一种温敏型基因回路系统及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于合成生物学与代谢工程技术领域，尤其是指一种温敏型基因回路系统及其构建方法与应用。

背景技术

2’-岩藻糖基乳糖(2’-fucosyllactose,2’-FL)，分子式C

作为GRAS(Generally Regard as Safe)革兰氏阳性宿主，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)已被广泛用于L-天冬酰胺酶，透明质酸以及核黄素等高附加值化合物的生物合成。相比于大肠杆菌(E.coli)或酿酒酵母(S.cere)等宿主，2’-FL在B.subtilis胞内代谢合成后能够快速高效的转运至胞外，降低后续提取工艺成本，从而实现工业化制备。2’-FL的代谢合成途径较为复杂，其合成关键前体大部分会流向两条竞争途径：磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway,PPP)与糖酵解途径(glycolysis)。然而磷酸戊糖与糖酵解途径均为微生物正常生长所必须途径，因此采用静态策略直接敲除这两条竞争途径会对细胞生长造成损害。因此如何调整B.subtilis胞内代谢流，平衡细胞生长与2’-FL代谢合成模块，提高2’-FL发酵产量是一个值得探讨的问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明通过代谢工程技术，发明了一种动态调控策略以提高2’-FL发酵产量的方法。本发明首先设计重构了一系列适用于B.subtilis的温敏型生物传感器；其次，基于CRISPRi系统构建双向基因回路，并将双向基因回路与单输入多输出(SIMO)基因回路结合构建了高版本单输入多输出(ASIMO)基因回路，实现多个代谢模块在不同发酵时间点的激活表达或/和下调表达。之后将获得的ASIMO基因回路动态调控参与2’-FL代谢合成的3个主要模块：2’-FL合成模块，辅因子供给模块和竞争途径模块。首先利用ASIMO回路中的激活模块动态激活基因manB与futC的表达，实现2’-FL的从头合成；其次将辅因子模块与2’-FL合成模块偶联，即在激活2’-FL合成模块同时上调辅因子供给模块的关键基因ndk与gmk，提高2’-FL的发酵产量；最后利用ASIMO回路中的抑制回路顺序下调磷酸戊糖与糖酵解途径的关键基因pfkA与zwf，使得代谢流更多的流向于2’-FL合成模块，得到重组菌株MT17。MT17菌株在摇瓶内发酵60h后2’-FL发酵产量达到1.83g/L，是出发菌株MT1的5.16倍，且重组菌株MT17在5-L发酵罐内发酵60h，发酵产量可达5.8g/L。与静态调控相比，利用ASIMO基因回路进行动态调控能够将细胞生长阶段与2’-FL合成阶段解耦连，缓解宿主细胞的代谢压力，合理分配代谢流，进而实现2’-FL的高效合成。

本发明的第一个目的在于提供一种温敏型启动子，所述启动子为P

本发明的第二个目的在于提供一种单输入多输出基因回路，所述单输入多输出基因回路包含至少2个所述的温敏型启动子，将不同激活温度的温敏型启动子分别与至少2个模块蛋白编码基因连接，实现至少2个模块蛋白的顺序表达。

本发明的第三个目的在于提供一种双向基因回路，所述双向回路包含至少1个所述的温敏型启动子、dCPf1和crRNA，实现基因的上调和下调；所述dCPf1连接温敏型启动子，crRNA连接组成型启动子，或dCPf1连接组成型启动子，crRNA连接温敏型启动子。

本发明的第四个目的在于提供一种高版本单输入多输出基因回路，所述高版本单输入多输出基因回路同时包含所述的单输入多输出基因回路和所述的双向基因回路。

本发明的第五个目的在于提供含所述温敏型启动子的细胞。

在本发明的一个实施例中，所述细胞还表达由组成型启动子连接的转录因子CI

本发明的第六个目的在于提供一种重组枯草芽孢杆菌，以枯草芽孢杆菌168、W600和W800为出发菌株，用所述的温敏型启动子控制基因manB与futC的表达，和/或表达dCpf1，并利用所述的温敏型启动子控制crRNA的表达实现竞争途径关键基因zwf与pfkA的抑制表达，和/或利用所述的温敏型启动子在基因组上过表达辅因子GTP合成途径基因ndk与gmk。

在本发明的一个实施例中，以枯草芽孢杆菌168、W600和W800为出发菌株，用温敏型启动子P

在本发明的一个实施例中，利用组成型启动子或温敏型启动子表达所述dCpf1。

在本发明的一个实施例中，组成型启动子选自P

在本发明的一个实施例中，所述温敏型启动子选自P

在本发明的一个实施例中，所述基因manB Gene ID:946574；所述基因futC的序列来源于文章Engineering the Substrate Transport and Cofactor RegenerationSystems for Enhancing 2’-Fucosyllactose Synthesis in Bacillus subtilis DOI:10.1021/acssynbio.9b00314；所述基因zwf的序列来源于CRISPRi allows optimaltemporal control of N-acetylglucosamine bioproduction by a dynamiccoordination of glucose and xylose metabolism in Bacillus subtilis，所述基因pfkA的序列来源于CRISPRi allows optimal temporal control of N-acetylglucosamine bioproduction by a dynamic coordination of glucose andxylose metabolism in Bacillus subtilis；所述基因ndk的序列来源于文章Engineeringthe Substrate Transport and Cofactor Regeneration Systems for Enhancing 2’-Fucosyllactose Synthesis in Bacillus subtilis DOI:10.1021/acssynbio.9b00314；所述基因gmk的序列来源于文章Engineering the Substrate Transport and CofactorRegeneration Systems for Enhancing 2’-Fucosyllactose Synthesis in Bacillussubtilis DOI:10.1021/acssynbio.9b00314。

本发明的第七个目的在于提供一种重组枯草芽孢杆菌的构建方法，以枯草芽孢杆菌168、W600和W800为出发菌株，用所述的温敏型启动子控制基因manB与futC的表达，和/或表达dCpf1，并利用所述的温敏型启动子控制crRNA的表达实现竞争途径关键基因zwf与pfkA的抑制表达，和/或利用所述的温敏型启动子在基因组上过表达辅因子GTP合成途径基因ndk与gmk。

本发明的第八个目的在于提供所述的温敏型启动子或所述的基因回路或所述的重组枯草芽孢杆菌在合成化合物中的应用。

在本发明的一个实施例中，所述应用为在发酵合成2’-岩藻糖基乳糖中的应用。

在本发明的一个实施例中，发酵培养分三个时间段进行，时间段分别为0-12h、12-18h、18-60h；发酵培养的温度为30-37℃，搅拌速率200-900rpm。

在本发明的一个实施例中，发酵的培养基包括5-60g/L碳源，2-12g/L氮源，2-15g/L三水磷酸氢二钾，2-15g/L磷酸二氢钾。

在本发明的一个实施例中，所述碳源包括乳糖与其他碳源，所述其他碳源选自蔗糖、葡萄糖和甘油中的一种或多种；所述氮源选自蛋白胨、酵母粉和硫酸铵中的一种或多种。

为解决2’-FL发酵产量较低的问题，本发明提供了一种提高2’-FL的枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用。本方法首先在B.subtilis内利用组成型启动子P43表达来源于噬菌体λ的温敏型转录因子CI

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

本发明基于新型正交的温敏型传感器，设计构建了ASIMO基因回路，顺序调控涉及2’-FL代谢合成的3个模块，合理分配胞内资源，缓解代谢压力，最终2’-FL摇瓶发酵产量达到1830mg/L，5-L发酵罐内发酵产量可达5.8g/L。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图1是本发明实施例中所得重组菌株在不同温度下的荧光表达强度；

图2是本发明实施例2中梯度温度变化培养下WY9菌株荧光表达变化；

图3是本发明温敏型双向基因回路调控结果图；

图4是本发明实施例5菌株MT3发酵培养过程图；

图5是本发明实施例5菌株MT9发酵培养过程图；

图6是本发明实施例5菌株MT17发酵培养过程图；

图7是本发明实施例6菌株MT17在5-L发酵罐规模中发酵培养过程图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1.温敏型启动子的设计与构建

(a)人工合成基因片段P

(b)将步骤(a)中获得的四个片段amye-U、amye-D、amye-S和P43-CI基因片段按照等摩尔比配置进行一步融合pcr处理。将连接之后的片段转入枯草芽孢杆菌168感受态内，之后涂板于添加壮观霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养12h，长出的单菌落即为重组菌株WY1。

(c)以质粒phta0为模板(序列来源文章：Design of a programmable biosensor-CRISPRi genetic circuits for dynamic and autonomous dual-control of metabolicflux in Bacillus subtilis doi:10.1093/nar/gkz1123)，分别采用6对引物引物Pveg-F、Pveg-R，Pveg1-F、Pveg1-R，Pveg2-F、Pveg2-R，Pveg3-F、Pveg3-R，Pveg4-F、Pveg4-R，Pveg5-F、Pveg5-R扩增得到片段Pveg、Pveg1、Pveg2、Pveg3、Pveg4和Pveg5。将得到的6个片段分别热击转入大肠杆菌JM109感受态后进行测序。测序正确的单菌落接入含有氨苄抗性的2mLLB液体培养基内37℃培养16h后利用生工质粒提取试剂盒提取得到6种质粒phta1、phta2、phta3、phta4、phta5和phta6。

(d)在步骤(a)制备得到的枯草芽孢杆菌WY1中，分别导入质粒phta2、phta3、phta4、phta5和phta6，之后涂板于添加氯霉素的LB固体培养基平板上，37℃培养18h，之后长出的单菌落即分别枯草芽孢杆菌WY2、WY3、WY4、WY5、WY6和WY7。

(e)将步骤(d)中构建的6株菌使用LB培养基培养，使用96孔板分别在28℃、30℃、32℃、34℃、37℃、39℃和42℃培养20h，利用酶标仪检测荧光值。GFP荧光蛋白激发波长：490nm，发射波长530nm，增益60。结果如图1所示，含有phta6质粒的WY7在低于37℃情况下泄露较低，且动态调控范围达到39.5倍。因此，质粒phta6内含有的启动子P

(f)随后发现，以启动子P

引物序列：

Amye-D-F：ggaagaaacatttggctaaccgcaactttagagtaaagggc

Amye-D-R：tgaacaggagcgttgattgatataac

Amye-U-F：ggttcatcctctgtctctatcaat

Amye-U-R：aattgttatccgctctaatcatccttccagggtatgtt

P43-CI-F：ctgggaaaacccttgataggtggtatgttttcgct

P43-CI-R：ttactctaaagttgcggttagccaaatgtttcttccggc

S-amye-F：ggaaggatgattagagcggataacaatttcacac

S-amye-R：cataccacctatcaagggttttcccagtcacg

Pveg-F：ttattaacgttgatataatttaaattttatttgacaaaaatgggctcgtgttgtacaataaatgtagctgtcaccggatgtgcttPveg-R：acatttattgtacaacacgagcccatttttgtcaaataaaatttaaattatatcaacgttaataatagagcgcaacgcaattaatg

Pveg1-F：ttattaacgttgatataatttaaattttatttgacataacaccgtgcgtgttgtacaataaatgtagctgtcaccggatgtgct

Pveg1-R：acatttattgtacaacacgcacggtgttatgtcaaataaaatttaaattatatcaacgttaataatagagcgcaacgcaattaatgt

Pveg2-F：ttattaacgttgatattaacaccgtgcgtgttgacaaaaatgggctcgtgttgtacaataaatgtagctgtcaccggatgtgct

Pveg2-R：acatttattgtacaacacgagcccatttttgtcaacacgcacggtgttaatatcaacgttaataatagagcgcaacgcaattaatg

Pveg3-F：ttattaacgttgatataatttaaattttatttgacaaaaatgggctcgtgttgtacaataaatgtagtaacaccgtgcgtgttgagctgtcaccggatgtgctt

Pveg3-R：caacacgcacggtgttactacatttattgtacaacacgagcccatttttgtcaaataaaatttaaattatatcaacgttaataatagagcgcaacgcaattaatgt

Pveg4-F：

ttattaacgttgatattaacaccgtgcgtgttgacaaaaatgggctcgtgttgtacaataaatgtagtacctctggcggtgataaagctgtcaccggatgtgc

Pveg4-R：ttatcaccgccagaggtactacatttattgtacaacacgagcccatttttgtcaacacgcacggtgttaatatcaacgttaataatagagcgcaacgcaattaa

P

P

实施例2.构建SIMO基因回路

(a)人工合成以启动子P

(b)将步骤(a)中获得的npre-U、npre-D、npre-Z和P

(c)挑选步骤(b)中平板上长出的单菌落WY9培养至10mL LB液体培养基内，30℃培养10h取样1mL，之后将剩余的液体培养基放置在32℃培养4h，取样1mL；其次将剩余的液体培养基放置于34℃培养基4h，取1mL，最后剩余的液体培养基放置于37℃培养基4h，取1mL。

(d)将步骤(c)中分别在30、32、34和37℃培养条件下的的样品利用激光扫描共聚焦显微镜进行荧光表达分析。荧光检测波长为：CFP激发波长为440nm，发射波长为465-480nm；GFP激发波长为488nm，发射波长为515-564nm；mcherry激发波长为580nm，发射波长为610-669nm。如图2所示，在30℃培养条件下，WY9菌株内的CFP、GFP与mcherry均不表达；当温度提升至32℃时，WY9菌株内的CFP开始表达，菌株显示出青色荧光；将温度继续升至34℃后，WY9菌株内的CFP继续表达，同时GFP开始表达，菌株显示出青色与绿色荧光；当温度最终升至37℃时，WY9菌株内的CFP、GFP与mcherry均表达，菌株显示出青色、绿色与红色荧光。因此，该结果证明了温敏型单输入多输出基因回路的成功构建。

引物序列：

Npre-D-Fgtcgtgactgggaaaaccctaattctgctacaggtcacg

Npre-D-Rggcagccatcttcacc

Npre-U-Fcacttattcacacgcacata

Npre-U-Racgcaataaatatcaacgttaataattcattcaagagttatgttt

Npre-Z-F ggcattacgcttggcatggacgaactctataaataatatgaccatgattacgaattcgag

Npre-Z-Rtgacctgtagcagaattagggttttcccagtcacgacgt

Gana-C-F ctaatgtgtgtttacgacaaagggttttcccagtcacgac

Gana-C-R cactccaccggcggcatggacgagctgtacaagtaagagcggataacaatttcacaca

Gana-D-F ctacccgtgttaatatcaacgttaataatgacatcacattctcctcct

Gana-D-Rtatctattcaatggcggaggtc

Gana-U-F agttgcctggccttgaaca

Gana-U-R ctgggaaaaccctttgtcgtaaacacacattaggc

实施例3.构建双向基因回路

(a)人工合成以启动子P

(b)将步骤(a)中获得的npre-U2、npre-D、npre-Z2和P

(c)人工合成以启动子P

(d)挑选步骤(c)中平板上长出的单菌落WY11培养至2mL LB液体培养基内，分别在32℃、34℃、37℃、39℃与42℃条件下培养20h，将上述不同温度培养的样品利用酶标仪检测荧光值。GFP荧光蛋白激发波长：490nm，发射波长530nm，增益60；Cherry荧光蛋白激发波长：580nm，发射波长610nm，增益70。如图3所示，随着培养温度的升高，GFP相对表达水平呈现上升趋势，且mcherry相对表达水平呈现下降趋势。因此，该结果证明了温敏型双向调控基因回路的成功构建。

引物序列：

P43-FtggacgagctgtacaagtaaAGAGTCGACCTGTTAcgaa

P43-R cataccacctatcaggatccagttgctcaaaaaaatctcgg

Npre-D-F：gtcgtgactgggaaaaccctaattctgctacaggtcacg

Npre-D-R：ggcagccatcttcacc

Npre-U-F：cacttattcacacgcacata

Npre-U-R2：cagaggtatgtcaacacgcacggtgttaatatcaacgttaataattcattcaagagttatgtttttt

Npre-Z-F2：atgaagagtattttgagttcgtgcagaataggaataactaatatgaccatgattacgaattcgag

Npre-Z-R：tgacctgtagcagaattagggttttcccagtcacgacgt

Gana-C-F：ctaatgtgtgtttacgacaaagggttttcccagtcacgac

Gana-C-R2：gtacttgaaaacaggctgtgaggcctgtttttttattaatccgagcggataacaatttcacacag

Gana-D-F2：ttttgtcaaataaaatttaaattatatcaacgttaataatgacatcacattctcctccttgtt

Gana-D-R：tatctattcaatggcggaggtc

Gana-U-F：agttgcctggccttgaaca

Gana-U-R：ctgggaaaaccctttgtcgtaaacacacattaggc

实施例4.模块顺序动态调控2’-FL代谢合成

(a)，人工合成以启动子P

(b)，将步骤(a)中获得的npre-U3、npre-D、npre-Z3和P

(c)，人工合成以启动子P

(d)，将步骤(c)中获得的ganA-U、ganA-D2、ganA-Z3和实施例3步骤(a)中的P

(e)，人工合成以启动子P

(f)，将步骤(e)中获得的ldh-U、ldh-D、ldh-S和P

引物序列：

Npre-D-F：gtcgtgactgggaaaaccctaattctgctacaggtcacg

Npre-D-R：ggcagccatcttcacc

Npre-U-F：cacttattcacacgcacata

Npre-U-R3：aagttcaagcgaaaacataccacctatcaggatcttcattcaagagttatgttttttacatat

Npre-Z-F3：agtggttccttgagaatcaagaccgctttcgggggtaatatgaccatgattacgaattcgag

Npre-Z-R：tgacctgtagcagaattagggttttcccagtcacgacgt

Bpr-C-F：aatgaggaaaaaaacgaaaaacagagagcggataacaatttcacacagg

Bpr-C-R：tatgtcaacactacccgtgttaatatcaacgttaataaagggttttcccagtcacga

Bpr-D-F：tggaagaaaagacaaaacttatccttgagttactgaacaagtaataagtggaaaaaaagctgcc

Bpr-D-R：cgaacattatgaaacgtgtttgac

Bpr-U-F：ttatcgcacaaatcgcgaaag

Bpr-U-R：tgaaattgttatccgctctctgtttttcgtttttttcctcat

ganA-C-F：ctaatgtgtgtttacgacaaagggttttcccagtcacgac

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ganA-D-F2：ttttgtcaaataaaatttaaattatatcaacgttaataatgacatcacattctcctccttgtt

ganA-D-R：tatctattcaatggcggaggtc

ganA-U-F：agttgcctggccttgaaca

ganA-U-R：ctgggaaaaccctttgtcgtaaacacacattaggc

epr-C-F：gtacttgaaaacaggctgtgaggcctgtttttttattaatcctatgaccatgattacgaattcgagctc

epr-C-R：aaatcttaaaggtttttggttaagggttttcccagtcacgacgt

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epr-U-R：tatgtcaacgagcacgccgccaatatcaacgttaataaatgagcgagagggcctatg

ldh-C-F：aagcgtgaacgcgttgcaccaagatataagaaaatgctggaggttgaataatatgaccatgattacgaattcgagctcg

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ldh-U-F：ggttcatcctctgtctctatcaa

ldh-U-R：gtcaacactacccgtgttaatatcaacgttaataataatcatccttccagggtatgtttc

实施例5.枯草芽孢杆菌的摇瓶发酵培养

在2mL LB培养基中接种固体LB平板上的枯草芽孢杆菌单菌落MT3、MT9、MT17，30℃，220rpm培养8-10h后，按接种量5％接入含有12.5g/L三水磷酸氢二钾，2.5g/L磷酸二氢钾，12.0g/L酵母粉，6.0g/L蛋白胨，10.0g/L蔗糖和10.0g/L乳糖的液体培养基内。如图4所示，枯草芽孢杆菌MT3在0-12h时，培养温度30℃，12-60h时培养温度37℃。60h后发酵结束，取1mL菌液超声破碎离心，取上清液进行高效液相色谱检测，枯草芽孢杆菌MT3的2’-FL发酵产量达到755mg/L。如图5所示，枯草芽孢杆菌MT9在0-12h培养温度30℃，12-18h培养温度34℃，18-60h培养温度37℃，60h后发酵结束，取1mL菌液超声破碎离心，取上清液进行高效液相色谱检测，枯草芽孢杆菌MT9的2’-FL发酵产量达到1399mg/L。如图6所示，枯草芽孢杆菌MT17在0-12h培养温度30℃，12-18h培养温度34℃，18-60h培养温度37℃。60h后发酵结束，取1mL菌液超声破碎离心，取上清液进行高效液相色谱检测，枯草芽孢杆菌MT17的2’-FL发酵产量达到1830mg/L。

实施例6.枯草芽孢杆菌MT17的5-L发酵罐培养

在125mL的LB培养基中接种固体LB平板上的枯草芽孢杆菌MT17单菌落，30℃，220rpm培养8-10h后，按接种量5％接入含有12.5g/L三水磷酸氢二钾，2.5g/L磷酸二氢钾，20.0g/L酵母粉，20.0g/L蛋白胨，30.0g/L蔗糖，8.0g/L尿素和5.0g/L乳糖的5-L发酵罐内。5-L发酵罐内初始体积为2.5L，发酵过程中利用氨水保持pH为7.0，溶氧控制范围20～40％。发酵罐培养条件为0-12h时培养温度30℃，12-18h时培养温度34℃，18-60h时培养温度37℃。在发酵时间20h与40h时，补料蔗糖使发酵罐内蔗糖浓度达到60g/L，在发酵时间36h时，补料乳糖使发酵罐内乳糖终浓度提高5g/L。如图7所示，枯草芽孢杆菌MT17的发酵产量可达5.8g/L。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种温敏型基因回路系统及其构建方法与应用

<130> 16

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3181

<212> DNA

<213> （人工合成）

<400> 1

gacgctcttc gcaagggtgt ctttttttgc ctttttttcg gtttttgcgc ggtacacata 60

gtcatgtaaa gattgtaaat tgcattcagc aataaaaaaa gattgaacgc agcagtttgg 120

tttaaaaatt tttatttttc tgtaaataat gtttagtgga aatgattgcg gcatcccgca 180

aaaaatattg ctgtaaataa actggaatct ttcggcatcc cgcatgaaac ttttcaccca 240

tttttcggtg ataaaaacat ttttttcatt taaactgaac ggtagaaaga taaaaaatat 300

gtaccgagct caaaggaggt gaaatgtaca catgcaaaag ttactgtctc tcccatctaa 360

cttagtccag agctttcatg aattagaaag agtaaatcgg actgactggt tttgcacatc 420

cgacccggtc ggaaaaaagc ttggcagtgg cggtggcaca tcatggctgc tcgaggaatg 480

ctataatgaa tactctgacg gcgcaacttt cggagagtgg ctcgaaaaag agaaaagaat 540

actgctccac gccggtgggc agtcccgccg tttgccgggt tacgctccta gtggtaagat 600

ccttacgccg gtcccagtat ttcgctggga aagaggacag cacctgggcc agaacctttt 660

gagtttacag cttccacttt atgagaaaat aatgagctta gctcctgaca agcttcatac 720

ccttatcgcc agcggagatg tctatatacg ctctgaaaaa ccgttgcagt ccatacctga 780

ggccgacgtt gtttgttacg ggctgtgggt cgacccttcc ttggcgacgc accatggggt 840

attcgccagt gaccgcaaac atccggagca gctcgacttc atgctccaga agccttcttt 900

ggcagaactt gaaagtctct ctaagactca tcttttcctg atggacatag ggatttggtt 960

attgtccgat cgcgcggtag agattttgat gaagcggtcc cataaggagt cctctgaaga 1020

attgaaatac tatgatcttt acagcgactt tgggcttgcc ctgggcaccc acccacggat 1080

agaagatgag gaagtgaata ctctctcagt tgcaattctg cctctcccgg gcggggagtt 1140

ttatcattac ggtactagca aagagctgat ttcctccacc ctgtcagtcc agaataaggt 1200

ttatgaccaa cgccggatca tgcatagaaa ggtcaaaccg aaccctgcca tgtttgtcca 1260

aaatgcggta gtacgtatcc cactgtgcgc tgagaacgca gacctctgga ttgaaaactc 1320

acatataggt ccgaagtgga agatagcgag ccggcatatt attactgggg tgccggagaa 1380

cgactggagt ttagcagtgc cagcaggggt atgtgtcgac gttgtcccga tgggtgataa 1440

aggttttgtg gcacggcctt acgggctgga cgatgtattt aaaggagacc tgagagattc 1500

aaaaaccact ttgaccggaa tcccattcgg tgaatggatg tccaaacggg gactctccta 1560

cactgatctg aaaggtcgga ctgacgacct tcaagccgtg agcgtgtttc cgatggtcaa 1620

ttccgttgag gaattgggcc tcgtactccg ctggatgctt tcagaacctg agttggaaga 1680

gggtaagaac atctggcttc gctccgagca cttctctgcg gatgaaataa gcgctggagc 1740

gaacctgaag cgcctctatg ctcaacggga agaattccgg aaggggaact ggaaagcatt 1800

agccgttaac catgagaagt ccgtatttta ccaactcgat ttggccgatg cggcggagga 1860

tttcgtacgg ttgggactcg acatgcctga attactccct gaggacgccc tgcagatgag 1920

tcgcatccat aatagaatgc ttcgcgctcg catcctcaag ctcgacggca aagattaccg 1980

gcctgaggaa caggcagcgt tcgatctgct gcgcgacggt ttgctcgatg gaatctctaa 2040

ccgtaaaagc acaccaaagc tggacgttta ttctgaccaa atagtgtggg gccggagccc 2100

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aggcaatgtt gtgaaccttg cgattgaatt aaatggtcaa cctccattgc aggtatacgt 2220

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a 3181

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<213> （人工合成）

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aaatgt 66

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<212> DNA

<213> （人工合成）

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aaatgt 66

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<212> DNA

<213> （人工合成）

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aaatgt 66

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aaatgt 66

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<212> DNA

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aaatgt 66

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<212> DNA

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<210> 8

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<212> DNA

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tattggaaag cgctgtttga tgagagaaat cttcaagatg tggtttataa gctaaatggt 2580

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aattttaaat ctagtggagc taataagttt aatgatgaaa tcaatttatt gctaaaagaa 2820

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<210> 11

<211> 258

<212> DNA

<213> （人工合成）

<400> 11

ttattaacgt tgatataatt taaattttat ttgacaaaaa tgggctcgtg ttgtacaata 60

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<210> 12

<211> 1042

<212> DNA

<213> （人工合成）

<400> 12

gatcctgata ggtggtatgt tttcgcttga acttttaaat acagccattg aacatacggt 60

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ggccatcatc aaggagttca tgcgcttcaa ggtgcacatg gagggctccg tgaacggcca 420

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<210> 13

<211> 3858

<212> DNA

<213> （人工合成）

<400> 13

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gctgtaatgg ctgaaaattc ttacatttat tttacatttt tagaaatggg cgtgaaaaaa 240

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aagcatccaa atgaaaatcc acttatgctc gttcttccag ccgatcactc cgtaaaaaaa 660

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ccggacgtgg tggtatgggg cagcggtaca ccgatgcgcg aatttctgca cgtcgatgat 3540

atggcggcgg cgagcattca tgtcatggag ctggcgcatg aagtctggct ggagaacacc 3600

cagccgatgt tgtcgcacat taacgtcggc acgggcgttg actgcactat ccgcgagctg 3660

gcgcaaacca tcgccaaagt ggtgggttac aaaggccggg tggtttttga tgccagcaaa 3720

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<210> 14

<211> 2524

<212> DNA

<213> （人工合成）

<400> 14

ttattaacgt tgatattaac acgggtagtg ttgacatacc tctggcggtg ataatacaat 60

aaatgtagtg atagcggtac caaaggaggt gggatccatg gcatttaagg ttgttcagat 120

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