一种短双歧杆菌M-16V在制备药物中的应用

技术领域

本发明属于药物领域，特别涉及一种短双歧杆菌M-16V在制备药物中的应用。

背景技术

免疫系统是生物进化史上最晚出现的一个生理系统，也是最神秘的功能性系统之一。当某种因素使免疫系统某一成分发生这样或那样的改变，可能会影响免疫功能的强弱或效率，但免疫系统基本功能必须得到维持，否则机体将会出现一系列与免疫功能相关的问题。免疫功能紊乱是在某些诱因(疲劳，酗酒，过敏源等)作用下，免疫系统未能真实有效的起到自我防御的功能，或过强攻击，或过弱而无法防御。

纳米聚苯乙烯是一种常见的微塑料，广泛应用于包装和建筑，可能通过肠道进入人类的食物链。因此，聚苯乙烯与宿主的胃肠道系统及其微生物群直接接触。根据以往的研究，聚苯乙烯可诱导小鼠肠道菌群失调和代谢紊乱，提示聚苯乙烯暴露于肠道菌群在介导化学毒性中发挥重要作用。研究发现，免疫细胞比例和免疫相关基因表达的变化与聚苯乙烯对适应性免疫系统的影响相关，并与不良健康结果有关。关于聚苯乙烯对免疫系统影响的研究揭示了宿主体内微生物-肠道免疫轴的重要性。

在提高机体防御能力过程中，食品工业引入了新的元素，以便帮助消费者提高免疫力。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种短双歧杆菌M-16V在制备药物中的应用。

本发明的一种短双歧杆菌M-16V在制备预防或治疗免疫功能紊乱药物中的应用。

所述短双歧杆菌M-16V在制备预防或治疗微塑料纳米聚苯乙烯所致的免疫功能紊乱药物中的应用。

所述短双歧杆菌M-16V通过激活小肠MyD88基因表达，来调控机体免疫系统紊乱。

本发明的一种短双歧杆菌M-16V在制备预防或治疗抗炎药物中的应用。

本发明的一种短双歧杆菌M-16V在制备调节肠道菌群药物中的应用。

所述药物含短双歧杆菌M-16V；所述药物的制剂剂型包括口服液、胶囊剂、油滴剂、粉剂、片剂或注射剂。

所述药物包括食品、健康食品或营养补充剂。

所述药物包括单方制剂或复方制剂。

本发明中短双歧杆菌M-16V是通过调节某些基因的差异性表达而起作用的，其中所述的差异基因积极地影响了免疫功能的调控，这使得本发明的菌株特别有效地用于预防和/或治疗微塑料纳米聚苯乙烯诱导的免疫紊乱。经纳米聚苯乙烯暴露的哺乳动物摄入本发明的菌株之后，被抑制的Th1相关因子IL-12水平明显升高。提示短双歧杆菌M-16V能够恢复细胞的免疫功能，来提高机体免疫力。

本发明涉及短双歧杆菌M-16V在预防或治疗微塑料纳米聚苯乙烯所致的免疫功能紊乱药物的用途。短双歧杆菌M-16V可以维持正常的免疫功能，增强机体免疫力，进而预防疾病的发生。

本发明的菌株干预的肠道菌群研究结果显示，摄取所述菌株可能通过在属水平上降低Prevotella、Eisenbergiella和Intestinimonas的相对丰度来部分缓解肠道菌群失调。Prevotella、Eisenbergiella和Intestinimonas被认为是促炎菌，免疫细胞释放炎症介质被抑制证明了这一点。上述结果提示所述菌株具有一定的抗炎和免疫调节功能。

此外，本发明的菌株的代谢组学研究证明，摄取该菌株会引起与氨基酸和鞘氨醇有关的一系列代谢变化。就氨基酸含量明显增高而言，组氨酸和酪氨酸合成可以识别为本发明菌株的靶物。

附图说明

图片标注：对照组(Control)、模型组(PS)和治疗组(PS+M-16V/M16V)。

图1为短双歧杆菌M-16V对免疫紊乱的干预机制示意图。

图2为各组小鼠CD4

图3为各组小肠基因表达情况。**P≤0.01,****P≤0.0001。

图4短双歧杆菌M-16V缓解肠道菌群失调。A.线性判别分析(LDA)。B.LEfSe工具计算细菌类群的相对丰度。

图5为短双歧杆菌M-16V缓解肠道菌群失调其中，A.分层聚类树。B.细菌群落在属水平上的相对丰度。*P≤0.05,**P≤0.01,***P≤0.001。

图6短双歧杆菌M-16V调控肠道菌群代谢。A.OPLS-DA图。B.气泡图。

图7短双歧杆菌M-16V调控肠道菌群代谢；其中A.Z-score图。B.相关热图。

图8 ROC曲线。A.ROC(脾脏CD4+T细胞)。B.ROC(肠道差异基因)。C.ROC(粪便微生物群)。D.ROC(粪便代谢组学)。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

短双歧杆菌M-16V：迪辅乐M-16V益生菌。

实施例1

使用聚苯乙烯建立免疫紊乱小鼠在体模型，经短双歧杆菌M-16V干预，研究短双歧杆菌M-16V对免疫紊乱的治疗作用。

选择用2月龄ICR小鼠，模型组：采用5μm聚苯乙烯1000μg/L灌胃4周，每周六天。治疗组：采用2×10

经口灌胃一个月后，对小鼠实施安乐死并收集组织。基于实验目的，将脾脏机械分离成单细胞悬液进行进一步测量。粪便和肠道保存在-80℃，分别用于16S rDNA基因测序、非靶向代谢组学检测和RT-PCR分析。

短双歧杆菌M-16V可以改变肠道菌群及代谢物组成，通过调控脾脏淋巴细胞比例和小肠与免疫相关的基因表达缓解免疫紊乱症状(如图1所示)。

实施例2

用流式细胞术测定脾淋巴细胞亚群的变化。用流式细胞术染色缓冲液洗涤T细胞，Fc阻断液阻断T细胞，4℃染色30min。洗涤后重悬。将100μL PBS中的10

如图2所示，PS的免疫毒性可能直接归因于抗原特异性Th2细胞功能亢进，Th1细胞明显减少，即导致2型免疫的发生。而短双歧杆菌M-16V在脾脏淋巴细胞分化中的作用表现为抑制Th2和Th17淋巴细胞亚群的水平。短双歧杆菌M-16V的饮食干预可以抑制小鼠的过敏症状，并降低Th2活化。

实施例3

使用Trizol试剂从肠道中分离出总RNA。然后，RNA被用于用逆转录酶试剂盒合成cDNA。RT-PCR采用SYBR Green体系进行。

引物序列：

MyD88，F:GTGAACTGGAAGATCTTCGAGA，如SEQ ID NO.1所示；

R:ACTTGGTCAGTACTTTAGGTGG；如SEQ ID NO.2所示。

MHC-Ⅱ，F:GTGAACTGGAAGATCTTCGAGA，如SEQ ID NO.3所示；

R:ACTTGGTCAGTACTTTAGGTGG；如SEQ ID NO.4所示。

TRIF，F:ACGATCCTGCTCCTGACTGCTAG，如SEQ ID NO.5所示；

R:TCCTGCCTCCCAGACTGTGTAAG；如SEQ ID NO.6所示。

GAPDH转录水平被确定为管家基因。RT-PCR执行如下：变性10分钟95℃，紧随其后的是40周期10s 95℃和30s 60℃。采用2

如图3所示，RT-PCR法检测小肠关键基因表达结果显示，与对照组比较，模型组小肠免疫节相关基因MyD88、MHC-Ⅱ和TRIF表达明显下降，经短双歧杆菌M-16V干预后，上述基因表达水平明显上升(P＜0.05)。研究发现，在缺乏MyD88的情况下，免疫反应失调是病原体依赖的，并突出了重要的潜在基因型与环境因素的相关性。结果揭示，短双歧杆菌M-16V可能通过激活小肠MyD88基因表达，来调控机体免疫系统紊乱。

实施例4

进行总DNA抽提，对V3-V4可变区进行PCR扩增。根据IlluminaMiSeq平台标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE 2×300的文库；利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序。原始测序序列使用Trimmomatic软件质控，使用FLASH软件进行拼接，使用的UPARSE软件，根据97％相似度对序列进行OTU聚类；使用UCHIME软件剔除嵌合体。利用RDPclassifier对每条序列进行物种分类注释。

如图4A-B所示，对照组Lactobacillus为主，模型组以Prevotella为典型的生物标志物，短双歧杆菌M-16V处理后以Firmicutes为主。换句话说，短双歧杆菌M-16V干预前后最明显的对比是Prevotella的丰度明显减少，而Firmicutes的丰度明显增加。这些数据可作为一种辅助诊断方法。而在聚类分析中，模型组的聚类与对照组和短双歧杆菌M-16V干预组的距离最大(图5A)。

结果显示，模型组小鼠粪便中Prevotella,Eisenbergiella,andIntestinimonas含量明显增加，而短双歧杆菌M-16V可能通过降低Prevotella、Eisenbergiella和Intestinimonas的相对丰度来部分缓解肠道菌群失调。Prevotella、Eisenbergiella和Intestinimonas被认为是促炎菌，见图5B。上述结果提示聚苯乙烯可能诱导小鼠肠道菌群失调，刺激促炎反应，加重免疫紊乱。同时，短双歧杆菌M-16V具有一定的抗炎和免疫调节功能。

实施例5

样本于离心管中，加甲醇研磨，涡旋振荡充分混匀，4℃超声；静置，涡旋，4℃静置后离心；取全部上清于一新离心管中，静置后离心；移取上清，加入内标，转入小瓶；取相同体积的每个待测样本进行混合，制成QC样本，在待测样本进样前、进样中和进样后上机检测。色谱分离条件：柱温40℃；流速0.3mL/min；正模式流动相组成A水+5％乙腈+0.1％甲酸，B乙腈+0.1％甲酸；负模式流动相组成A水+5％乙腈+0.05％甲酸，B乙腈+0.05％甲酸；3μL进样量；自动进样器温度4℃。质谱条件：a)正模式：加热器温度300℃；鞘气流速45arb；辅助气流速15arb；尾气流速1arb；电喷雾电压3.0KV；毛细管温度350℃；S-Lens RF Level,30％；b)负模式：加热器温度300℃；鞘气流速45arb；辅助气流速15arb；尾气流速1arb；电喷雾电压3.2KV；毛细管温度350℃；S-Lens RF Level,60％。

如图6A所示，模型组和干预组之间存在显著的代谢组差异(R2X[1]＝0.439,R2X[2]＝0.098)。根据OPLS-DA模型获得不同的代谢产物(VIP>1,P<0.05)，纳入进一步分析。本研究通过200×permutation验证OPLS-DA模型的拟合程度。如图6B所示，聚苯乙烯严重干扰了多种氨基酸代谢途径，包括苯丙氨酸、组氨酸、酪氨酸、色氨酸，并且对鞘脂代谢有一定的影响。与上述结果相一致，在差异显著的代谢产物中，模型组的组氨酸和酪氨酸等氨基酸及鞘氨醇的含量显著减少，经短双歧杆菌M-16V干预，上述代谢产物含量明显增加(图7A)。并且如图7B所示，组氨酸和酪氨酸与鞘氨醇均呈正相关。研究发现，酪氨酸能解除因环境、心理及身体的压力，常被用来治疗忧郁症,甲状腺机能降低，也有助于细胞长久保持年轻化，提高身体的免疫力。

实施例6

采用随机森林分析建立预测模型，区分模型组和治疗组。使用“pROC”和“ggplot2”包派生的R项目构建受试者工作特征(ROC)曲线。通过计算曲线下面积(AUC)评估预测模型的判别能力。ROC曲线下的面积值在0.5～1之间。AUC值越接近1，诊断效果越好。AUC在0.7-0.9之间具有一定的精度，在0.9以上具有较高的精度。

构建一个分类算法来评估短双歧杆菌M-16V的免疫调控作用。如图8A-D所示，在该模型中，发现脾脏CD4+T细胞Th2(AUC＝0.9922)和Th17(AUC＝0.9688)、肠道差异基因MHCII(AUC＝1.000)和TRIF(AUC＝1.000)、肠道菌群Prevotella(AUC＝1.000)、粪便代谢产物组氨酸(AUC＝1.000)、酪氨酸(AUC＝0.9792)和鞘氨醇(AUC＝1.000)的准确性较高，为诊断提供了新的生物标志物。同时，肠道MyD88基因(AUC＝0.8438)、Eisenbergiella(AUC＝0.8333)和Intestinimonas(AUC＝0.8542)的预测能力具有一定的准确性。在临床应用中，根据实际情况选择最优模型进行辅助诊断。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海交通大学医学院附属瑞金医院

迪辅乐生物(上海)有限公司

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