一种快速多时间生物素修饰核酸转录连缀测序文库的构建方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速多时间生物素修饰核酸转录连缀测序文库的构建方法及其应用。

背景技术

多时间生物素修饰核酸转录连缀测序技术(TV-PRO-seq)(Zhang et al.,2021)是基于生物素修饰核酸转录连缀测序(PRO-seq)(Mahat et al.,2016)的改进方法。此方法改进了生物素修饰核酸转录连缀测序的转录连缀程序，采用多转录连缀时间。由此，多时间生物素修饰核酸转录连缀测序技术可以检测RNA聚合酶II在全基因组水平上每个单碱基转录暂停位点的停顿时间。

多时间生物素修饰核酸转录连缀测序是现有唯一可以在转录组水平单碱基分辨率检测RNA聚合转录暂停的方法，此方法可潜在应用于RNA聚合酶II近启动子暂停，RNA聚合酶II在基因体的暂停，RNA聚合酶I及RNA聚合酶III的动力学研究，进而为药物开发提供理论基础。然而，多时间生物素修饰核酸转录连缀测序建库所需长达26个小时，需三个以上工作日方可完成，且步骤繁琐，中间经历了3次生物素磁珠富集以及3次Trizol RNA提取/纯化步骤；文库建立所需时间长，起始生物材料多，实验成功率低；复杂的实验步骤影响了此方法在相关领域的应用范围和难度。

Mahat,D.B.,Kwak,H.,Booth,G.T.,Jonkers,I.H.,Danko,C.G.,Patel,R.K.,Waters,C.T.,Munson,K.,Core,L.J.,Lis,J.T.,2016.Base-pair-resolution genome-wide mapping of active RNA polymerases usin g precision nuclear run-on(PRO-seq).Nat Protoc 11,1455–1476.https://doi.org/10.1038/nprot.2016.086。

Zhang,J.,Cavallaro,M.,Hebenstreit,D.,2021.Timing RNA polymerasepausing with TV-PRO-seq.Cell Reports Methods 1,100083.https://doi.org/10.1016/j.crmeth.2021.100083。

发明内容

本发明的目的在于简化多时间生物素修饰核酸转录连缀测序技术步骤，从而缩短建库时间、减少所需材料、提高实验效率。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一方面，提供一种测序文库的构建方法，包括以下步骤：

S1：在待测样本中加入带有标记的核苷酸；

S2：对所述样本进行RNA提取并进行片段化处理，得到RNA片段；

S3：加入3’末端接头；

S4：加入磁珠对所述接头连接产物进行纯化处理；

S5：加入5’末端接头得连接产物；

S6：洗脱磁珠获得纯化后的连接产物；

S7：对纯化后的连接产物进行PCR扩增，得到测序文库。

在本发明的一些实施方式中，在步骤S1之前先对待测样本进行透化处理。

在本发明的一些实施方式中，步骤S1中所述的标记为生物素标记。本发明通过加入带有生物素标记的核苷酸到可进行转录的体系中(如表面透过化处理后的细胞或体外转录系统)，使新生成的RNA带有标记，也称为转录连缀。

在本发明的一些实施方式中，所述生物素标记的核苷酸包括：生物素标记腺嘌呤核苷三磷酸、生物素标记鸟嘌呤核苷三磷酸、生物素标记胞嘧啶核苷三磷酸、生物素标记尿嘧啶核苷三磷酸。

在本发明的一些实施方式中，步骤S1的具体操作为：将表面透化处理后的样本加入含有带生物素标记的核苷酸的连缀反应液中，具体为采用0.2至60分钟内的等比数列，进行四个不同时间长度的连缀反应。

在本发明的一些实施方式中，所述步骤S3包括：向所述RNA片段中加入3’末端接头，20-28℃孵育1-4h。

在本发明的一些实施方式中，步骤S3中加入3’末端接头后进行热处理，具体条件60-75℃反应30～60s；热处理后冷却至室温进行孵育。

在本发明的一些实施方式中，所述的3’末端接头的序列为GAUCGUCGGACUGUAGAACUCUGAAC(SEQ ID NO.1)。

在本发明的一些实施方式中，所述磁珠包括C1磁珠或T1磁珠。

在本发明的一些优选实施方式中，所述磁珠为C1磁珠。

在本发明的一些实施方式中，步骤S4的反应条件为：室温反应0.5-1h。

在本发明的一些实施方式中，步骤S4～步骤S6中包括使用磁珠清洗液进行磁珠清洗，所述磁珠清洗液包括4sU DRB-seq缓冲液或TimeLapse-seq缓冲液。

在本发明的一些实施方式中，所述4sU DRB-seq缓冲液包括0.5～1.5M氯化钠，2～3mM Tris-HCl缓冲液，0.02～0.03％吐温。

在本发明的一些实施方式中，所述4sU DRB-seq缓冲液包括1M氯化钠，2.5mMTris-HCl缓冲液，0.025％吐温。

在本发明的一些实施方式中，所述TimeLapse-seq缓冲液包括0.5～1.5M氯化钠，80～120mM Tris-HCl缓冲液，0.03～0.07％吐温，8～12mM乙二胺四乙基二钠。

在本发明的一些实施方式中，所述TimeLapse-seq缓冲液包括1M氯化钠，100mMTris-HCl缓冲液，0.05％吐温，10mM乙二胺四乙基二钠。

在本发明的一些实施方式中，所述缓冲液的pH为7.0～7.8。

在本发明的一些实施方式中，所述吐温包括Tween-20。

在本发明的一些实施方式中，在步骤S5之前，包括使用RNA 5′焦磷酸水解酶和多聚合核苷酸激酶进行5’末端酶处理。

在本发明的一些实施方式中，所述步骤S5包括：加入5’末端接头，RNA连接酶I及其缓冲液室温孵育1-4h。

在本发明的一些实施方式中，所述5’末端接头的序列为CCUUGGCACCCGAGA AUUCCA(SEQ ID NO.2)。

在本发明的一些实施方式中，步骤S6具体为使用Trizol将RNA从磁珠上洗脱。

在本发明的一些实施方式中，步骤S7包括逆转录和PCR扩增。

在本发明的一些实施方式中，所述逆转录引物包括：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGT TCAGAGTTCTACAGTCCGA(SEQ ID NO.3)。

在本发明的一些实施方式中，所述PCR扩增的引物包括：CAAGCAGAAGACGG CATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA(SEQ IDNO.4)。

在本发明的一些实施方式中，在PCR扩增后可进一步将PCR扩增产物进行电泳检测，并回收DNA片段。

本发明的第二方面，提供一种测序文库，根据本发明第一方面所述的方法制备。

本发明的第三方面，提供一种测序方法，所述方法包括对本发明第一方面所述的方法制备的测序文库进行测序。

本发明的第四方面，提供本发明第一方面所述的构建方法或本发明第二方面所述的测序文库或本发明第三方面所述的测序方法的应用，优选为在RNA聚合酶II近启动子暂停，RNA聚合酶II在基因体的暂停，RNA聚合酶I及RNA聚合酶III的动力学研究、生物遗传分析、系统生物学研究、合成生物学研究、药物制备中的应用。

本发明的有益效果是：

本发明通过优化磁珠上酶反应体系简化了TV-PRO-seq实验步骤，将三次磁珠富集简化为一次。且使用了链霉亲和素磁珠C1(赛默飞，65001)取代原方法中的链霉亲和素磁珠M280，并使用了新的缓冲液洗脱体系；提高了被标记分子的富集比例的同时缩短了实验流程。这些改变大幅减少了多时间生物素修饰核酸转录连缀测序的建库时间，从26小时减少为14小时(图1)；整体实验时间的缩短也减少了新生RNA降解的可能，提高了实验的成功率(从54例样本成功32例上升至8例样本成功8例，成功率显著上升，P<0.05)，减少了实验所需起始细胞的用量(从一千万减少到一百万)，也使实验中材料的损耗大幅降低，从而扩宽了多时间生物素修饰核酸转录连缀测序的应用场景。

本发明通过磁珠上反应体系精简不必要的RNA回收步骤，加速实验流程的同时减少样品需求。同时，本发明有效提高了多时间生物素修饰核酸转录连缀测序文库建库的成功率并降低了实验花费。

附图说明

图1为本发明快速多时间生物素修饰核酸转录连缀测序流程图。

图2为实施例1中的PAGE胶电泳图，图2A各带从左向右依次为：Marker，0.5分钟连缀样品1、2，2分钟连缀样品1、2；图2B各带从左向右依次为：8分钟连缀样品1、2，32分钟连缀样品1、2，Marker；。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

Fast-TV-PRO-seq:Fast time variant precise(Biotin-NTP)run-onsequencing。

Time variant：指本发明中的生物素标记的转录连缀具有多个时间。

Biotin-NTP：生物素标记的核苷酸。

run-on：转录连缀，即通过加入带有标记的核苷酸(如，溴或者生物素)到可进行转录的体系中(如活细胞或体外转录系统)，使新生成的RNA带有标记。

Sequencing：测序，此专利中特指第二代测序。

快速多时间生物素修饰核酸转录连缀测序建库提取动物细胞中正在进行转录的RNA，并通过读数3’末端读数量的变化估计RNA聚合酶在对应位点的停留时间。首先，细胞需经过膜透过化处理快速冻存于液氮中。经膜透过化处理的细胞在经过1分钟预热解冻后加入含有带生物素标记的核苷酸的连缀反应液中，进行四个不同时间长度的连缀反应(0.2至60分钟内的等比数列，如0.5分钟、2分钟、8分钟、32分钟)。完成连缀反应后，迅速使用Trizol终止反应，并提取细胞总RNA。这些RNA将被进一步片段化，并使用RNA连接酶为其3’末端加接头。加接头后的RNA与链霉亲和素磁珠共同孵化30分钟，洗去反应液。向磁珠中加入RNA 5’焦磷酸水解酶及缓冲液，37摄氏度反应60分钟，洗去反应液。再次磁珠中加入T4多聚合核苷酸激酶及反应液，37摄氏度反应30分钟，洗去反应液。使用RNA连接酶为磁珠上的RNA5’末端加接头。完成加接头后，使用Trizol将RNA从磁珠上洗脱，进行逆转录。cDNA进行聚合酶链式反应进行扩增，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯化后进行测序。

实施例1快速多时间生物素修饰核酸转录连缀测序

1、细胞透过化处理

配置细胞透过化液，向50mL离心管加入1mol/L的蔗糖(Sigma-Aldrich，S0389)15mL，1％聚山梨醇酯-20(Sigma-Aldrich，P9416)2.5mL，1mol/L pH7.4 Tris-HCl缓冲液(Sigma-Aldrich，T2663)0.5mL，0.1mol/L乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(Sigma-Aldrich，E3889)0.5mL，10％ NP40(赛默飞，85124)0.5mL，2mol/L氯化钾(Sigma-Aldrich，P9333)0.25mL，1mol/L氯化镁(Sigma-Aldrich，M2670)0.25mL，1mol/L二硫苏糖醇(Sigma-Aldrich，D0632)25μL，RNA酶抑制剂(Ambion,AM2696)5μL，蛋白酶抑制剂(罗氏,11873580001)一片，使用焦碳酸二乙酯水(赛默飞，10514065)补足到50mL。

细胞储存液，向15mL离心管加入0.5mol/L乙二胺四乙酸(赛默飞，AM9260G)0.4μL，1mol/LpH8.0 Tris-HCl缓冲液(Ambion,93283)20μL，1mol/L氯化镁(Sigma-Aldrich，M2670)10μL，1mol/L二硫苏糖醇(Sigma-Aldrich，D0632)10μL，甘油(Sigma-Aldrich，G5516)0.5mL，焦碳酸二乙酯水(赛默飞，10514065)1.46mL。

于T75培养皿中培养HEK293细胞至60％，更换培养基过夜。使用5mL胰酶处理培养细胞，加入15mL含FBS(Gibco，10099141C)的DMEM培养基(Sigma-Aldrich，D5796)。并于4℃500g离心5min收集细胞(约一至三百万细胞，原多时间生物素修饰核酸转录连缀测序需一千万细胞以上)。去除上清液，加入冰上冷却的pH7.4 PBS缓冲液(赛默飞，10728775)轻柔吹打清洗细胞，并于4℃500g离心5min收集细胞。去除上清，加入20mL冰上冷却的细胞透过化液，轻柔吹打重悬细胞，在冰上孵化5min，并于4℃500g离心5min收集细胞。去除上清液，加入15mL冰上冷却的细胞透过化液，轻柔吹打重悬细胞，4℃500g离心5min收集细胞。去除上清液，加入15mL冰上冷却的细胞透过化液，轻柔吹打重悬细胞，4℃500g离心5min收集细胞。去除上清液，使用移液枪尽量吸取残余液体，加入2mL冰上冷却的细胞储存液。轻柔的吹打细胞，使其充分重悬，并取各50μL分装于1.5mL离心管中，分装好的细胞需快速丢入装有液氮的储存罐中。此步骤所制成的细胞可于-80℃冰箱保存1个月。

2、多时间转录连缀

配置转录连缀液：1mol/L氯化镁(Sigma-Aldrich，M2670)2.25μL，1M pH8.0Tris-HCl缓冲液(Ambion,93283)4.5μL，0.1mol/L二硫苏糖醇(Sigma-Aldrich，D0632)4.5μL，RNA酶抑制剂(Ambion,AM2696)9μL，1mmol/L生物素标记腺嘌呤核苷三磷酸(PerkinElmer,NEL544001EA)22.5μL，1mmol/L生物素标记鸟嘌呤核苷三磷酸(PerkinElmer,NEL545001EA)22.5μL，1mmol/L生物素标记胞嘧啶核苷三磷酸(PerkinElmer,NEL542001EA)22.5μL，1mmol/L生物素标记尿嘧啶核苷三磷酸(PerkinElmer,NEL543001EA)22.5μL，2mol/L氯化钾(Sigma-Aldrich，P9333)67.5μL，焦碳酸二乙酯水(赛默飞，10514065)272.25μL。

将8管步骤1中所制备的膜透过性细胞置于37℃金属浴中预热1min，向每管中加入50μL转录连缀液，使用移液枪轻柔吹打混合。分别于0.5min，2min，8min，32min后向各两离心管中加入500μLTrizol(Ambion,115596018)终止反应。使用移液枪吹打混匀液体，置于冰上。

3、RNA提取

将步骤2中的离心管从冰上转移到室温孵化7min，每管加入130μL氯仿(赛默飞，10488400)，使用振荡器剧烈混匀15秒，于室温静置1min。于4℃14000g离心2min，转移上清至新离心管。每管加入1μL GlycoBlue(赛默飞，10301575)及与管中溶液等体积的异丙醇(赛默飞，BP2618)，使用振荡器混匀10秒。于室温静置10min后，4℃14000g离心20min。去除上清，加入30μL焦碳酸二乙酯水，溶解RNA沉淀。

4、RNA片段化

将步骤3中的RNA溶液置于冰上，加入7.5μL 1N氢氧化钠(赛默飞，10396240)，冰上孵化10min。加入37.5μL pH6.8 Tris-HCl缓冲液(VWR International Ltd,A4987)。用移液枪混匀溶液，滴入P-30过滤柱，4℃1000g离心4min。向滤过液中加入125μL焦碳酸二乙酯水，1μLGlycoBlue，8μL5mol/L氯化钠(Sigma-Aldrich，S9888)及0.5mL-20℃冷藏的乙醇(Sigma-Aldrich，51976-500ML)。轻微震荡混匀离心管中溶液，于4℃16000g离心30min。去除上清液，加入7μL焦碳酸二乙酯水，溶解RNA沉淀。

5、3’末端加接头

向步骤4中的RNA溶液中加入0.5μL 20μmol/L的3’RNA接头(rGrArUrCrGrUrCrGrGrArCrUrGrUrArGrArArCrUrCrUrGrArArC/invert dT/)，置于65℃金属浴热变性40秒，置于冰上冷却。向各管中加入，2μL 10X T4 RNA ligase buffer(NEB，M0204S)，1.5μL T4 RNALigase I(NEB，M0204S)，6μL PEG8000(NEB，M0204S)，1μL RNA酶抑制剂，2μL 10mmol/L腺嘌呤核苷三磷酸(NEB，P0756S)。使用移液枪混匀管中溶液，26℃孵化一小时。

6、磁珠结合

配置2倍浓度的磁珠清洗液：向50mL离心管中加入10mL 5mol/L氯化钠，250μL1mol/L pH7.4 Tris-HCl缓冲液，2.5mL 1％ Tween-20，12.25mL焦碳酸二乙酯水(DEPC水)。将160μL链霉亲和素磁珠C1(赛默飞，65001)加入离心管，置于磁力分离架上，去除溶液。使用500μL含0.1N氢氧化钠及50mM氯化钠的焦碳酸二乙酯水清洗管中磁珠两次，再使用100mM的氯化钠清洗磁珠一次。将离心管从磁力分离架上取下，加入165μL 2倍浓度的磁珠清洗液，吹打混匀，各取20μL向步骤5中的8个离心管中加入。在室温条件下于旋转孵化仪上孵化30min。将离心管置于磁力分离架，去除液体。使用焦碳酸二乙酯水1:1稀释2倍浓度的磁珠清洗液，后续使用其清洗磁珠。

7、5’末端酶处理

吸取步骤6中的液体，向各离心管中的磁珠加入15μL焦碳酸二乙酯水，1μL RNA5′焦磷酸水解酶(NEB，M0356S)，2μL反应缓冲液(NEB，M0356S)，1μL RNA酶抑制剂。轻微震荡混匀各离心管，将离心管置于37℃恒温箱中孵化1小时。

将离心管置于磁力分离架上，使用磁珠清洗液清洗磁珠。吸取磁珠清洗液，向各离心管中加入1μL T4多聚合核苷酸激酶，2μL反应缓冲液，2μL 10mmol/L腺嘌呤核苷三磷酸，1μL RNA酶抑制剂，13μL焦碳酸二乙酯水。轻微震荡混匀各离心管，将离心管置于37℃恒温箱中孵化30min。

8、5’末端加接头

将步骤7中的离心管置于磁力分离架上，使用磁珠清洗液清洗磁珠。吸取磁珠清洗液，向各离心管中加入6.5μL焦碳酸二乙酯水，0.5μL 20μmol/L的5’RNA接头(rCrCrUrUrGrGrCrArCrCrCrGrArGrArArUrUrCrCrA)，2μL 10X T4 RNA ligase buffer，1.5μL T4RNALigase I，6μL PEG8000，1μL RNA酶抑制剂，2μL 10mmol/L腺嘌呤核苷三磷酸。使用移液枪混匀管中溶液，26℃孵化1h。

9、磁珠洗脱

将步骤8中的离心管置于磁力分离架上，使用磁珠清洗液清洗磁珠两遍。向离心管中加入300μL Trizol，吹打混匀，室温静置3min。将溶液转移至另一离心管，向磁珠中加入200μL Trizol，吹打混匀，室温静置3min后与另一离心管中的Trizol溶液合并。向管中的500μL溶液中加入100μL氯仿，震荡混匀15秒。静置1min，4℃14000g离心2min。转移上清液到新离心管并加入等体积的异丙醇及1μL GlycoBlue，使用移液枪混匀，室温静置10min。离心管4℃16000g离心20min，去除液体，加入12μL焦碳酸二乙酯水溶解RNA沉淀。

10、逆转录

向步骤9中的RNA溶液中加入1μL 10mmol/L脱氧核苷酸(NEB，N0447)，1μL 25μmol/LRP1引物(AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTAC AGTCCGA)。将离心管置于65℃金属浴变性1min，置于冰上冷却。向各离心管中加入1.5μL Superscript III逆转录酶(赛默飞，12087539)，4μL First-stand缓冲液(赛默飞，12087539)，1μL 0.1mol/L二硫苏糖醇(赛默飞，12087539)，1μL RNA酶抑制剂。将离心管中溶液混匀，转移至200μL PCR管。将PCR管置于PCR仪，运行以下程序：37℃5min，45℃15min，50℃40min，55℃10min，70℃15min，4℃恒温。

11、聚合酶链式扩增

向步骤10的产物中加入4μL焦碳酸二乙酯水，25μL Q5 PCR mix()，1μL25μmol/LRPI-n引物(CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(SEQ ID NO.5)NNNNNNGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA(SEQ ID NO.6)，NNNNNN为illumina公司的IlluminaAdapter Sequences中TruSeq Small RNA部分中的Index1(RPI1)～Index48(RPI48)中的Adapter序列，具体为：CGTGAT、ACATCG、GCCTAA、TGGTCA、CA CTGT、ATTGGC、GATCTG、TCAAGT、CTGATC、AAGCTA、GTAGCC、TACAAG、TTGACT、GGAACT、TGACAT、GGACGG、CTCTAC、GCGGAC、TTTCAC、GGC CAC、CGAAAC、CGTACG、CCACTC、GCTACC、ATCAGT、GCTCAT、AGGAAT、CTTTTG、TAGTTG、CCGGTG、ATCGTG、TGAGTG、CGCCTG、GCCATG、AAAATG、TGTTGG、ATTCCG、AGCTAG、GTATAG、TCTGAG、GTCGTC、CGATTA、GCTGTA、ATTATA、GAATGA、TCGGGA、CTTCGA、TGCCGA)。PCR仪运行以下程序：95℃5min，(95℃30秒，56℃30秒，72℃30秒)循环15次，72℃10min，4℃恒温。

12、纯化回收

将步骤11的产物转移至1.5mL离心管，各管加入750μL乙醇，232μL焦碳酸二乙酯水，18μL 5mol/L氯化钠，混匀。置于-80℃冷却20min，4℃16000g离心30min。去除上清，置于通风橱风干5min。向每管中加入50μL焦碳酸二乙酯水，溶解DNA沉淀。各取20μL溶液至新离心管(剩余溶液于-80℃保存备用)，加入4μL 6X橙色上样缓冲液(NEB，B7022S)。将样品分为两孔上样于预制PAGE胶(赛默飞，XP00100BOX)，15mA电泳直至上样缓冲液跑出凝胶，SYBRGold(S33102)染色5min。于蓝光切胶仪中切取120bp至500bp范围凝胶(见图2，成功率8/8，原多时间生物素修饰核酸转录连缀测序建库方法成功率32/54)。将胶块放入底部由使用18G注射器针头打孔的500μL离心管，再将500μL离心管放入2mL离心管。5000g离心1min，使凝胶充分打碎进入2mL离心管。向离心管中加入200μL裂解液(NEB，T3012-1)，37℃震荡金属浴30min。向各离心管中加入1mLDNA Cleanup Binding Buffer(NEB，T1030S)，混匀，4000g离心30秒。取约580μL溶液至洗脱柱，根据使用说明书回收DNA片段(NEB，T1030S)。

实施例2磁珠富集体系优化实验

本实施例磁珠富集体系进行优化实验，使用相同浓度的生物素连缀RNA作为起始物，使用三种不同的磁珠及三种不同的磁珠预处理及清洗体系；磁珠包括：M280磁珠、C1磁珠、T1磁珠，缓冲液包括：PRO-seq，4sU DRB-seq，TimeLapse-seq；实验重复两次，所回收的RNA浓度的平均值见表1：

表1 RNA浓度检测(ng/μL)

准备18个离心管，各6管分别加入M280磁珠、C1磁珠、T1磁珠20μL。将离心管置于磁力分离架，静置一分钟，去除上清液。使用500μL含0.1N氢氧化钠及50mM氯化钠的焦碳酸二乙酯水清洗管中磁珠两次，再使用含100mM氯化钠的焦碳酸二乙酯水清洗磁珠一次，去除上清液。将离心管从磁力分离架上取下，各种磁珠分别使用三种磁珠清洗流程进行生物素标记的RNA回收各2管。

PRO-seq磁珠结合清洗方法为：混合10μL结合缓冲液与10μL 2ng/μL生物素标记RNA溶液，加入带有经过清洗的磁珠的离心管，在室温条件下于旋转孵化仪上孵化30min。将离心管置于磁力分离架，去除液体。使用500μL低盐缓冲液清洗磁珠，于磁力分离架静置1分钟，去除上清液；使用500μL结合缓冲液清洗磁珠，于磁力分离架静置1分钟，去除上清液，重复两次；使用500μL高盐缓冲液清洗磁珠，于磁力分离架静置1分钟，去除上清液，重复两次。低盐缓冲液配方为：5mM Tris-HCl pH7.4，0.1％Triton X-100，溶解于焦碳酸二乙酯水；结合缓冲液配方为：10mM Tris-HCl pH7.4，300mM NaCl，0.1％Triton X-100，溶解于焦碳酸二乙酯水；高盐缓冲液配方为：50mM Tr is-HCl pH7.4，2M NaCl，0.5％Triton X-100，溶解于焦碳酸二乙酯水。

4sU DRB-seq磁珠清洗方法为：混合10μL二倍浓度磁珠清洗液与10μL 2ng/μL生物素标记RNA溶液，加入带有经过清洗的磁珠的离心管，在室温条件下于旋转孵化仪上孵化30min。将离心管置于磁力分离架，去除液体。使用500μL磁珠清洗液清洗磁珠，于磁力分离架静置1分钟，去除上清液，重复两次；二倍浓度磁珠清洗液配方为：2M氯化钠，5mM pH7.4Tris-HCl缓冲液，0.05％ Tween-20，溶解于焦碳酸二乙酯水。磁珠清洗液配方为：向二倍浓度磁珠清洗液种加入等体积焦碳酸二乙酯水进行稀释。

TimeLapse-seq磁珠清洗方法为：混合10μL磁珠清洗液与10μL 2ng/μL生物素标记RNA溶液，加入带有经过清洗的磁珠的离心管，在室温条件下于旋转孵化仪上孵化30min。将离心管置于磁力分离架，去除液体。使用500μL磁珠清洗液清洗磁珠，于磁力分离架静置1分钟，去除上清液，重复两次；磁珠清洗液配方为：1M氯化钠，100mM pH7.4 Tris-HCl缓冲液，0.05％ Tween-20，10mM乙二胺四乙基二钠，溶解于焦碳酸二乙酯水。

将上述18个离心管置于磁力分离架上中各加入300μL Trizol，吹打混匀，室温静置3min。将溶液转移至另一离心管，向磁珠中加入200μL Trizol，吹打混匀，室温静置3min后与另一离心管中的Trizol溶液合并。向管中的500μL溶液中加入100μL氯仿，震荡混匀15秒。静置1min，4℃14000g离心2min。转移上清液到新离心管并加入等体积的异丙醇及1μLGlycoBlue，使用移液枪混匀，室温静置10min。离心管4℃16000g离心20min，去除液体，加入12μL焦碳酸二乙酯水溶解RNA沉淀。并使用Qub it检测RNA浓度。

经对比，最后采用了TimeLapse-seq所使用的C1磁珠及4sU DRB-seq所使用的磁珠清洗及缓冲液体系取代了原多时间生物素修饰核酸转录连缀测序建库方法所使用的M280磁珠及PRO-seq缓冲液体系；在该体系下，RNA浓度显著高于其他体系。

上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。