一种利用天然蓝藻材料保藏芽孢杆菌菌种的方法

技术领域

本发明属于菌种保藏技术领域，具体涉及一种利用天然蓝藻材料保藏芽孢杆菌菌种的方法。

背景技术

微生物菌种是国家的重要生物资源，也是生产、教学和科学研究的基本材料。为确保菌种的质量和活力，正确的菌种保藏方法在微生物学研究及实际应用中至关重要。

目前，芽孢杆菌菌种的保藏方法存在一些缺陷，如操作复杂、菌种容易发生污染和退化，保藏所使用的冷冻保护剂经济成本高且不安全。

发明内容

针对现有蜡样芽孢杆菌菌种保藏存在的问题，本发明提供一种利用天然蓝藻材料保藏芽孢杆菌菌种的方法，以天然蓝藻材料(发菜、地木耳)为载体进行菌种保藏，菌种存活率高，操作简单易行，经济节约，安全性高。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种利用天然蓝藻材料保藏芽孢杆菌菌种的方法，包括以下步骤：

步骤1，将待保藏的芽孢杆菌单菌落培养后作为种子菌培养至对数期；

步骤2，将步骤1得到的菌液离心后舍弃上清液，先洗涤菌体沉淀，之后用PBS溶液重悬菌体沉淀；

步骤3，将灭菌后的发菜或地木耳浸泡在步骤2得到的混合液中，之后进行恒温干燥，最后在-80℃～25℃下保藏，完成芽孢杆菌菌种的保藏。

优选的，步骤1将待保藏的芽孢杆菌先置于液体培养基中，之后在35～38℃和150～300rpm的条件下恒温震荡培养12～18h，作为种子菌。

进一步，步骤1将所得的种子菌按1％的接种量接种到液体培养基中，培养至OD

优选的，步骤2将步骤1得到的菌液在5000～7000rpm下离心3～8min后舍弃上清液。

优选的，步骤2用浓度为0.01M、pH为7.0的PBS溶液洗涤菌体沉淀3～5次。

优选的，步骤2用与步骤1所述菌液等体积的PBS溶液重悬菌体沉淀，PBS溶液的浓度为0.01M、pH为7.0。

优选的，步骤3按如下过程对发菜或地木耳进行灭菌：

用质量分数为60％～80％的乙醇浸泡发菜或地木耳30～45s，之后用灭菌水进行漂洗，然后在紫外灯下照射0.5～1h，最后真空冷冻干燥，得到所述的发菜或地木耳。

优选的，步骤3中所述的发菜或地木耳与所述的混合液的比例为(0.01～0.1)g：1mL。

优选的，步骤3将灭菌后的发菜或地木耳在混合液中浸泡15～20min。

优选的，步骤3将浸泡后的发菜或地木耳在温度为20～30℃、相对湿度为40％～60％RH的恒温条件下干燥3～5天，再进行保藏。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明是一种利用天然蓝藻材料保藏芽孢杆菌菌种的方法，先将待保藏的芽孢杆菌单菌落培养后作为种子菌培养至对数期，之后可将得到的菌液离心，舍弃上清液后方便洗涤菌体沉淀，之后用PBS溶液重悬菌体沉淀，再将灭菌后的发菜或地木耳浸泡在得到的混合液中，之后恒温干燥即可在-80℃～25℃下保藏。发菜表面粗糙不平，由不规则的胶质块体堆积而成，厚薄不均，呈波浪状无规则皱折起伏，并有许多指状突起和裂隙。发菜特殊的形态结构有利于微生物的附着。在生长过程中，野生发菜在藻丝体表面分泌多糖并形成胶鞘，此胶鞘为附生微生物提供了可生存的场所，而地木耳的表面皱折不平，含有大量胶质物。这些胶质物呈片状堆积，形成许多大小不等的间缝，这种特殊的形态结构为微生物附着提供了环境。本发明操作简单、方便，菌种存活率高，利用天然蓝藻材料的自然形态结构特点用于芽孢杆菌菌种保藏，原料易得，适用范围广。此外，保藏温度(常温和低温)范围广，保藏过程不需要添加额外试剂，如DMSO、甘油和海藻糖等高成本、有毒的冷冻保护剂，可节约成本、降低环境污染，能够实现芽孢杆菌菌种的稳定保存，菌种变异或退化程度极小，菌种存活率高。

附图说明

图1为本发明实施例1中发菜原植体形态图。

图2为本发明实施例5中地木耳原植体形态图。

图3为本发明实施例1中扫描电镜下发菜的表面结构图。

图4为本发明实施例1中扫描电镜下菌种在发菜表面的分布图。

图5为本发明实施例1中菌种的存活率图。

图6为本发明实施例2中菌种的存活率图。

图7为本发明实施例3中菌种的存活率图。

图8为本发明实施例4中菌种的存活率图。

图9为本发明实施例5中菌种的存活率图。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

发菜，又名发状念珠藻，是一种生长在荒漠地带的陆生性蓝藻。发菜原植体外观为头发丝状，粗细不均；藻体表面粗糙不平，由不规则的胶质块体堆积而成，厚薄不均，呈波浪状无规则皱折起伏，并有许多指状突起和裂隙。发菜特殊的形态结构有利于微生物的附着。在生长过程中，野生发菜在藻丝体表面分泌多糖并形成胶鞘，此胶鞘为附生微生物提供了可生存的场所。

地木耳，又名地皮菜，分布于沙漠、干燥的草原和岩石表面。成熟的地木耳外观呈扁平皱折膜状或波状片体，有时边缘呈不规则撕裂状，有的有穿孔；地木耳的表面皱折不平，含有大量胶质物。这些胶质物呈片状堆积，形成许多大小不等的间缝，这种特殊的形态结构为微生物附着提供了环境。

以下实施例中的发菜采集于宁夏回族自治区银川市，地木耳采集于甘肃省会宁县；所采用的菌种为蜡样芽孢杆菌，分离于野生发菜表面，通过16SrRNA测序结果鉴定该菌株为蜡样芽孢杆菌，基因组序列已提交于GenBank数据库中，序列编号为JAGKST000000000，并命名为Bacillus sp.strain WL1；所采用的仪器和试剂，如无特殊说明，均为常规生物公司购买。

本发明一种利用天然蓝藻材料保藏芽孢杆菌菌种的方法，包括如下步骤：

(1)天然蓝藻材料的处理：

将野外采集的发菜和地木耳清洗干净，去除杂质，然后进行灭菌和干燥处理。

灭菌处理为质量分数为60％～80％的乙醇浸泡30～45s，然后用灭菌水快速漂洗，紫外灯照射0.5～1h，真空冷冻干燥备用。

(2)菌种的活化：

采用平板划线法活化保藏于-80℃的芽孢杆菌。

(3)菌种的培养：

挑取芽孢杆菌单菌落置于液体培养基中，35～38℃、150～300rpm恒温震荡培养12～18h，作为种子菌，将接种量为1％的种子菌接种到新鲜的液体培养基中培养至OD

(4)接种保藏：

吸取1mL的菌液，在5000～7000rpm下离心3～8min后舍弃上清液，利用PBS溶液(0.01M,pH＝7.0)洗涤菌体沉淀，重复3～5次后加入1mL PBS溶液(0.01M，pH 7.0)重悬菌体沉淀；

然后将0.01～0.1g发菜或0.01～0.1g地木耳加入形成的混合液中浸泡15～20min，吸取未被吸收的菌液，置于温度为20～30℃、相对湿度为40％～60％RH的恒温培养室干燥，保藏3～5天后，待发菜或地木耳完全干燥后，分别置于室温、4℃、-20℃和-80℃的冰箱保藏。

实施例1

本发明是一种利用天然蓝藻材料发菜保藏芽孢杆菌菌种的方法，包括如下步骤：

(1)发菜材料的处理：将野外采集的发菜清洗干净，去除杂质，然后用质量分数为70％乙醇浸泡30s，灭菌水漂洗4次，然后在超净工作台中利用紫外灯管照射1h，真空冷冻干燥备用。处理后的发菜如图1所示为细丝状，略有不规则弯曲。

(2)菌种的活化和培养：采用平板划线法活化保藏于-80℃的芽孢杆菌菌种，挑取芽孢杆菌单菌落置于LB液体培养基，37℃、200rpm恒温震荡培养箱培养12h作为种子菌，吸取接种量为1％的种子菌置于新鲜的LB液体培养基培养至OD

(3)漂洗菌体沉淀：将上述培养至对数期的1mL菌液6000rpm离心5min，舍弃上清液，利用PBS溶液(0.01M,pH＝7.0)洗涤菌体沉淀，重复3次后加入1mL PBS溶液重悬菌体沉淀，得到漂洗后的菌液。

(4)菌种的保藏：称取0.02g发菜于2mL灭菌离心管中，用步骤(3)得到的漂洗后的菌液浸没发菜，15min后吸取未被发菜吸收的菌液，置于温度为25℃、相对湿度为52％RH的恒温培养室保藏，3天后发菜完全干燥后置于室温保藏。

(5)计算菌种存活率：分别取保藏0d、4d、8d、16d、32d、3month后的发菜，采用1mL灭菌水浸没接种后的发菜10min，涡旋振荡器3000rpm震荡30s，将吸附在发菜表面的菌种充分漂洗下来，稀释2000倍，吸取100μL稀释后的菌液涂布，于37℃培养12h，统计菌落数并计算菌种存活率，经计算，3个月的菌种存活率为83.66％。

图3和图4是采用美国FEI公司生产的型号规格为Verios 460的扫描电镜拍摄的图片。如图3所示，发菜原植体表面呈波浪状无规则皱折起伏，并有许多指状突起和裂隙；如图4所示，芽孢杆菌密集分布在发菜表面。具体的菌种的存活率图可参见图5，菌种的存活率随着时间的增加而降低，保藏3个月后，菌种存活率下降趋势趋于平缓。

实施例2

本发明是一种利用天然蓝藻材料发菜保藏芽孢杆菌菌种的方法，包括如下步骤：

(1)发菜材料的处理：将野外采集的发菜清洗干净，去除杂质，然后用质量分数为70％乙醇浸泡30s，灭菌水漂洗4次，然后在超净工作台中利用紫外灯管照射1h，真空冷冻干燥备用。

(2)菌种的活化和培养：采用平板划线法活化保藏于-80℃的芽孢杆菌菌种，挑取芽孢杆菌单菌落置于LB液体培养基，37℃、200rpm恒温震荡培养箱培养12h作为种子菌，吸取接种量为1％的种子菌置于新鲜的LB液体培养基培养至OD

(3)漂洗菌体沉淀：将上述培养至对数期的1mL菌液6000rpm离心5min，舍弃上清液，利用PBS溶液(0.01M,pH＝7.0)洗涤菌体沉淀，重复3次后加入1mL PBS溶液重悬菌体沉淀,得到漂洗后的菌液。

(4)菌种的保藏：称取0.02g发菜于2mL灭菌离心管中，用步骤(3)得到的漂洗后的菌液浸没发菜，15min后吸取未被发菜吸收的菌液，置于温度为25℃、相对湿度为52％RH的恒温培养室保藏，3d后发菜完全干燥后置于4℃冰箱保藏。

(5)计算菌种存活率：分别取保藏0d、4d、8d、16d、32d、3month后的发菜，采用1mL灭菌水浸没接种后的发菜10min，涡旋振荡器3000rpm震荡30s，将吸附在发菜表面的菌种充分漂洗下来，稀释2000倍，吸取100μL稀释后的菌液涂布，于37℃培养12h，统计菌落数并计算菌种存活率，经计算，保藏3个月后的菌种存活率达85.35％。

具体的菌种的存活率图可参见图6，菌种的存活率随着时间的增加而降低，保藏3个月后，菌种存活率下降趋势趋于平缓。

实施例3

本发明是一种利用天然蓝藻材料发菜保藏芽孢杆菌菌种的方法，包括如下步骤：

(1)发菜材料的处理：将野外采集的发菜清洗干净，去除杂质，然后用质量分数为70％乙醇浸泡30s，灭菌水漂洗4次，然后在超净工作台中利用紫外灯管照射1h，真空冷冻干燥备用。

(2)菌种的活化和培养：采用平板划线法活化保藏于-80℃的芽孢杆菌菌种，挑取芽孢杆菌单菌落置于LB液体培养基，37℃、200rpm恒温震荡培养箱培养12h作为种子菌，吸取接种量为1％的种子菌置于新鲜的LB液体培养基培养至OD

(3)漂洗菌体沉淀：将上述培养至对数期的1mL菌液6000rpm离心5min，舍弃上清液，利用PBS溶液(0.01M,pH＝7.0)洗涤菌体沉淀，重复3次后加入1mL PBS溶液重悬菌体沉淀，得到漂洗后的菌液。

(4)菌种的保藏：称取0.02g发菜于2mL灭菌离心管中，用步骤(3)得到的漂洗后的菌液浸没发菜，15min后吸取未被发菜吸收的菌液，置于温度为25℃、相对湿度为52％RH的恒温培养室保藏，3天后发菜完全干燥后置于-20℃冰箱保藏。

(5)计算菌种存活率：分别取保藏0d、4d、8d、16d、32d、3month后的发菜，采用1mL灭菌水浸没接种后的发菜10min，涡旋振荡器3000rpm震荡30s，将吸附在发菜表面的菌种充分漂洗下来，稀释2000倍，吸取100μL稀释后的菌液涂布，于37℃培养12h，统计菌落数并计算菌种存活率，经计算，保藏3个月后的菌种存活率达83.64％。

具体的菌种的存活率图可参见图7，菌种的存活率随着时间的增加而降低，保藏3个月后，菌种存活率下降趋势趋于平缓。

实施例4.

本发明是一种利用天然蓝藻材料发菜保藏芽孢杆菌菌种的方法，包括如下步骤：

(1)发菜材料的处理：将野外采集的发菜清洗干净，去除杂质，然后用质量分数为70％乙醇浸泡30s，灭菌水漂洗4次，然后在超净工作台中利用紫外灯管照射1h，真空冷冻干燥备用。

(2)菌种的活化和培养：采用平板划线法活化保藏于-80℃的芽孢杆菌菌种，挑取芽孢杆菌单菌落置于LB液体培养基，37℃、200rpm恒温震荡培养箱培养12h作为种子菌，吸取接种量为1％的种子菌置于新鲜的LB液体培养基培养至OD

(3)漂洗菌体沉淀：将上述培养至对数期的1mL菌液6000rpm离心5min，舍弃上清液，利用PBS溶液(0.01M,pH＝7.0)洗涤菌体沉淀，重复3次后加入1mL PBS溶液重悬菌体沉淀,得到漂洗后的菌液。

(4)菌种的保藏：称取0.02g发菜于2mL灭菌离心管中，用步骤(3)得到的漂洗后的菌液浸没发菜，15min后吸取未被发菜吸收的菌液，置于温度为25℃、相对湿度为52％RH的恒温培养室保藏，3d后发菜完全干燥后置于-80℃冰箱保藏。

(5)计算菌种存活率：分别取保藏0d、4d、8d、16d、32d、3month后的发菜，采用1mL灭菌水浸没接种后的发菜10min，涡旋振荡器3000rpm震荡30s，将吸附在发菜表面的菌种充分漂洗下来，稀释2000倍，吸取100μL稀释后的菌液涂布，于37℃培养12h，统计菌落数并计算菌种存活率，经计算，保藏3个月后的菌种存活率达84.28％。

具体的菌种的存活率图可参见图8，菌种的存活率随着时间的增加而降低，保藏3个月后，菌种存活率下降趋势趋于平缓。

实施例5

本发明是一种利用天然蓝藻材料地木耳保藏芽孢杆菌菌种的方法，包括如下步骤：

(1)地木耳材料的处理：将野外采集的地木耳清洗干净，去除杂质，然后用质量分数为70％乙醇浸泡30s，灭菌水漂洗4次，然后在超净工作台中利用紫外灯管照射1h，真空冷冻干燥备用。处理后的地木耳如图2所示，呈扁平皱折膜状或波状片体，边缘呈不规则撕裂状。

(2)菌种的活化和培养：采用平板划线法活化保藏于-80℃的芽孢杆菌菌种，挑取芽孢杆菌单菌落置于LB液体培养基，37℃、200rpm恒温震荡培养箱培养12h作为种子菌，吸取接种量为1％的种子菌置于新鲜的LB液体培养基培养至OD

(3)漂洗菌体沉淀：将上述培养至对数期的1mL菌液6000rpm离心5min，舍弃上清液，利用PBS溶液(0.01M,pH＝7.0)洗涤菌体沉淀，重复3次后加入1mL PBS溶液重悬菌体沉淀,得到漂洗后的菌液。

(4)菌种的保藏：称取0.02g地木耳于2mL灭菌离心管中，用步骤(3)得到的漂洗后的菌液浸没地木耳，15min后吸取未被地木耳吸收的菌液，置于温度为25℃、相对湿度为52％RH的恒温培养室保藏，3d后地木耳完全干燥后置于室温保藏。

(5)计算菌种存活率：分别取保藏0d、4d、8d、16d、32d、3month后的发菜，采用1mL灭菌水浸没接种后的地木耳10min，涡旋振荡器3000rpm震荡30s，将吸附在地木耳表面的菌种充分漂洗下来，稀释2000倍，吸取100μL稀释后的菌液涂布，于37℃培养12h，统计菌落数并计算菌种存活率，经计算，保藏3个月后的菌种存活率达82.35％。

具体的菌种的存活率图可参见图9，菌种的存活率随着时间的增加而降低，保藏3个月后，菌种存活率下降趋势趋于平缓。