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肺部病原菌检测的引物探针及其试剂盒

文献发布时间：2023-06-19 15:47:50

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及肺部病原菌检测的引物探针组合及其试剂盒。

背景技术

肺部感染是指包括终末气道、肺泡腔及肺间质在内的肺实质炎症，病因以感染最为常见，还可由理化、免疫及药物引起。肺部感染包括细菌性肺部感染、真菌性肺部感染、病毒性肺部感染、支原体性肺部感染等。因其种类繁多，本项目集中在肺侵袭性真菌感染和诺卡氏菌属感染。肺袭蚀性真菌又包括：念球菌属、曲霉属、隐球菌属、接合菌门里的毛霉目和肺孢子菌属。因念球菌属主要通过血流感染，接合菌门肺部感染的发生率为2.9/100000引起的死亡率为86％，样本非常难获取，本项目主要针对的肺侵袭性真菌为曲霉属、隐球菌属、肺孢子菌属等。

肺侵袭性真菌感染引起的真菌病分为原发性和继发性两种，原发性肺侵袭性真菌病主要是社区获得性感染，因其宿主可以没有真菌感染的危险因素、临床过程相对缓和、凶险程度低等特点。医学上比较关注的是继发性肺侵袭性真菌感染，继发性真菌感染主要发生在如：器官移植受者、恶性血液病患者、恶性肿瘤患者等免疫受损或其他危重病患者身上。其特征是：医院获得性感染，存在比较明确的真菌感染高危危险因素、临床过程急骤和凶险。

近30年来，随着实体器官及造血干细胞移植技术和导管介入及留置技术的开发和利用，以及免疫抑制剂的大量使用、恶性肿瘤患者放疗化疗进行和抗生素的广泛使用，继发性侵袭性真菌感染的发病率及致死率在全球范围内显著升高。流行病学研究显示，目前全球每年有200万人被侵蚀性真菌感染，院内侵袭性真菌感染率为7.5％，肿瘤病人侵袭性真菌感染率为8％，严重烧伤及创伤病人的侵袭性真菌感染率高达16％，而侵袭性真菌感染的致死率高达55％-70％，因此侵袭性真菌感染已成为严重威胁人类生命健康的疾病。

一般认为肺侵袭性真菌感染与血液恶性肿瘤和造血干细胞移植导致的粒细胞缺乏关系最为密切，但最近美国1000多家医疗机构对l88l例侵袭性真菌感染患者的统计分析结果显示，最易发生侵袭性真菌感染的基础疾病患病群体中，居于前三位的分别是：COPD、糖尿病、恶性血液病，分别占中感染率的22.2％、21.7％、9.6％。国内研究报道显示：由这些菌属引起的曲霉菌病、隐球菌病、肺孢子菌病分别占侵袭性真菌病的37.9％、15.6％、2.1％。

诺卡氏菌病的发生率为0.31/100000，与肺侵袭性真菌感染的患病人群一致，其主要感染部位为肺部，主要感染人群为HIV感染、器官移植、接受放化疗的恶性肿瘤、慢性阻塞性肺炎、糖尿病、长期使用糖皮质激素等引起免疫功能缺陷或受损的患者。

对于这些不同种属的肺部感染菌引起感染病的检测方法略有差异，但其主要检测方法包括：痰液或肺泡灌洗液镜检、组织病理学检查、血清抗原及其代谢物质检测，这些检测结果需要结合患者的临床表征和影像特征共同判定。随着PCR技术的发展，目前一些荧光定量PCR和环介导等方法也被引进到肺部感染病的检测中。

这些检测方法各有优缺点，涂片镜检操作简单，但是不能排除阴性患者感染的可能。组织病理学检查虽是深部感染检测的金标准，但无法确定病原菌种类。菌培养是从无菌部位如血液、胸腔积液、支气管肺泡灌洗液以及活检组织块中分离出条件致病菌常提示肯定的感染，但对痰液等标本则应谨慎解释结果，一次培养结果阳性往往不能确定诊断，必要时应多次重复检查，同时阴性结果并不能排除侵袭性曲霉病，并依据药物敏感性选择药物，耗时长、敏感性低，可能需要多次培养，也可能根本无法培养，极易丧失最佳治疗时间。血清抗原及其代谢物质检测包括GM试验和G试验：GM试验诊断侵袭性曲霉病的敏感性为80.7％，特异性为89.2％，虽可作为诊断侵袭性曲霉病的依据，但其易受某些食物或药物的影响可致假阳性结果，假阳性率高达18％；G试验虽被列入侵袭性真菌病的诊断标准，但其不能用于接合菌和隐球菌感染的检测，也无法鉴别致病菌种，且具有较高的假阳性。荧光定量PCR和环介导技术虽然耗时短、效率高，受二代PCR技术本身的限制，其检测深度只能达到1％，灵敏度较低。

因此，目前临床的肺部感染检测不但技术存在耗时较长、特异性较差、假阳性率及漏检率较高、可重复性差等问题，而且主要停留在定性判断有无的水平上不能准确区分菌种等问题，距满足临床需求还有较大的距离。发展灵敏快捷的侵蚀性肺部感染检测方法对于临床精准及时治疗具有重要意义。

数字PCR(digitalpolymerase chainreaction，dPCR)是一项针对单分子靶标DNA的绝对定量技术。该技术是将核酸模板大量稀释后，添加到含有对应引物和荧光探针标记的PCR反应体系中，再通过微流控芯片把配制好的含有核酸模板的反应体系分割成几万到几十万个油包水的微液滴后进入PCR循环，使得PCR反应在每一个微液滴中独立进行，然后通过对每个微液滴的荧光探测统计阴性和阳性微液滴的个数，利用泊松分布原理计算出原始体系中目标模板的拷贝数。因为液滴的分割大大降低了PCR反应体系内部的相互干扰，从而提高了低丰度靶标的扩增的灵敏度；通过泊松分布原理对阴性和阳性液滴的比例计算直接得出原始反应体系中核酸模板的拷贝数，不用引入内参避免了因扩展效益的差别对定量结果的影响，因此达到绝对定量的效果；因为没有PCR反应体系内部的相互干扰，可以通过不同的荧光探针标记不同的靶标，因此同一反应体系可以进行多重PCR反应，所以检测通量高模板用量少；整个检测过程只需要配制好反应体系，其他步骤都可以通过数字PCR自动操控。综上因素，数字PCR具有特异性强、灵敏度高、绝对定量、操作方便、检测通量高、模板要求量低等优点。然而，目前尚未见将数字PCR应用于肺部病原菌不同属的联合检测的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了肺部病原菌检测的引物探针及其试剂盒，该引物探针组合结合数字PCR技术，可快速实现曲霉属、耶氏孢子菌、隐球菌和诺卡菌的四个菌属的联合检测，准确性好、灵敏度高，且检测时间短。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了耶氏孢子菌检测的引物探针，包括SEQ ID NO:1～2所示核苷酸序列的引物和SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针。

其中，SEQ ID NO：1所示的上游引物、SEQ ID NO：1所示的下游引物和SEQ ID NO：3所示的探针，针对耶氏孢子菌的保守区域IF-PNEU-STD设计，保守区域的长度为216bp，具体序列为：

TTCACTTAATATTAATTGGGGAGCTTTAATTACTGTTCTGGGCTGTTTCCCTTTCGACTATCTACCTTATCGCACATAGTCTGATTATTTATTTTAAGAAATAGTTATTTTGAGATTAAATATCTGAGATAAATATTTTCATACTCCCTCGAGATATTCAGTGCTATACCTACTATTTTTAAGAGGAATAAACAATTGCCAAAACAATTCGCAGAA。

本发明提供的隐球菌检测的引物探针，包括SEQ ID NO:4～5所示核苷酸序列的引物和SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的探针。

其中，SEQ ID NO：4所示的上游引物、SEQ ID NO：5所示的下游引物和SEQ ID NO：6所示的探针，针对隐球菌的保守区域

AGCGGAGGAAAAGAAACTAACAAGGATTCCCTTAGTAACGGCGAGTGAACCGGGAAGAGCTCAAATTTGAAATCTGGCGTCCTCCGGGCGTCCGAGTTGTAATCTACAGAAACGTTTTCCGTGCTGGACCGTGTCTAAGTCCCTTGGAATAGGGTATCAAAGAGGGTGACAATCCCGTACTTGACACGATCACCAGTGCTCTGTGATACGTTTTCTACGAGTCGCGTTACTTGGGAGTGTAGCGCAAAATGGGTGGTAAACTCCATCTAAAGCTAAATATTGGTGGAAGACCGATAGCGAACAAGTACCGTGAGGGAAAGATGAAAAGCACTTTGGAAAGAGAGTTAAACAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAACGATT。

曲霉属检测的引物探针，其特征在于，包括SEQ ID NO:7～9所示核苷酸序列的引物和SEQ ID NO:10～11所示核苷酸序列的探针。

其中，SEQ ID NO：7～8所示的上游引物、SEQ ID NO：9所示的下游引物和SEQ IDNO：10～11所示的探针，针对曲霉的保守区域

ASP-STD-123：

CGCTACTACCGATTGAATGGCTCGGTGAGGCCTTCGGACTGGCTCAGGAGGGTTGGCAACGA；

ASP-STD-4：

CGCTACTACCGATTGAATGGCTCGGTGAGGCCTCCGGACTGGCTCAGGAGGGTTGGCAACGA；

ASP-STD-5：

CGCTACTACCGATTGAATGGCTCGGTGAGGCCTTCGGACTGGCTCCAGGGGGTTGGCAAC。

本发明提供的诺卡菌检测的引物探针，包括SEQ ID NO：12～18所示核苷酸序列的引物和SEQ ID NO:19所示核苷酸序列的探针。

SEQ ID NO：12～16所示的上游引物、SEQ ID NO：17～18所示的下游引物和SEQ IDNO：19所示的探针，针对诺卡菌属的皮疽诺卡、盖尔森诺卡、豚鼠耳炎诺卡、巴西诺卡、脓肿诺卡五种菌的STD-CRYI-1、STD-ABSC-2、STD-OTITI-3、STD-FRAC-4和STD-BRAS-5五个特异性保守区域设计，具体序列为：

STD-CRYI-1：

ACCTCCTTTCTAAGGAGCACTTCTCCACGACGCTTCACACAGGTGAATGTGGTTGTGGCAGAGACCGTTTAGTTCCCAATCGTGGAACTGCGGAAGCTCATGGGTGGAACGCTGACAACCTCTCCCGCGTATCGGTTGGTCCTCAGTGGCCGGCTGGTGGGTGATATATCGACACACTGTTGGGTCCTGAAAGAACAGACGTTCTTTCCAGGCAAAAAAGACGACGAGGCTGATCTTCAGTCATACCGGCTTCTTCCCCTTGGGGTTGGGGTGCTG。

STD-ABSC-2：

ACCTCCTTTCTAAGGAGCACTTCTGCATGATCGCCTCGAACAGTCGAGCGTGGTCGTGCCAGAGACCGCTTATGTCCCCGACTGTGGGACTGCGGAAGCTCATGGGTGGAACGCTGACAGCTTCTTCCGTGTATCGGTCGGTCTTGGATGATCGGCCGGCGGGTGATATATCGACACACTGTTGGGTCCTGAAAGAACAGGCGTTCTTTCCAGGCAAAAAATACGATCCGGGAGTTTCTCCGGTCATACCGGTCTCGATCCCTTCGGGGGTTGGGG。

STD-OTITI-3：

CTCCTTTCTAAGGAGCATTCTCCAGTGAGCGTCTCGAACAGTCGAGATCGCTCCTGGCAGAGACAGTTTCGGACTCACATGTAGTCCGGCTGAAGCTCATGGGTGGAACGCTGACAAGTTTCATCGCATCATGCTCGGTCCTCAGCGGTCGAGCGCGGTGAATATATCGACACACTGTTGGGTCCTGAAAGAACAGACGTTCTTTCCAGGCAAGATAACGACGAGGCTGATCTTCAGTCATACCGCCGAGAGTTTTCTCGGGCTGGTGCTGGGTAA。

STD-FRAC-4：

ACCTCCTTTCTAAGGAGCACTTCTCCACGATGCGTCACACAGGTGATTGTGGTCGTGGCAGAGGCCATGTCGGACTCGAATGTAGTCCGGTGGTTGCTCATGGGTGGAACGCTGGCATGTGCCTCGTGTATCGGTTGGTCCTGTGTGGCCGGCCGGCGGGGATGTAGTCGACACACTGTTGGGTCCTGAGAGAACACGCGAGTGACTCTCTAGGTATGAGATAACGACGAGGCTGGATCTTCAGTCATACCGCGGGGCTTTCTTCGGAGGGTTTCG。

STD-BRAS-5：

CTCCTTTCTAAGGAGCACTTCTCCGCGGACACCCACACAGGTGGGACGGTAAACGTCTTGTGGCAGAGACCGTTTCGGATGCATACGTCATCCGGCGGACGCTCATGGGTGGAACGCTGACAAGTTTCATCGCACTCGATCGGGACTGTGTTCCTGGTCGCGGTGGATATACCGACACACTACTGGGTCCTGAAAGAACAGACGTTCTTTCCAGGCAAGATAACGACAGGACTGGCCTTTCAGTCATACCGCCGGATGTGGTCCGGGCTGGTGCTG。

本发明提供的以上四种引物探针，可实现曲霉属、耶氏孢子菌、隐球菌和诺卡菌四种肺部感染真菌菌属的快速检测，其中，曲霉属包括烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉、构巢曲霉；隐球菌包括新型隐球菌的两个种和格特隐球菌的5个种；诺卡菌包括皮疽诺卡、盖尔森诺卡、豚鼠耳炎诺卡、巴西诺卡、脓肿诺卡；检测准确性和特异性好、灵敏度高，可以在一个体系中对样品进行四个属的病原菌的多重检测。

本发明还提供了同时检测曲霉属、耶氏孢子菌、隐球菌和诺卡菌中至少两个菌属的试剂盒，包括上述检测曲霉属、耶氏孢子菌、隐球菌和诺卡菌中至少两个菌属的引物探针。

本发明提供的试剂盒还包括检测外源内参的引物和探针；

所述检测外源内参的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:20～21所示；

所述检测外源内参的探针，核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示。

其中，SEQ ID NO：20～21所示的引物和SEQ ID NO：22所示的探针外源内参IC-S设计，IC-S的序列为：

TCACAATCTTGACCTGCACGGCAAAGAGACGCTTCTTGTGGAGCTCGACAACGCAACAACGCGACGGATCTACGTCACAGCGAGTATAGTGAAAACGAAGTTGCTGACGGCGGAAGCGACATAGGGATCTGTCAGTTGTCATTCGCGAAA。

本发明中，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，具体地：

SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团MGB；

SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团CY5，3’端标记有荧光淬灭基团MGB；

SEQ ID NO:10所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团ROX，3’端标记有荧光淬灭基团MGB；

SEQ ID NO:11所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团ROX，3’端标记有荧光淬灭基团MGB；

SEQ ID NO:19所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团VIC，3’端标记有荧光淬灭基团MGB；

SEQ ID NO:22所示核苷酸序列的探针的5’端标记有荧光报告基团ATTO-425，3’端标记有荧光淬灭基团BHQ1。

本发明所述试剂盒还包括数字PCR的检测试剂；所述检测试剂包括无菌水、ddPCRMix、DNA扩增酶、dNTP、Mg

本发明所述的试剂盒，还包括提取待测样本DNA的提取试剂。

本发明对提取待测样本DNA的提取试剂没有特殊限制，在具体实施例中，所述提取待测样本DNA的提取试剂为磁珠法DNA提取试剂。

本发明提供的试剂盒基于数字PCR平台进行检测，适用于多种类型的样本检测，可以用于于痰液、肺泡灌洗液等样本的检测，还可以用于食品样本、水体样本的检测。

本发明还提供了检测肺部病原菌的方法，利用本发明所述的引物探针组合或本发明所述的试剂盒对样本进行PCR扩增检测。

本发明中，所述样本为食品样本、痰液、肺泡灌洗液、血液样本、石蜡切片、病理组织、穿刺样本等任何可提取含有病原菌DNA的样本。

本发明中，PCR扩增的程序包括：98℃5min(98℃15s，60℃30S)×40。

本发明引物探针可实现曲霉属、耶氏孢子菌、隐球菌和诺卡菌四种肺部感染菌属的快速检测，准确性和特异性好、灵敏度高，便于实时评估患者健康状况，及时为临床医生提供辅助治疗建议，对提高感染患者的存活率有着重要的意义。

附图说明

图1示本发明试剂盒检测曲霉属的线性分析图；

图2示本发明试剂盒检测诺卡菌曲霉属的线性分析图；

图3示本发明试剂盒检测耶氏孢子菌的线性分析图；

图4示本发明试剂盒检测隐球菌的线性分析图。

具体实施方式

本发明提供了肺部病原菌检测的引物探针及其试剂盒。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

1、引物探针

1.1依据曲霉属、耶氏孢子菌、隐球菌和诺卡菌的四个菌属的序列分析结果，采用PrimerExpress软件，设计引物和探针；同时搭配一组外源内参的引物探针，具体序列如表1所示。

表1引物探针组合序列

2、样品

2.1菌DNA样品：外购灭活菌，磁珠法提取基因组DNA。

2.2人DNA样品：痰液或肺泡灌洗液，磁珠法提取基因组DNA。

2.3外源内参模板：生物公司合成，溶解稀释后备用。

3、检测方法

3.1数字PCR扩增体系

3.1.125×Bc引物探针混合液

表2

3.1.2 ddPCR反应体系

表3

3.1.3扩增程序

98℃5min【98℃15s，60℃30S】×40

实施例2灵敏度检测试验

从合作的医院获得190例有缔蓝烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉核酸检测试剂盒检测结果的缔蓝真菌提取试剂盒抽提过的肺DNA样本，使用我们的四种肺部感染菌属数字PCR核酸检测试剂盒检测。

31例阳性样本我们检测结果都是阳性，159例阴性检测出1例诺卡菌属、曲霉和隐球菌三阳性。阳性符合率为100％，阴性符合率99.4％，灵敏度为96.9％，特异性为99.4％。

实施例3特异性检测实验

按照实施例1的引物探针和方法对以下样本进行数字PCR检测，结果如表5。

表4

表5

表6

表7

结果显示，对以上多种病原菌，本发明试剂盒发现只能检测出曲霉属、耶氏孢子菌、隐球菌和诺卡菌四种肺部感染真菌，无法检出其他的病原菌。说明，本发明试剂盒特异性高，能准确地、特异地将以上四个真菌菌属检测出来。

实施例4

把四种肺部感染菌属体系的模板分别配制到5000-7000copies/μl，按2倍稀释6个浓度梯度，每个浓度做4个复孔，做回归曲线，结果见图1～4。

耶氏孢子菌：FAM通道：Y＝0.9645X,R

曲霉属：ROX通道：Y＝0.9833X,R

诺卡菌：VIC通道：Y＝1.0145X,R

隐球菌：CY5通道：Y＝0.9988X,R

结果显示，采用本发明试剂盒检测曲霉属、耶氏孢子菌、隐球菌和诺卡菌时，在浓度为100-10000copies/μl的范围内呈现良好的线性关系。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 领航基因科技（杭州）有限公司

<120> 肺部病原菌检测的引物探针及其试剂盒

<130> MP21035862

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA