构建DNA文库的试剂盒及方法

技术领域

本公开特别涉及一种构建DNA文库的试剂盒及方法。

背景技术

众所周知，二代测序(NGS)系统可同时进行大量平行测序反应。虽然不同的二代测序平台在技术细节上有许多不同，但在测序前都需要建立文库，因此文库的获得至关重要。

目前，通常采用建库试剂盒(例如illumina、Roche、NEB等厂商提供的建库试剂盒)进行构建文库，且构建文库的主要流程包括：对基因组进行片段化、末端修复、加A反应、连接接头、磁珠捕获片段、PCR扩增和纯化等步骤。然而，这些建库试剂盒往往存在建库流程繁杂、实验耗时较长、出库率较低等问题。

发明内容

本公开有鉴于上述现有技术的状况而完成，其目的在于提供一种提高建库效率的构建DNA文库的试剂盒及方法。

为此，本公开一方面提供了一种构建DNA文库的试剂盒，其包括：混合酶液、混合缓冲液、连接酶和连接缓冲液，所述混合酶液包含核酸内切酶、T4 DNA聚合酶、Klenow片段、Taq DNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶，所述混合缓冲液包含DTT和PEG 8000，所述连接缓冲液包含DTT和PEG 8000，所述混合酶液和所述混合缓冲液用于形成第一反应体系，所述第一反应体系用于DNA的片段化、末端修复和加A反应，所述连接酶和所述连接缓冲液用于形成第二反应体系，所述第二反应体系用于连接测序接头，在所述第一反应体系中，所述核酸内切酶的工作浓度为0.01至0.05U/μL，所述T4 DNA聚合酶的工作浓度为0.04至0.1U/μL，所述Klenow片段的工作浓度为0.005至0.02U/μL，所述Taq DNA聚合酶的工作浓度为0.025至0.075U/μL，所述T4多聚核苷酸激酶的工作浓度为0.1至0.5U/μL，所述DTT的工作浓度为5至10mM，所述PEG 8000的工作浓度为1至10％，在所述第二反应体系中，所述连接酶的工作浓度为15至60U/μL，所述DTT的工作浓度为0.5至2mM，所述PEG 8000的工作浓度为5至15％。在本公开中，片段化、末端修复和加A反应在同一反应体系中进行，由此能够简化流程、缩短建库时长，并且通过成分和浓度的配合能够提升末端修复效率和接头连接效率，由此能够提高建库效率。

另外，在本公开一方面所涉及的试剂盒中，可选地，所述混合缓冲液由Tris-HCL、MgCl

另外，在本公开一方面所涉及的试剂盒中，可选地，在所述第一反应体系中，所述Tris-HCL的工作浓度为50至100mM，所述MgCl

另外，在本公开一方面所涉及的试剂盒中，可选地，所述连接酶为T4 DNA连接酶，所述连接缓冲液由Tris-HCL、MgCl

另外，在本公开一方面所涉及的试剂盒中，可选地，在所述第二反应体系中，所述Tris-HCL的工作浓度为30至100mM，所述MgCl

另外，在本公开一方面所涉及的试剂盒中，可选地，所述测序接头为Y字型接头，所述Y字型接头由P5端接头序列与P7端接头序列退火而形成，所述P7端接头序列的3'端最后两位碱基之间的连接键经硫代修饰，所述P5端接头序列的5'端第一位碱基经磷酸化修饰。由此，能够有助于测序接头与DNA连接。

另外，在本公开一方面所涉及的试剂盒中，可选地，所述P5端接头序列选自SEQ IDNO︰1-SEQ ID NO︰10所示的序列，所述P7端接头序列选自SEQ ID NO︰11-SEQ ID NO︰20所示的序列。

另外，在本公开一方面所涉及的试剂盒中，可选地，包括扩增引物和PCR反应缓冲液，所述扩增引物和所述PCR反应缓冲液用于形成第三反应体系，所述第三反应体系用于PCR扩增反应。由此，能够进行扩增以形成文库。

另外，在本公开一方面所涉及的试剂盒中，可选地，所述第一反应体系的产物直接与所述连接酶和所述连接缓冲液混合以形成所述第二反应体系。由此，能够减少交叉污染等情况发生。

本公开另一方面提供了一种构建DNA文库的方法，其包括：准备样本DNA并使用上述任一试剂盒进行文库构建。在这种情况下，片段化、末端修复和加A反应在同一反应体系中进行，并且通过成分和浓度的配合提升末端修复效率和接头连接效率，由此能够提高建库效率。

根据本公开，能够提供一种提高建库效率的构建DNA文库的试剂盒及方法。

附图说明

图1是示出了本公开的示例所涉及的构建DNA文库的方法的流程示意图。

图2是示出了本公开的示例所涉及的文库构建的流程。

具体实施方式

以下，参考附图，详细地说明本公开的优选实施方式。在下面的说明中，对于相同的部件赋予相同的符号，省略重复的说明。另外，附图只是示意性的图，部件相互之间的尺寸的比例或者部件的形状等可以与实际的不同。

在本公开中，单位“mM”可以为mmol/L的缩写，单位“μM”可以为μmol/L的缩写。另外，工作浓度可以是指实际实验时的反应浓度。

本实施方式所涉及的构建DNA文库的试剂盒(以下简称“试剂盒”)可以应用于测序文库构建。在一些示例中，本实施方式所涉及的试剂盒可以用于构建二代测序文库(例如Illumina平台的二代测序文库)。

在一些示例中，试剂盒可以包括混合酶液和混合缓冲液。另外，混合酶液和混合缓冲液可以配合使用。

在一些示例中，混合酶液和混合缓冲液可以用于形成第一反应体系。在另一些示例中，样本DNA可以与混合酶液和混合缓冲液混合形成第一反应体系。

在一些示例中，第一反应体系可以用于DNA(样本DNA)的片段化、末端修复和加A反应。也就是说，DNA的片段化、末端修复和加A反应可以合并成一步反应。由此，能够简化操作流程，减少文库构建的时间和成本。另外，第一反应体系还可以用于DNA片段的5'端磷酸化。

在一些示例中，在第一反应体系中，样本DNA可以经DNA的片段化、末端修复和加A反应以形成DNA片段。另外，在第一反应体系中，DNA片段可以经5'端磷酸化修饰以形成第一反应产物。此外，第一反应体系经过反应后可以形成为第一反应产物溶液。

在一些示例中，混合酶液可以包括核酸内切酶。由此，能够利用酶切法进行片段化处理。在另一些示例中，核酸内切酶可以为可识别序列并进行切割的限制性内切酶。另外，核酸内切酶可以为多种酶的组合(例如多种酶等浓度组合)。

在一些示例中，核酸内切酶可以选自核酸内切酶dsDNase、T7核酸内切酶、核酸内切酶DNaseI中的至少一种。

在一些示例中，在第一反应体系中，核酸内切酶的工作浓度可以为0.01至0.05U/μL。例如，核酸内切酶的工作浓度可以为0.01U/μL、0.02U/μL、0.03U/μL、0.04U/μL或0.05U/μL。

在一些示例中，核酸内切酶可以为市售的酶液。

在一些示例中，混合酶液可以包含DNA聚合酶。由此，能够进行末端修复和/或加A反应。另外，在第一反应体系中，DNA聚合酶的工作浓度可以为0.005至0.2U/μL。

在一些示例中，DNA聚合酶可以选自DNA聚合酶Ⅰ、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Klenow片段中的至少一种。

在一些示例中，DNA聚合酶可以为T4 DNA聚合酶、Klenow片段和Taq DNA聚合酶。换言之，混合酶液可以包含T4 DNA聚合酶、Klenow片段和Taq DNA聚合酶。在这种情况下，通过T4 DNA聚合酶和Klenow片段能够进行末端修复，利用Taq DNA聚合酶能够进行加A反应，并且T4 DNA聚合酶、Klenow片段与Taq DNA聚合酶能够协同作用而有助于末端修复效率的提高。

在一些示例中，在第一反应体系中，T4 DNA聚合酶的工作浓度可以为0.04至0.1U/μL。由此，能够有利于末端修复效率的提升。例如，T4 DNA聚合酶的工作浓度可以为0.04U/μL、0.05U/μL、0.06U/μL、0.07U/μL、0.08U/μL、0.09U/μL或0.1U/μL。

在一些示例中，在第一反应体系中，Klenow片段的工作浓度可以为0.005至0.02U/μL。由此，能够有利于末端修复效率的提升。例如，Klenow片段的工作浓度可以为0.005U/μL、0.006U/μL、0.008U/μL、0.01U/μL、0.012U/μL、0.014U/μL、0.06U/μL、0.018U/μL或0.02U/μL。

在一些示例中，在第一反应体系中，Taq DNA聚合酶的工作浓度可以为0.025至0.075U/μL。由此，能够有利于末端修复效率的提升。例如，Taq DNA聚合酶的工作浓度可以为0.025U/μL、0.03U/μL、0.035U/μL、0.04U/μL、0.045U/μL、0.05U/μL、0.055U/μL、0.06U/μL、0.065U/μL、0.07U/μL或0.075U/μL。

在一些示例中，混合酶液可以包含多聚核苷酸激酶。由此，能够对DNA片段进行5'端磷酸化以便于后续连接测序接头，即能够有利于接头连接效率的提升。另外，在第一反应体系中，多聚核苷酸激酶的工作浓度可以为0.1至0.5U/μL。

在一些示例中，多聚核苷酸激酶可以为T4多聚核苷酸激酶。换言之，混合酶液可以包含T4多聚核苷酸激酶。另外，在第一反应体系中，T4多聚核苷酸激酶的工作浓度可以为0.1至0.5U/μL。例如，T4多聚核苷酸激酶的工作浓度可以为0.1U/μL、0.15U/μL、0.2U/μL、0.25U/μL、0.3U/μL、0.35U/μL、0.4U/μL、0.45U/μL或0.5U/μL。

在一些示例中，混合酶液可以由核酸内切酶、T4 DNA聚合酶、Klenow片段、Taq DNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶组成。换言之，混合酶液可以为核酸内切酶、T4 DNA聚合酶、Klenow片段、Taq DNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶混合的溶液。

如上所述，试剂盒可以包括与混合酶液配合的混合缓冲液。在一些示例中，混合缓冲液可以包含缓冲剂。由此，能够维持第一反应体系处于一定pH范围内。另外，在第一反应体系中，缓冲剂的工作浓度可以为50至100mM。由此，能够维持第一反应体系处于适宜pH范围。

在一些示例中，缓冲剂可以为Tris-HCL。换言之，混合缓冲液可以包含Tris-HCL。另外，在第一反应体系中，Tris-HCL的工作浓度可以为50至100mM。例如，Tris-HCL的工作浓度可以为50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM或100mM。

在一些示例中，混合缓冲液可以包含金属盐。换言之，混合缓冲液可以包括金属阳离子。另外，在一些示例中，金属盐可以选自MgCl

在一些示例中，混合缓冲液可以包含MgCl

在一些示例中，在第一反应体系中，MgCl

在一些示例中，混合缓冲液可以包含底物。由此，能够在第一反应体系中提供反应所需物质。另外，底物可以选自ATP、dNTP和dATP中的至少一种。

在一些示例中，底物可以包含ATP、dNTP和dATP。换言之，混合缓冲液可以包含ATP、dNTP和dATP。在这种情况下，ATP能够为DNA片段的5'端磷酸化提供底物分子，dNTP能够提供末端修复的原料，dATP能够提供加A反应的原料。

在一些示例中，dNTP可以是dATP、dTTP、dCTP和dGTP的混合物。另外，在一些示例中，dNTP可以是dATP、dTTP、dCTP和dGTP的等量混合物。

在一些示例中，在第一反应体系中，ATP的工作浓度可以为2至5mM。由此，能够有利于DNA片段的5'端磷酸化，从而能够有利于提高后续连接测序接头的效率。例如，ATP的工作浓度可以为2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM或5mM。

在一些示例中，在第一反应体系中，dNTP的工作浓度可以为0.1至1mM。由此，能够有利于末端修复效率的提高。另外，dNTP的工作浓度可以为0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM或1mM。

在一些示例中，在第一反应体系中，dATP的工作浓度可以为1至10mM。由此，能够有利于加A反应的进行。另外，dATP的工作浓度可以为1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM或10mM。

在一些示例中，混合缓冲液可以包含DTT(二硫苏糖醇)。由此，能够提高第一反应体系中酶(比如核酸内切酶、T4 DNA聚合酶、Klenow片段、Taq DNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶)的稳定性。

在一些示例中，在第一反应体系中，DTT的工作浓度可以为5至10mM。由此，能够有效提高第一反应体系中酶的稳定性，减少酶失活的情况发生。例如，DTT的工作浓度可以为5mM、6mM、7mM、8mM、9mM或10mM。

在一些示例中，混合缓冲液可以包含PEG 8000(聚乙二醇8000)。由此，能够提高片段化、末端修复和加A反应的效率。

在一些示例中，在第一反应体系中，PEG 8000的工作浓度可以为1至10％。例如，PEG 8000的工作浓度可以为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％。

在一些示例中，混合缓冲液可以由Tris-HCL、MgCl

另外，在第一反应体系中，各成分按照一定浓度相互配合能够提高末端修复效率，从而能够有助于提高建库效率(增加出库量)。

在一些示例中，可选地，在第一反应体系中，Tris-HCL的工作浓度为50至100mM，MgCl

在一些示例中，试剂盒可以包括连接酶和连接缓冲液。另外，连接酶和连接缓冲液可以配合使用。在另一些示例中，连接酶和连接缓冲液可以用于形成第二反应体系。另外，第一反应产物(或第一反应产物溶液)可以与连接酶、连接缓冲液和测序接头混合形成第二反应体系。

在一些示例中，第二反应体系可以用于连接测序接头。具体而言，第一反应产物、连接酶、连接缓冲液和测序接头混合形成第二反应体系，第二反应体系可以用于第一反应产物连接测序接头。

在一些示例中，第一反应体系的产物(即第一反应产物或第一反应产物溶液)可以直接与连接酶和连接缓冲液混合以形成第二反应体系。由此，能够减少液体转移、中间纯化等步骤，从而能够减少交叉污染等情况发生。具体而言，在第一反应体系的反应结束后，可以直接与连接酶、连接缓冲液和测序接头混合形成第二反应体系。

在一些示例中，在第二反应体系中，连接酶的工作浓度可以为15至60U/μL。由此，能够有利于测序接头的连接。例如，连接酶的工作浓度可以为15U/μL、20U/μL、25U/μL、30U/μL、35U/μL、40U/μL、45U/μL、50U/μL、55U/μL或60U/μL。另外，连接酶可以为T4 DNA连接酶。

在一些示例中，连接缓冲液可以包含缓冲剂。由此，能够维持第二反应体系处于一定pH范围内。另外，在第二反应体系中，缓冲剂的工作浓度可以为30至100mM。由此，能够维持第二反应体系处于适宜pH范围。

在一些示例中，缓冲剂可以为Tris-HCL。换言之，连接缓冲液可以包含Tris-HCL。另外，在第二反应体系中，Tris-HCL的工作浓度可以为30至100mM。例如，Tris-HCL的工作浓度可以为30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM。

在一些示例中，连接缓冲液可以包含金属盐。换言之，连接缓冲液可以包括金属阳离子。另外，在一些示例中，金属盐可以选自MgCl

在一些示例中，连接缓冲液可以包含MgCl

在一些示例中，在第二反应体系中，MgCl

在一些示例中，连接缓冲液可以包含ATP。由此，能够为第二反应体系中的连接反应提供能量。另外，在第二反应体系中，ATP的工作浓度可以为0.5至2mM。由此，能够有助于连接反应的进行。

在一些示例中，在第二反应体系中，ATP的工作浓度可以为0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、1.2mM、1.4mM、1.6mM、1.8mM或2mM。

在一些示例中，连接缓冲液可以包含DTT。由此，能够提高第二反应体系中酶(比如连接酶)的稳定性。

在一些示例中，在第二反应体系中，DTT的工作浓度可以为0.5至2mM。由此，能够有效提高第二反应体系中酶的稳定性，从而能够有利于连接反应的进行，提高接头连接效率。例如，DTT的工作浓度可以为0.5mM、0.8mM、1mM、1.2mM、1.5mM、1.8mM或2mM。

在一些示例中，连接缓冲液可以包含PEG 8000。由此，能够促进第一反应产物与测序接头连接，也即能够提高接头连接效率(增加连接产物量)。

在一些示例中，在第二反应体系中，PEG 8000的工作浓度可以为5至15％。由此，能够有利于提高接头连接效率。例如，PEG 8000的工作浓度可以为5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％。

在一些示例中，连接缓冲液可以由Tris-HCL、MgCl

在一些示例中，可选地，在第二反应体系中，Tris-HCL的工作浓度为30至100mM，MgCl

在一些示例中，试剂盒可以包括测序接头。由此，能够进行连接反应并且能够有利于提高测序的准确性。

在一些示例中，在第二反应体系中，测序接头的工作浓度可以为0.15至0.75μM。由此，能够有利于提高接头连接效率。例如，测序接头的工作浓度可以为0.15μM、0.2μM、0.25μM、0.3μM、0.35μM、0.4μM、0.45μM、0.5μM、0.55μM、0.6μM、0.65μM、0.7μM或0.75μM。

在一些示例中，测序接头可以为Y字型接头。另外，Y字型接头可以由P5端接头序列与P7端接头序列退火而形成。换言之，测序接头可以由P5端接头序列与P7端接头序列退火而形成。

在一些示例中，P5端接头序列和P7端接头序列的退火条件可以为95℃保持10min(分钟)，70℃保持10min，65℃保持10min，60℃保持10min，55℃保持10min，50℃保持10min，45℃保持10min，40℃保持10min，25℃保持10min。

在一些示例中，P5端接头序列可以为5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3'。其中，NNNNNNNN可以为单分子标签序列，单分子标签可以为用于标记不同DNA片段的随机的碱基序列。由此，能够有助于提高测序的准确性。

在一些示例中，P5端接头序列可以选自SEQ ID NO︰1-SEQ IDNO︰10所示的序列。也就是说，P5端接头序列可以选自SEQ ID NO︰1-SEQ ID NO︰10中的至少一个。

在一些示例中，P5端接头序列的3'端可以经硫代修饰(硫代磷酸化修饰)。由此，能够减少测序接头的自连。例如，P5端接头序列的3'端最后两位碱基之间的连接键可以经硫代修饰，比如P5端接头序列可以为5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNNACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3'(*表示硫代修饰)。

在一些示例中，P7端接头序列可以为5'-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACXXXXXXXXATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'。其中，XXXXXXXX可以为样本标签序列，样本标签可以为用于区别不同样本的固定的碱基序列。

在一些示例中，P7端接头序列可以选自SEQ ID NO︰11-SEQ ID NO︰20所示的序列。具体而言，P7端接头序列可以选自SEQ ID NO︰11-SEQ ID NO︰20中的至少一个。

在一些示例中，P7端接头序列的5'端可以经磷酸化修饰。由此，能够有助于测序接头与DNA片段(第一反应产物)连接。例如，P7端接头序列的5'端第一位碱基可以经磷酸化修饰，比如P7端接头序列可以为5'-/Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACXXXXXXXXATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'。

另外，在第二反应体系中，各成分按照一定浓度相互配合能够提高接头连接效率，从而能够有助于提高建库效率(增加出库量)。

在一些示例中，试剂盒可以扩增引物和PCR反应缓冲液。由此，能够进行扩增以形成文库。另外，扩增引物和PCR反应缓冲液可以用于形成第三反应体系。此外，第三反应体系可以用于PCR扩增反应。

在一些示例中，扩增引物可以为通用引物或靶向引物。在另一些示例中，扩增引物可以为市售的引物混合物。另外，PCR反应缓冲液可以为市售的反应缓冲液。

在一些示例中，试剂盒可以包括纯化试剂。由此，能够进行纯化处理。例如，试剂盒可以包括分选磁珠(或磁珠分选液)。另外，纯化试剂可以为市售的试剂(比如磁珠液)。

在一些示例中，试剂盒可以由混合酶液和混合缓冲液组成。在另一些示例中，试剂盒可以由混合酶液、混合缓冲液、连接酶和连接缓冲液组成。另外，试剂盒可以由混合酶液、混合缓冲液、连接酶、连接缓冲液、扩增引物和PCR反应缓冲液组成。此外，试剂盒可以由混合酶液、混合缓冲液、连接酶、连接缓冲液、扩增引物、PCR反应缓冲液和纯化试剂组成。

在一些示例中，本公开所涉及的试剂盒的多个组成可以分别独立包装。例如，混合酶液、混合缓冲液、连接酶和连接缓冲液可以各自独立包装。

在一些示例中，本公开所涉及的试剂盒的组成可以以浓缩溶液的形式来制造和/或包装。在另一些示例中，本公开所涉及的试剂盒的组成可以分别以冻干粉的形式来制造和/或包装。另外，本公开所涉及的试剂盒的组成可以在后续使用之前先进行稀释或溶解。

在本实施方式中，片段化、末端修复和加A反应在同一反应体系中进行，由此能够简化流程、缩短建库时长，而且通过成分和浓度的配合能够提升末端修复效率和接头连接效率，由此能够提高建库效率。

在一些示例中，本公开所涉及的试剂盒构建的DNA文库可以为DNA小片段文库。换言之，本公开所涉及的试剂盒构建的DNA文库的文库片段长度可以小于1000bp。

另外，本公开所涉及的试剂盒构建的DNA文库的片段长度分布一致性良好。换言之，在本公开的试剂盒构建的DNA文库中，文库片段长度可以大致分布在一定范围内或一定长度。例如，文库片段可以大致分布在280至350bp、400至500bp或500至600bp，或者可以大致分布在250bp、310bp、420bp、550bp或700bp。

以下，参考图1，详细地描述本公开所涉及的构建DNA文库的方法。图1是示出了本公开的示例所涉及的构建DNA文库的方法的流程图。

在一些示例中，如图1所示，构建DNA文库的方法可以包括准备样本DNA(步骤S100)。另外，样本DNA可以来源于真核生物。

在一些示例中，样本DNA可以来源于真菌、体液、动物组织、植物组织、培养细胞或细胞系。例如，样本DNA可以来源于白细胞、唾液、胸水、脑积液、新鲜组织或FFPE样本。

在一些示例中，在步骤S100中，可以采用本领域常用方法进行样本DNA的提取。例如，可以通过沉淀法、SDS法、CTAB法或DNA提取试剂盒提取样本DNA。

在一些示例中，如图1所示，构建DNA文库的方法可以包括使用试剂盒进行文库构建(步骤S200)。另外，在步骤S200中，试剂盒可以参照上文的描述。

在一些示例中，在步骤S200中，样本DNA的投入量可以为1至1000ng。例如，样本DNA的投入量可以为1ng、10ng、50ng、100ng、200ng、300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng或1000ng。

图2是示出了本公开的示例所涉及的文库构建的流程。

在一些示例中，在步骤S200中，如图2所示，文库构建的流程可以依次包括片段化、末端修复和加A反应，连接反应，以及扩增反应。

具体而言，可选地，先使用混合酶液和混合缓冲液与样本DNA混合形成第一反应体系，并进行片段化、末端修复和加A反应；接着继续添加连接酶、连接缓冲液和测序接头混合形成第二反应体系，并进行连接反应；然后进行纯化处理，再与扩增引物和PCR反应缓冲液混合形成第三反应体系，进行扩增反应并纯化，从而获得DNA文库。在这种情况下，片段化、末端修复和加A反应在同一反应体系中进行，并且通过成分和浓度的配合提升末端修复效率和接头连接效率，由此能够提高建库效率。

在一些示例中，在步骤S200中，片段化、末端修复和加A反应可以置于PCR仪中进行。另外，片段化、末端修复和加A反应的反应条件可以为37至45℃保持10至20min，70至75℃保持10至30min。此外，片段化、末端修复和加A反应完成后可以在4℃保存。

在一些示例中，在步骤S200中，连接反应可以置于PCR仪中进行。另外，连接反应的反应条件可以为20至25℃保持10至30min。此外，连接反应完成后可以在4℃保存或16℃过夜。

在一些示例中，在步骤S200中，扩增反应可以置于PCR仪中进行。另外，扩增反应的反应条件可以为95至98℃保持45至80s(秒)；95至98℃保持10至30s，55至60℃保持10至30s，70至75℃保持30至50s，4至12个循环；70至75℃保持5至10min。此外，扩增反应完成后可以在4℃保存。

在一些示例中，在步骤S200中，纯化处理可以包括双筛过程。

根据本公开，能够提供一种提高建库效率的构建DNA文库的试剂盒及方法。

为了进一步说明本公开，以下结合实施例对本公开提供的构建DNA文库的试剂盒及方法进行详细描述，并结合对比例对本公开实现的有益效果进行充分说明。

[实施例]

在本实施例中，利用商用试剂盒提取临床样本的样本DNA，并利用Qubit3.0荧光定量仪对样本DNA进行定量。另外，一共分为A、B、C三组进行实验。

在本实施例中，分别准备混合酶液、混合缓冲液、T4 DNA连接酶、连接缓冲液、PCR反应缓冲液、扩增引物和纯化试剂。其中，dNTP为dATP、dTTP、dCTP和dGTP的等量混合物，核酸内切酶为OnePot Fragmentation Enzyme Mix，PCR反应缓冲液为VAHTS HiFiAmplification Mix，扩增引物为PCR Primer Mix 3 for Illumina，纯化试剂为HP PureBeads。

(1)在冰盒上根据表1配制各组的第一反应体系，其中样本DNA的投入量分别为500ng，并且第一反应体系中各成分的配比如表2所示；然后用移液器轻柔吸打6-8次混匀，瞬时离心后，立即放入预冷至4℃的PCR仪中按照表3的反应程序进行反应；当PCR仪中反应程序结束后，取出样本管并立即置于冰上。

表1

表2

表3

(2)根据表4配制各组的连接体系，然后向各个样本管分别加入45μL连接体系和5μL IDT接头以形成第二反应体系，用移液器吸打混匀后瞬时离心，并置于PCR仪中20℃反应15min，其中第二反应体系中各成分的配比如表5所示。

表4

表5

(3)接头连接反应结束后，开始DNA纯化，步骤如下：分别向样本管加入100μL充分混匀的磁珠(HP Pure Beads)，混匀离心；室温孵育10min后上架吸附，弃去上清；用500μL80％乙醇洗涤磁珠，弃去上清，重复本洗涤步骤一次；将样本管取下磁力架，开盖干燥至磁珠表面不反光。

(4)接着进行双筛，步骤如下：分别向样本管内加入100μLNuclease-free water，涡旋混匀，室温静置5min；再加入50μL磁珠，室温静置10min，使大于450bp的DNA片段吸附于磁珠上；准备新的1.5mL样本管，管盖管壁标注相对应的编号，分别加入30μL混合均匀的磁珠，并将样本管置于磁力架上，进行磁珠吸附，直至溶液澄清；然后取145μL上清液，移至对应编号的含磁珠的新样本管中，充分涡旋混匀，室温静置10min，使大于250bp的DNA片段吸附于磁珠上。

(5)双筛结束后，开始进行DNA纯化，具体步骤如下：将样本管置于磁力架上，进行磁珠吸附，直至溶液澄清；保持在磁力架上移除上清液，再加入200μL 80％乙醇，180度旋转样本管使磁珠穿过溶液吸至另一侧管壁，旋转2-3次，静置15s后弃上清液，重复本洗涤步骤一次；将样本管自磁力架上取下，快速离心，然后置于磁力架上再次分离、移除残留的酒精溶液；接着将离心管自磁力架上取下，打开管盖，常温下干燥磁珠，挥发乙醇。

(6)然后向各个样本管分别加入22μL Nuclease-Free water，重悬浮磁珠，充分混匀后室温静置5min，并准备一批新的0.2mLPCR管，管盖管壁标注对应的样本编号；将样本管置于磁力架，进行磁珠吸附，直至溶液澄清后，将上清液转移至对应编号的PCR管中，作为PCR实验的模板；配置Qubit Buffer 199μL，加入1μL DNA样本，涡旋混匀,避光静置2min，测试浓度，结果见表6。

表6

(7)分别向PCR管中加入25μL VAHTS HiFi Amplification Mix和5μL PCR PrimerMix 3 for Illumina混合形成第三反应体系，然后置于PCR仪中按照表7的反应程序进行扩增反应。

表7

(8)扩增反应结束后，开始进行DNA纯化，具体步骤如下：将1.5mLPCR管置于磁力架上，进行磁珠吸附，直至溶液澄清；小心移除上清液，再加入500μL 80％乙醇，180度旋转PCR管使磁珠穿过溶液吸至另一侧管壁，旋转2-3次静置15s后弃上清液，重复本洗涤步骤一次；接着将PCR管自磁力架上取下，快速离心，然后置于磁力架上再次分离、移除残留的酒精溶液。将PCR管自磁力架上取下，打开管盖，常温下干燥磁珠，挥发乙醇。

(9)准备新的1.5mL离心管，管盖管壁标注对应的样本编号，加入90μL混合均匀的磁珠，充分涡旋混匀后，室温静置10min，并向各PCR管内加入22μL Nuclease-Free water，充分混匀后室温静置5min；接着将将PCR管置于磁力架上，进行磁珠吸附，直至溶液澄清后，将上清液转移至对应的新的写有样本信息的1.5mL离心管，并用qubit 3.0定量，结果如表8所示。

[对比例]

在本对比例中，投入500ng样本DNA利用KAPA HyperPlus Kit试剂盒进行建库，并按照产品说明书进行建库操作，并以与实施例相同的方式进行文库定量，结果如表8所示。

表8

从表8可以看出，实施例与对比例相比，实施例的片段化、末端修复和加A一步反应，流程简单且用时短，而且实施例的出库量明显大于对比例的出库量，也就是说，实施例的建库效率高于对比例的建库效率。

虽然以上结合附图和实施方式对本公开进行了具体说明，但是可以理解，上述说明不以任何形式限制本公开。本领域技术人员在不偏离本公开的实质精神和范围的情况下可以根据需要对本公开进行变形和变化，这些变形和变化均落入本公开的范围内。

序列表

<110> 深圳海普洛斯医学检验实验室

<120> 构建DNA文库的试剂盒及方法

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc aatcgacaca ctctttccct acacgacgct 60

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ggagttgaca ctctttccct acacgacgct 60

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