一种从乙肝病毒肽库中快速确定阳性反应单肽的方法及其应用

技术领域

本发明涉及生化检测领域，具体涉及一种从乙肝病毒肽库中快速确定阳性反应单肽的方法及其应用。

背景技术

乙肝病毒(HBV)感染可导致严重肝病，包括急性和慢性乙型肝炎、肝硬化、肝癌。据统计，近年来，世界范围内，肝癌的发病率增加了75％，其中42％为HBV继发的相关肝细胞癌(HCC)，病毒性肝炎已成为全球发病率和死亡率的第七大诱因，每年共计造成全球145万人死亡，其死亡率远超艾滋病毒、疟疾和结核病。因此，消除慢性HBV感染者可以有效提高人类的生存情况。

现有技术中尚难以对慢性HBV感染者体内的关键表位肽做有效的筛选及处理，主要原因在于：

1.HBV感染在95％以上具有免疫能力的成年人中是自限性的，虽然可以在急性肝炎患者样品中检测到强烈的HBV特异性T细胞反应，但对于慢性感染患者而言，由于T细胞耗尽，很少有慢性感染患者能自发清除HBV。

2.T细胞可针对病原体不同表位形成表位特异性免疫应答，不同表位诱导的免疫应答的抗病毒效应存在差异。T细胞识别抗原具有HLA限制性，因此，其只能识别抗原提呈细胞提呈的线性表位。而HBV感染人体后，可在体内产生表面抗原(S，surface)、核心抗原(C，core)、DNA聚合酶蛋白(P)和X抗原(X，HBx)等蛋白抗原，这些抗原存在数以千计的表位，由于人类HLA多样性，这些表位在不同患者中诱导的T细胞特异性免疫应答也存在区别，极大程度的加剧了确定与预后相关的关键表位肽的工作难度。

3.同时，HBV慢性感染者HBV特异性T细胞稀缺，从患者体内采集的标本量往往无法满足表位筛选的工作。

因此，亟需一种合适的检测HBV特异性T细胞表位的方法，以彻底剖析HBV慢性感染者体内HBV特异性T细胞的特点，为HBV相关预防与治疗提供相应的技术支持。

发明内容

本发明的目的在于提供一种病毒阳性反应单肽多重筛选肽库的构建方法；

本发明的另一目的在于提供上述构建方法构建得到的病毒阳性反应单肽多重筛选肽库；

本发明的另一目的在于提供基于上述病毒阳性反应单肽多重筛选肽库的HBV阳性反应单肽筛选方法

本发明的另一目的在于提供病毒阳性反应单肽筛选试剂盒；

本发明的另一目的在于提供上述病毒阳性反应单肽筛选试剂盒或上述HBV阳性反应单肽筛选方法在病毒阳性反应单肽筛选中的应用；

本发明的另一目的在于提供上述病毒阳性反应单肽筛选试剂盒在制备病毒检测制剂中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供：

一种病毒阳性反应单肽多重筛选肽库的构建方法，该病毒阳性反应单肽多重筛选肽库包括T细胞阳性一维(dimension，1D)肽库和T细胞阳性二维(dimension，2D)肽库，包括以下步骤：

分别将病毒的结构蛋白中的单肽合成为对应结构蛋白的重叠多肽，构建T细胞阳性一维肽库；

分别将病毒的结构蛋白中的单肽以XY阵列的方式进行组合，构建T细胞阳性二维肽库。

进一步地，上述结构蛋白包括S蛋白、C蛋白、P蛋白和X蛋白。

进一步地，上述结构蛋白的重叠多肽可采用本领域的常规方法进行合成，也可以通过生物公司或商用设计程序进行编辑得到。

进一步地，上述结构蛋白的重叠多肽的数目不限定于1条，本领域技术人员可以根据实际使用需求，将全部或部分重叠多肽进行拆分。

进一步地，上述步骤(2)中，XY阵列可采用XY行列表的形式进行，其中，X与Y的大小应当尽量接近，X+Y为最小值。

更进一步地，上述X与Y的大小相等。

进一步地，上述病毒包括HBV。

进一步地，上述T细胞阳性1D肽库中，每条重叠多肽中上述结构蛋白的单肽的长度为15个氨基酸，每条重叠多肽中上述结构蛋白的单肽与单肽之间重叠11个氨基酸。

进一步地，上述T细胞阳性2D肽库中，每两个T细胞阳性2D肽库中存在1个相同的上述病毒的对应的结构蛋白中的单肽。

在本发明实施例中，每两个T细胞阳性2D肽库中存在相同的病毒的S蛋白、C蛋白、P蛋白和X蛋白中的单肽简化了检测步骤，使整个检测步骤无需复杂仪器，仅依靠人工即可完成，而且结果更加直观，判断标准容易理解，易于技术的推广。

本发明的第二个方面，提供：

上述构建方法构建得到的病毒阳性反应单肽多重筛选肽库。

本发明中的病毒阳性反应单肽多重筛选肽库，以较少的样本和实验工作量预测患者的阳性反应单肽，再根据预测结果进行验证。该病毒阳性反应单肽多重筛选肽库可提高预测工作的效率，节约预测成本。

进一步地，上述病毒包括HBV。

本发明的第三个方面，提供：

基于上述病毒阳性反应单肽多重筛选肽库的HBV阳性反应单肽筛选方法，包括以下步骤：

(1)使用上述病毒阳性反应单肽多重筛选肽库中的T细胞阳性1D肽库检测待测样品，确定HBV阳性反应单肽所在的蛋白；

(2)根据步骤(1)中阳性反应单肽所在的蛋白，使用上述病毒阳性反应单肽多重筛选肽库中的对应蛋白的T细胞阳性2D肽库检测待测样品，确定HBV阳性反应单肽。

进一步地，上述步骤(2)中HBV阳性反应单肽确定标准为：

筛选出所有出现阳性反应的T细胞阳性2D肽库，每两个出现阳性反应的T细胞阳性2D肽库中的相同的单肽即为HBV阳性反应单肽。

在本发明实施例中，每两个T细胞阳性2D肽库中存在相同的上述病毒的S蛋白、C蛋白、P蛋白和X蛋白中的单肽简化了检测步骤，使整个检测步骤无需复杂仪器，仅依靠人工即可完成，而且结果更加直观，判断标准容易理解，易于技术的推广。

本发明中的HBV阳性反应单肽筛选方法可以脱离计算机软件进行表位预测，而且不限定于特定HLA分型，无需借助动物试验，而且，相比于普通的肽库筛选，本发明中的矩阵化设计也降低了筛选的工作量。

本发明的第四个方面，提供：

病毒阳性反应单肽筛选试剂盒，该试剂盒含有上述病毒阳性反应单肽多重筛选肽库。

本发明中的病毒阳性反应单肽筛选试剂盒含有上述病毒阳性反应单肽多重筛选肽库，能以较少的样本和实验工作量预测患者的阳性反应单肽，再根据预测结果进行验证。该病毒阳性反应单肽筛选试剂盒可提高预测工作的效率，节约预测成本。

本发明的第五个方面，提供：

上述病毒阳性反应单肽筛选试剂盒或上述HBV阳性反应单肽筛选方法在病毒阳性反应单肽筛选中的应用。

本发明的第六个方面，提供：

上述病毒阳性反应单肽筛选试剂盒在制备病毒检测制剂中的应用。

本发明的有益效果是：

本发明中的病毒阳性反应单肽多重筛选肽库，以较少的样本和实验工作量预测患者的阳性反应单肽，再根据预测结果进行验证，筛选效果好，试验操作难度低，能有效提高预测工作的效率，节约预测成本。

附图说明

图1为本发明实施例中筛选出来的1D肽库阳性反应结果(图1A)和对应的2D肽库矩阵验证结果(图1B)，其中，虚线框表示结果为阳性；

图2为本发明实施例中筛选出来的三维(dimension，3D)单肽的ELISPOT验证结果及其对应的布板示意图，其中，虚线框表示结果为阳性；

图3为本发明实施例中筛选出来的三维(dimension，3D)单肽的流式细胞术验证结果(传统的胞内因子染色)。

具体实施方式

为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。

所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。

病毒阳性反应单肽多重筛选肽库的构建

该病毒阳性反应单肽多重筛选肽库包括T细胞阳性1D肽库和T细胞阳性2D肽库。

(1)构建T细胞阳性1D肽库：

根据GenBank公布的HBV氨基酸序列(MN908947)，以不同的结构蛋白进行分组(S蛋白、C蛋白、P蛋白和X蛋白)，分别合成S蛋白、C蛋白、P蛋白和X蛋白重叠多肽。每条重叠多肽中上述S蛋白、C蛋白、P蛋白或X蛋白的单肽的长度均为15个氨基酸，每条重叠多肽中上述S蛋白、C蛋白、P蛋白或X蛋白的单肽与单肽之间均重叠11个氨基酸。

本实例中，每条重叠多肽均使用PeptGen Peptide Generator(https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/PEPTGEN/peptgen.html)进行设计然后根据设计结果进行合成。其中，由于来源于P蛋白的单肽数量过多，因此拆分称两个肽库(P1、P2)。最终设计得到的1D(dimension)肽库编号对应于其来源蛋白，即为S、C、P1、P2、X。

(2)构建T细胞阳性2D肽库：

2D肽库应当包含构成上述1D肽库的所有单肽。

将构成1D肽库的所有单肽放进XY矩阵的行列表中，X与Y应当尽量接近，甚至相等(X+Y最小值)，即得T细胞阳性2D肽库。

为能更清晰的说明本发明中的2D肽库中的矩阵排列，以下将选择部分实例进行演示说明。

如表1所示，在一样品中，HBV surface蛋白(S)由98条肽(s01至s98)构成，则将这98条肽以编号顺序放进10×10的行列表中，再由每一行、每一列的单肽构成2D肽库，共20个2D肽库。在该样品中，HBV core蛋白(C)由51条单肽(c01至c51)构成，则将这51条肽以编号顺序放进6×9或7×8的行列表中，构成15个2D肽库。设计得到的2D肽库的特点是两两2D肽库之间存在重复的单肽。如表1所示，S01肽库包含s01至s10的10条单肽，S11肽库包含s01、s11、s21、s31、s41、s51、s61、s71、s81、s91共10条单肽，S01肽库和S11肽库都包含s01单肽。

表1 2D肽库XY矩阵

T细胞阳性2D肽库中，每两个T细胞阳性2D肽库中至少存在1个相同的所述病毒的S蛋白、C蛋白、P蛋白和X蛋白中的单肽的好处是：在确定了患者阳性反应的1D肽库后，只需要检测患者对该1D肽库对应的2D肽库的反应(假设患者对S肽库有阳性反应，则需要检测患者对20个2D肽库的反应)，即可推测出患者的阳性反应单肽(如患者对S01和S11肽库存在阳性反应，则患者的阳性反应单肽为s01)。

病毒阳性反应单肽多重筛选肽库的使用方法

(1)构建1D肽库特异性T细胞

用含20％人AB血清的RPMI 1640培养基将2.5million(M)PBMC(外周血单个核细胞)重悬至2.5×10

孵育结束后，将细胞各转入48孔板，并补加800μL含有IL-2(10ng/mL)的培养基，继续于孵箱孵育。孵育第7天时，观察板底细胞密集程度，当细胞覆盖板底2/3面积以上时，吹匀细胞并平均分为2孔，各补加500μL含有IL-2(10ng/mL)的培养基，继续孵育。孵育第10天，收集细胞于流式管中，500g离心5min，弃上清，打散细胞，加入4mL培养基洗涤，然后再次500g离心5min，重复6次。于最后1次时，弃上清，打散细胞，用4mL含10％FBS的RPMI 1640培养基重悬后转移到6孔板静息过夜。收集静息后的细胞于流式管内，加入4mL培养基洗涤2次，用1mL20％FBS的RPMI 1640培养基溶液重悬后计数，根据细胞数补加/减少R20溶液，并将细胞悬液重悬为4M/mL。

(2)1D肽库筛选

从待测样品中分析单个核细胞，加入上述实施例中的T细胞阳性1D肽库，进行特异性扩增，在培养的第1天加入IL7，在第3天和第7天加入IL2。在培养的第10天加入50μL/孔IFN-γ捕获抗体(一抗，以1：100的比例用PBS稀释)于96孔ELISPOT PVDF板(MSIPS4W10)中于4℃包被过夜。培养的第11天用PBS 200μL/孔洗涤包被过的96孔板，洗涤6次，然后以200μL/孔加入R10(含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基)溶液，室温封闭1h后，甩去封闭液。各孔各加入50μL1D肽库溶液(S蛋白、C蛋白、P蛋白(P1和P2)和X蛋白，工作浓度为2μg/mL)和50μL重悬细胞液(0.02M/孔)。以含血清培养基的细胞的孔作为阴性对照，以加入PHA(植物血凝素，10μg/mL)的细胞的孔作为阳性对照孔。其中，阳性孔，对照孔和实验孔均做复孔。

将PVDF板置于37℃孵育18小时，用PBS洗涤6次，去除液体后各加入50μL/孔稀释的生物素化小鼠抗人IFN-γ单克隆抗体(二抗，1:1000，用0.5％BSA稀释)，室温孵育3小时。甩去孔中的二抗，用PBS洗涤6次，去除液体后各加入50μL稀释的山羊碱性磷酸酶抗生物素抗体(三抗，1:1000用PBS稀释)，室温孵育1小时。甩去孔中的三抗，用PBS洗涤6次，去除液体后各加入100μL碱性磷酸酶缀合底物溶液，室温避光显色15-20分钟后，用水终止显色反应。去除孔中的液体，避光将板风干。

用ImmunoSpot分析仪计数斑点，将分泌IFN-γ的细胞斑点表示为斑点形成细胞(SFC)。若实验孔SFC计数高于阴性孔2倍，则视为阳性。筛选出1D阳性肽库，以用于进行2D肽库的筛选。

(3)2D肽库筛选

将1D肽库扩增得到的细胞用2D肽库刺激后，ELISPOT检测INF-γ水平。

具体步骤如下：

从待测样品中分析单个核细胞，加入上述实施例中的T细胞阳性1D肽库，进行特异性扩增，在培养的第1天加入IL7，在第3天和第7天加入IL2。在培养的第10天加入50μL/孔IFN-γ捕获抗体(一抗，以1：100的比例用PBS稀释)于96孔ELISPOT PVDF板(MSIPS4W10)中于4℃包被过夜。培养的第11天用PBS 200μL/孔洗涤包被过的96孔板，洗涤6次，然后以200μL/孔加入R10(含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基)溶液，室温封闭1h后，甩去封闭液。各孔各加入50μL步骤(2)筛选出来的1D阳性肽库对应的2D肽库和50μL重悬细胞液(步骤(1)扩增好的HBV特异性T细胞，0.02M/孔).以含血清培养基的细胞的孔作为阴性对照，以加入PHA(植物血凝素，10μg/mL)的细胞的孔作为阳性对照孔。其中，阳性孔，对照孔和实验孔均做复孔。

将PVDF板置于37℃孵育18小时，用PBS洗涤6次，去除液体后各加入50μL/孔稀释的生物素化小鼠抗人IFN-γ单克隆抗体(二抗，1:1000，用0.5％BSA稀释)，室温孵育3小时。甩去孔中的二抗，用PBS洗涤6次，去除液体后各加入50μL稀释的山羊碱性磷酸酶抗生物素抗体(三抗，1:1000用PBS稀释)，室温孵育1小时。甩去孔中的三抗，用PBS洗涤6次，去除液体后各加入100μL碱性磷酸酶缀合底物溶液，室温避光显色15-20分钟后，用水终止显色反应。去除孔中的液体，避光将板风干。

用ImmunoSpot分析仪计数斑点，将分泌IFN-γ的细胞斑点表示为斑点形成细胞(SFC)。若实验孔SFC计数高于阴性孔2倍，则视为阳性。筛选出2D阳性肽库，以用于确定阳性反应单肽(3D单肽)。

(4)筛选的阳性反应单肽(3D单肽)验证

可以采用ELISPOT或流式细胞术验证本发明方法筛选得到的3D单肽准确性。

当然，也可以采用其他本领域常规技术验证。

ELISPOT验证：

将1D肽库扩增得到的细胞用上述实施例中筛选得到的阳性反应单肽(3D单肽)刺激后，ELISPOT检测INF-γ水平。

具体步骤如下：

细胞培养方法如上述步骤(2)所示，其中，在包板和封闭结束后，各孔各加入筛选得到的3D单肽50μL溶液和50μL上述步骤(1)中得到的重悬细胞液(0.02M/孔)，设置阴性对照和阳性对照孔。将PVDF板置于37℃孵育18小时后，加入二抗、三抗、显色液，读板，若结果为阳性，则说明筛选得到的3D单肽为HBV阳性反应单肽。

流式细胞术验证：

将1D肽库扩增得到的细胞用本发明实施例中筛选得到的阳性反应单肽(3D单肽)刺激后，流式细胞术检测INF-γ水平。

具体步骤如下：

在待检细胞(0.5M/管)加入本发明实施例中筛选得到的3D单肽(工作浓度2μg/mL)和布雷菲德菌素A(Brefeldin A)，刺激6h，所得细胞用于胞内因子染色，检测T细胞亚群和胞内IFN-γ水平。

实际筛选效果验证

随机选取一名HBV感染患者，抽取外周血并提取PBMC作为检测对象，采用上述病毒阳性反应单肽多重筛选肽库的使用方法进行检测。其中，每组两个重复实验孔以确保实验的准确性。

通过ELISPOT检测发现，该患者对C、P1、P2肽库(1D肽库)有阳性反应(图1A)，说明患者外周血中存在对构成C、P1、P2肽库的一条或多条单肽具有特异性免疫应答的T细胞。

根据试验结果，用3组1D肽库对应的2D肽库矩阵(表2)刺激对应的培养细胞，ELISPOT检测细胞在2D肽库刺激下分泌IFN-γ的能力。

结果表明，患者对C肽库(1D)对应的C02、C05、C12肽库(2D)有阳性反应，对P1肽库(1D)对应的P05、P17肽库(2D)有阳性反应，未检测到患者对P2肽库(1D)对应的2D肽库的阳性反应(图1B)。

表2筛选出来的3D单肽验证结果

其中，加粗并标有下划线的结果为阳性结果。

Neg表示阴性对照。

因此，根据2D肽库矩阵(表1)匹配出的相应的3D单肽，可以得到该患者的HBV阳性反应单肽为c15、c42、p46(3D，即单肽)(如表3所示)。

表3 2D肽库矩阵中匹配出的相应的3D单肽

其中，加粗并标有下划线的结果表示3D单肽所在的XY阵列(阳性的2D肽库)，仅加粗表示筛选出的3D单肽。

然后用3D单肽c15、c42、p46刺激对应的培养细胞，发现患者对c15、p46单肽存在阳性反应(图2)。同时，为确保数据有效性，采用流式细胞术进行重复检测，用C肽库(1D肽库)和P1肽库(1D肽库)刺激扩增所得到的HBV特异性T细胞系，分别加入c15或p46单肽(工作浓度2μg/mL)和布雷菲德菌素A，刺激6h，胞内因子染色检测CD3

结果显示，患者外周血的确存在c15和p46特异性T细胞。综上所述，利用2D肽库可以预测患者阳性反应单肽，且预测结果可被ELISPOT和传统的胞内因子染色重复(图2和图3)。

上述方法在乙肝表面抗原清除患者特异性T细胞方法的实际应用

上述方法还可以应用于乙肝表面抗原清除患者特异性T细胞的检测。

乙肝表面清除(HBsAg loss)提示患者功能性治愈，是停止抗病毒治疗的一大指证，也提示患者有较好预后。为了探索HBsAg loss与哪些抗原肽有关，采用本发明方法进行筛选。

选取南方医院门诊就诊的HBV感染患者共42例，其中，HBsAg loss患者13例，未发生HBsAg loss的HBV感染者29例。

利用上述方法设计相关肽库矩阵(2D肽库)检测患者对HBV肽的阳性反应，并用3D单肽进行验证。结果发现，HBsAg loss患者可出现对s87单肽的阳性反应，而未在HBsAg阳性的患者中检测到s87单肽阳性反应，说明HBsAg loss患者可能与s87单肽诱导的特异性T细胞免疫应答相关(表4)。

表4抗原单肽s87与HBsAg loss的相关性验证结果

卡方检验，P＝0.02。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。