一种方法涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS、或含有10％右旋糖酐40和5％右旋糖的培养基、20％人血清白蛋白和7.5％ DMSO、或31.25％勃脈力A(Plasmalyte-A)、31.25％右旋糖5％、0.45％NaCl、10％右旋糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％ DMSO或含有例如Hespan和勃脈力A的其它合适的细胞冷冻培养基，然后将细胞以每分钟1°的速率冷冻至-80℃，并且以液氮储存罐的气相形式储存。可以使用其它受控冷冻方法以及在-20℃下或在液氮中的立即不受控冷冻。

在某些实施例中，如本文所描述将冷冻保存的细胞解冻和清洗，并且在使用本发明的方法激活之前在室温下静置一小时。

在本发明的上下文中，还设想了在可能需要如本文所描述的扩增的细胞之前的时间段从受试者采集血液样品或单采术产品。因此，可以在任何必要的时间点收集要扩增的细胞来源，并且分离和冷冻期望的细胞，如T细胞，以供以后用于将受益于免疫细胞疗法的许多疾病或病状的免疫细胞疗法，例如本文所描述的。在一个实施例中，血液样品或单采物取自一般健康的受试者。在某些实施例中，从有患上疾病的风险但尚未患上疾病的一般健康受试者中采集血液样品或单采物，并且分离和冷冻所关注细胞以供以后使用。在某些实施例中，T细胞可以被扩增、冷冻并在以后时间使用。在某些实施例中，如本文所描述，在特定疾病诊断后不久，但在任何治疗前，从患者收集样品。在另外的实施例中，在任何数量的相关治疗模式之前，从受试者的血液样品或单采物中分离细胞，所述治疗模式包含但不限于用药剂如那他珠单抗、依法珠单抗、抗病毒剂、化学疗法、放射疗法、免疫抑制剂如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506、抗体或其它免疫清除剂如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇、FR901228和照射疗法进行治疗。

制备表达CAR的细胞的方法

在一实施例中，本发明的方法包含通过将编码CAR的载体或核酸引入到细胞中来制备表达CAR的细胞。将基因引入到细胞中并进行表达的方法在本领域是已知的。在表达载体的上下文中，可以通过本领域的任何方法将载体容易地引入到宿主T细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫T细胞中。例如，表达载体可以通过物理、化学或生物手段转移到宿主T细胞中。

用于将多核苷酸引入到宿主T细胞中的物理方法包含磷酸钙沉淀、脂质转染、颗粒轰击、微注射、电穿孔等。用于产生包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域是众所周知的(参见例如Sambrook,《分子克隆：实验室手册》,第1-4卷,冷泉港实验室出版社)。将多核苷酸引入到宿主T细胞中的优选方法是磷酸钙转染。

用于将所关注的多核苷酸引入到宿主T细胞中的生物方法包含使用DNA和RNA载体。病毒载体，以及尤其是逆转录病毒载体已成为用于将基因插入到哺乳动物，例如，人类细胞中的最广泛使用的方法。其它病毒载体可以源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等(参见例如，US 5,350,674和US 5,585,362)。

用于将多核苷酸引入到宿主T细胞中的化学手段包含胶分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠粒以及包含水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体的基于脂质的系统。用作体外和体内递送媒剂的示例性胶态系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。以现有技术靶向递送核酸的其它方法是可用的，如用靶向纳米颗粒或其它适合的亚微米大小的递送系统递送多核苷酸。

一种示例性非病毒递送媒剂是脂质体。考虑使用脂质调配物将核酸引入到宿主T细胞中(体外、离体或体内)。在另一实施例中，核酸可以与脂质缔合。可以将与脂质缔合的核酸包封在脂质体的含水内部、散布在脂质体的脂质双层、经由与脂质体和寡核苷酸二者缔合的连接分子连接至脂质体、捕获在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质合并、作为脂质中的悬浮液而含有、含有微团或与微团复合、或以其它方式与脂质缔合。与脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体缔合的组合物分不限于溶液中的任何具体结构。例如，所述组合物可以按以下存在：双层结构、微团或“塌陷”结构。所述组合物还可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或性状并不均匀的聚集体。脂质是可以是天然存在的脂质或合成脂质的脂肪物质。例如，脂质包含在细胞质中天然存在的脂肪滴，以及含有长链脂肪烃的化合物及其衍生物(例如脂肪酸、醇、胺、氨基醇、和醛)的类别。适合使用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻基磷脂酰胆碱(“DMPC”)可以从西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)获得；磷酸二鲸蜡脂(“DCP”)可以从K&K实验室(K&K Laboratories)获得；胆固醇(“Choi”)可以从Calbiochem-Behring公司(Calbiochem-Behring)获得；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“DMPG”)和其它脂质可以从例如埃文蒂极性脂质公司(Avanti PolarLipids,Inc.)获得。脂质于氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液可以储存在约-20℃下。氯仿用作唯一的溶剂，因为其比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是涵盖由封闭的脂质双层或聚集体的生成而形成的各种单层和多层脂质媒剂的通用术语。脂质体可以表征为具有带有磷脂双层膜和内部水性介质的囊泡结构。

多层脂质体具有由水性介质分隔开的多个脂质层。当磷脂悬浮于过量的水溶液中时，磷脂会自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前进行自我重排，并且在脂质双层之间截留水和溶解的溶质(Ghosh等人,1991)。然而，还涵盖在溶液中具有不同于正常囊泡结构的结构的组合物。例如，脂质可能呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了脂质转染胺-核酸复合物。

无论用于将外源核酸引入到宿主细胞中或以其它方式将细胞暴露于本发明的抑制剂的方法如何，为了证实重组DNA序列存在于宿主细胞中，可以进行多种测定。此类测定包含例如本领域技术人员众所周知的“分子生物学”测定，如Southern和Northern印迹、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，如例如通过免疫学方法(ELISA和蛋白质印迹)或通过本文所描述的测定来检测特定肽的存在或不存在，以鉴定落入本发明的范围内的药剂。

培养和扩增免疫细胞的方法

通常可以使用如例如以下所描述的方法来激活和扩增免疫细胞，如T细胞：US 6,352,694；US 6,534,055；US 6,905,680；US 6,692,964；US 5,858,358；US 6,887,466；US6,905,681；US 7,144,575；US 7,067,318；US 7,172,869；US 7,232,566；US 7,175,843；US5,883,223；US 6,905,874；US 6,797,514；US 6,867,041；和US 20060121005。

通过本文所公开的方法扩增T细胞可以使细胞倍增约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍或更多，以及介于两者之间的任何和所有整体整数或部分整数。在一个实施例中，T细胞的扩增范围是约20倍到约50倍。

在一实施例中，将细胞培养约7天至约14天或约7天至约10天。

通常，免疫细胞，例如T调节性细胞耗竭细胞的群体可以通过与和刺激CD3/TCR复合物相关的信号的药剂和刺激T细胞的表面上的共刺激分子的配体附接的表面接触来扩增。具体地，T细胞群体可以如本文所述被刺激，如通过与抗CD3抗体或其抗原结合片段或固定在表面上的抗CD2抗体接触或通过与和钙离子载体结合的蛋白激酶C激活剂(例如，苔藓抑素)接触。对于辅助分子在T细胞表面的共刺激，使用与辅助分子结合的配体。例如，在适于刺激T细胞的增殖的条件下，可以使T细胞群体与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，可以使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。抗CD28抗体的实例包含可以用作本领域通常已知的其它方法的9.3、B-T3、XR-CD28(法国贝桑松市的Diaclone公司(Diaclone,Besancon,France)(Berg等人,1998；Haanen等人,1999；Garland等人,1999)。

适于免疫细胞培养的条件包含适当的培养基(例如，最小必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15(龙沙公司(Lonza)))，所述培养基可以含有增殖和活力所必需的因子，包含血清(例如，胎牛血清或人血清)、白细胞介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGF、TNF-a或本领域的技术人员已知的用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包含但不限于：表面活性剂、血浆蛋白粉(plasmanate)和还原剂(诸如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇)。培养基可以包含RPMI1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、Optimizer，其添加有氨基酸、丙酮酸钠和维生素，其无血清或补充有适量血清(或血浆)或一组限定的激素和/或足以使T细胞生长和扩增的量的细胞因子。抗生素(例如，青霉素和链霉素)仅包含于实验培养物，而不包含于待注入受试者体内的细胞培养物。将靶T细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如适当的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气加5％ CO

表达CAR的细胞疗法

CAR-T细胞疗法

CAR-T细胞疗法是一种细胞疗法，在所述细胞疗法中，免疫细胞(例如，T细胞)经基因修饰以表达CAR，并且将表达CAR的细胞(例如，CAR-T细胞)输注给有需要的受体。输注的细胞能够杀死受体中表达CAR的靶标的患病细胞。与抗体疗法不同，经CAR修饰的免疫细胞(例如，CAR-T细胞)能够在体内复制，产生使得可以实现对肿瘤的持续控制的长期持久性。在各个实施例中，在向患者施用CAR-T细胞之后，施用于患者的CAR-T细胞其后代在患者体内持续至少四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月、十三个月、十四个月、十五个月、十六个月、十七个月、十八个月、十九个月、二十个月、二十一个月、二十二个月、二十三个月、两年、三年、四年或五年。

本发明还包含一种细胞疗法，在所述细胞疗法中，例如通过体外转录RNA修饰免疫细胞(例如，T细胞)，以使其瞬时表达嵌合抗原受体(CAR)，并且将CAR-T细胞输注至有需要的受体。所输注的细胞能够杀死受体中的肿瘤细胞。因此，在各个实施例中，向患者施用CAR-T细胞之后，施用于患者的免疫细胞(例如，CAR-T细胞)的存在时间少于一个月，例如三周、两周、一周。不希望受到任何特定理论的束缚，CAR-T细胞引发的抗肿瘤免疫应答可以是主动免疫应答或被动免疫应答，或者可替代地可以是直接免疫应答相对于间接免疫应答。

如上所述，体外程序在本领域是众所周知的，并且上文也有描述。简而言之，从哺乳动物(例如，人)分离细胞，并且用表达CAR的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。表达CAR的细胞(例如，CAR-T细胞)可以施用于哺乳动物受体以提供治疗性益处。哺乳动物受体可以是人，并且表达CAR的细胞相对于受体可以是自体的。可替代地，相对于受体而言，细胞可以是同种异体的、同系的或异种的。

US 5,199,942中描述了用于造血干细胞和祖细胞的体外扩增的方法，所述方法可以应用于本发明的细胞。其它合适的方法是本领域已知的，因此本发明不限于细胞离体扩增的任何特定方法。简而言之，免疫细胞(例如，T细胞)的体外培养和扩增包括：(1)从哺乳动物的外周血液采集物或骨髓外植体中收集CD34+造血干细胞和祖细胞；以及(2)体外扩增此类细胞。除了在US 5,199,942中描述的细胞生长因子外，其它因子如flt3-L、IL-1、IL-3和c-试剂盒配体也可以用于细胞的培养和扩增。

如本文所描述的，本发明的CAR-T细胞可以单独施用，或者作为药物组合物与稀释剂和/或与其它组分如IL-2或其它细胞因子或细胞群体组合施用。免疫细胞可以单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其它组分(如IL-2、IL-15、或其它细胞因子或细胞群体)组合施用。简而言之，药物组合物可以包括如本文所描述的免疫细胞与一种或多种药学上或生理学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂的组合。此类组合物可以包括缓冲液，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；以及防腐剂。在一些实施例中，调配在所公开的方法中使用的组合物以静脉内施用。

包括本文所描述的细胞的药物组合物可以以10

在某些实施例中，可以期望向受试者施用激活的免疫细胞，并且随后重新抽血(或进行单采术)，从中激活和扩增免疫细胞，并且向患者重新输注这些激活的和扩增的T细胞。此过程可以每隔几周执行多次。在某些实施例中，可以抽取10cc到400cc的血液来激活免疫细胞。在某些实施例中，通过抽取20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的血液来激活免疫细胞。使用此多次抽血/多次重新输注方案可以用于选出某些免疫细胞的群体。

组合疗法

免疫细胞，如本发明的CAR-T细胞，或根据本发明的方法产生的免疫细胞可以与选自由以下组成的组的一种或多种另外的治疗活性组分共调配和/或共施用：PRLR拮抗剂(例如，抗PRLR抗体或PRLR的小分子抑制剂)、EGFR拮抗剂(例如，抗EGFR抗体[例如，西妥昔单抗(cetuximab)或帕尼单抗(panitumumab)]或EGFR的小分子抑制剂[例如，吉非替尼(gefitinib)或厄洛替尼(erlotinib)])、另一EGFR家族成员，如Her2/ErbB2、ErbB3或ErbB4的拮抗剂(例如，抗ErbB2[例如，曲妥珠单抗(trastuzumab)或T-DM1]、抗ErbB3或抗ErbB4抗体或ErbB2、ErbB3或ErbB4活性小分子抑制剂)、cMET拮抗剂(例如，抗cMET抗体)、IGF1R拮抗剂(例如，抗IGF1R抗体)、B-raf抑制剂(例如，维莫非尼(vemurafenib)、索拉非尼(sorafenib)、GDC-0879、PLX-4720)、PDGFR-α抑制剂(例如，抗PDGFR-α抗体)、PDGFR-β抑制剂(例如，抗PDGFR-β抗体或小分子激酶抑制剂，例如甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)或苹果酸舒尼替尼(sunitinib malate)等)、PDGF配体抑制剂(例如，抗PDGF-A、-B、-C或-D抗体、适配体、siRNA等)、VEGF拮抗剂(例如，VEGF-陷阱，如阿柏西普(aflibercept)，参见例如US 7,087,411(本文也称为“VEGF抑制融合蛋白”)、抗VEGF抗体(例如，贝伐单抗(bevacizumab))、VEGF受体的小分子激酶抑制剂(例如，舒尼替尼、索拉非尼或帕唑帕尼(pazopanib)))、DLL4拮抗剂(例如，US2009/0142354中公开的抗DLL4抗体，如REGN421)、Ang2拮抗剂(例如，US2011/0027286中公开的抗Ang2抗体，如H1H685P)、FOLH1拮抗剂(例如，抗FOLH1抗体)、STEAP1或STEAP2拮抗剂(例如，抗STEAP1抗体或抗STEAP2抗体)、TMPRSS2拮抗剂(例如，抗TMPRSS2抗体)、MSLN拮抗剂(例如，抗MSLN抗体)、CA9拮抗剂(例如，抗CA9抗体)、尿斑素拮抗剂(例如，抗尿斑素[例如，抗UPK3A]抗体)、MUC16拮抗剂(例如，抗MUC16抗体)、Tn抗原拮抗剂(例如，抗Tn抗体)、CLEC12A拮抗剂(例如，抗CLEC12A抗体)、TNFRSF17拮抗剂(例如，抗TNFRSF17抗体)、LGR5拮抗剂(例如，抗LGR5抗体)、单价CD20拮抗剂(例如，单价抗CD20抗体，如利妥昔单抗(rituximab))、PD-1抗体、PD-L1抗体、CD3抗体、CTLA-4抗体等。可以与本发明的CAR-T细胞有益地组合施用的其它药剂包含例如他莫昔芬(tamoxifen)、芳香化酶抑制剂和细胞因子抑制剂，包含小分子细胞因子抑制剂和与细胞因子(如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18)或其相应受体结合的抗体。

任选地通过本发明的方法产生的免疫细胞，如本发明的CAR-T细胞可以与检查点抑制剂组合使用。在另一实例中，AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂可以与检查点抑制剂一起施用。两种已知的抑制性检查点通路涉及通过细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)和程序性死亡1(PD-1)受体进行信号传导。这些蛋白质是共信号传导分子CD28-B7家族的成员，所述成员在T细胞功能的所有阶段都发挥着重要作用。PD-1受体(也称为CD279)在激活的T细胞的表面上表达。其配体PD-L1(B7-H1；CD274)和PD-L2(B7-DC；CD273)在APC的表面上表达，如树突状细胞或巨噬细胞。PD-L1是主导配体，而PD-L2的表达模式更加受限。当配体与PD-1结合时，抑制性信号会传递到T细胞中，这减少细胞因子产生并抑制T细胞增殖。检查点抑制剂包含但不限于阻断PD-1的抗体(纳武单抗(Nivolumab)(BMS-936558或MDX1106)、CT-011、MK-3475)、PD-L1(MDX-1105(BMS-936559)、MPDL3280A、MSB0010718C)、PD-L2(rHlgM12B7)、CTLA-4(易普利姆玛(Ipilimumab)(MDX-010)、曲美木单抗(Tremelimumab)(CP-675,206))、IDO、B7-H3(MGA271)、B7-H4、TIM3、LAG-3(BMS-986016)。

在一些实施例中，PD-L1抑制剂包括与PD-L1特异性结合的抗体，如BMS-936559(百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb))或MPDL3280A(罗氏公司(Roche))。在一些实施例中，PD1抑制剂包括与PD1特异性结合的抗体，如兰博利珠单抗(lambrolizumab)(默克公司(Merck))、纳武单抗(百时美施贵宝公司)

或MEDl4736(阿斯利康公司(AstraZeneca))。美国专利第8,008,449号中描述了针对PD-1的人单克隆抗体和单独使用抗PD-1抗体或与其它免疫治疗剂组合用于治疗癌症的方法，所述美国专利因这些抗体通过引用并入。在美国专利第8,552,154号中描述了抗PD-L1抗体以及其用途，所述美国专利关于这些抗体通过引用并入。在美国专利第8,617,546号中描述了包括抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体的抗癌剂，所述美国专利关于这些抗体通过引用并入。

本发明包含包括本文所描述的任何免疫细胞(如CAR-T细胞)与一种或多种化疗药物组合的组合物和治疗制剂。化学治疗剂的实例包含：烷化剂类，如塞替派和环磷酰胺(CytoxanTM)；磺酸烷基酯类，如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类，例如，苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺类和甲基三聚氰胺类，包含六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三乙烯磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙烯硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲基三聚氰胺(trimethylomelamine)；氮芥类，例如，苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlomaphazine)、胆磷酰胺(chlorophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；硝基脲类，例如，卡莫司汀、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类，例如，阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素、放线菌素C(cactinomycin)、加利车霉素、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D、柔红霉素、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，例如，甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)(5-FU)；叶酸类似物，例如，二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如，氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，例如，安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，例如，卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，例如，氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，例如，亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；贝他布昔(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elfomithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌；莫哌达醇(mopidamnol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSKTM；雷佐生(razoxane)；西索菲兰(sizofuran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；甲托辛(gacytosine)；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派；紫杉烷类，例如，紫杉醇(TaxolTM，新泽西州普林斯顿大学的百时美施贵宝肿瘤学(Bristol-Myers SquibbOncology,Princeton,N.J.))和多西紫杉醇(TaxotereTM；法国Aventis Antony)；苯丁酸氮芥(chloranmbucil)；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，例如，顺铂和卡铂(carboplatin)；长春碱；铂(platinum)；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；丝裂霉素C(mitomycin C)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱；长春瑞滨；诺维本(navelbine)；诺肖林(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸(retinoic acid)；埃斯波霉素；卡培他滨(capecitabine)；以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在此定义中还包含其起作用以调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，如抗雌激素类包含例如他莫昔芬、雷洛昔芬(raloxifene)、抑制芳香酶的4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、盐酸雷洛昔芬(keoxifene)、LY 117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(法乐通)和抗雄激素类如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。

可以按任何方便的方式(包含通过注射、输血或植入)来施用所公开的治疗剂中的任一种。本文所描述的组合物可以通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内向患者皮下、皮内、瘤内、结内、髓内、肌内施用。在一些实施例中，通过静脉内注射施用所公开的组合物。也可以将组合物直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位中。

如本领域普通技术人员将理解的，上述细胞将以治疗有效量施用于受试者。如本文所使用的，术语“有效量”或“治疗有效量”是指所施用的治疗剂的足够量，其将在某种程度上缓解或预防正在治疗的疾病或病状的症状中的一个或多个症状的恶化。结果可能是减少或预防疾病的迹象、症状或病因的进展，或生物系统的任何其它期望的改变。例如，用于治疗用途的“有效量”是在没有过度不良副作用的情况下提供临床上显著减少的疾病症状所需的治疗剂的量。

术语“治疗有效量”包含例如预防有效量。治疗剂的“有效量”是在没有过度副作用的情况下有效实现期望的药理学效果或治疗改进的量。应当理解，“有效量”或“治疗有效量”可以因受试者而不同，这是由于受试者的年龄、体重、总体状况、所治疗的病状、所治疗的病状的严重程度以及处方医师的判断中的任一种的化合物的代谢变化。

利用常规实验(包含但不限于剂量递增临床试验)确定这类治疗有效量被认为完全属于所属领域的技能范围内。可以使用如剂量递增研究等技术来确定在任何个体病例中的合适的“有效量”。

当组合中使用一种以上治疗剂时，每种治疗剂的“治疗有效量”可以指单独使用时具有治疗效果的治疗剂的量，或者可以指由于与一种或多种另外的治疗剂组合使用而具有治疗效果的减少量。

治疗方法

本发明的或使用本发明产生的免疫细胞，例如CAR-T细胞尤其可用于治疗、预防和/或改善疾病或病症。例如，本发明的CAR-T细胞可用于治疗癌症、感染或炎性疾病。作为另一实例，通过本发明的方法产生的树突状细胞可以用作树突状细胞疫苗(参见例如Datta等人,2014年)，以用于治疗例如癌症、感染(如细菌或病毒感染)或自身免疫性疾病(如糖尿病)等。作为另外的实例，NK细胞，如NK-CAR细胞可以用于治疗癌症(参见例如Liu等人,2021年)。

CAR-T细胞可以用于治疗在脑和脑膜、口咽、肺和支气管树、胃肠道、雄性和雌性生殖道、肌肉、骨、皮肤和附属结构、结缔组织、脾脏、免疫系统、血液形成细胞和骨髓、肝脏和泌尿道以及如眼等特殊感觉器官中产生的原发性和/或转移性肿瘤。在某些实施例中，本发明的CAR-T细胞用于治疗以下一种或多种癌症：肾细胞癌、胰腺癌、头颈癌、前列腺癌、恶性胶质瘤、骨肉瘤、结直肠癌、胃癌(例如，具有MET扩增的胃癌)、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、滑膜肉瘤、甲状腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、白血病或淋巴瘤。

在一实施例中，本发明的CAR-T细胞用于治疗白血病，例如急性髓系白血病、慢性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病或慢性淋巴细胞白血病。在一实施例中，白血病为低CD33+未成熟细胞占主导地位的急性髓系白血病。

在另一实施例中，本发明的CAR-T细胞用于治疗淋巴瘤，例如霍奇金氏淋巴瘤或非霍奇金氏淋巴瘤。非霍奇金氏淋巴瘤的类型包含弥漫大B细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、淋巴母细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤或外周T细胞淋巴瘤。在一实施例中，所述淋巴瘤是具有低水平的CD19和/或CD20的弥漫大B细胞淋巴瘤或非霍奇金氏淋巴瘤。

在本文所描述的治疗方法的上下文中，免疫细胞，如CAR-T细胞可以作为单一疗法(即，作为唯一的治疗剂)或与一种或多种另外的治疗剂(其实例在本文别处描述)组合(组合疗法)施用。

在一个实施例中，所述受试者有风险患上癌症(例如，癌症)。如果受试者患癌症的风险高于对照群体的风险，则所述受试者就有风险。对照群体可以包含从普通群体中随机选择的一名或多名未患过癌症或没有癌症家族史的受试者(例如，按年龄、性别、种族和/或民族进行匹配)。如果发现与癌症相关的“风险因素”与所述受试者相关，则受试者可以被认为有风险患上癌症。风险因素可以包含与给定病症相关的任何活动、特征、事件或属性，例如，通过对受试者群体进行统计或流行病学研究得出的结果。因此，即使确定潜在风险因素的研究没有具体包含受试者，受试者也可以被归类为有风险患癌症。

在一个实施例中，所述受试者有风险患上癌症，并且在癌症的症状发作之前或之后施用所述细胞或组合物。在一个实施例中，所述细胞或组合物在癌症的症状发作之前施用。在一个实施例中，所述细胞或组合物在癌症的症状发作之后施用。在一个实施例中，本发明的所述细胞或组合物以减轻或减少有风险的受试者的癌症的症状中的一种或多种症状的剂量施用。

在一实施例中，所述受试者已被诊断为患有或疑似患有疾病或病症，如癌症、感染或炎性疾病。在一实施例中，所述受试者已被诊断为患有或疑似患有结肠癌或乳腺癌。在一实施例中，本文所描述的方法包括将所述受试者诊断为患有或疑似患有疾病或病症，如癌症、感染或炎性疾病，优选地结肠癌或乳腺癌的步骤。

如本文所使用的诊断是指确定受试者或患者需要用本发明的CAR-T细胞和/或AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂进行治疗。根据本文所描述的方法诊断的疾病或病症的类型可以是本领域已知的或本文所描述的任何类型。

在一实施例中，鉴定或诊断需要用本发明的CAR-T细胞和/或AKT抑制剂和/或PH结构域蛋白抑制剂治疗的受试者的步骤包括确定受试者患有癌症，并且可以包含评估以下一种或多种或全部：

-血液概况分析；

-细胞活检抽吸；

-成像，如计算机断层扫描(CT)扫描、骨扫描、磁共振成像(MRI)、正电子发射断层扫描(PET)扫描、超声波和X射线；

-体格检查。

可以用NK细胞治疗的疾病的实例包含但不限于癌症(例如，黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌和肝癌)和感染，如病毒感染(例如，HSV、肝炎病毒、人巨细胞病毒、流感病毒、黄病毒和HIV-1感染)、细菌感染(例如，分枝杆菌(Mycobacteria)、李斯特菌(Listeria)和葡萄球菌(Staphylococcus)感染)和原生动物感染(例如，疟原虫感染)和真菌感染(例如，曲霉菌属(Aspergillus)感染)。

对于本技术人员是明显的，受试者的癌症的症状的“减轻”将与同样患有癌症但未接受用本文所描述的方法治疗的另一受试者相对比。这并不一定需要对两个受试者进行并排比较。而是可以依靠群体数据。例如，对未接受用本文所描述的方法治疗的癌症的受试者群体(任选地，与经治疗的受试者类似的受试者群体，例如，年龄、体重、种族)进行评估，并且将平均值与用本文所描述的方法治疗的受试者或受试者群体的结果进行比较。

在一个实施例中，本发明的CAR-T细胞和方法用于增加患有疾病或病症，如癌症、感染或炎性疾病的受试者的生存期。在设想生存期时，可以使用卡普兰-迈耶方法(Kaplan-Meier method)进行生存期分析(如图26C所示)。卡普兰-迈耶方法根据生命时间数据估计生存期函数，并且可以用于测量患者在治疗后存活一定时间的分数。生存期函数的卡普兰-迈耶方法的图是一系列幅度递减的水平步长，当采集足够大的样品时，这些步长接近所述群体的真正生存期函数。假设连续不同采样观测值(“点击”)之间的生存期函数值是恒定的。

卡普兰-迈耶曲线的重要优点是所述方法可以在观察到最终结果之前考虑样品中的“删截的”数据损失(例如，如果患者退出研究)。在图中，小的竖直勾号标记表示损失，其中患者的数据已被删截。当没有截断或删截发生时，卡普兰-迈耶曲线相当于经验分布。

在统计学中，对数秩测试(也称为Mantel-Cox测试)是比较两组患者的生存期分布的假设检验。这是一种非参数测试，并且适合在数据被右删截时使用。这广泛用于临床试验中，以在测量发生时建立新药物相较于对照组的功效。对数秩测试统计比较了两组在每个观察到的事件时间时的危险函数估计值。这是通过以下来构建的：在每个观察到的事件时间时计算其中一个组中观察到的和预期的事件数量，并且然后将这些数量相加，以获得存在事件的所有时间点的总体汇总。对数秩统计可以递送作为比较两组的Cox比例风险模型的评分测试。因此，所述对数秩统计渐近地等同于基于所述模型的似然比检验统计。

实例

实例1-材料和方法

小鼠CAR-T制备方案

使用CD3/CD28抗体激活小鼠脾细胞，并且在存在重组IL-2和IL-7的情况下培养24小时，然后用CAR-T载体转导。转导后立即添加TCN(曲西立滨)或TCN-P(曲西立滨磷酸)，并且然后将CAR-T细胞暴露于TCN/TCN-P，持续24小时、48小时或72小时。

人PBMC是从血沉棕黄包装中提取的(澳大利亚红十字会血液服务(AustralianRed Cross Blood Service))。在转导48小时之前，使用抗CD3抗体(OKT3)激活2天，所有过程都在存在IL-2的情况下下进行。将TCN或TCN-P立即添加到这些在IL-2中培养至多3天的CAR-T细胞中。

肿瘤杀伤测定

将100,000个E0771-Her2肿瘤细胞接种到96孔板的每个孔中，并将其维持处于37℃、5％的CO2的环境中。两小时后，将鼠类CAR-T细胞以2:1、1:1和0.5:1的效应细胞:靶T细胞的比率接种到相同的孔中，并且温育至多16小时。收集培养上清液，并且测量干扰素γ(IFNγ)和肿瘤坏死因子α(TNFα)的水平。

流式细胞术表型

在制备完成后，使用针对CD4、CD8、CD44和CD62L的荧光标记抗体对细胞进行染色，以对鼠类CAR-T细胞进行表型。使用针对CD4、CD8、CD45RA、CD45RO、CD44、CD62L、CCR7、CD27、PD-1和CD69的荧光染料缀合的抗体对人CAR-T细胞进行表型。使用可固定的活/死染料来区分活细胞或死细胞。

质谱法

在用TCN或TCN-P治疗24天或3天之后，收集人CAR-T细胞。在每个时间点，收集细胞并用冷DPBS洗涤三次，然后进行细胞裂解以进行全局蛋白质组学分析。具体地，对于磷酸化蛋白质组学分析，人CAR-T细胞要么未经处理，要么用TCN或TCN-P处理0分钟、5分钟和15分钟，然后用DPBS洗涤，然后裂解细胞。

细胞蛋白质组和磷酸蛋白质组的质谱法

在用LysC(酶:底物：1:100，和光纯药工业株式会社(Wako Pure ChemicalIndustries)胰蛋白酶(酶:底物：1:50)进行基于Sera-Mag Speed Bead的蛋白质消化之前，通过尖端探针超声对含蛋白酶和磷酸酶抑制剂(HALT)的细胞进行均质/溶解、定量、归一化、还原(二硫苏糖醇，DTT)和烷基化(碘乙酰胺)。对归一化肽混合物进行串联质量标签(TMT)复用(9-plex TMT，参考131C异序标签)。肽脱盐(SDB-RPS阶段-尖端)，并且对全球细胞蛋白质组进行分析。对于磷酸蛋白质组分析，使用高选择性二氧化钛(TiO2)珠捕获从每组TMT中富集磷酸肽。

在与Easy-nLC 1200(赛默飞世尔科技公司)超高压液相色谱(UHPLC)泵偶联的Orbitrap Q-Exactive HF-X质谱仪上的数据依赖性采集中获得光谱。用5-100％梯度的缓冲液B(80％ ACN，0.1％ FA)以300纳升/分钟的流速在55℃下直接输注240分钟分离肽(1.9μm粒径C18，0.075x 250mm，Nikkyo技术有限责任公司(Nikkyo Technos Co.Ltd))。扫描序列包含MS1光谱(分辨率是60,000；质量范围是300-1650m/z；自动增益控制(AGC)目标值是3e6，最大注射时间是128毫秒，隔离窗口是0.8Th)。选择最强烈的MS1离子进行MS2分析，通过高能碰撞解离碎裂，其中归一化碰撞能量为33。前体根据电荷态≥2过滤，对于MS/MS，AGC设置为1e5，其中使用单同位素峰。

数据处理和生物信息学流水线

质谱使用MaxQuant(1.6.14)进行预处理和处理。使用Andromeda，针对UniProt(序列数据库Jan-2021)中注释的完整组的人类蛋白质序列搜索光谱。通过固定修饰、半胱氨酸氨基甲酰胺基甲基化和可变修饰、N-乙酰化和蛋氨酸氧化(以及磷酸化(STY))搜索数据。在进行总蛋白/磷蛋白水平分析时，使用20ppm的前体离子容差进行搜索，并且使用内部参考标记通道对批次效应进行归一化。另外的修饰包含设置为静态修饰的肽N末端上的TMT标签/赖氨酸残基(+229.16293Da)。应用严格的1％错误发现率来过滤肽和蛋白质水平的不良鉴定。所得p值通过本杰明尼-霍奇伯格多重测试调整方法(Benjamini-Hochberg multi-test adjustment method)进行调整，以获得大量比较。

对于另外的数据分析，将归一化强度转换为每个样品组中测量的每种蛋白质的强度与中值强度的log2比率，其中使用斯图登氏t测试(Student's T-test)或ANOVA进行统计分析(p值<0.05被认为是显著的)。使用Microsoft Office Excel、R(ggPlot2)和Perseus(慕尼黑蛋白质组学和信号转导系的马克斯-普朗克生物化学研究所(Max-PlanckInstitute of Biochemistry,Department of Proteomics and Signal Transduction,Munich))软件进行数据分析。基因富集功能注释聚类分析使用Gprofiler/Reactome生物信息学进行。所有数据都相对于内部参考TMT通道归一化，并且在时间0时进行相对于DMSO和非治疗对照(蛋白质组分析)和DMSO对照的比较(磷酸化蛋白质组分析)。从SMART在线软件工具(http://smart.embl-heidelberg.de/)检索含有PH的域。

实例2-结果

在转导过程中或之后添加50μM TCN或TCN-P，会导致至少80％的CAR-T细胞死亡(图1)。然而，低浓度的TCN或TCN-P(至多10μM，低于50μM)维持高水平的活CAR-T细胞(约60％)，甚至至多3天的治疗。用TCN预处理的鼠类CAR-T的增殖率较低(图2)，同时保留中枢记忆表型(CD44

在测量鼠类CAR-T细胞的激活标志物时，发明人观察到TCN预处理增加了经典早期激活标志物PD-1和CD69的表达(图5A-B)。在TCN预处理后，肿瘤抗原定向细胞毒性虽然减弱，但仍得以保留(图6A)。相比之下，鼠类CD8+CAR-T细胞的存活率在TCN预处理后略有提高(图6B)。

基于鼠类CAR-T细胞中的这些结果，相同的方案用于从人PBMC产生CAR-T细胞。处理来自三个供体的血沉棕黄层以分离PBMC，其中5000万PBMC在存在含有抗CD3抗体(OKT3，1.5μg/mL)和重组IL-2(600U/mL)的培养基的情况下培养2天。然后，用Her2靶向CAR构建体对激活的T细胞进行2天的逆转录病毒转导方案，之后在存在600U/mL重组IL-2的情况下用5μM TCN或媒剂(DMSO)处理。24小时或72小时后收集样品。此处，观察到TCN处理不会影响CD4+或CD8+T细胞的转导效率(图7)。

令人关注地，TCN处理在所有3个供体中一致地增加中枢记忆T(T

考虑到调节性T(T

多种含PH结构域的蛋白质以及不含PH结构域的蛋白质出现显著的去磷酸化，其中TCN或TCN-P可能在所述蛋白质的上游发挥作用。丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶PRP4同源物、血影蛋白β链、非红细胞1通过抑制TGFβ信号传导对调节性T细胞功能很重要。数据显示，施用TCN后，下列蛋白质被显著抑制：氧甾醇结合蛋白1、氧甾醇结合蛋白2、血影蛋白β链、非红细胞1和Rho GTP酶激活蛋白27。

结论

用TCN或TCN-P预处理使T细胞表型富集已被证明在体内持续存在，并且与CAR-T疗法后的临床应答相对应。考虑到先前关于当T细胞用作AKT抑制剂时的毒性的报道(参见例如Mousset等人,2018年)，当前研究的发现令人惊讶。经转导的T细胞对极低浓度的TCN和TCN-P耐受性良好，并且能有效富集具有T

总之，发现表明，TCN或TCN-P预处理是一种用于通过使已知在体内持续存在并与部分或完全临床应答相关的T细胞表型富集来增强CAR-T疗法的功效的有效方法。TCN和TCN-P预处理似乎主要影响CD8+CAR-T细胞，对CD4+CAR-T细胞几乎没有影响或没有影响。

数据进一步表明，抑制剂可以用于增加树突状细胞的数量和NK细胞的细胞毒活性。

实例3-用于在体内测试TCN和TCN-P作为预处理或作为新佐剂的功效的材料和方

发明人接下来寻求确定AKT抑制剂对在治疗相关的癌症模型中增强体内T

细胞系和小鼠

采用小鼠结肠腺癌MC-38-hHer2和乳腺癌E0771-hHer2癌细胞系进行体外实验和体内实验。用于产生逆转录病毒载体的GP+e86细胞系从ATCC(美国弗吉尼亚州)获得。所有肿瘤和包装细胞系在RPMI培养基中在5％ CO

将C57BL/6J野生型(WT)和人Her2(hHer2)转基因小鼠系饲养并保存在彼得麦卡勒姆癌症中心(澳大利亚维多利亚)中。将介于6周龄与16周龄之间的小鼠进行性别匹配，并且随机分为不同的治疗组。所有动物实验均经动物实验伦理委员会(方案E678)的批准。

小鼠CAR-T细胞的逆转录病毒转导

在存在IL-2和200pg mL-1Il-7的情况下，用1μg mL

人Her2+同基因小鼠肿瘤模型

将2.5x 10

腹膜内注射PTX-200

稀释于DPBS的PTX-200通过腹膜内注射以每只小鼠5、25或50mg/Kg每3-4天施用。

小鼠肿瘤部位、引流淋巴结、脾和血液免疫子集分析

在治疗后8-9天，通过颌下取血将小鼠的血液直接收集到含有EDTA的管中。在实验终点，在安乐死后立即收集包含肿瘤、引流淋巴结(dLN)和脾等各种器官。来自dLN和脾的单细胞悬浮液是通过70μm过滤器处理这些器官而获得的。对于脾细胞，用ACK裂解缓冲液使红细胞裂解。将实体瘤手动切片，并且在以120r.p.m的摇动温育中在37℃下用含有1mg mL

体外慢性肿瘤再刺激

在存在IL-7(200pg mL

活癌细胞随时间变化的分析

在384孔板中，将未经处理或PTX-200预处理的CAR-T细胞与MC-38或E0771-hHer2以指示的效应子:靶标比率进行共培养。将胱天蛋白酶3/7染料分配到细胞悬浮液中。使用Incucyte SX5每4小时拍摄一次图像。使用IncuCyte Zoom软件对细胞计数和相关的胱天蛋白酶3/7活性进行定量。

流式细胞仪

在室温下用Fc受体阻断剂(用FACS缓冲液以1:50稀释的杂交瘤上清液的克隆2.4G2)阻断细胞15分钟。将细胞用FACS缓冲液洗涤，并且然后在冰上用荧光染料缀合的抗体染色30分钟。将染色细胞用FACS缓冲液洗涤两次，然后重悬浮于含有20000个计数珠的FACS缓冲液中。对于细胞内或核内染色，染色细胞分别按照生产商的说明使用BD生物科学公司或eBioscience试剂盒进行固定和渗透。将固定和渗透的细胞在室温下用荧光染料缀合的抗体染色30分钟，然后用perm/wash缓冲液洗涤两次，并且最后重悬于含有计数珠的FACS缓冲液。在BD FACSymphony(BD生物科学公司)上获取染色样品。靶标T细胞群体的数量的计算方法是：样品中的输入珠粒的数量/珠粒事件x靶向群体的事件。

统计分析

使用Flowjo vs.10进行FACS分析。图和统计分析使用第9版GraphPad PRISM软件生成。数据表示为平均值±s.e.m.，并使用单向/双向方差分析(ANOVA)进行统计分析，同时使用对数秩(双尾Mantel-Cox)测试确定生存期分析中的统计显著性。

实例4-TCN和TCN-P作为体内预处理的功效结果

发明人首先寻求确定AKT抑制剂当用作制备试剂时以使内源性或过继性转移CAR-T中的CAR-T

免疫活性同基因hHer2小鼠的肿瘤模型的代表性实例如图19A所示。在施用CAR-T细胞之前，采用流式细胞术确定CD4:CD8 T细胞的比率，观察到在CAR-T制备期间，这一比率因TCN-P调理而没有改变(图19B，上图和图19C)。然而，TCN-P预调理使中枢记忆CD8+CAR-T细胞显著富集(图19B，下图)。TCN-P预调理对CAR-T细胞的影响转化为改善体内肿瘤控制。当不受控制时，E0771乳腺癌肿瘤模型在第14天达到实验终点(即肿瘤>120mm

使用相同的同基因hHer2乳腺癌模型，单独队列的动物在治疗后8天评估肿瘤生长情况(图20A)。循环T细胞的分析表明，预调理CAR-T细胞导致体内CD4:CD8比率的偏斜，使得CD4+CAR-T细胞在接受TCN-P预调理CAR-T细胞的动物中比接受未经处理的CAR-T细胞的动物更普遍(图20B，上图)。还注意到预调理导致体内CD8+CAR-T细胞减少(图20B，中间图)。这些观察结果与中枢记忆T细胞几乎翻倍一致(图20B，下图)。

流式细胞术分析进一步揭示CAR-T细胞预调理对肿瘤内的CD4+或CD8+组成没有显著的影响(图20C)，但似乎增加了脾-次级淋巴器官内的CD4+细胞(图20D)。令人关注地，预调理的CAR-T细胞对肿瘤杀伤效率的提高与细胞因子、TNF-α或IFN-γ的产生的任何显著变化不一致(图20E)。

各组之间的宿主CD4+和CD8+T细胞的循环数量差异并不显著(图21A-B)。各组之间的CD8+CAR-T细胞数量也类似，但在接受预调理的CAR-T细胞的动物中，循环CD4+CAR-T细胞平均增加了3倍(图21D，p＝0.0009)。对循环CAR-T细胞的表型分析表明，在制备步骤期间的预调理使CAR-T细胞在体内保留了中枢记忆表型。在预调理组中，具有中枢记忆表型的CD8+CAR-T细胞的百分比几乎翻倍(图21E，p<0.0001)。在预调理组中，具有中枢记忆表型的CD4+CAR-T细胞的百分比高出约20％(图21F，p<0.0001)。这些发现与具有效应记忆表型的CD8+和CD4+CAR T细胞的减半相一致(图21G-H，p<0.001和p＝0.0029)。

在分析肿瘤和脾的免疫细胞时，发现预调理对具有中枢记忆表型的CD8+或CD4+CAR-T细胞没有显著影响(图22A和C)。虽然在肿瘤中CD8+CAR-T细胞上的早期衰竭标志物的表达中没有观察到显著差异(图22B)，但当其被募集到脾时，预调理似乎能保护CD8+CAR-T细胞免于衰竭(图22D)。

然后，发明人寻求确定用TCN-P预处理的CAR-T细胞与PD-1检查点阻断剂组合的效果，以确定此治疗是否能提高实体瘤的抗肿瘤功效。如图23A-B所示，当用TCN-P预处理的CAR-T细胞与PD-1检查点阻断剂组合时，可以观察到肿瘤面积的协同减少。

实例5-TCN和TCN-P作为新佐剂在体内的功效结果

在第二种方法中，测试了AKT抑制剂当用作佐剂时以使内源性或过继性转移CAR-T中的CAR-T

如图25所示，当Her2+转基因小鼠接种有2.5

最后，还使用MC-38hHer2结肠癌模型评估了TCN-P作为CAR-T疗法的佐剂的效用，其中在CAR-T施用后每3天向小鼠施用媒剂、未经处理的CAR-T细胞、CAR-T细胞与25mg/kgTCN-P辅助剂的组合，或者施用预处理的CAR-T细胞与TCN-P佐剂的组合(图27A)。对第14天之前的肿瘤大小进行评估。此处，发明人观察到，将TCN-P施用作为佐剂使用显著改善Her2靶向CAR-T细胞对肿瘤的控制(图27B，

这项研究的发现表明，TCN-P预调理可以通过使已知在体内持续存在并与部分或完全临床应答相关的T细胞表型富集来提高常规CAR-T疗法的功效。考虑到在肿瘤学适应症中使用TCN-P的临床安全性数据，TCN-P和类似化合物可以与CAR-T疗法结合使用，以提高中枢记忆CAR-T细胞的体内持久性，并且这样做提高临床耐久性和应答性。

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参考文献

Berg等人,(1998),《移植程序(Transplant Proc.)》30:3975-3977。

Datta等人,(2014),《耶鲁生物学与医学杂志(Yale J Biol Med)》,87:491-518.。

Garland等人,(1999),《免疫学方法杂志(J.Immunol Meth.)》,227:53-63。

Ghosh等人,(1991),糖生物学(Glycobiology),5:505-510。

Haanen等人,(1999),《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》190:1319-1328。

Lui等人,(2021),《血液学肿瘤学杂志(J Hemat Oncol)》,14:7。

McLellan和Ali Hosseini Rad,(2019),《免疫学与细胞生物学(Immunol CellBiol)》,97:664-674。

Mousset等人,(2018),《肿瘤免疫学(Oncoimmunology)》,7:e1488565。

Rosenberg等人,(1988),《新英格兰医学杂志(New Eng.J.of Med.)》,319:1676。

Sabado等人,(2017),《细胞研究(Cell Res)》,27:74-95。

Smith等人,(2015),《临床和翻译免疫学(Clinical&TranslationalImmunology)》,(2015)4:e31。