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一种基于RAA扩增的快速检测杂交鹿茸试剂盒

文献发布时间：2023-06-19 15:47:50

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及到一种基于RAA扩增的杂交鹿茸鉴定方法。

背景技术

中国是世界第三养鹿大国，以产茸为主。一般而言，鹿茸是从3岁的梅花鹿和马鹿中获得稳定的收割，每年7月一次，4月和9月两次，且二杠茸的重量不超过120g，三岔茸的重量不超过400g，长期低产限制了鹿茸的产量。近年，随着世界经济的一体化，鹿业市场的全球化，以肉用为主的鹿养殖国家将鹿茸及其副产品大量进入中国市场，给中国养鹿业带来了巨大的压力。为了提高国际鹿茸竞争优势，增加鹿的养殖效益，提高鹿的生产性能及鹿茸的产量，杂交鹿也顺势出现。杂交方式按亲本来源可分为三种：1)梅花鹿和马鹿的杂交后代(花·马杂交)，母本来源包括：东北梅花鹿(Cervus nippon hortulorum)、长白山梅花鹿(Cervus nippon)、日本梅花鹿(Cervus nippon nippon)等，父本来源包括：东北马鹿(Cervus elaphus xanthopygus)、天山马鹿(Cervus elaphus songaricus)、塔里木马鹿(Cervus elaphusyarkandensis)。2)马鹿与马鹿的杂交后代(马·马杂交)，母本来源包括东北马鹿(Cervus elaphusxanthopygus)、天山马鹿(Cervus elaphus songaricus)、甘肃马鹿(Cervus elaphus kansuensis)等，父本来源包括：天山马鹿(Cervus elaphussongaricus)、塔里木马鹿(Cervus elaphus yarkandensis)和阿尔泰马鹿(Cervuselaphus sibericus)等。3)水鹿与马鹿或梅花鹿杂交，母本来源水鹿(Cervus unicolor),父本来源包括：新疆马鹿(Cervus elaphus)，欧洲马鹿(Cervus elaphus)和梅花鹿(Cervusnippon)。在种间杂交中，通过梅花鹿和马鹿的杂交，可以使F1代呈现极显著复杂的杂种优势，还能显著降低饲养的成本。对于鹿茸来说，梅花鹿和马鹿杂交可以扩大药源，解决扩大药源供需关系的问题，并且有利于鹿茸类药材的利用与开发。但是目前从中药学和药物分析角度对杂交鹿茸的定性分析、质量评价、药理作用及安全性评价较少，在使用杂交鹿茸时，其质量和疗效是否会受到影响的研究不明确。

对于消费者而言，大部分的鹿茸产品难以通过肉眼直接的判断具体的鹿茸鹿种，不法商人就可能以贴错标签的形式用非药用鹿茸或用低价值的马鹿茸来替代高价值的梅花鹿鹿茸出售，通过不同鹿茸间的价格差获取巨大的经济利益。此外，无标签标识的鹿茸商品也给了鹿茸产品造假一定的可趁之机。而花·马杂交鹿茸的出现进一步加剧了鹿茸市场的混淆，由于杂交鹿茸并不是《中国药典》中明确规定的药用鹿茸，所以杂交鹿茸是否能作为药用鹿茸出售还有待商榷。

单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)技术是基因组DNA最基本的变异形式，利用一个或几个碱基的作为分子标记，通过对生物体内某位点的碱基差异来实现物种鉴定。目前SNP位点分子标记被广泛应用于动植物功能标记基因的开发、遗传图谱的构建、品种鉴定、物种进化等方面的研究。由于SNP标记在追溯体系中不仅能做到物种识别和个体鉴定，还能揭示个体基因品种的组成，所以也被逐渐应用到食品的真伪的表征中。基于SNP的分子标记检测技术在物种鉴别中的应用已经十分广泛，但是在鹿茸物种鉴定中的研究还相对较少。

近年来，鹿茸供需关系紧俏，为了满足鹿茸产品的需求，提高鹿茸产量，杂交育种也逐渐兴起，通过杂交技术来培育优良特性的鹿种以扩大鹿茸来源，提高鹿茸的产量也成为一个扩大鹿茸产量的方法。杂交技术虽然促进了鹿茸产业的发展，但是也为鹿茸市场监管增加了困难。此外，由于杂交鹿茸不在《中国药典》中规定的药用鹿茸范围中，其药用价值和安全性还有待进一步的评估。而目前常用的DNA条形码方法鉴定物种的基础是基于线粒体基因的鉴定，但是线粒体是母系遗传，仅通过线粒体上的基因片段无法实现对杂交鹿茸的鉴定。

胶体金免疫层析法是将特异性的抗原或抗体以条带状固定在NC膜上，胶体金标记试剂吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫后，通过层析作用，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，当移动至固定的抗原或抗体区域时，待检物与金标试剂的结合物发生抗原抗体结合，使胶体金倍截留，聚集在检测带上，通过肉眼可观察到显色结果。该检测方式灵敏度高，成本低，操作简便快速。

发明内容

本发明的目的在于提供检测杂交鹿的SNP引物，进一步设计成试剂盒，具有快速、灵敏、操作简便等优势，可适用于现场鉴定，对杂交鹿茸的鉴定具有重要意义。

为实现上述的目的，本申请采取了以下技术解决思路：

从NCBI上下载了马鹿的全基因组(GCA_002197005.1)序列作为参考基因组，从BIOproject中下载了100个梅花鹿和68个马鹿的基因组数据(PRJNA355630)。提取32个梅花鹿，21个马鹿的DNA，用二代建库测序得到53个个体的基因组序列。将以上221个个体的基因组序列与NCBI上的马鹿全基因组序列进行比对，寻找SNP差异位点，结合NCBI上下载的29条梅花鹿，马鹿近源物种的序列筛选SNP位点，最后根据所得的2个SNP位点设计SNP引物，将每组SNP引物(3条)组成两对分别对梅花鹿和马鹿的特异性引物，对引物进行AS-PCR凝胶电泳特异性验证，在选定的引物的5ˊ端添加修饰，利用这两对引物对已知物种信息的鹿茸样品进行RAA扩增，最后用胶体金试纸条进行检测，评估该引物在杂交鹿茸鉴定中的有效性。

本发明第一方面提供一种基于RAA法检测杂交鹿茸的引物，所述引物的序列如下：

上游引物014F2：5ˊ-ATAAGTAGCAACAAACTGGTAAAGAGCAA-3ˊ(SEQ ID NO.1)；

马鹿特异性下游引物014R2：5ˊ-TTAAGGAGCTTGAGTGGGTTACATACACCG-3ˊ(SEQ IDNO.2)；

梅花鹿特异性下游引物014S2：5ˊ-TTAAGGAGCTTGAGTGGGTTACATACAGTA-3ˊ(SEQ IDNO.3)。

优选的，上游引物5ˊ端标记生物素，下游引物5ˊ端标记地高辛。

优选的，所述杂交鹿茸为马鹿和梅花鹿的杂交鹿茸。

本发明的第二方面提供一种基于RAA法检测杂交鹿茸的试剂盒，所述试剂盒包含上述引物、反应试剂以及胶体金检测试纸条。

优选的，所述胶体金检测试纸条的检测线T线包埋链霉亲和素，质控线C线包埋兔抗羊二抗，胶体金上结合羊抗地高辛抗体。

优选的，所述上游引物和下游引物在RAA试剂盒中的终浓度为10μM。

优选的，所述反应体系(50μL)如下：25μL水解缓冲液，10μM上游引物3μL，10μM下游引物3μL，去离子水10.5μL，DNA模板6μL，醋酸镁2.5μL。

优选的，所述杂交鹿茸为梅花鹿和马鹿的杂交鹿茸。

本发明的第三方面提供上述引物或试剂盒在制备用于检测杂交鹿茸的试剂中的应用。

优选的，所述杂交鹿茸为梅花鹿和马鹿的杂交鹿茸。

本发明的第四方面提供使用上述试剂盒检测杂交鹿茸的方法，包括以下步骤：

(1)样品DNA提取：将鹿茸粉碎处理后提取DNA；

(2)RAA扩增：以提取到的鹿茸DNA为模板，用RAA试剂盒进行扩增；

(3)胶体金试纸条检测：将RAA扩增后的产物稀释后滴加到胶体金试纸条的样品垫上进行检测，当C线存在时，T线有条带表明为阳性，T线无条带为阴性。

优选的，所述步骤(2)中试剂盒的50μL反应体系如下：25μL水解缓冲液，10μM上游引物3μL，10μM下游引物3μL，去离子水10.5μL，DNA模板6μL，醋酸镁2.5μL。

优选的，所述步骤(2)中RAA扩增时，反应温度为37℃-41℃，反应时间为20-40min。

更优选的，所述步骤(2)中RAA扩增时，反应温度为37℃，反应时间为30min。

优选的，所述杂交鹿茸为梅花鹿和马鹿的杂交鹿茸。

本发明产生的有益效果：

1、本发明针对花马杂交鹿难以用常规的基于线粒体DNA条形码鉴别的难点，比较了梅花鹿、马鹿和其它近缘鹿种的全基因组序列，找出了可用于区分梅花鹿和马鹿的特异性SNP位点，并基于该SNP位点设计了等位基因特异性扩增(Allele specific-PCR，AS-PCR)引物，建立了基于等位基因特异性重组酶介导等温扩增(Alleles specific-recombinaseaided amplification，AS-RAA)的胶体金试纸条SNP分型检测方法，为花马杂交鹿的鉴定提供简单、有效的科学手段。

2、本发明基于重组酶介导的等温核酸扩增技术设计特异性SNP引物，并建立基于RAA的快速检测杂交鹿茸的试剂盒，实现37℃下进行30min即可完成扩增反应，结合胶体金试纸条检测技术，能快速对鹿茸进行现场检测。

附图说明

图1为Ce0141引物的Tm梯度特异性验证PCR电泳图(注：M：DL2000分子量标准；A：马鹿特异性引物014F1/R1；B：梅花鹿特异性引物014F1/S1；a：马鹿鹿茸；c：梅花鹿鹿茸；1：52℃；2：54℃；3：56℃；4：58℃；5：60℃；6：62℃；b：空白对照)

图2为Ce0142引物的Tm梯度特异性验证PCR电泳图(注：M：DL2000分子量标准；A：马鹿特异性引物014F2/R2；B：梅花鹿特异性引物014F2/S2；a：马鹿鹿茸；c：梅花鹿鹿茸；1：54℃；2：58℃；3：62℃；4：66℃；b：空白对照)

图3为Ce1741引物的Tm梯度特异性验证PCR电泳图(注：M：DL2000分子量标准；A：马鹿特异性引物174F1/R1；B：梅花鹿特异性引物174F1/S1；a：马鹿鹿茸；c：梅花鹿鹿茸；1：60℃；2：64℃；3：68℃；b：空白对照)

图4为Ce1745引物的Tm梯度特异性验证PCR电泳图(注：M：DL2000分子量标准；A：马鹿特异性引物174F5/R5；B：梅花鹿特异性引物174F5/S5；a：马鹿鹿茸；c：梅花鹿鹿茸；1：62℃；2：64℃；3：66℃；4：68℃；5：70℃；b：空白对照)；

图5为Ce1742和Ce1743引物的Tm梯度特异性验证电泳图(注：M：DL2000分子量标准；(1)：Ce1742；(2)：Ce1743；A：马鹿特异性引物174F2/R2(174F3/R3)；B：梅花鹿特异性引物174F2/S2(174F3/S3)；a：马鹿鹿茸；c：梅花鹿鹿茸；1：50℃；2：55℃；3：60℃；4：65℃；5：70℃；b：空白对照)；

图6为Ce1744和Ce1746引物的Tm梯度特异性验证PCR电泳图(注：M：DL2000分子量标准；(1)：Ce1744；(2)：Ce1746；A：马鹿特异性引物174F4/R4(174F6/R6)；B：梅花鹿特异性引物174F4/S4(174F6/S6)；a：马鹿鹿茸；c：梅花鹿鹿茸；1：55℃；2：60℃；3：65℃；4：70℃；b：空白对照)；

图7为Ce0142对9份鹿茸样品的RAA-胶体金试纸条检测结果(注：A：014F2/R2；B：014F2/S2；1-3：纯马鹿；4-6：梅花鹿；7-9：花马杂交鹿；b：空白对照)。

具体实施方式

本发明提供了一种基于RAA扩增的胶体金试纸条检测杂交鹿的引物及试剂盒，通过实施例的方式对本发明作进一步的说明，但是本发明并不仅仅局限于以下实施例。

试验例1、用于鉴定杂交鹿茸的SNP引物设计

1、引物设计

本发明根据筛选所得的SNP位点设计引物，以期能够鉴定出杂交鹿茸。所有的引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 SNP位点AS-PCR引物相关信息

2、试验结果分析

由图1-6不同引物的Tm梯度特异性验证PCR电泳图可知，引物Ce0141中的梅花鹿特异性引物014F1/R1在不同温度下无明显扩增(图1)、引物Ce0142中的马鹿特异性引物014F2/R2和梅花鹿特异性引物014F2/S2分别对马鹿和梅花鹿有特异性(图2)。引物Ce1741、Ce1742、Ce0143、Ce0144、Ce0145和Ce0146对梅花鹿和马鹿都无特异性(图3-6)

本发明根据筛选所得的SNP引物Ce0142，在上游引物引物5ˊ端标记生物素，在下游引物5ˊ端标记地高辛。所有的引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。本发明设计了三条引物，包括一条通用引物，两条特异性引物，具体如表2所示。

表2杂交鹿茸SNP引物

试验例2、鉴定杂交鹿茸的RAA试剂盒使用方法及功能验证

1、样品DNA提取

对于整支的鹿茸，用75％的乙醇冲洗三次，洗毕后切成片状，放入烘箱烘干，随后将烘干后的鹿茸再切成1cm×1cm的块状；若为片状的干鹿茸，则直接切成1cm×1cm的块状。将处理好的块状鹿茸样品放入组织研磨器中，在频率30Hz下研磨60s。转移至离心管中，置于4℃下保存称取100mg充分研磨后的鹿茸组织样品，用NucleoSpin Food DNA提取试剂盒提取DNA，按照试剂盒说明书操作，对于不易裂解的样品可将裂解时间延长30-60min。

2、RAA扩增

以提取到的鹿茸DNA为模板，用RAA试剂盒(江苏奇天基因生物科技有限公司)进行扩增，试剂盒的50μL反应体系如下：25μL水解缓冲液，10μM上游引物3μL，10μM下游引物3μL，去离子水10.5μL，DNA模板6μL，醋酸镁2.5μL，在37℃下加热30min。

3、胶体金试纸条检测

将RAA扩增后的产物稀释5倍，把70μL的稀释后样品滴加到胶体金试纸条的样品垫上，观察T线和C线条带显色情况，判断是否为花马杂交鹿茸。

4、结果分析

如图7所示，结果显示对于序号1-3的纯马鹿样品，只有014F2/R2的T线有显色条带，对于4-6的纯梅花鹿鹿茸样品，只有014F2/S2的T线有显色条带，对于7-9的花马杂交鹿茸样品，014F2/R2和014F2/S2的T线都有条带。因此，本发明设计的AS-RAA引物扩增出的产物可用于分辨花马杂交鹿茸。

虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本领域技术人员应认识到，在不偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种改变与修饰。因而，本发明意欲涵盖落在附属权利要求书及其同等物范围内的所有这些改变与修饰。

序列表

<110> 中国检验检疫科学研究院

<120> 一种基于RAA扩增的快速检测杂交鹿茸试剂盒

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA