一种mNGS法检测病原微生物的DNA文库构建方法

技术领域

本发明涉及生物信息技术领域，尤其涉及一种mNGS法检测病原微生物的DNA文库构建方法。

背景技术

病原微生物是指可以侵犯人体，引起感染甚至传染病的微生物，或称病原体。病原体中，以细菌和病毒的危害性最大。病原微生物指朊毒体、寄生虫(原虫、蠕虫、医学昆虫)、真菌、细菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体、病毒。病原微生物感染人体后极有可能产生病症，导致感染者出现对应的感染症状。当出现感染症状时，现有技术有多种方法进行检测以判断是哪种病原微生物，进而便于疾病的治疗。

mNGS作为一种不需培养的新型技术，可以深入快速鉴定感染病原体，相比传统培养方法拥有更高敏感性的同时又与“精准诊疗”的理念相契合。Gyarmati等在2016年发表的一篇文献中指出，mNGS可以直接从血液样本中鉴定不能培养的、苛养的以及非细菌(病毒和真菌)病原体。除此之外，mNGS可以用于传染病预防，具有直接从临床样本中获的病原体传播线索的潜力。2014年，Hasman等指出mNGS可用于尿液样本中病原体以及耐药基因的检测，而且不仅耐药基因的检测结果与药敏实验一致，也与基于纯培养物的全基因组测序(WGS)的进化分析结果相匹配。

发明内容

本发明的提供一种mNGS法检测病原微生物的DNA文库构建方法。

本发明的方案是：

一种mNGS法检测病原微生物的DNA文库构建方法，包括下列步骤：

1)Tn5转座打断和产物纯化，在第一无菌PCR管配制反应体系，使用移液枪上下吸打，充分混匀，然后将所述第一无菌PCR管放入PCR仪上，设定反应程序，进行反应，反应结束后，取出所述第一无菌PCR管，往其加入6X Termination Buffer，通过涡旋或移液枪上下吸打混匀手段，充分混匀后室温下孵育3～8min,往所述第一无菌PCR管内添加DNA纯化磁珠，使用移液枪上下吸打10次，充分混匀，室温静止8～12min，将所述第一无菌PCR管置于磁力架上4～6min，待所述第一无菌PCR管内溶液澄清后，移除上清，然后进行两次漂洗处理，通过移液枪移除位于所述磁力架上的所述第一无菌PCR管管底残留乙醇，打开所述第一无菌PCR管的管盖4～6min，然后取出所述第一无菌PCR管，往里加入灭菌超纯水，充分吸打混匀，室温孵育1～3min,然后重新将所述第一无菌PCR放入所述磁力加上，待所述第一无菌PCR管内溶液澄清后，吸取所述第一无菌PCR管内上清液，用于PCR反应样本；

2)PCR文库富集，将步骤1)中PCR反应样本加入到第二无菌PCR管中，随后在所述第二无菌PCR管中配制反应体系，混匀后含有PCR反应体系的第二无菌PCR管进行离心，放入PCR仪中，设定PCR的反应程序进行反应，得到扩增好的第二无菌PCR管；

3)扩增产物片段大小分选，吸取第一轮DNA磁珠加入到扩增好的第二无菌PCR管中，充分混匀，室温孵育4～6min,将所述第二无菌PCR管置于磁力加上，待溶液澄清后，将第二无菌PCR管中的上清转移至第三无菌PCR管中，丢弃磁珠，吸取第二轮DNA磁珠加入所述第三无菌PCR管中，充分混匀，室温精致4～6min，然后将所述第三无菌PCR管放在磁力架上，待溶液澄清后，移除上清，两次漂洗处理，保持所述第三无菌PCR管在磁力架上，用移液枪移除管底残留的乙醇，并打开管盖空气干燥至管中不再有残留乙醇，取出干燥好的所述第三无菌PCR管，加入灭菌超纯水，充分混匀，室温孵育2min，重新将所述第三无菌PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸取上清液转移至新的无菌PCR管中，得到可测序文库；

4)文库选择测序，洗脱下来的文库放在-20℃冰箱长期保存，后续用Agilent 2100Bioanalyzer软件包评价文库质量，文库质控合格后，根据文库大小选择测序模式。

优选的技术方案，所述步骤1)中第一无菌PCR管配制反应体系如下：

往第一无菌PCR管中加组分时先加入ddH2O，再加入其它组分，最后统一加入Tagment Enzyme A50。

优选的技术方案，所述步骤1)中设定反应程序如下：

热盖(75℃) on；

55℃ 5min；

12℃ hold。

优选的技术方案，所述步骤1)中漂洗处理为：所述第一无菌PCR管加入80％乙醇漂洗磁珠，孵育30s后移除上清液。

优选的技术方案，所述步骤2)中第二无菌PCR管中配制反应体系如下：

优选的技术方案，所述步骤2)中设定PCR的反应程序如下：

其中，步骤S4至S6进行7次循环。

优选的技术方案，步骤3)中第一轮DNA磁珠与第二轮DNA用量筛选如下：

文库平均长度～250bp，第一轮DNA磁珠用量45μl，第二轮DNA磁珠用量10μl；文库平均长度～350bp，第一轮DNA磁珠用量45μl，第二轮DNA磁珠用量7.5μl；文库平均长度～450bp，第一轮DNA磁珠用量30μl，第二轮DNA磁珠用量7.5μl；文库平均长度～550bp，第一轮DNA磁珠用量25μl，第二轮DNA磁珠用量7.5μl。

优选的技术方案，所述步骤3)中漂洗处理为：第三无菌PCR管加入加入80％乙醇漂洗磁珠，孵育30s后移除上清。

优选的技术方案，所述步骤4)中测序模式为脑脊液20M reads；肺泡灌洗液40Mreads；血浆50M reads；痰液80M reads；胸腹水100M reads；其他20M reads。

由于采用了上述技术方案一种mNGS法检测病原微生物的DNA文库构建方法，1)Tn5转座打断和产物纯化，在第一无菌PCR管配制反应体系，使用移液枪上下吸打，充分混匀，然后将所述第一无菌PCR管放入PCR仪上，设定反应程序，进行反应，反应结束后，取出所述第一无菌PCR管，往其加入6X Termination Buffer，通过涡旋或移液枪上下吸打混匀手段，充分混匀后室温下孵育3～8min,往所述第一无菌PCR管内添加DNA纯化磁珠，使用移液枪上下吸打10次，充分混匀，室温静止8～12min，将所述第一无菌PCR管置于磁力架上4～6min，待所述第一无菌PCR管内溶液澄清后，移除上清，然后进行两次漂洗处理，通过移液枪移除位于所述磁力架上的所述第一无菌PCR管管底残留乙醇，打开所述第一无菌PCR管的管盖4～6min，然后取出所述第一无菌PCR管，往里加入灭菌超纯水，充分吸打混匀，室温孵育1～3min,然后重新将所述第一无菌PCR放入所述磁力加上，待所述第一无菌PCR管内溶液澄清后，吸取所述第一无菌PCR管内上清液，用于PCR反应样本；2)PCR文库富集，将步骤1)中PCR反应样本加入到第二无菌PCR管中，随后在所述第二无菌PCR管中配制反应体系，混匀后含有PCR反应体系的第二无菌PCR管进行离心，放入PCR仪中，设定PCR的反应程序进行反应，得到扩增好的第二无菌PCR管；3)扩增产物片段大小分选，吸取第一轮DNA磁珠加入到扩增好的第二无菌PCR管中，充分混匀，室温孵育4～6min,将所述第二无菌PCR管置于磁力加上，待溶液澄清后，将第二无菌PCR管中的上清转移至第三无菌PCR管中，丢弃磁珠，吸取第二轮DNA磁珠加入所述第三无菌PCR管中，充分混匀，室温精致4～6min，然后将所述第三无菌PCR管放在磁力架上，待溶液澄清后，移除上清，两次漂洗处理，保持所述第三无菌PCR管在磁力架上，用移液枪移除管底残留的乙醇，并打开管盖空气干燥至管中不再有残留乙醇，取出干燥好的所述第三无菌PCR管，加入灭菌超纯水，充分混匀，室温孵育2min，重新将所述第三无菌PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸取上清液转移至新的无菌PCR管中，得到可测序文库；4)文库选择测序，洗脱下来的文库放在-20℃冰箱长期保存，后续用Agilent 2100Bioanalyzer软件包评价文库质量，文库质控合格后，根据文库大小选择测序模式。

本发明的优点：

本发明将传统的耗时10-11个小时的病原微生物DNA/RNA共建库，缩短至仅需几个小时，大大缩短了建库时间，提高文库产出和下机数据质量，帮助得到更多真实信息；

本发明具有较高的cDNA杂合链打断效率，有效防止转座酶粘在DNA上，有利于文库扩增，得到高产量的文库，避免样本导致转座酶加入时间不同，引起打断片段大小有差异，精确度高，准确信强，并且提高了文库的保存时间。

附图说明

图1为本发明实施例的高通量病原微生物检测流程图；

图2为本发明实施例的文库片段大小分布图。

具体实施方式

为了弥补以上不足，本发明提供了一种mNGS法检测病原微生物的DNA文库构建方法以解决上述背景技术中的问题。

一种mNGS法检测病原微生物的DNA文库构建方法，包括下列步骤：

1)Tn5转座打断和产物纯化，在第一无菌PCR管配制反应体系，使用移液枪上下吸打，充分混匀，然后将所述第一无菌PCR管放入PCR仪上，设定反应程序，进行反应，反应结束后，取出所述第一无菌PCR管，往其加入6X Termination Buffer，通过涡旋或移液枪上下吸打混匀手段，充分混匀后室温下孵育3～8min,往所述第一无菌PCR管内添加DNA纯化磁珠，使用移液枪上下吸打10次，充分混匀，室温静止8～12min，将所述第一无菌PCR管置于磁力架上4～6min，待所述第一无菌PCR管内溶液澄清后，移除上清，然后进行两次漂洗处理，通过移液枪移除位于所述磁力架上的所述第一无菌PCR管管底残留乙醇，打开所述第一无菌PCR管的管盖4～6min，然后取出所述第一无菌PCR管，往里加入灭菌超纯水，充分吸打混匀，室温孵育1～3min,然后重新将所述第一无菌PCR放入所述磁力加上，待所述第一无菌PCR管内溶液澄清后，吸取所述第一无菌PCR管内上清液，用于PCR反应样本；

2)PCR文库富集，将步骤1)中PCR反应样本加入到第二无菌PCR管中，随后在所述第二无菌PCR管中配制反应体系，混匀后含有PCR反应体系的第二无菌PCR管进行离心，放入PCR仪中，设定PCR的反应程序进行反应，得到扩增好的第二无菌PCR管；

3)扩增产物片段大小分选，吸取第一轮DNA磁珠加入到扩增好的第二无菌PCR管中，充分混匀，室温孵育4～6min,将所述第二无菌PCR管置于磁力加上，待溶液澄清后，将第二无菌PCR管中的上清转移至第三无菌PCR管中，丢弃磁珠，吸取第二轮DNA磁珠加入所述第三无菌PCR管中，充分混匀，室温精致4～6min，然后将所述第三无菌PCR管放在磁力架上，待溶液澄清后，移除上清，两次漂洗处理，保持所述第三无菌PCR管在磁力架上，用移液枪移除管底残留的乙醇，并打开管盖空气干燥至管中不再有残留乙醇，取出干燥好的所述第三无菌PCR管，加入灭菌超纯水，充分混匀，室温孵育2min，重新将所述第三无菌PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸取上清液转移至新的无菌PCR管中，得到可测序文库；

4)文库选择测序，洗脱下来的文库放在-20℃冰箱长期保存，后续用Agilent2100Bioanalyzer软件包评价文库质量，文库质控合格后，根据文库大小选择测序模式。

所述步骤1)中第一无菌PCR管配制反应体系如下：

往第一无菌PCR管中加组分时先加入ddH2O，再加入其它组分，最后统一加入Tagment Enzyme A50。

所述步骤1)中设定反应程序如下：

热盖(75℃) on；

55℃ 5min；

12℃ hold。

所述步骤1)中漂洗处理为：所述第一无菌PCR管加入80％乙醇漂洗磁珠，孵育30s后移除上清液。

所述步骤2)中第二无菌PCR管中配制反应体系如下：

所述步骤2)中设定PCR的反应程序如下：

其中，步骤S4至S6进行7次循环。

步骤3)中第一轮DNA磁珠与第二轮DNA用量筛选如下：

文库平均长度～250bp，第一轮DNA磁珠用量45μl，第二轮DNA磁珠用量10μl；文库平均长度～350bp，第一轮DNA磁珠用量45μl，第二轮DNA磁珠用量7.5μl；文库平均长度～450bp，第一轮DNA磁珠用量30μl，第二轮DNA磁珠用量7.5μl；文库平均长度～550bp，第一轮DNA磁珠用量25μl，第二轮DNA磁珠用量7.5μl。

所述步骤3)中漂洗处理为：第三无菌PCR管加入加入80％乙醇漂洗磁珠，孵育30s后移除上清。

所述步骤4)中测序模式为脑脊液20M reads；肺泡灌洗液40M reads；血浆50Mreads；痰液80M reads；胸腹水100M reads；其他20M reads。

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例：

自备材料：磁力架、PCR仪、PCR管、DNA纯化磁珠，无水乙醇，Dual DNA Adapter96Kit for One-step DNA Lib Prep。

操作步骤：

1.Tn5转座打断和产物纯化：

1.1在无菌PCR管中配制以下反应体系：

该步骤加组分时可以先加入ddH

1.2使用移液枪上下吸打，充分混匀。

该步骤混匀不充分，可能导致打断反应不充分，产生过大或过小的片段，影响后续的结果分析。

1.3将PCR管放到PCR仪上，进行如下的反应程序：

热盖(75℃) on

55℃ 5min

12℃ hold

1.4反应结束后，立即取出PCR管，加入10μl 6X Termination Buffer，涡旋或使用移液枪上下吸打混匀，充分混匀后室温孵育5min。

该步骤是终止打断反应，使转座酶和DNA片段相互分离，若不进行此步，会导致文库产量降低，但不影响建库。

1.5向PCR管中加入60μl DNA纯化磁珠，使用移液枪上下吸打10次，充分混匀，室温静止10min。

1.6将PCR管置于磁力架上约5min，待溶液澄清后，移除上清。

该步骤移除上清时注意不要碰到磁珠。

1.7加入200μl的80％乙醇漂洗磁珠，孵育30s后移除上清液。

1.8重复步骤1.7一次。

1.9保持PCR管在磁力架上，用10μl移液枪移除管底残留的乙醇，并打开PCR管盖空气干燥至管中不再有残留乙醇(5min左右)。

1.10取出干燥的PCR管，加入18μl灭菌超纯水，充分吸打混匀，室温孵育2min。

1.11重新将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸取15μl上清液用于PCR反应。

2.PCR文库富集：

2.1在无菌PCR管中配制如下反应体系：

2.2将混匀的PCR反应体系离心后放入PCR仪中，设置反应程序：

2.3 PCR反应结束后，可直接进行扩增产物分选。

3.扩增产物片段大小分选：

扩增产物需要进行片段大小分选，筛选方案具体如下表所示：

具体操作步骤如下：

3.1从4℃冰箱取出DNA磁珠，平衡至室温30min，磁珠使用前混匀，按照表中需要筛选的片段轻轻吸取第一轮磁珠需要的用量(文库平均大小～250bp)，加入到扩增好的PCR管中，涡旋振荡或移液枪上下吸打10次充分混匀，室温孵育5min该步骤轻轻吸取磁珠、加入PCR管中时，管壁、枪头不要残留磁珠，否则片段大小分选结果会与预期不符。

3.2将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后(5min)，小心转移上清至新的无菌PCR管中，丢弃磁珠。

该步骤吸取上清时不要吸到磁珠。

3.3按照表中第二轮磁珠需要的用量，吸取相应体积的磁珠加入至新的PCR管中，涡旋振荡或移液枪上下吸打充分混匀，室温静置5min。

3.4将PCR管放到磁力架上，待溶液澄清(5min)后，小心移除上清。

3.5加入200μl的80％乙醇漂洗磁珠，孵育30s后移除上清。

3.6重复步骤3.5一次。

3.7保持PCR管在磁力架上，用10μl移液枪移除管底残留的乙醇，并打开管盖空气干燥至管中不再有残留乙醇(约5min左右)。

3.8取出干燥好的PCR管，加入22μl的灭菌超纯水，涡旋振荡或使用移液枪上下吸打10次充分混匀，室温孵育2min。

3.9重新将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸取上清液20μl转移至新的无菌PCR管中。

洗脱下来的文库可以放在-20℃冰箱长期保存，后续用Agilent 2100Bioanalyzer评价文库质量，文库质控合格后，根据文库大小选择测序模式(推荐脑脊液：20M reads；肺泡灌洗液：40M reads；血浆：50M reads；痰液：80M reads；胸腹水：100Mreads；其他：20M reads；SE75,Nextseq 500)。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。