一种筛选pH响应自组装多肽的方法

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种筛选pH响应自组装多肽的方法。

背景技术

多肽具有良好的生物相容性、可降解性以及低免疫原性。多肽的自组装特性有利于设计具有特定功能的新型生物材料。智能多肽的响应性和可调节的微环境适应能力是实现多种体内生物应用精确控制的关键。多肽和蛋白质的自组装能力形成多样的结构和材料，构成生命的基础。自组装能力来源于多肽分子内和分子间一系列的非共价相互作用：氢键、盐桥、金属螯合、疏水相互作用、π–π相互作用以及范德华力。这类非共价相互作用弱于共价键，因此自组装多肽高度敏感于某些环境因素的变化，这些环境因素包括温度、光照、离子强度以及pH等等，这一现象为设计以多肽为基础的新型条件响应性功能材料提供了发展的可能。尤其是在生物医药领域，对于生物体内各处差异巨大的体内环境，尤其是针对正常组织与肿瘤内环境的pH差异，设计一种可按需变形的pH响应自组装多肽，是一项非常有意义的研究，然而这种设计难度大、耗时长，远远不能满足多领域的应用需求。

“一珠一物”化学肽库(OBOC library)是一种广泛应用于高通量发现针对细胞表面受体、靶蛋白的配体、针对小分子的宿主分子、蛋白酶底物等分子的策略。在化学合成过程中，除了天然氨基酸，“一珠一物”化学肽库还可以通过引入有机分子和非天然氨基酸，进一步提高库容量，创造更多结构的可能性，并且它合成过程简单稳定，产物易得。

ThioflavinT(ThT)是阳离子苯并噻唑(benzothiazole)衍生物，在盐酸的参与下，通过脱氢硫甲苯胺(dehydrothiotoluidine)的甲基化而成，是一种常用的蛋白质多肽荧光染料，可以和富含β折叠的结构结合。一旦结合，硫磺素T的发射光谱就会发生红移，并且荧光强度增强，适合用于检测多肽自组装体的产生。

CN113648277A公开了一种抗肿瘤联合用药的pH响应多肽水凝胶、制法及应用，多肽序列为VKVKVOVK-VDPPT-KVEVKVKV，所述多肽的合成方法为：(1)多肽C端首个氨基酸连接到树脂上：将用Fmoc保护的氨基酸、HBTU、HOBt和DIPEA溶于DMF中，加入到含有树脂的多肽反应器中，将首个氨基酸C端连接到溶胀的Rink树脂上；(2)Fmoc保护基的脱除：在DCM充分鼓吹下，脱去首个氨基酸的Fmoc保护基；(3)氨基酸偶合：将活化剂HBTU加入到多肽反应器中，用DCM洗涤完成偶合；(4)重复步骤(2)和步骤(3)，按照设计的序列，依次引入对应的氨基酸；(5)肽链的切割：以TFA/TIS/EDT/H2O作为切割剂，得到多肽粗品；(6)多肽的纯化：对多肽粗品进行分析纯化，得到多肽，但是此种pH响应多肽合成方法需要对多肽粗品进行分析纯化，操作复杂，成本高，得到多肽数量较少。

CN113754730A公开了可以自组装形成PH响应载药水凝胶的多肽、水凝胶及其制备方法和用途，所述的可以自组装形成PH响应载药水凝胶的多肽的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)将第一个氨基酸共价连接到树脂上：加入缩合剂HBTU和HOBt，使被保护氨基酸羧基端与树脂形成共脂以完成氨基酸的固定；(2)去保护：采用碱性溶剂去除氨基上的Fmoc，暴露出氨基；(3)激活和交联：采用活化剂HBTU和HOBt活化下一个氨基上的羧基，与树脂上的氨基交联，形成肽键；(4)重复(2)和(3)，反复循环添加单体氨基酸，按照FOVVVEF序列的顺序从右到左合成，直到合成完成；(5)乙酰化：采用碱性溶剂去除氨基上的Fmoc，暴露出氨基，加入乙酸酐和DIEA，反应；(6)洗脱和脱保护：采用脱保护剂三氟乙酸将肽链从树脂上洗脱下来，并脱除保护基，HPLC分析纯化，冻干保存，但是此种pH响应多肽合成方法需要对多肽粗品进行分析纯化，操作复杂，成本高，得到多肽数量较少。

综上所述，目前pH响应多肽合成方法存在需要对多肽粗品进行分析纯化，操作复杂，成本高，得到多肽数量较少等问题。如何提供一种高通量且简便的筛选pH响应自组装多肽方法，已成为目前生物医学技术领域亟待解决的问题之一。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种筛选pH响应自组装多肽的方法，解决了目前pH响应多肽合成方法存在的需要对多肽粗品进行分析纯化，操作复杂，成本高，得到多肽数量较少等问题，实现了高通量、快速高效地筛选pH响应自组装多肽。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种筛选pH响应自组装多肽的方法，所述方法包括：

合成多肽库，将所述多肽库与荧光分子混合进行共孵育，筛选发荧光的多肽与荧光分子混合进行再次孵育，筛选荧光淬灭的多肽，得到pH响应自组装多肽；所述共孵育的体系的pH为7.5～8；所述再次孵育的体系的pH为3～6.5。

本发明的筛选方法具有通量高、筛选效率高、筛选过程简单等优势，容易实现自动化，有利于发现具有理想性能的新型纳米材料，在为生物医学和材料应用领域研发新型纳米结构方面具有重要意义。

上述7.5～8中的具体点值可以选择7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8等。

上述3～6.5中的具体点值可以选择3、3.1、3.2、4、5、6、6.1、6.4、6.5等。

可以理解，本发明中所述荧光分子指在特定激发波长下，根据所处环境的性质，可发出特定波长(发射波长)荧光的小分子。

优选地，所述多肽库的合成方法包括一珠一化合物法。

优选地，所述多肽库中多肽长度为7～10aa。

优选地，所述荧光分子包括ThT、尼罗红。

优选地，所述共孵育的时间为2～4h。

上述7～10中的具体点值可以选择7、8、9、10等。

上述2～4中的具体点值可以选择2、3、4等。

优选地，所述多肽库的合成方法包括以下步骤：

(1)在树脂微珠上合成前导序列；

(2)将树脂微珠均分后，将一个Fmoc保护的氨基酸进行活化并加入树脂微珠中，与脱保护的前一个氨基酸进行缩合反应；

(3)将树脂微珠混合，进行Fmoc脱保护，重复步骤(2)和(3)，直至最后一个氨基酸合成完成，得到所述多肽库。

本发明中，在固相合成过程中，通过对树脂微珠的多次混合与均分，使每个树脂微珠上带有唯一一种随机多肽序列，构建得到多肽库。

本发明中，首先在树脂微珠上合成含有甲硫氨酸的前导序列，主要作用是CNBr

根据本发明，前导序列中还含有其他19种氨基酸中的任意一种或多种，优选为含有甘氨酸(G)，用于将树脂微珠与功能性多肽相间隔。

本发明中，合成长度为7～10aa的多肽构建多肽库，不仅丰富了多肽的序列多样性，提高了多肽库中的多肽数量，理论上多肽库中含有19

优选地，步骤(1)所述前导序列的长度为2～4aa。

上述2～4中的具体点值可以选择2、3、4等。

优选地，所述前导序列包括甲硫氨酸。

优选地，步骤(2)所述活化的试剂包括N,N-二甲基甲酰胺、甲醇、N-甲基吗啉、N,N'-二异丙基碳二亚胺或1-羟基苯并三唑中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，步骤(3)所述脱保护的试剂包括含有六氢吡啶的DMF溶液或含有哌嗪和1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯的DMF溶液。

第二方面，本发明提供了一种pH响应自组装多肽，所述pH响应自组装多肽由第一方面所述的筛选pH响应自组装多肽的方法筛选得到，所述pH响应自组装多肽的氨基酸序列包括SEQ ID NO.1～6所示的序列中任意一种。

SEQ ID NO.1：LVEFRHY。

SEQ ID NO.2：FGTFWPY。

SEQ ID NO.3：VAGFGRD。

SEQ ID NO.4：QFTQIYR。

SEQ ID NO.5：YHTQIYR。

SEQ ID NO.6：HEVFAYQ。

优选地，所述多肽具有pH依赖性的β折叠结构以及自组装能力。

作为优选技术方案，本发明提供了一种第二方面所述pH响应自组装多肽的筛选方法，所述方法包括以下步骤：

(1)在树脂微珠上首先合成含有甲硫氨酸的长度为2～4aa的前导序列；

(2)将树脂微珠均分后，将一个Fmoc保护的氨基酸进行活化并加入树脂微珠中，与脱保护的前一个氨基酸进行缩合反应；

(3)将树脂微珠混合，采用含有六氢吡啶的DMF溶液进行Fmoc脱保护，重复步骤(2)和(3)，直至最后一个氨基酸合成完成，得到所述多肽库，所述多肽库中多肽的长度为7～10aa；

(4)将步骤(3)的多肽库置于pH7.5的PBS缓冲液中，并加入荧光分子ThT作为自组装指示剂25℃孵育2h，收集发出荧光的树脂微珠，得到在pH7.5环境中具有自组装能力的多肽；

(5)将步骤(4)得到的树脂微珠转移到pH6.5的PBS缓冲液中，加入与步骤(4)相同的ThT，随后弃去发出荧光的树脂微珠，对荧光淬灭的树脂微珠进行测序，得到具有pH响应性的自组装多肽；

(5)将树脂经过裂解去除侧链保护基团，获得脱离树脂的多肽，进一步测序确认多肽包括如SEQ ID NO.1～6所示的氨基酸序列。

上述2～4中的具体点值可以选择2、3、4等。

上述7～10中的具体点值可以选择7、8、9、10等。

根据本发明，一珠一化合物(one-bead-one-compound，OBOC)法是一种组合化学方法，基于OBOC方法建立的多肽库主要用于筛选具有pH响应自组装功能的多肽，具有通量高、筛选效率高等优势；本发明利用多肽库与荧光分子ThT及pH7.5和pH6.5的PBS缓冲液，最终得到在pH7.5的环境中能够形成β折叠结构，从而自组装成纳米纤维，并在环境pH降低为6.5时，转化为纳米颗粒，经过测序得到多肽的氨基酸序列；本发明的方法建立了环境因素(pH)与多肽β折叠结构形成自组装之间的联系，为发现pH响应自组装多肽提供了简便易行的方法，为进一步研发pH响应多肽纳米材料提供了依据。

第三方面，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子含有第二方面所述的pH响应自组装多肽的编码序列。

第四方面，本发明提供了一种重组载体，所述重组载体含有第三方面所述的核酸分子。

第五方面，本发明提供了一种重组细胞，所述重组细胞含有第三方面所述的核酸分子和/或第四方面所述的重组载体。

第六方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括第二方面所述的pH响应自组装多肽。

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。

第七方面，本发明提供了第二方面所述的pH响应自组装多肽或第六方面所述的药物组合物在制备治疗疾病的药物中的应用。

优选地，所述疾病包括肿瘤、炎性或感染中的任意一种或至少两种的组合。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明的多肽筛选方法具有通量高、筛选效率高等优势，不仅发现生物上有用的纳米材料，而且允许我们识别新的肽基序，以无偏差的方式进行自组装，筛选过程简单，容易实现自动化，物理化学条件，如pH、离子强度、溶剂、温度、电流和磁场也可以纳入筛选步骤。在不同条件下连续筛选固定化OBOC文库，结合光谱分析，有利于发现具有理想性能的新型纳米材料，包括在生物医学应用中非常重要的刺激响应性能；

(2)采用本发明筛选的多肽在pH7.5的环境中能够自组装成纳米纤维或纳米，并在环境pH降低为6.5时，转化为纳米颗粒，成功在调控环境pH的条件下筛选出的多肽制备成水凝胶，这种多肽水凝胶分子量小、细胞毒性低、生物相容性好，作为一种新型纳米生物材料，为发现更多可与活性细胞相互作用并具有独特性质的自组装多肽并将其组合成各种生物医学应用的新型纳米材料提供了技术支持。

附图说明

图1A为多肽库在pH7.5环境中的荧光显微镜图；

图1B为多肽库在pH6.5环境中的荧光显微镜图；

图2为SEQ ID NO.1分别在pH7.5和pH6.5环境中的透射电镜图；

图3A为SEQ ID NO.1在pH7.5和pH6.5环境中的透射电镜图；

图3B为SEQ ID NO.2在pH7.5和pH6.5环境中的透射电镜图；

图3C为SEQ ID NO.3在pH7.5和pH6.5环境中的透射电镜图；

图4为SEQ ID NO.1在pH7.5和pH6.5的圆二色谱信号图；

图5为多肽形成水凝胶的结果图；

图6为多肽水凝胶包裹Hela细胞并实现pH响应性释放图。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1

OBOC多肽库的建立。

本实施例利用OBOC法在树脂微珠(beads)上合成多肽库，步骤如下：

(1)取1.8g树脂beads置于合成管中，加入DMF浸没树脂进行树脂溶胀，浸泡2h；

(2)向合成管中加入Fmoc保护的甲硫氨酸(M)，并加入HOBT(1-羟基苯并三唑)和DIC(N,N'-二异丙基碳二亚胺)的混合液，摇床反应2h，用甲醇和DMF反复交替冲洗三次，冲洗过程中用吸管反复将beads吹起，之后对beads进行茚三酮沸水浴检验，beads显色为无色；

(3)加入脱保护剂(20％六氢吡啶+80％DMF)进行Fmoc脱保护10min，用甲醇和DMF反复交替冲洗三次，冲洗过程中用吸管反复将beads吹起，之后对beads进行茚三酮沸水浴检验，beads显色为深蓝紫色；

(4)向合成管中加入Fmoc保护的甘氨酸(G)，重复步骤(2)和(3)；

(5)将合成管中的树脂平均分为19份，向每一支合成管中加入相同剂量的Fmoc保护的氨基酸(除甲硫氨酸之外的19种天然氨基酸)和HOBT(1-羟基苯并三唑)/DIC(N,N'-二异丙基碳二亚胺)混合液，摇床反应合成6h；

(6)用甲醇和DMF反复交替冲洗三次，冲洗过程中用吸管反复将beads吹起，确保充分混合冲洗；

(7)抽检其中6种多肽的合成效率，取出beads用乙醇浸泡后进行茚三酮沸水浴检验，重复步骤(5)～(7)，直至beads变为无色，将所有合成管中的树脂混合，进行Fmoc脱保护；

(8)重复步骤(5)～(8)，直至最后一个氨基酸合成完成；

(9)用脱保护剂(20％六氢吡啶+80％DMF)脱去侧链Fmoc保护基后，依次用DMF、甲醇、DMF冲洗三次，25℃下避光干抽15min，得到干燥的树脂；将干燥的树脂转移至小反应瓶(提前烘干)中，加入磁子，用酸性脱保护剂(TFA82.5％、苯酚5％、水10％、TRIS2.5％)脱去所有的酸响应侧链保护基，25℃反应4h，构建得到多肽库，多肽库在pH7.5环境中的荧光显微镜图如图1A所示，多肽库在pH6.5环境中的荧光显微镜图如图1B所示。

实施例2

筛选在pH7.5和pH6.5环境中转换自组装形态的多肽。

(1)将多肽库置于pH7.5的PBS缓冲液中并加入组装指示剂ThT进行孵育2h，收集发出荧光的树脂微珠，得到在pH7.5环境中具有自组装能力的多肽；

(2)将上一步得到的树脂微珠转移到pH6.5的PBS缓冲液中，加入ThT，随后弃去发出荧光的树脂微珠，留下荧光淬灭的树脂微珠，得到具有pH响应性的自组装多肽树脂微珠；

(3)挑选出的多肽树脂微珠用超纯水洗涤并干燥，采用30％的CNBr

实施例3

测量多肽在不同pH下的ThT荧光变化。

(1)多肽SEQ ID NO.1使用pH6.5的PBS配成200μM溶液，加入β折叠荧光探针ThT 20μM后25℃培养30min，注入石英比色皿，使用荧光分光光度计测量溶液在488nm的荧光发射强度；

(2)步骤(1)中的溶液加入10M NaOH溶液使pH上升为7.5后，25℃培养30min，测量荧光强度。

结果如图2所示，多肽在pH7.5环境中，ThT荧光强度是pH6.5时的6.5倍，说明多肽在pH7.5环境中形成了更多的β折叠结构。

结果表明：多肽在pH7.5环境中对比pH6.5中的β折叠结构有显著提升。步骤(1)和步骤(2)使用同一多肽溶液，仅调整pH，说明多肽的结构能够根据pH变化发生变化，实验结果说明了成功筛选出pH响应性的多肽，验证了筛选结果的可靠性。

实施例4

多肽自组装调控。

SEQ ID NO.1～3用DMSO配成20mM母液，随后用水配成200μM溶液，25℃培养4h后，用滴样法在铜网碳支持膜上制样，使用六硼化镧电子透射显微镜观察多肽纳米结构的形貌。

结果如图3A、图3B和图3C所示，表明SEQ ID NO.1～3三条多肽均显示出pH依赖的纳米形貌变化，结果表明筛选得到的多肽均是可发生pH响应性的纳米形貌变化的多肽，证明筛选方法是可靠且高效的。

实施例5

多肽在不同pH条件下圆二色谱信号的变化。

SEQ ID NO.1用水配成200μM pH7.5，pH6.5溶液，使用圆二色谱仪，波长190-230nm，速度300nm/min进行测试三次，取三次的平均色谱，结果如表1和图4所示。

表1

结果：表1和图4的结果显示SEQ ID NO.1在pH7.5的条件下形成更多β-折叠结构，而在pH6.5条件下形成多为α螺旋结构。此实验结果和筛选的目的相符合，即得到的多肽在pH7.5条件下拥有更多β折叠结构，而在pH6.5条件下没有明显的β折叠结构，证明了筛选方法选用ThT作为荧光探针的优越性。

实施例6

多肽水凝胶的制备。

(1)SEQ ID NO.1取10mg溶解于10μL DMSO中，加入1mL水超声10min后配成pH7.5的溶液，25℃静置4h使多肽溶液成胶；

(2)在上述多肽水凝胶中滴入1M HCl直至pH达到6.5，观察到水凝胶解散成为溶液。

如图5所示，SEQ ID NO.1可以通过pH调节在水凝胶和溶液状态下多次转换。

结果：由实施例6可见，筛选得到的多肽在pH值改变时，组装的形貌改变，由此形成水凝胶和溶液的两种状态；同时表明了本发明的筛选方法优越性，可用于筛选含β-折叠纤维结构且能成水凝胶的多肽序列。

实施例7

多肽水凝胶包裹癌细胞并实现pH响应性释放。

(1)多肽溶液10mg/mL 50μL和4×10

(2)加入DMEM培养基，37℃培养箱培养4h；

(3)使用calcein-AM/PI进行活死双染，用共聚焦显微镜进行观察；

(4)加入适量0.1M HCl将pH调至6.5，用共聚焦显微镜观察细胞从水凝胶中被释放到溶液中，结果如图6所示。

结果：由实例7可见，本发明的筛选方法得到的多肽水凝胶可用于细胞实验，筛选的多肽材料具有极好的生物安全性，且其因不同pH导致的从水凝胶到溶液的状态转变可被应用到癌细胞的包裹和定向释放中，证明了本发明的筛选方法的实用性。

综上所述，本发明的筛选方法具有通量高、筛选效率高、筛选过程简单等优势，容易实现自动化，有利于发现具有理想性能的新型纳米材料，在为生物医学和材料应用领域研发新型纳米结构方面具有重要意义。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。