一种PEDV变异株S基因的测序方法
文献发布时间：2023-06-19 19:27:02
技术领域
本发明涉及PEDV病毒的快速检测技术领域，尤其涉及一种PEDV变异株S基因的测序方法。
背景技术
流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒引起的猪的一种高度接触性传染病，它的主要特征是呕吐、水样腹泻和脱水死亡；各种年龄的猪均易
感，尤其对1～2周龄哺乳仔猪的危害最为严重，发病死亡率可高达90％～100％，SunRQ等报道2010年10月开始，爆发了PEDV，导致超过100万头仔猪死亡,给养猪业带来了很大的经济损失。早发现、早确诊对该病的防治意义重大。要做到早确诊就需要在临床上运用一种简便、快速、敏感、特异的诊断方法；目前，可鉴定PEDV病毒分型的主要方法主要是：病毒的分离鉴定以及测序；分子诊断技术；聚合酶链式反应（RT-PCR)技术。
专利号CN103320452A公开了一种猪流行性腹泻病毒变异株N基因全序列的扩增方法，依次通过对病毒RNA的提取、RT-PCR扩增、PCR产物的克隆及测序分析，从而完成对变异毒株的基因序列的扩增和测序。在产物克隆测序的过程中，在对目的片段纯化后直接进行与基因载体的连接，直接连接容易发生片段断裂，并且连接效率较低，从而影响克隆效率。
发明内容
本发明的目的是提供一种PEDV变异株S基因的测序方法，通过对目标片段进行平端加A尾反应，在片段加A尾后在连接载体，从而提高连接效果和连接效率，解决了背景技术中直接连接容易发生断裂的问题。
本发明提供一种PEDV变异株S基因的测序方法，包括以下步骤：步骤1，设计与合成引物；步骤2，提取病毒RNA；步骤3，进行RT-PCR反应；步骤4，对目的片段回收；步骤5，对回收产物进行平端加A尾反应；步骤6，对基因片段进行连接、并筛选克隆；步骤7，对产物进行测序分析。
进一步改进在于：步骤1中，根据GenBank公开的PEDV参考毒株的S基因保守序列设计4对特异性引物，
S1-F：５′－CCATTAGTGATGTTGTGTTAGG－３′；
S1-R：５′－AAGAATACGCTGAATGG－３′
S2-F：５′－CATGGCACTGACGATGA－３′
S2-R：５′－CCATCACCATTAAACGAAC－３′
S3-F：５′－GCATGTAAGACCATAGAGTCAG－３′
S3-R：５′－CATACGTCGCGATGAAAC－３′
S4-F：５′－ATTGCCTTGACTCTACGTG－３′
S4-R:５′－CAACTCTTGGACAGCATC－３′。
进一步改进在于：步骤2中，所述对病毒RNA的提取包括以下步骤：1）提取组织病毒液：取样品组织剪碎并充分碾磨，按1：5比例加入无菌PBS溶液制成组织悬浊液，反复冻融三次，在5000r/min、4℃条件下离心10min，取上清液即为组织病毒液，放于-70℃保存备用；
2）取400µl组织病毒液，加入1mlTrizol裂解液，剧烈震荡30s后室温静置10min；
3）吸取上清液至新EP管中，然后加入1倍体积的异丙醇，-20℃静置15min，在12000r/min条件下离心10min；
4）倒掉上层清液，加入1ml75%冰乙醇进行清洗沉淀，上下颠倒5~10次后，静置5min，在12000r/min条件下离心5min；
5）倒掉上层清液，倒置EP管于漂浮板上，室温风干沉淀，直至乙醇完全挥发；
6）将沉淀溶于40µl经过DEPC处理的灭菌水中。
进一步改进在于：步骤3中，所述RT-PCR反应包括以下步骤：1）以提取的RNA为模板，反转录合成cDNA；试剂及其用量为：反转录酶0.5µL、5×Buffer2.5µL、dNTPs0.5µL、随机游引物0.5µL、RNA3µL、ddH
2）以cDNA为模板，使用高保真酶进行PCR反应，扩增S1、S2、S3、S4基因，用于后续S基因测序；反应体系如下：cDNA5.0µL、上下游引物各2.0µL、2×HighFidelityPCRMasterMix25.0µL、灭菌水16µL。反应条件为：95℃、3min；95℃、15s，52~54℃、15s，72℃、2min，35个循环；72℃延伸5min；将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。
进一步改进在于：步骤4中，使用凝胶回收试剂盒进行目的片段回收，DNA溶液保存于-20℃。
进一步改进在于：步骤5中，所述平端加A尾反应包括以下步骤：取RT-PCR反应产物，加入1μL的dNTP（10mm）、5μL的PCRbufferwithMg2+（10X）、0.2μL的TaqDNApolymerase（5U/μL）、50μL的ddH2O，在72℃反应10~20min。
进一步改进在于：平端加A尾反应后，进行胶回收纯化。
进一步改进在于：步骤6中，所述基因片段连接包括以下步骤：1）将胶回收产物与克隆载体在16℃条件下过夜连接；
2）将1μL的T-VectorpMD19、1μL的DNA、3μL的ddH
3）将离心管转入42℃水浴，热击90s，再放置到冰上冰浴5min；
4）在离心管中加入800μL的LB液体培养基，在37℃、180r/min条件下培养45-60min，再在3500r/min条件下离心5min；
5）去掉上层清液，加入100μLLB液体培养基重悬，取50μL菌液涂布于含Amp+（50μg/mL）的LB固体培养基平板上，37℃过夜培养；
6）对菌落进行PCR扩增，并将阳性菌株进行测序。
进一步改进在于：步骤7中，产物的测序分析包括基因的遗传进化分析、基因序列特征分析、S蛋白建模分析；
基因的遗传进化分析：将将测得的S1、S2、S3、S4序列使用Geneious进行拼接，获得PEDV的S全基因序列，使用DNAStar软件对PEDVS全基因和GenBank上已公布的参考毒株的S全基因序列进行分析、比对，使用MEGA7.0软件的邻近法，且自助抽样选择重复1000次构建系统发育树；
基因序列特征分析：以CV777和CH-ZMDZY-11为对比毒株，利用DNAStar7.1将测得的PEDVS基因与参考毒株进行核苷酸序列同源性、氨基酸同源性及氨基酸缺失与增添分析，同时对S基因中和表位氨基酸的变异进行分析；
通过开源模拟器SWISS-MODEL对S蛋白及S蛋白C端与猪氨基肽酶N受体结合域构建三级结构预测模型。以PEDV的S蛋白作为模板制作S蛋白三聚体，以PEDV的S蛋白作为模板制作RBD三维模型，根据现有的研究，确定PEDVS蛋白与预测pAPN受体结合的氨基酸残基序列，通过Pymol软件对氨基酸的插入缺失位点及RBD区域的三维模拟进行比较分析。
本发明的有益效果：1、本发明通过在对提取的目标片段平末端后加啥样A尾，使片段尾端与载体头互补，从而便于克隆；现有的都是在对目标片段通过琼脂凝胶电泳分析并通过试剂盒进行回收后，就直接进行与克隆载体进行连接，片段长度不同容易造成连接断裂，连接效率也交底，从而影响克隆效果和克隆效率；本申请通过在平尾端添加A尾，大片段和小片段都补齐A尾，便于快速与载体连接，有效的提高了连接效率和连接效果，方便克隆。
2、本发明在片段连接载体时，采用16℃条件下过夜连接，既最大限度的发挥了酶的活性，有兼顾到短暂配对结构的稳定。
具体实施方式
为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明作进一步详述，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
本实施例提供一种PEDV变异株S基因的测序方法，包括以下步骤：步骤1，设计与合成引物；根据GenBank公开的PEDV参考毒株的S基因保守序列设计4对特异性引物，S基因分为4个片段（S1、S2、S3和S4），在扩增过程中，四个相邻片段之间存在部分碱基重叠。
步骤2，提取病毒RNA；
1）取样品组织剪碎并置于匀浆器内充分碾磨，按1：5比例加入无菌PBS溶液制成组织悬浊液，反复冻融三次，5000r/min、4℃离心10min，取上清液即为组织病毒液，放于-70℃保存备用；
2）取400µl组织病毒液，加入1mlTrizol裂解液，剧烈震荡30s后室温静置10min；
3）吸取上清液至新EP管中，然后加入1倍体积的异丙醇，-20℃静置15min，在12000r/min条件下离心10min；
4）倒掉上层清液，加入1ml75%冰乙醇进行清洗沉淀，上下颠倒5~10次后，静置5min，在12000r/min条件下离心5min；
5）倒掉上层清液，倒置EP管于漂浮板上，室温风干沉淀，直至乙醇完全挥发；
6）将沉淀溶于40µl经过DEPC处理的灭菌水中。
步骤3，进行RT-PCR反应；
1）以提取的RNA为模板，使用试剂盒反转录合成cDNA；试剂及其用量为：反转录酶0.5µL、5×Buffer2.5µL、dNTPs0.5µL、随机游引物0.5µL、RNA3µL、ddH
2）以cDNA为模板，使用高保真酶进行PCR反应，扩增S1、S2、S3、S4基因，用于后续S基因测序；反应体系如下：cDNA5.0µL、上下游引物各2.0µL、2×HighFidelityPCRMasterMix25.0µL、灭菌水16µL。反应条件为：95℃、3min；95℃、15s，52~54℃、15s，72℃、2min，35个循环；72℃延伸5min；将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。
步骤4，对目的片段回收；
凝胶回收试剂盒进行目的片段回收，DNA溶液保存于-20℃。
步骤5，对回收产物进行平端加A尾反应；
反应体系为：纯化的RT-PCR产物若干、dNTP（10mm）1μL、PCRbufferwithMg2+（10X）5μL、TaqDNApolymerase（5U/μL）0.2μL、ddH2O50μL，反应条件为72℃、20min。
纯化的RT-PCR产物用量：
平端加A尾反应后，采用凝胶回收试剂盒进行胶回收纯化。
步骤6，对基因片段进行连接、并筛选克隆；
1）将胶回收产物与克隆载体在16℃条件下过夜连接，12-16h；
2）将1μL的T-VectorpMD19、1μL的DNA、3μL的ddH
3）将离心管转入42℃水浴，热击90s，再放置到冰上冰浴5min；
4）在离心管中加入800μL的LB液体培养基，在37℃、180r/min条件下培养45-60min，再在3500r/min条件下离心5min；
5）去掉上层清液，加入100μLLB液体培养基重悬，取50μL菌液涂布于含Amp+（50μg/mL）的LB固体培养基平板上，37℃过夜培养；
6）对菌落进行PCR扩增，并将阳性菌株进行测序。
步骤7，对产物进行测序分析：
产物的测序分析包括基因的遗传进化分析、基因序列特征分析、S蛋白建模分析；
基因的遗传进化分析：将将测得的S1、S2、S3、S4序列使用Geneious进行拼接，获得PEDV的S全基因序列，使用DNAStar软件对PEDVS全基因和GenBank上已公布的参考毒株的S全基因序列进行分析、比对，使用MEGA7.0软件的邻近法，且自助抽样选择重复1000次构建系统发育树。
基因序列特征分析：以CV777和CH-ZMDZY-11为对比毒株，利用DNAStar7.1将测得的PEDVS基因与参考毒株进行核苷酸序列同源性、氨基酸同源性及氨基酸缺失与增添分析，同时对S基因中和表位氨基酸的变异进行分析。
S蛋白建模分析：通过开源模拟器SWISS-MODEL对S蛋白及S蛋白C端与猪氨基肽酶N受体结合域构建三级结构预测模型。以PEDV的S蛋白作为模板制作S蛋白三聚体，以PEDV的S蛋白作为模板制作RBD三维模型，根据现有的研究，确定PEDVS蛋白与预测pAPN受体结合的氨基酸残基序列，通过Pymol软件对氨基酸的插入缺失位点及RBD区域的三维模拟进行比较分析。
引物序列信息表：
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