抗体制剂

技术领域

本发明涉及抗体分子的稳定制剂。公开的制剂与冻干形式和液体形式相容，并且还适合静脉内和/或皮下施用途径。

背景技术

在过去的二十年中，重组DNA技术已导致许多蛋白质(特别是抗体治疗剂)的商业化。这些治疗性抗体的有效性主要取决于稳定性、施用途径以及它们的剂型和浓度。继而，需要适当地配制治疗性抗体以保持治疗性抗体的稳定性和活性。

用于每种施用途径和剂型的制剂可以是独特的，并且因此具有特定要求。固体剂型(例如冻干粉剂)通常比液体(水性)制剂更稳定。然而，相对于液体制剂，冻干制剂的重构需要显著的小瓶过量填充、在处理时当心、并且而涉及高的生产成本。虽然液体制剂在这些方面是有利的，并且通常对于可注射蛋白质治疗剂而言是优选的(就最终用户的便利性和制造商的制备容易性而言)，但鉴于蛋白质在诸如温度、pH值变化、搅拌等胁迫下易于变性、聚集、降解和氧化，此种形式可能并不总是可行的。这些胁迫因素均可能导致治疗性蛋白质/抗体的生物学活性的丧失。特别地，高浓度液体制剂易于降解和/或聚集。然而，由于降低了施用的频率和注射体积，可能期望高浓度制剂用于皮下或静脉内施用途径。另一方面，特定的治疗方案和剂量可能需要低浓度制剂，并且优选静脉内施用途径，以用于实现治疗药物的更可预测的递送以及完全生物利用度。

因此，设计在高或低浓度的治疗性蛋白质/抗体下稳定，有助于不同的施用途径(静脉内或皮下)并且适合冻干或液体形式的制剂造成了重大的开发挑战。此外，每种具有其独特的特征和降解特性的蛋白质或抗体增加了开发稳定的制剂的复杂性，并且可能需要特定的制剂。

治疗性蛋白质或抗体的稳定的制剂涉及多种稳定剂/赋形剂(包括氨基酸、糖、多元醇、表面活性剂、盐、聚合物、胺、抗氧化剂、螯合剂等)的添加。许多FDA批准的治疗性蛋白质/抗体含有一种以上稳定剂。

具有增加的蛋白质和/或稳定剂浓度的制剂组合可增加制剂的粘度，继而增加注射部位的疼痛和注射时间，并且在药物原料的加工过程中也造成困难。因此，有必要开发处于冻干形式以及液体形式的改进的制剂，其含有最小量或浓度的赋形剂，并且在宽范围的浓度下稳定药物。

发明简述

本发明公开了抗体的稳定的药物制剂，所述制剂包含缓冲剂、糖和表面活性剂。根据本发明的抗体结合α4β7。公开的α4β7抗体制剂在50℃下稳定2周，并且在上述储存条件下，制剂中抗体的聚集体和片段含量的变化小于约1.5％。此外，糖的浓度小于80mg/ml，优选小于70mg/ml。制剂任选地含有充当稳定剂的游离氨基酸。

本发明公开了一种α4β7抗体的稳定的药物制剂，所述制剂包含缓冲剂、糖、游离氨基酸和表面活性剂。公开的α4β7抗体制剂在50℃下稳定2周。此外，抗体在制剂中的聚集体和片段含量的变化在50℃下2周小于1％。

特别地，本发明公开了α4β7抗体制剂中最佳且更低浓度的赋形剂(即糖和游离氨基酸)的组合。公开的制剂的赋形剂在加速条件下控制聚集体和碎片含量的变化，此外维持了主峰含量。

附图简述

图1说明了多种糖对根据实施例制备并使用SEC色谱分析的维多珠单抗(60mg/ml)制剂的LMW、HMW和单体含量的影响。在50℃的储存条件下2周期间，图1(a)代表LMW含量，图1(b)代表聚集体含量，并且图1(c)代表单体含量。

图2说明了在50℃下2周后，多种糖对根据实施例1制备并使用IEX色谱分析的维多珠单抗(60mg/ml)制剂的主峰含量的影响。

图3说明了增加的蔗糖浓度对根据实施例2制备并使用SEC色谱分析的维多珠单抗(60mg/ml)制剂的LMW、HMW和单体含量的影响。在50℃的储存条件下2周期间，图3(a)代表LMW含量，图3(b)代表聚集体含量，并且图3(c)代表单体含量。

图4说明了在50℃下2周后，增加的蔗糖浓度对根据实施例2制备并使用IEX色谱分析的维多珠单抗(60mg/ml)制剂的主峰含量的影响。

图5说明了氨基酸和糖浓度对根据实施例3制备并使用SEC色谱分析的维多珠单抗(60mg/ml)制剂的LMW、HMW和单体含量的影响。在50℃的储存条件下2周期间，图5(a)代表LMW含量，图5(b)代表聚集体含量，并且图5(c)代表单体含量。

图6说明了在50℃下2周后，氨基酸和糖浓度对根据实施例3制备并使用IEX色谱分析的维多珠单抗(60mg/ml)制剂的主峰含量的影响。

图7说明了缓冲剂对根据实施例4制备并使用SEC色谱分析的维多珠单抗(60mg/ml)制剂的LMW、HMW和单体含量的影响。在50℃的储存条件下2周期间，图7(a)代表LMW含量，图7(b)代表聚集体含量，并且图7(c)代表单体含量。

图8说明了在50℃下2周后，缓冲剂对根据实施例4制备并使用IEX色谱分析的维多珠单抗(60mg/ml)制剂的主峰含量的影响。

发明详述

术语“抗体”是指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白或其抗原结合部分。本文所使用的“抗体”涵盖完整抗体或其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或其融合蛋白。

术语“稳定的”制剂是指其中的抗体在储存时保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性的制剂。

稳定性研究提供了一段时间内多种环境因素的影响下抗体质量的证据。ICH的“Q1A：新药原料和产品的稳定性测试”指出了加速的稳定性研究中的数据可用于评价抗体运输过程中可能发生的高于或低于标记储存条件的短期偏移的影响。

多种分析方法可用于测量药物制剂中抗体的物理和化学降解。如果在肉眼检查颜色和/或透明度、或通过UV光散射、或通过体积排阻色谱测量时基本上未显示出聚集、沉淀和/或变性迹象，则抗体在药物制剂中“保持了其物理稳定性”。当抗体显示无产物变体形成或最小量的产物变体形成时，则称抗体在药物制剂中“保持了其化学稳定性”，所述产物变体可包括由于对感兴趣的抗体的化学修饰(如脱氨、氧化等)而导致的产物变体。诸如离子交换色谱和疏水离子色谱等的分析方法可用于研究化学产物变体。

本文使用的术语“单体”描述了由两条轻链和两条重链组成的抗体。通常通过尺寸排阻色谱(SEC)分析抗体组合物的单体含量。根据SEC的分离原理，大分子或具有高分子量(HMW)的分子首先被洗脱，然后较小或较低分子量的分子被洗脱。在抗体组合物的典型SEC谱中，聚集体(可包括二聚体、多聚体等)首先被洗脱，然后单体被洗脱，且被剪切的抗体变体或降解物可最后被洗脱。在一些情况下，聚集体峰或降解物峰可不以基线分离峰洗脱，而是以肩峰或异常宽的峰洗脱。为维持抗体(特别是治疗性抗体)的适当活性，期望减少产物的片段化或聚集体的形成，并由此将单体含量控制在目标值。在稳定性研究期间的多个时间点测量的抑制聚集体和降解物含量形成的能力可表明候选制剂对感兴趣的抗体的适合性。TOSCH的TSK-GEL G3000SWXL(7.8mm×30cm)色谱柱可用于水HPLC以进行SEC。

本文使用的术语“主峰”是指在阳离子交换色谱过程中大量洗脱的峰(主峰)。在阳离子交换色谱过程中比主峰更早洗脱，具有相对于主峰为酸性的电荷的峰被称为酸性变体峰。在阳离子交换色谱过程中比主峰更晚洗脱，具有相对于主峰为碱性的电荷的峰被称为碱性变体峰。主峰含量可通过离子交换色谱(IEC)确定。存在两种可用的IEC模式，即阳离子交换色谱和阴离子交换色谱。带正电的分子结合至阴离子交换树脂，而带负电的分子结合至阳离子交换树脂。在抗体组合物的阳离子交换色谱的典型分布中，酸性变体首先洗脱，然后是主峰，然后是碱性变体。酸性变体是抗体修饰(例如天冬酰胺残基脱酰胺)的结果。碱性变体是C末端赖氨酸残基不完全去除的结果。通常，在抗体中，赖氨酸残基在重链和轻链的C末端均存在。重链和轻链均含有赖氨酸的抗体分子称为K2变体，重链和轻链中的任何一个含有赖氨酸残基的抗体分子称为K1变体，并且不具有赖氨酸残基的抗体分子为K0分子。羧肽酶B(CP-B酶)酶作用于K2和K1变体上存在的C末端赖氨酸残基，从而将其转化为K0分子。根据情况，可对用羧肽酶B(CP-B)酶消化的样品进行IEC分析。在典型的稳定性研究中，预期在研究过程中稳定的配制剂导致电荷变体(酸性和碱性变体)的形成减少，从而将主峰含量的任何减少最小化。

本文使用的术语“游离氨基酸”是指包含在制剂中并且不是缓冲剂组分的一部分的氨基酸。氨基酸可以以其D-和/或L-形式存在。氨基酸可以以任何合适的盐(例如盐酸盐，例如精氨酸盐酸盐)的形式存在。

盐的实例包括但不限于氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫氰酸钠、硫氰酸铵、硫酸铵、氯化铵、氯化钙、氯化锌和/或乙酸钠。

药学上可接受的赋形剂是指可有助于抗体在制剂中的稳定性的添加剂或载体。赋形剂可涵盖稳定剂和张力调节剂。稳定剂和张力调节剂的实例包括但不限于糖、多元醇、盐、表面活性剂以及它们的衍生物和组合。

本文的糖包括糖和糖醇(例如多元醇)。糖可指单糖、二糖和多糖。糖的实例包括但不限于蔗糖、海藻糖、葡萄糖、右旋糖、棉子糖等。多元醇的实例包括但不限于甘露醇，山梨糖醇和其它。

表面活性剂是指用于保护蛋白质制剂免受多种压力条件(例如搅动、剪切、暴露于高温等)的药学上可接受的赋形剂。合适的表面活性剂包括但不限于聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯，例如Tween 20

通过参考以下实例更全面地描述了本发明的某些特定方面和实施方式。然而，这些实例不应以任何方式解释为限制本发明的范围。

本发明公开了抗体的稳定药物制剂，所述制剂包含缓冲剂、糖和表面活性剂。

在以上实施方式中，抗体为治疗性单克隆抗体。

在上述实施方式中，治疗性抗体结合α4β7。

在本发明的一个实施方式中，公开了α4β7抗体的稳定的药物制剂，所述制剂包含缓冲剂、糖和表面活性剂，其中糖的浓度小于80mg/ml、优选小于70mg/ml、更优选60mg/ml。

在上述实施方式中，α4β7抗体制剂中存在的糖在储存条件下控制聚集体和片段的形成。

在上述实施方式中，制剂中α4β7抗体的聚集体和片段含量的变化在50℃下持续2周小于1.5％。

在任一上述实施方式中，制剂任选地含有药学上可接受的赋形剂，例如氨基酸和盐。

在另一实施方式中，本发明公开了包含缓冲剂、糖、游离氨基酸和表面活性剂的稳定的α4β7抗体。

在上述实施方式中，糖的浓度小于70mg/ml，优选30mg/ml，游离氨基酸的浓度小于15mg/ml，优选约5mg/ml，其有效地控制了制剂中抗体的聚集体和片段含量的增加。

在以上实施方式中，公开的含有糖和游离氨基酸的α4β7抗体制剂在50℃下稳定2周，并且将制剂中抗体的聚集体和片段含量的变化控制为小于1％。

在本发明的任一上述实施方式中，缓冲剂包括有机缓冲剂、无机缓冲剂和/或它们的组合。

在上述实施方式中，有机缓冲剂包括组氨酸、琥珀酸盐或醋酸盐缓冲剂以及它们的盐。

在本发明的另一实施方式中，α4β7抗体的稳定的制剂包含无机缓冲剂、所述无机缓冲剂包括磷酸盐缓冲剂。

在实施方式中，本发明公开了α4β7抗体的稳定的药物制剂，所述制剂包含磷酸盐缓冲剂、至少60mg/ml的糖、50mM游离氨基酸、和表面活性剂，其中所述制剂在50℃下稳定2周并且在上述储存条件下维持了抗体的至少97％的单体含量。

在实施方式中，本发明公开了α4β7抗体的稳定的药物制剂，所述制剂包含乙酸盐缓冲剂、至少60mg/ml的糖、50mM游离氨基酸、和表面活性剂，其中所述制剂在50℃下稳定2周并且维持了抗体的至少96％的单体含量。此外，在公开的制剂中，在所述储存条件下维持至少55％的抗体为主峰。

在实施方式中，本发明公开了α4β7抗体的稳定的药物制剂，所述制剂包含琥珀酸盐缓冲剂、至少60mg/ml的糖、50mM游离氨基酸、和表面活性剂，其中所述制剂在50℃下稳定2周并且在所述储存条件下维持了至少55％的抗体保留为主峰。

在任一上述实施方式中，糖为蔗糖或海藻糖或甘露醇或山梨糖醇。优选地，糖为海藻糖。

在任一上述实施方式中，游离氨基酸为精氨酸或赖氨酸或甘氨酸或它们的组合或衍生物。

在本发明的所有以上实施方式中，α4β7抗体的浓度为约50mg/ml至约200mg/ml。

在本发明的任一所述实施方式中，α4β7抗体制剂的pH为6.0-7.0。

在实施方式中，本发明公开了包含缓冲剂、糖、游离氨基酸和表面活性剂的α4β7抗体，其中制剂在50℃下稳定2周。

在上述实施方式中，糖的浓度为至少30mg/ml并且小于70mg/ml，并且优选为60mg/ml。

在本发明的上述实施方式中，精氨酸的浓度为至少5mg/ml并且小于15mg/ml，并且优选为10mg/ml。

在上述任一实施方式中，α4β7抗体的制剂是稳定的液体(水)制剂，其可以用于肠胃外施用。肠胃外施用包括静脉内、皮下、腹膜内、肌内施用或任何其它通常认为属于肠胃外施用范围并且本领域技术人员熟知的递送途径。

在本发明的上述任一实施方式中，稳定的液体/水性制剂是合适的并且可冻干为冻干粉。此外，可用适当的稀释剂对α4β7抗体的冻干制剂进行重构，以获得适合施用的液体制剂。

实施例

通过本领域已知的标准方法生产本药物组合物中的适合储存的α4β7抗体维多珠单抗(vedolizumab)。例如，通过在哺乳动物宿主细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞)中重组表达免疫球蛋白轻链和重链基因来制备维多珠单抗。此外，获得表达的维多珠单抗，并且对粗获取物进行标准下游工艺步骤，包括纯化、过滤以及任选的稀释或浓缩步骤。例如，可使用标准色谱技术(例如亲和色谱、离子交换色谱以及它们的组合)来纯化维多珠单抗的粗获取物。纯化的维多珠单抗溶液可额外进行一个或多个过滤步骤，并且将获得的溶液进行进一步的制剂研究。将由下游色谱过程获得的三醋酸盐缓冲剂中的维多珠单抗(浓度为8mg/ml)进行缓冲剂交换，并且在组氨酸缓冲剂中浓缩至70mg/ml。浓缩的维多珠单抗用于随后的实验。

实施例1：在多种糖存在下维多珠单抗的稳定性

为了解多种糖对维多珠单抗稳定性的影响，制备了具有多种糖的制剂。将组氨酸缓冲剂背景中的浓缩的维多珠单抗的一部分缓冲剂交换为20mM磷酸盐缓冲剂。此外，将赋形剂(例如糖和聚山梨醇酯)添加至制剂中。FDA批准的维多珠单抗制剂含有精氨酸、蔗糖和聚山梨醇酯。因此，将相同的赋形剂添加至组氨酸缓冲剂背景中的维多珠单抗，并将其用作后续实验的参考标准。表1中给出了制剂的详细信息。所有样品在50℃下进行2周加速稳定性研究。之后使用尺寸排阻色谱(SEC)分析样品中的低分子量(LMW)或片段化种类、高分子量(HMW)种类或聚集体以及单体含量[图1(a)-(c)中示出了结果]，并且使用离子交换色谱检查主峰含量(图2中示出了结果)。表2中给出了维多珠单抗样品的肉眼观察数据。

表1：不同的糖存在下的维多珠单抗制剂的组成

表2：根据实施例1制备的维多珠单抗(60mg/ml)制剂的肉眼观察数据

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实施例2：浓度增加的蔗糖存在下的维多珠单抗制剂

为了解蔗糖浓度对维多珠单抗的稳定性的影响，制备了具有多种浓度的蔗糖的制剂。将组氨酸缓冲剂背景中的浓缩的维多珠单抗的一部分缓冲剂交换为20mM磷酸盐缓冲剂。之后将赋形剂(例如蔗糖、多糖酸盐)添加至组氨酸缓冲剂背景和磷酸盐缓冲剂背景中存在的维多珠单抗中。将蔗糖以增加的浓度添加至多种维多珠单抗样品中，以了解蔗糖对蛋白质稳定性的影响。

表3中给出了制剂的详细信息。所有样品在50℃下进行2周稳定性研究。之后使用尺寸排阻色谱(SEC)分析样品的低分子量(LMW/片段)物种、高分子量物种(HMW/聚集体)和单体含量[图3(a)-(c)中示出了结果]，并且还使用离子交换色谱检查主峰含量(图4中示出了结果)。表4中给出了维多珠单抗样品的肉眼观察数据。

表3：根据实施例2制备的维多珠单抗制剂的组成

表4：根据实施例1制备的维多珠单抗(60mg/ml)制剂的肉眼观察数据

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实施例3：糖和氨基酸存在下的维多珠单抗制剂

为了解氨基酸对维多珠单抗稳定性的影响，制备了不同浓度的精氨酸并添加至实施例2的制剂中。表5中给出了制剂的详细信息。所有样品在50℃下进行2周加速稳定性研究。之后使用尺寸排阻色谱(SEC)分析样品的抗体的聚集体、片段和单体含量[图5(a)-(c)中示出了结果]，并且使用离子交换色谱检查主峰含量[图6中示出了结果]，并且也进行了肉眼观察[表6]。

表5：具有游离氨基酸的多种维多珠单抗制剂的组成

表6：根据实施例3制备的维多珠单抗(60mg/ml)制剂的肉眼观察数据

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实施例4：多种缓冲剂背景中的维多珠单抗制剂

从以上实验中选择了维多珠单抗的最佳赋形剂浓度，并且以相同的组成用多种缓冲剂背景配制。表7中给出了配方的详细信息。所有样品在50℃下进行2周加速稳定性研究。之后，使用尺寸排阻色谱(SEC)分析样品的低分子量(LMW/片段)种类、高分子量种类(HMW/聚集体)和单体含量[图7(a)-(c)中示出了结果]，并且还使用离子交换色谱检查主峰含量(图8中示出了结果)。表8中给出了维多珠单抗样品的肉眼观察数据。

表7：不同缓冲剂背景中维多珠单抗制剂的组成

表8：根据实施例4制备的维多珠单抗(60mg/ml)制剂的肉眼观察数据

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对根据实施例1、2、3和4制备的维多珠单抗样品的液体制剂进行本领域已知的冻干技术并检查稳定性。

实施例5：维多珠单抗的高浓度制剂

从下游色谱步骤中获得40mM组氨酸缓冲剂背景中的30mg/ml浓度的维多珠单抗，将其缓冲剂交换为具有赋形剂的40mM组氨酸-磷酸盐缓冲剂背景，并浓缩至120mg/ml(Vmab-12)，而在Vmab 13和Vmab 14的情况中首先将维多珠单抗缓冲剂交换为40mM组氨酸-磷酸盐缓冲剂，然后添加赋形剂，然后浓缩至120mg/ml。表9中给出了制剂的详细信息。之后将样品在2℃-8℃下储存一周，然后使用尺寸排阻色谱(SEC)分析样品的低分子量(LMW/片段)种类、高分子量种类(HMW/聚集体)和单体含量[表10中表示了结果]，并且还使用离子交换色谱检查主峰含量[表11中表示了结果]。表12中给出了维多珠单抗样品的肉眼观察数据。

表9：根据实施例5制备的高浓度维多珠单抗制剂的组成。

表10：根据实施例5制备的维多珠单抗(60mg/ml)制剂的SEC数据

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表11：根据实施例5制备的维多珠单抗(60mg/ml)制剂的IEX数据

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表12：根据实施例5制备的维多珠单抗(60mg/ml)制剂的肉眼观察数据

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实施例6：糖、盐和氨基酸存在下的维多珠单抗制剂

为了解多种赋形剂(如盐、糖和氨基酸)的组合的累积稳定性效应，将组氨酸缓冲剂背景中的维多珠单抗缓冲剂交换为含有多种赋形剂的组氨酸-磷酸盐缓冲剂。表13中给出了制剂的详细信息。所有样品在40℃下进行4周加速稳定性研究。之后使用尺寸排阻色谱(SEC)分析样品的高分子量种类(HMW/聚集体)和单体含量[表14中表示了结果]，并使用离子交换色谱检查主峰含量[表15中表示了结果]。表16中给出了维多珠单抗样品的肉眼观察数据。此外，还检查了样品的pH变化，即pH的稳定性(表17)。

表13：根据实施例6制备的维多珠单抗制剂的组成。

表14：根据实施例6制备的维多珠单抗(60mg/ml)制剂的SEC数据

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表15：根据实施例6制备的维多珠单抗(60mg/ml)制剂的IEX数据

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表16：根据实施例6制备的维多珠单抗(60mg/ml)制剂的肉眼观察数据

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表17：在40℃下储存一段时间(0周-4周)内观察到的维多珠单抗制剂的pH值

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