抗肿瘤效果增强剂

技术领域

本发明涉及一种使肿瘤免疫应答活化、增强由其导致的抗肿瘤效果的抗肿瘤效果增强剂及肿瘤免疫活化剂。

背景技术

肿瘤免疫疗法是作用于癌症患者其本身原本具备的免疫监视机制，通过强化针对癌症的免疫力，由此抑制或治疗癌症的发展的疗法。近年来，在癌症的进展中，已经清楚癌症细胞本身具有回避免疫监视机制的系统，作为用于这样的回避系统的分子，已知有CTLA－4、PD－1或者作为其配体的PD－L1等免疫检查点分子组。并且，报告了阻断这些免疫检查点分子组的功能的免疫检查点抑制剂对于强化针对癌症的免疫力极其有用(专利文献1)。

另外，实现免疫应答的抑制性控制的控制性T细胞(Regulatory T cells：Treg)抑制罹患癌症或感染性细菌时的免疫应答的诱发，所以在肿瘤免疫疗法中，还进行了控制控制性T细胞的运行的各种尝试。

然而，存在即使通过使用了免疫检查点抑制剂等的免疫系统的激活也没有看到充分的治疗效果的癌症患者，需要开发出进一步的治疗方法。

另一方面，已经清楚以乳杆菌属细菌等为代表的乳酸菌、双歧杆菌属细菌具有肠内菌群的改善、便性的改善、肠道功能的改善、抵御感染、免疫激活等各种效果。认为这些细菌通过改善肠内环境而有助于人类的健康，被称为所谓益生菌。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第5885764号公报。

发明内容

本发明涉及提供一种在使用免疫检查点抑制剂的肿瘤免疫疗法中使免疫应答活化的新方法。

本发明人等鉴于这种课题反复进行了研究，其结果发现在将乳杆菌属细菌、双歧杆菌属细菌等益生菌与低聚半乳糖等益生元组合，并将其与免疫检查点抑制剂并用的情况下，抗肿瘤效果开始显著增强，肿瘤免疫发生活化。

即，本发明涉及以下的1)～19)的技术方案。

1)一种使用免疫检查点抑制剂情况下的抗肿瘤效果增强剂，以益生菌和益生元作为有效成分。

2)根据1)的抗肿瘤效果增强剂，其中，益生菌选自乳杆菌属细菌和双歧杆菌属细菌中的1种以上。

3)根据1)或2)的抗肿瘤效果增强剂，其中，益生菌为选自干酪乳杆菌和短双歧杆菌中的1种以上。

4)根据1)～3)中任一项的抗肿瘤效果增强剂，其中，益生菌为选自干酪乳杆菌YIT9029株(FERM BP－1366)和短双歧杆菌YIT12272株(FERM BP－11320)中的1种以上。

5)根据1)～4)中任一项的抗肿瘤效果增强剂，其中，益生元为低聚半乳糖。

6)根据1)～5)中任一项的抗肿瘤效果增强剂，其中，益生元是以β－1,4半乳糖基乳糖作为主成分的低聚半乳糖。

7)根据1)～6)中任一项的抗肿瘤效果增强剂，其中，免疫检查点抑制剂是选自抗PD－1抗体、抗PD－L1抗体以及PD－1拮抗剂中的1种以上。

8)一种肿瘤免疫活化剂，以益生菌、益生元以及免疫检查点抑制剂作为有效成分。

9)根据8)的肿瘤免疫活化剂，其中，通过解除介由控制性T细胞的免疫抑制状态和/或活化NK细胞，而使肿瘤免疫活化。

10)一种医药品，是组合益生菌、益生元以及免疫检查点抑制剂而成的。

11)一种医药组合物，含有益生菌和益生元，用于与免疫检查点抑制剂组合。

12)益生菌和益生元在制造使用免疫检查点抑制剂情况下的抗肿瘤效果增强剂中的应用。

13)益生菌、益生元以及免疫检查点抑制剂在制造肿瘤免疫活化剂中的应用。

14)益生菌、益生元以及免疫检查点抑制剂的组合在制造医药品中的应用。

15)一种益生菌和益生元，用于使用免疫检查点抑制剂情况下的抗肿瘤效果增强。

16)一种益生菌、益生元以及免疫检查点抑制剂，用于肿瘤免疫活化。

17)一种益生菌、益生元以及免疫检查点抑制剂的组合，用于医药品。

18)一种使用免疫检查点抑制剂情况下的抗肿瘤效果增强方法，将益生菌和益生元给予需要它们的对象。

19)一种肿瘤免疫活化方法，将益生菌、益生元以及免疫检查点抑制剂给予需要它们的对象。

发明效果

根据本发明，能够激活肿瘤免疫，能够抑制癌症的发展、抑制癌症的复发或者治疗癌症。

附图说明

图1是由合生元/免疫检查点抑制剂并用带来的抗肿瘤作用。

图2是由合生元/免疫检查点抑制剂并用带来的对免疫细胞的影响。

图3是由合生元/免疫检查点抑制剂并用带来的对控制性T细胞(Treg)的影响。

图4是由合生元/免疫检查点抑制剂并用带来的对免疫抑制状态的影响。

图5是由合生元/免疫检查点抑制剂并用带来的对肿瘤的来自骨髄的免疫抑制细胞(MDSC)的影响。

图6是由合生元/免疫检查点抑制剂并用带来的对免疫状态的影响。

图7是由各种肠内细菌制剂/免疫检查点抑制剂并用带来的NK细胞活性增强作用。C：对照组，P：抗PD－1抗体给药组，LP：益生菌+抗PD－1抗体给药组，GP：益生元+抗PD－1抗体给药组，LG：合生元给药组，LGP：合生元+抗PD－1抗体给药组。

具体实施方式

本发明中，“益生菌”是指摄取适当的量时对宿主的健康带来有益的作用的活的微生物。“益生元”是指成为双歧杆菌、乳酸菌的“饵食”、增加这些菌而起到有益的作用的物质。

作为本发明的益生菌，具体而言，例如可举出选自乳杆菌属细菌、双歧杆菌属细菌、链球菌属细菌、乳球菌属细菌中的1种以上的微生物。

作为乳杆菌属细菌，例如可举出干酪乳杆菌(L.casei)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、植物乳杆菌(L.plantarum)、布氏乳杆菌(L.buchneri)、鸡乳杆菌(L.gallinarum)、噬淀粉乳杆菌(L.amylovorus)、短乳杆菌(L.brevis)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、开菲尔乳杆菌(L.kefir)、弯曲乳杆菌(L.curvatus)、玉米乳杆菌(L.zeae)、瑞士乳杆菌(L.helveticus)、唾液乳杆菌(L.salivalius)、格氏乳杆菌(L.gasseri)、发酵乳杆菌(L.fermentum)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)、卷曲乳杆菌(L.crispatus)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(L.delbrueckii subsp.bulgaricus)、德氏乳杆菌德氏亚种(L.delbrueckii subsp.delbrueckii)、约氏乳杆菌(L.johnsonii)等。

其中，从抗肿瘤效果增强的观点考虑，优选为干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌，更优选为干酪乳杆菌YIT 9018(FERM BP－665)、干酪乳杆菌YIT9029(FERM BP－1366)、干酪乳杆菌YIT 10003(FERM BP－7707)、嗜酸乳杆菌YIT 0198，其中，进一步优选为干酪乳杆菌YIT9029(FERM BP－1366)。

作为双歧杆菌属细菌，例如可举出短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、长双歧杆菌(B.longum)、两歧双歧杆菌(B.bifidum)、动物双歧杆菌(B.animalis)、猪双歧杆菌(B.suis)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)、青春双歧杆菌(B.adolescentis)、链状双歧杆菌(B.catenulatum)、假链状双歧杆菌(B.pseudocatenulatum)、乳双歧杆菌(B.lactis)、球双歧杆菌(B.globosum)等。

其中，从抗肿瘤效果增强的观点考虑，优选为短双歧杆菌、两歧双歧杆菌、假链状双歧杆菌，更优选为短双歧杆菌YIT12272株(FERM BP－11320)、短双歧杆菌YIT10001株(FERM BP－8205)、两歧双歧杆菌YIT10347(FERM BP－10613)。

作为链球菌属细菌，例如可举出嗜热链球菌(Streptcoccus thermophilus)、乳酸链球菌(Streptcoccus lactis)等。

其中，从抗肿瘤效果增强的观点考虑，优选为嗜热链球菌，更优选为嗜热链球菌YIT 2021株(FERM BP－7537)。

作为乳球菌属细菌，可举出乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactissubsp.lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)，植物乳球菌(Lactococcus plantarum)、棉子糖乳球菌(Lactococcus raffinolactis)等。

其中，从抗肿瘤效果增强的观点考虑，优选为乳酸乳球菌，更优选为乳酸乳球菌YIT 2027(FERM BP－6224)。

作为本发明的益生元，优选通过优选地作用于本发明的益生菌从而对宿主给予有益作用的物质，具体而言，可举出选自低聚半乳糖、低聚果糖、低聚乳果糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、黑曲霉寡糖、低聚龙胆糖、果胶低聚糖、环糊精等低聚糖、聚葡萄糖、菊粉、发芽大麦、菊粉、难消化性糊精、抗性淀粉等食物纤维中的1种以上。

本发明中，对于这些益生元而言，从抗肿瘤效果增强的观点考虑，优选为低聚半乳糖。

这里，低聚半乳糖是指在分子内具有至少1个以上的半乳糖残基的低聚糖的通称，例如可举出2～9个、优选3～4个单糖键合而成的糖。另外，作为低聚半乳糖，可举出半乳糖进行β1－2键合而成的糖、进行β1－3键合而成的糖、进行β1－4键合而成的糖、进行β1－6键合而成的糖，但特别优选具有进行β1－4键合而成的糖、进行β1－6键合而成的糖的低聚半乳糖。

作为更优选的低聚半乳糖，可举出β－1,4半乳糖基乳糖(Galβ1－4Galβ1－4Glc)、β－1,6半乳糖基乳糖(Galβ1－6Galβ1－4Glc)、β－1,3半乳糖基乳糖(Galβ1－3Galβ1－4Glc)等，从抗肿瘤效果增强的观点考虑，更优选为以β－1,4半乳糖基乳糖作为主成分的低聚半乳糖，例如可使用Oligomate 55N(养乐多药品工业(株)、固体成分中的β－1,4半乳糖基乳糖的含量为18.5％)。

本发明中，益生菌和益生元可组合这些作为合生元使用。合生元优选作为混合两者而制备的制剂(肠内细菌制剂)使用。

该制剂中的益生菌的含量没有特别限定，在制剂100g中，例如为0.1×10

另外，该制剂中的益生菌与益生元的含量之比率例如相对于益生元合计质量1g，益生菌为0.01×10

制剂中的益生元的含量没有特别限定，制剂中，为0.5～40质量％，优选为2～10质量％，更优选为3～6质量％。

合生元中，在不损害本发明的效果的范围内，可以包含其它的成分。作为其它的成分，可举出钙、镁、锌、铁、白云石等矿物或者其盐；柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、乳酸、乙酸、氨基酸等酸类，胶原、硫酸软骨素、羟脯氨酸、黄酮、黄酮醇、异黄酮、花青素、儿茶素、原花青素等添加剂类，维生素A、维生素B类、维生素C、维生素E、维生素D类、维生素K类、Β-胡萝卜素、维甲酸、叶酸等各种维生素类等。这些可以单独使用1种或者组合2种以上使用。

合生元的给药形态没有特别限定，可举出能够口服给药、经肠给药的形态，优选为经口给药的形态。

作为经口给药的形态，例如可举出片剂(包含糖衣片、肠溶性包衣片、口腔片)、散剂、胶囊剂(包含肠溶性胶囊、软胶囊)、颗粒剂(包含包衣的类型)、丸剂、含剂、封入脂质体剂、液剂以及它们的缓释制剂等医药制剂。另外，也可以是食品(例如清涼饮料、碳酸饮料、营养饮料、果汁饮料、乳酸菌饮料等饮料；加工乳、乳饮料、发酵乳、黄油等乳制品；健康辅助食品等功能性食品等)的形态。

制剂化中，可使用通常医药制剂中通用的载体、赋形剂(例如乳糖、葡萄糖、白糖、甘露醇、马铃薯淀粉、玉米淀粉、碳酸钙、磷酸钙、硫酸钙、结晶纤维素等)、结合剂(例如淀粉、明胶、葡萄糖、半乳糖、聚乙烯醇、聚乙烯醚、聚乙烯吡咯烷酮、羟基丙基纤维素、乙基纤维素、甲基纤维素以及羧基甲基纤维素等)、崩解剂(例如淀粉、琼脂、明胶、羧基甲基纤维素钠、羧基甲基纤维素钙、结晶纤维素、碳酸钙、碳酸氢钠、以及海藻酸钠等)、润滑剂(例如硬脂酸镁、氢化植物油以及聚乙二醇等)、稳定剂、调味除臭剂、稀释剂、表面活性剂、溶剂等添加剂。

本发明中，“免疫检查点抑制剂”是指抑制CTLA－4、PD－1或作为其配体的PD－L1等免疫检查点分子组的功能的分子。

作为免疫检查点抑制剂，例如可举出抗PD－1抗体(例如Nivolumab、Pembrolizumab)、抗PD－L1抗体(例如Atezolizumab、Avelumab、Durvalumab)、PD－1拮抗剂(例如，AUNP－12)、抗CTLA－4抗体(例如Ipilimumab以及Tremelimumab)、抗LAG－3抗体(例如BMS－986016以及LAG525)等。

其中，从抗肿瘤效果增强的观点考虑，优选为抗PD－1抗体、抗PD－L1抗体、PD－1拮抗剂，更优选为抗PD－1抗体。

如后述实施例所示，本发明所涉及的益生菌和益生元的组合在与免疫检查点抑制剂并用的情况下，增强由免疫检查点抑制剂带来的抗肿瘤效果。因此，益生菌和益生元的组合可成为使用免疫检查点抑制剂情况下的抗肿瘤效果增强剂。

另外，益生菌和益生元以及免疫检查点抑制剂的并用使Th1细胞(CD3

这种使用免疫检查点抑制剂情况下的抗肿瘤效果增强剂和肿瘤免疫活化剂能够用于癌症的发展抑制、复发抑制、治疗。

另外，根据本发明的使用免疫检查点抑制剂情况下的抗肿瘤效果增强剂以及肿瘤免疫活化剂，也能够实现免疫检查点抑制剂的给药量的减少、副作用的减轻。

在本发明的使用免疫检查点抑制剂情况下的抗肿瘤效果增强剂或者抗肿瘤免疫活化剂中，作为对象的癌症没有特别限定，可包含任何的实体癌以及血液癌。例如可举出头颈部癌、食道癌、胃癌、结肠·直肠癌、肝癌、胆囊·胆管癌、胰脏癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、膀胱癌、前立腺癌、睾丸癌、骨·软组织肉瘤、恶性淋巴瘤、白血病、宫颈癌、皮肤癌、脑肿瘤等，其中，优选基于免疫检查点抑制剂的肿瘤免疫疗法较为有效的癌症。

本发明的益生菌和益生元与免疫检查点抑制剂可以同时给予两者，也可以先给予益生菌和益生元，在其给予后给予免疫检查点抑制剂，也可以先给予免疫检查点抑制剂，其后给予益生菌和益生元。

另外，益生菌和益生元与免疫检查点抑制剂的给药形态可以相同也可以不同，以适于各自的形态给药即可。另外，益生菌和益生元以及免疫检查点抑制剂也能够作为将它们组合的试剂盒而制成一种医药制剂。

在本发明的使用免疫检查点抑制剂情况下的抗肿瘤效果增强剂或肿瘤免疫活化剂中，益生菌和益生元的给药量根据年龄、体重、症状、治疗效果、给药方法、处理时间等不同，通常以成人一日益生菌为3×10

免疫检查点抑制剂的给药量可以以临床上使用的用量作为基准适当地选择。另外，免疫检查点抑制剂可以组合任意的2种以上进行给药。

实施例

根据以下的实施例，进一步详细说明本发明，本发明的范围并不限于此。

＜试验品＞

1)益生菌

使用菌株为干酪乳杆菌YIT9029株(FERM BP－1366)、短双歧杆菌YIT12272株(FERM BP－11320)

2)益生元

以β－1,4半乳糖基乳糖作为主成分的低聚半乳糖

3)合生元

混合1mLGOS(100mg/1mL)、0.5mL(20×10

4)抗PD－1抗体

“Anti-PD1(J43)Hamster IgG ms”(BioxCell公司)(对照抗体“IgG IsotypeHamster IgG ms”(BioxCell))

实施例1体内的由合生元/免疫检查点抑制剂并用带来的抗肿瘤作用

向7周龄的雄性C57BL/6NCrSlc小鼠移植小鼠结肠癌细胞株MC38细胞，制成细胞株移植模型小鼠。分为对照(Vehicle)组、合生元给药组、抗PD－1抗体给药组、合生元+抗PD－1抗体给药组{n＝10(Vehicle组)，5(合生元给药组，抗PD－1抗体给药组)，6(合生元+抗PD－1抗体给药组)}。

合生元如下给药：在移植后，1天1次，0.2mL合生元/小鼠，28天每天口服给药。抗PD－1抗体如下给药：肿瘤移植第7天起，初次腹腔内给药20mg/kg抗PD－1抗体，以后每隔6天给药，第2～4次以10mg/kg进行腹腔内给药。

肿瘤体积以卡尺测定。(Tukey－Kramer test)。

肿瘤体积是测定肿瘤的长径和短径，使用{(长径)×(短径)

将结果示于图1。由图1示出了抗PD－1抗体与合生元的并用组的肿瘤体积明显小。另一方面，两药剂的单独使用组中没有观察到肿瘤体积的明显缩小。另外，单独使用时的肿瘤尺寸比Vehicle组和合生元+抗PD－1抗体给药组的中点大，所以与简单的相加效果也不同。由此，能够判断抗PD－1抗体与合生元的并用时特异性发挥了肿瘤生长抑制作用。

实施例2体内的由合生元/免疫检查点并用带来的对免疫细胞的影响

向7周龄的雄性C57BL/6NCrSlc小鼠移植小鼠结肠癌细胞株MC38细胞，制成细胞株移植模型小鼠。分为对照(Vehicle)组、合生元给药组、抗PD－1抗体给药组、合生元+抗PD－1抗体给药组。

合生元如下给药：在移植后，1天1次，0.2mL合生元/小鼠，28天每天口服给药。抗PD－1抗体如下给药：肿瘤移植第7天起，初次腹腔内给药20mg/kg抗PD－1抗体，以后每隔6天给药，第2～4次以10mg/kg进行腹腔内给药。

解剖时，回收各组织(脾脏、肿瘤)，将细胞分离成单细胞状态。将所分离的细胞用各种免疫细胞的标志物蛋白质特异性抗体进行标记，利用流式细胞仪进行识别。根据识别数据，测定Th1细胞(CD3

将结果示于图2。由图2可确认抑制周围的免疫细胞的活性的Treg数仅在合生元+抗PD－1抗体给药组中显示出明显的减少。由于Treg也被用作肿瘤细胞的抗免疫机制，所以其结果可推测通过两剂的并用而抑制了肿瘤的抗免疫防御。另一方面，脾脏中的活化的T细胞(活化标志物CD8、CD4阳性)的个数在合生元+抗PD－1抗体给药组中没有特异性增加，所以启示了由并用带来的效果是借助于免疫细胞的活化。

实施例3体内的由合生元/免疫检查点抑制剂并用带来的对小肠的控制性T细胞(Treg)的影响

向7周龄的雄性C57BL/6NCrSlc小鼠移植小鼠结肠癌细胞株MC38细胞，制成细胞株移植模型小鼠。分为对照(Vehicle)组、合生元给药组、抗PD－1抗体给药组、合生元+抗PD－1抗体给药组{n＝10(Vehicle组)、5(合生元给药组、抗PD－1抗体给药组)、6(合生元+抗PD－1抗体给药组)}。

合生元如下给药：在移植后，1天1次，0.2mL合生元/小鼠，28天每天口服给药。抗PD－1抗体如下给药：肿瘤移植第7天起，初次腹腔内给药20mg/kg抗PD－1抗体，以后每隔6天给药，第2～4次以10mg/kg进行腹腔内给药。

解剖时，回收小肠，将FOXP3作为指标，利用实时PCR评价Treg。(Mann Whitney Utest)

将结果示于图3。由图3示出了，Treg的主转录因子即FOXP3基因表达量在合生元+抗PD－1抗体给药组中明显地降低。其结果支持了以上示出的Treg数的减少。

实施例4体内的由合生元/免疫检查点抑制剂并用带来的对全身的免疫抑制状态的影响

向7周龄的雄性C57BL/6NCrSlc小鼠移植小鼠结肠癌细胞株MC38细胞，制成细胞株移植模型小鼠。分为对照(Vehicle)组、合生元给药组、抗PD－1抗体给药组、合生元+抗PD－1抗体给药组{n＝10(Vehicle组)，5(合生元给药组，抗PD－1抗体给药组)，6(合生元+抗PD－1抗体给药组)}。

合生元如下给药：在移植后，1天1次，0.2mL合生元/小鼠，28天每天口服给药。抗PD－1抗体如下给药：肿瘤移植第7天起，初次腹腔内给药20mg/kg抗PD－1抗体，以后每隔6天给药，第2～4次以10mg/kg进行腹腔内给药。

解剖时，回收各组织(小肠、派尔集合淋巴结)，将TGFβ作为指标利用实时PCR评价免疫抑制状态。(Mann Whitney U test)

将结果示于图4。根据图4，TGFβ是发挥免疫抑制性作用的细胞因子，通过来自于肠内细菌的物质受到诱导。根据图4，小肠整体以及小肠免疫的中心组织即派尔集合淋巴结中，与Vehicle组相比，在合生元+抗PD－1抗体给药组中TGFβ的基因表达量明显低，启示了小肠免疫的活化。

实施例5体内的由合生元/免疫检查点抑制剂并用带来的对肿瘤的来自骨髄的免疫抑制细胞(MDSC)的影响

向7周龄的雄性C57BL/6NCrSlc小鼠移植小鼠结肠癌细胞株MC38细胞，制成细胞株移植模型小鼠。分为对照(Vehicle)组、合生元给药组、抗PD－1抗体给药组、合生元+抗PD－1抗体给药组{n＝10(Vehicle组)，5(合生元给药组，抗PD－1抗体给药组)，6(合生元+抗PD－1抗体给药组)}。

合生元如下给药：在移植后，1天1次，0.2mL合生元/小鼠，28天每天口服给药。抗PD－1抗体如下给药：肿瘤移植第7天起，初次腹腔内给药20mg/kg抗PD－1抗体，以后每隔6天给药，第2～4次以10mg/kg进行腹腔内给药。

解剖时，回收肿瘤，以Bv8作为指标利用实时PCR评价MDSCs。(Mann Whitney Utest)

将结果示于图5。Bv8是MDSC的标志物，存在于肿瘤内的MDSC的数量减少，启示了带来抗肿瘤效果。

实施例6体内的由合生元/免疫检查点抑制剂并用带来的对全身的免疫状态的影响

向7周龄的雄性C57BL/6NCrSlc小鼠移植小鼠结肠癌细胞株MC38细胞，制成细胞株移植模型小鼠。分为对照(Vehicle)组、合生元给药组、抗PD－1抗体给药组、合生元+抗PD－1抗体给药组{n＝10(Vehicle组)，5(合生元给药组，抗PD－1抗体给药组)，6(合生元+抗PD－1抗体给药组)}。

合生元如下给药：在移植后，1天1次，0.2mL合生元/小鼠，28天每天口服给药。抗PD－1抗体如下给药：肿瘤移植第7天起，初次腹腔内给药20mg/kg抗PD－1抗体，以后每隔6天给药，第2～4次以10mg/kg进行腹腔内给药。

解剖时，回收各组织(小肠、肿瘤)，利用实时PCR评价各细胞因子(IFN－β，IL－17)基因的表达量。(Mann Whitney U test)

将结果示于图6。根据图6，在合生元+抗PD－1抗体给药组的小肠中抗炎症性细胞因子即IFN－β的基因表达量特异性高表达，并结合图4中示出的TGFβ为低值，小肠中的免疫功能亢进的可能性高。另一方面，IL－17是免疫细胞高表达的细胞因子，其在合生元+抗PD－1抗体给药组中明显为高值，启示了肿瘤内的免疫细胞的增加。这些结果均支持肿瘤免疫的活化。

实施例7体内的由各种肠内细菌制剂/免疫检查点抑制剂并用带来的NK细胞活性增强作用

向7周龄的雄性C57BL/6NCrSlc小鼠移植小鼠结肠癌细胞株MC38细胞，制成移植模型小鼠。分为对照(Vehicle)组(C)、抗PD－1抗体给药组(P)、益生菌+抗PD－1抗体给药组(LP)、益生元+抗PD－1抗体给药组(GP)、合生元给药组(LG)、合生元+抗PD－1抗体给药组(LGP){n＝9(C，LG，LGP)，8(P，GP，LP)}。

合生元如下给药：在移植后，以除了星期日以外的六天1天1次的周期，0.2mL合生元/小鼠，合计15天口服给药。抗PD－1抗体如下给药：肿瘤移植第6天起，初次腹腔内给药20mg/kg抗PD－1抗体，以后每隔6天给药，第2～3次以10mg/kg进行腹腔内给药。由解剖时采取的脾脏制备单细胞，形成效应细胞。作为靶细胞，使用小鼠淋巴瘤即YAC－1细胞。通过将靶细胞(4×10

细胞伤害活性(％细胞溶解)＝((样品荧光强度－自然游离荧光强度)×100)/(最大荧光强度－自然游离荧光强度)

将结果示于图7。根据图7可知，仅在益生菌、益生元、抗PD－1抗体这3者同时存在的LGP组中，NK细胞的细胞伤害活性明显地活化。由于图2中示出的Treg数的减少而肿瘤的抗免疫防御功能被抑制，其结果，免疫细胞对肿瘤的活性提高，是支持了由两种制剂并用带来的肿瘤免疫的活化的结果。