一种用于检测冠突散囊菌的荧光定量PCR试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及微生物菌种检测技术领域，特别是涉及一种用于检测冠突散囊菌的荧光定量PCR试剂盒及其应用。

背景技术

黑茶是一种后发酵茶，在特定的温度和湿度条件下，通过发花工艺生长出“金花”。而通过模拟茯砖茶特殊的发花工艺，普洱茶、六堡茶、白茶等茶叶种类都能生长出“金花”。金花菌的数量是判断“金花”样品的重要品质之一。

目前国内外对“金花”的研究较少，研究内容也比较滞后，主要根据形态学特征鉴定，不同研究者将其命名为谢瓦氏曲霉、冠突曲霉、针刺曲霉、灰绿曲霉等，随着分子生物学和生理生化技术的发展，并参考真菌鉴定手册，大对数研究者们将“金花”菌确定为冠突散囊菌，其无性型为冠突曲霉。冠突散囊菌数量是衡量茯砖茶品质的指标之一，在现行国家标准GB/T 9833.3-2013中规定茯砖茶中冠突散囊菌数量需要达到20×10

目前冠突散囊菌数量的检测仍没有针对性的方法。冠突散囊菌数量检测使用标准GB 4789.15-2016中的方法一：霉菌与酵母平板计数法。该检测方法主要依靠选择性培养基计数和形态学检测，属于传统的微生物学检测方法，该方法也存在程序繁琐、周期长等问题，且没有明确冠突散囊菌的形态学特征，仍需要根据文献资料参考比对鉴定，不能确保与其他类似霉菌完全区分，可能存在鉴定不准确等问题。

因此，建立一种快速、敏感、特异的冠突散囊菌荧光定量PCR方法具有重要的实践意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测冠突散囊菌的荧光定量PCR的试剂盒，针对现有标准冠突散囊菌数量检测过程中容易出现的问题，提供了一种快速、特异检测冠突散囊菌的荧光定量PCR试剂盒及其检测方法，可以替代传统的平板计数法，能够满足大部分茶厂对茶叶中冠突散囊菌快速检测的需求，为食品安全监控提供新的科学依据。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

技术方案一：一种用于检测冠突散囊菌的荧光定量PCR试剂盒，包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照为冠突散囊菌菌株基因组DNA或是含有SEQ ID No.3所示序列的载体。

所述SEQ ID NO:3序列为：

GGCTCGTAGCGTTAGTAGGCCGATGACCGGTCGACTGCCTAGCGGGTCGGGGACTTGCGCGTACCACATGTAGAGGTAACTAGCGATGACTGTGATGGACATGCGGGCGAAGAGGATCTAACTCGTTAGCCGGGATAAGGTCATATTTATAGCAGTGGGCAATACCTGAAAGGGATCCATTCCAGCACCGCGCTCTCCGTCAATCTCGAGATACTGTGTCATAACGTTCATGCTGGCGCCAAAGAACTGCGACAACAGTACTAGGGTCATGCCTTTACTTTGGAGCCAGA。

进一步地，所述试剂盒还包括阴性对照标准品。

进一步地，所述阴性对照标准品为无菌水。

技术方案二：一种利用所述荧光定量PCR试剂盒检测冠突散囊菌的方法，所述方法为采用实时荧光定量PCR检测所述冠突散囊菌。

进一步地，所述实时荧光定量PCR的扩增体系为：

进一步地，所述实时荧光定量PCR的扩增程序为：预变性94℃、30s；变性94℃、5s，退火60℃、15s，延伸72℃、10s，40个循环。

技术方案三：一种所述的试剂盒或所述的方法在检测冠突散囊菌中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

采用本发明的检测方法，能够克服传统的微生物学分离培养存在程序繁琐、检测周期长等问题，但本发明建立的冠突散囊菌的荧光定量PCR检测方法特异性好、灵敏度高、结果准确，并且可以很好的区分冠突散囊菌；而且该方法操作简单、快速，在普通的分子实验室均可以进行，整个检测过程只需一天就可以完成，在微生物快速检测的市场背景下，本发明具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为含有冠突散囊菌目的片段的重组质粒PCR扩增图谱，其中，M：Trans2K DNAMarker分子质量标准；1为阳性质粒；2为阴性对照；

图2为不同浓度重组质粒标准品模板的荧光定量PCR扩增曲线；其中，1：2.2×10

图3为标准品模板的荧光定量PCR标准曲线；

图4为6个不同菌株基因组DNA荧光定量PCR扩增曲线；其中，1：冠突散囊菌；2-7依次为：黄曲霉、黑曲霉、构巢曲霉、灰绿曲霉、青霉、阴性对照；

图5为不同浓度阳性质粒DNA模板的荧光定量PCR的扩增曲线；其中，1：100ng/μL；2：10ng/μL；3：1ng/μL；4：100pg/μL；5：10pg/μL；6：1pg/μL；7：100fg/μL；8：10fg/μL；9：1fg/μL；10：0.1fg/μL；11：0.01fg/μL；12：0.001fg/μL；13：阴性对照；

图6为3个不同浓度质粒标准品3个重复的荧光定量PCR扩增曲线；其中，1：2.2×10

图7为标准品的荧光定量PCR标准曲线；

图8为利用荧光定量PCR检测技术对部分市售茶叶检测结果；其中1：金花茯茶；2：桑植金花白茶；3：天茯金砖；4：陈料茯砖茶；5：泾阳茯砖茶；6：泾阳茯茶；7：七子茯茶；8：覃塘毛尖(广西)；9：菊花散茶；10：铁观音；11：阴性对照。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

下列实施例中常规实验方法，参见萨姆布鲁克等著金冬雁等译的《分子克隆实验指南(第二版)》，仪器的使用参照仪器操作手册。

实验用菌株与试剂：实验菌株为冠突散囊菌(Eurotium cristatum CGMCC3.2167)、黄曲霉(Aspergillusflavus CGMCC 3.4410)、黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、灰绿曲霉(Aspergillusglaucus)、青霉(Penicillium)。其中黄曲霉为与冠突散囊菌形状相似容易干扰判断的菌株，黑曲霉、构巢曲霉、灰绿曲霉、青霉为常见的曲霉类真菌，除用于制作质粒标准品的冠突散囊菌以及形态相似的黄曲霉外，其他菌株由实验室分离得到。

实施例1

1.引物设计与合成

本发明所选用的特异性引物，是由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列如下：

上游引物：5’-TCTGGCTCCAAAGTAAAGGC-3’(SEQ ID No.1所示)；

下游引物：5’-GGCTCGTAGCGTTAGTAGGC-3’(SEQ ID No.2所示)；

2.菌株DNA的提取

采用真菌基因组DNA提取试剂盒(或等效方法)提取真菌菌株DNA。使用超微量紫外分光光度计测定核酸纯度，吸光值A

2.1.荧光定量PCR扩增方法的建立

2.2.荧光定量PCR标准品的制备

以冠突散囊菌(CGMCC 3.2167)基因组作为模板，以引物对上游引物F/下游引物R对其进行PCR扩增。总反应体系包括

3.荧光定量PCR标准曲线的制备

使用超微量紫外分光光度计测定质粒标准品的浓度浓度为114ng/μL，为方便计算使用去离子水将其稀释至100ng/μL，计算出标准品的拷贝数为2.2×10

使用去离子水将制备好的标准品质粒进行10倍梯度稀释，使稀释浓度分别为2.2×10

表1荧光定量PCR反应体系

图2和图3显示了不同浓度质粒标准品模板的荧光定量PCR扩增曲线与标准曲线，阳性标准品拷贝数浓度处在2.2×10

4.荧光定量PCR特异性评价

取上述供试的6株菌株，使用真菌通用的PDA培养基培养5天后，用真菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA，测定各菌株基因组的浓度与纯度，确定其纯度良好，并稀释各基因组浓度使所有菌株的基因组浓度相同，以这些基因组为模板进行SYBR实时荧光定量PCR反应，反应体系和程序均参照“2.2荧光定量PCR标准品的制备”中的反应条件。

菌株基因组DNA的提取：取PDA培养基培养5天的真菌菌丝体约200mg，采用真菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA；-20℃保存备用作为PCR反应模板。

图4显示了6个菌株基因组DNA荧光定量PCR扩增曲线，结果显示，只有冠突散囊菌在17个循环左右时起峰，并有明显的S型扩增曲线，其他菌株及阴性对照在接近40循环时开始有轻微起峰或无峰。表明本发明的荧光定量PCR方法在检测冠突散囊菌时的特异性良好。

5.荧光定量PCR灵敏度评价

用质粒DNA试剂盒提取阳性质粒DNA，使用超微量紫外分光光度计测定其核酸浓度，使用去离子水将其稀释至100ng/μL，随后进行10倍梯度稀释至浓度为1×10

图5显示了不同浓度DNA模板的荧光定量PCR的扩增曲线，结果显示，100ng/μL至10fg/μL之间8个浓度的扩增曲线均在35循环以内(Ct＜35)起峰，且S型明显；但10fg/μL之后更低浓度的扩增曲线及起峰循环数接近重合或者CT大于35，无法判断其数目的准确性，表明扩增曲线结果中，小于10fg/μL及下更低浓度的扩增曲线不代表目的基因的有效扩增。综上分析表明本发明的荧光定量PCR方法检测冠突散囊菌的灵敏度为10fg/μL。

6.荧光定量PCR重复性评价

选取在线性范围内的三个不同梯度浓度的标准质粒，分别取1μL上述系列稀释后的标准质粒作为模板，同上条件进行实时荧光定量PCR反应，每个稀释梯度标准质粒做3个重复。图6为SYBR实时荧光定量PCR检测冠突散囊菌的重复性扩增曲线；图7为SYBR实时荧光定量PCR检测冠突散囊菌重复性的标准曲线，呈现良好的线性关系，相关系数为0.998，PCR的扩增效率为0.88，CT值与拷贝数关系式为：CT＝45.03-3.658×(copies number)；表2显示3个重复的变异系数在0.01-0.05之间；以上结果均表明本发明的荧光定量PCR方法在检测冠突散囊菌时的重复性良好。

表2荧光定量PCR反应体系

7.实际样品的检测

取市面上售卖的7种疑似含“金花”和3种不含“金花”茶叶样品进行检测，具体(产地/生产日期)如下：泾阳茯茶(陕西/20170609)、金花茯茶(陕西/-)、七子茯茶(陕西/20190921)、陈料茯砖茶(湖南/20180808)、天茯金砖(湖南/20160618)、泾阳茯砖茶(陕西/20160805)、桑植金花白茶(湖南/20180818)、铁观音、覃塘毛尖(广西/-)、菊花散茶。每种茶叶分别取10g，加入无菌水30mL，充分震荡后去除茶叶，剩下的液体8000g离心5min，弃上清，用50μL无菌水重悬，得到的液体为茶叶中的菌液；然后使用植物基因组DNA提取试剂盒提取DNA，并按本发明SYBR荧光定量PCR方法进行检测，扩增曲线见图8，结果显示7种疑似含“金花”的茶叶样品均检出冠突散囊菌，另外3种不含“金花”的茶叶未检出。表3为含“金花”的茶叶样品SYBR荧光定量PCR检测结果与平板分离计数法结果之间的对比。

表3含“金花”茶叶样品中冠突散囊菌不同计数方法对比

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 广西壮族自治区亚热带作物研究所（广西亚热带农产品加工研究所）

<120> 一种用于检测冠突散囊菌的荧光定量PCR试剂盒及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

tctggctcca aagtaaaggc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ggctcgtagc gttagtaggc 20

<210> 3

<211> 290

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

ggctcgtagc gttagtaggc cgatgaccgg tcgactgcct agcgggtcgg ggacttgcgc 60

gtaccacatg tagaggtaac tagcgatgac tgtgatggac atgcgggcga agaggatcta 120

actcgttagc cgggataagg tcatatttat agcagtgggc aatacctgaa agggatccat 180

tccagcaccg cgctctccgt caatctcgag atactgtgtc ataacgttca tgctggcgcc 240

aaagaactgc gacaacagta ctagggtcat gcctttactt tggagccaga 290