一种用于SARS-CoV-2的可视化核酸检测方法及试剂盒

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种用于SARS-CoV-2的可视化核酸检测方法及试剂盒。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2，亦被称为2019-nCoV、HCoV-19)属于β属的冠状病毒，颗粒呈圆形或椭圆形直径60nm～140nm，基因特征与SARS具有明显的区别，且相比于SARS具有更高的感染能力。基于流行病学调查，COVID-19的潜伏期为1～14天，多为3～7天，症状以发热、干咳、乏力为主，重症患者多在发病一周后出现呼吸困难和/或低氧血症，严重者可快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出现凝血功能障碍及多器官功能衰竭等。因此，如何快速确诊疑似病例，以及如何有效监控疾病进程，成为治疗COVID-19，打好疫情攻坚战的重点。

SARS-COV-2的快速检测对当前世界上疫情的控制具有突出的贡献。目前市场上对2019-Ncov的主要检测方法包括核酸检测，抗体和抗原检测。其中，核酸检测的一般步骤是：取样—提取核酸—反转录-定量PCR，整个检测过程需要专业的仪器(全自动核酸提取仪，定量PCR仪)，专业的操作人员(操作步骤多)，平均耗时3小时以上才能拿到结果。

抗体检测主要是检测已经感染人员血液中的IgM和IgG，然而，抗体只有在感染几天之后才逐渐出现。抗原检测需要时间短，可以实现自主检测，但检测灵敏度有限。因此，有必要开发一种操作简单、无需专业仪器、灵敏度高，且耗时短的SARS-COV-2核酸检测方法。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明一种基于环介导等温扩增原理的SARS-COV-2核酸检测方法(试剂或试剂盒)，能够直接使用咽拭子样品，无需提取核酸，一步加样操作，30分钟内特异性检测SARS-COV-2核酸。所需设备极度简化，只需要一个恒温加热装置，检测结果可以通过肉眼可分辨的颜色来判读。

为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：

本发明提供了一种用于SARS-CoV-2的可视化核酸检测试剂，所述试剂包括(NH

作为本发明的一个优选实施方式，所述试剂共20～30μL，包含10mM(NH

优选地，所述显色试剂为0.2mg/mL间甲酚紫与0.2mg/mL偶氮氯膦Ⅲ的混合液，或者0.4mg/mL溴百里酚蓝与0.2mg/mL偶氮胂I的混合液。

优选地，所述N基因LAMP引物包括N gene引物组合，或ORF 1ab基因引物组合，或者人基因RPLP0引物组合，所述N gene引物组合如SEQ ID NO：1～6所示，所述ORF 1ab基因引物组合如SEQ ID NO：7～12所示，所述人基因RPLP0引物组合。

优选地，所述促核酸释放试剂包括Tween 20和CHAPS，所述Tween 20和CHAPS的用量比为1:1；所述逆转录酶为2-8ng/μL AMV逆转录酶，或者5-20ng/μL Tth DNA聚合酶，或者0.2-0.8ng/μL HIV逆转录酶。

本发明还提供了一种用于SARS-CoV-2的可视化核酸检测试剂盒，所述试剂盒包括外套管和内套管，所述外套管预装有反应试剂，所述内套管预装有取样液，所述反应试剂包括Tris-HCl，KCl，dNTP，N基因LAMP引物，Bst DNA聚合酶大片段，AMV逆转录酶，所述取样液包括(NH

作为本发明的一个优选实施方式，所述反应试剂为20μL，包括10mMTris-HCl(pH8.8)，300mMKCl，16mMdNTP，1μM～16μM的6条N基因LAMP引物，0.1μg/μLBst DNA聚合酶大片段，8ng/μL AMV逆转录酶；所述取样液为200-300μL，包括10mM(NH

优选地，所述内套管的上下管口通透，材质为聚丙烯，底部管口由2-3mm厚度的固体石蜡密封，石蜡熔点为50-60℃，预装取样液后用可撕开的密封膜将内套管上口密封，然后将密封后的内套管放入外套管，盖上盖子保存。

优选地，所述反应试剂和取样液可制备为冻干剂。

所述试剂盒的使用方法为：首先将样品管放置于恒温金属浴的EP管孔内，打开管盖，撕去密封膜；然后使用拭子取样，将取样的拭子在样品管的取样液中顺时针或逆时针搅拌15-20圈；盖上盖子，启动金属浴，设置60～65℃开始反应；当温度达到设定温度，并反应20～30分钟后取出判读结果。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供了一种可视化、简易操作的核酸检测方法(试剂或试剂盒)，该方法基于环介导等温扩增的原理，在60-65℃进行反应，然后通过样品颜色变化判断结果。该方法无需提取核酸，初始样品可以是取样的拭子，只需要一个恒温加热装置(金属浴，水浴)，一步加样，30分钟内即可判读结果，检测结果可以通过肉眼可分辨的颜色或紫外吸收光谱颜色的变化来判读。

附图说明

图1为SARS-CoV-2核酸的显色法检测结果；

图2为甲酚红显色法检测咽拭子样品中的SARS-COV-2假病毒；

图3为间甲酚紫加偶氮氯膦Ⅲ显色法检测咽拭子样品中的SARS-COV-2假病毒；

图4为溴百里酚蓝加偶氮胂I显色法检测咽拭子样品中的SARS-COV-2假病毒；

图5为一步法核酸检测试剂盒的结构组成；

图6为一步法核酸检测试剂盒的使用流程；

图7为一步法检测人细胞核酸(间甲酚紫加偶氮氯膦Ⅲ为显色试剂)；

图8为一步法检测不同拷贝数SARS-COV-2的核酸(溴百里酚蓝加偶氮胂I为显色剂)；

图9为一步法核酸检测反应前后紫外吸收光谱的变化(溴百里酚蓝加偶氮胂I为显色剂)。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。

实施例1一种检测核酸的可见光显色法

待检测目标核酸为SARS-CoV-2的N基因(1260bp；Gene ID:43740575)。包含N基因的假病毒购买自北京擎科生物，浓度为10

外引物1：TGGACCCCAAAATCAGCG(SEQ ID NO：1)；

外引物2：AGCCAATTTGGTCATCTGGA(SEQ ID NO：2)；

内引物1：CGTTGTTTTGATCGCGCCCC-ATTACGTTTGGTGGACCCTC(SEQ ID NO：3)；

内引物2：ATACTGCGTCTTGGTTCACCGC-ATTGGAACGCCTTGTCCTC(SEQ ID NO：4)；

环引物1：TGCGTTCTCCATTCTGGTTACT(SEQ ID NO：5)；

环引物2：TCTCACTCAACATGGCAAGGAA(SEQ ID NO：6)。

显色法等温扩增反应体系一共25μL，包含10mM(NH

如图1所示，显色法等温扩增法可以在30分钟内检测到2拷贝以上的N基因假病毒，阳性样品颜色清晰，与阴性样品有显著差异。

实施例2筛选能够耐受杂质的变色试剂

由于化学结构的差异，不同染料对环境pH变化，以及拭子等样品中的杂质的吸附能力不同，因此对核酸检测结果可能有一定影响。特此探究能够耐受杂质的变色试剂，具体方法如下：

取健康人咽拭子样品于1mL生理盐水中。将含咽拭子样品的生理盐水分为两份，一份不作处理，定义为阴性样本；另一份中加入终浓度为10copies/μL的假病毒，定义为阳性样本。使用生理盐水作为对照样本。

显色法等温扩增反应体系一共25μL，包含10mM(NH

反应所使用的ORF1ab基因以及人内参RPLP0基因的引物组合如下所示，各条引物浓度为0.1μM～1.6μM：

ORF1ab的引物序列如下所示：

外引物1：TGTTCTTGCTCGCAAACA(SEQ ID NO：7)；

外引物2：TAACATTGGCCGTGACAG(SEQ ID NO：8)；

内引物1：TCACTCAATACTTGAGCACACTCATCAACGTGTTGTAGCTTGTC(SEQ ID NO：9)；

内引物2：ATGGTCATGTGTGGCGGTTCCTATTAGCATAAGCAGTTGTGG(SEQ ID NO：10)；

环引物1：AGCTAATCTATAGAAACGGTGT(SEQ ID NO：11)；

环引物2：CAGGTGGAACCTCATCAGGAG(SEQ ID NO：12)。

RPLP0的引物序列如下所示：

外引物1：GCGTCCTCGTGGAAGTGA(SEQ ID NO：13)；

外引物2：TGCGCATCATGGTGTTCTTG(SEQ ID NO：14)；

内引物1：GGACTTCCAGGTCGCCCTAATAACCCTGCGTGGCAATCC(SEQ ID NO：15)；

内引物2：TGTGGGAGCAGACAATGTGGTTTCATCAGCACCACAGCCTTCC(SEQ ID NO：16)；

环引物1：CTTCCCTGGGCATCACGG(SEQ ID NO：17)；

环引物2：AAGCAGATGCAGCAGATCCG(SEQ ID NO：18)。

表1对照样品的加样方式

表2阳性样品的加样方式

反应于65℃水浴中反应30分钟后取出，放置室温下观察检测结果。图2-图4的结果显示，含假病毒的阳性样品中，三个引物的检测结果都发生了变色。而甲酚红组不含假病毒的阴性样品中，三个样品也有明显的变色，与预期不太相符。咽拭子样品中可能含有唾液，痰液以及口腔残留食物等杂质，它们在加热过程中释放了很多化学分子，可能与染料发生结合，从而干扰染料的颜色。因此甲酚红在复杂体液样本的应用中可能有一定的局限性。

通过以上实验，筛选得到两个非常适合LAMP变色反应的染料组合，即间甲酚紫加偶氮氯膦Ⅲ，或者溴百里酚蓝加偶氮胂I。其中，间甲酚紫和溴百里酚蓝通过pH的变化而显色，偶氮氯膦Ⅲ和偶氮胂I则通过与溶液中的镁离子螯合显色。随着LAMP反应的进行，溶液的pH降低同时镁离子被反应副产物焦磷酸结合并沉淀，从而让pH和镁离子响应的染料变色。pH和镁离子双响应的变色染料可以更耐受样品的杂质干扰，从而能够更准确的检测样品是否发生扩增(图3和图4)。因此，使用该染料配制的一管式逆转录-环介导的显色法等温扩增试剂能够灵敏的检测病毒样品的核酸，同时也能够直接使用复杂体液，比如咽拭子来检测，无需提取核酸的步骤。

实施例3一步法核酸检测试剂盒

为了简化可视化核酸检测的流程，降低实验操作的专业需求。进一步制备了一步法核酸检测试剂盒。该试剂盒由两部分组成，如图5所示，其中外套管中预装了20μL反应试剂，包括：10mMTris-HCl(pH 8.8)，300mMKCl，16mMdNTP，1μM～16μM的6条LAMP引物，然后加入0.1μg/μLBst DNA聚合酶大片段，8ng/μL AMV逆转录酶。预装试剂也可以制备为冻干剂。

内套管中则预装收集样品以及可以让RNA释放的溶液，体积为200-300μL，成分包括：10mM(NH

本发明的一步法核酸检测试剂盒可以直接检测拭子样本上的目标核酸。使用流程见图6所示，首先将样品管放置于恒温金属浴的EP管孔内，打开管盖，撕去密封膜；然后使用鼻拭子或者咽拭子取样，将取样的拭子在样品管的取样液中顺时针或逆时针搅拌15-20圈；盖上盖子，启动金属浴，设置65℃开始反应；当温度达到设定温度，并反应20分钟后取出判读结果。

本试剂盒检测核酸的原理为：首先，咽拭子或鼻拭子样品在取样液中洗脱后，细胞或者病原体的蛋白在去垢剂(Tween 20和CHAPS)存在以及65℃升温的条件下发生溶解变性，释放待检测RNA。其次，升温的取样液将石蜡融化，使内套管中的液体与外套管底部的反应试剂混合，启动核酸等温扩增反应。最后，在含有待检测目标RNA的反应中，底物dNTP被消耗产生焦磷酸，降低溶液pH同时络合镁离子，从而让显色剂变色。没有发生扩增反应的样品管则不变色。

其中，将内套管中的取样液和外套管中的反应试剂在反应启动前进行物理隔离，具有以下优点：1)可以在-20℃以下长期储存；如果将反应试剂冻干则可以室温储存。2)反应试剂和取样液在反应温度下才混合，可以避免低温下引物错配导致的非特异性扩增。

实施例4一步法检测鼻拭子中的人细胞RNA

使用人基因RPLP0引物的试剂盒，取健康人鼻拭子样品，按照实施例3中的操作流程进行加样检测，并以生理盐水浸泡的拭子作为阴性对照。

如图7所示，65℃反应20分钟后，鼻拭子样品中检测到人细胞RPLP0基因的核酸。

实施例5一步法检测鼻拭子中的病原体RNA

使用SARS-COV-2的N引物试剂盒，取健康人鼻拭子样品后，分别在拭子上滴加梯度拷贝数量的假病毒，然后按照实施例3中的操作流程进行加样检测。

如图8所示，拭子加样后取样液颜色未见明显变化，65℃反应20分钟后，鼻拭子样品中检测到SARS-COV-2的核酸，检测下限是20拷贝/反应。

该试剂盒的阳性和阴性样品颜色变化非常显著，肉眼可以清晰分辨。此外，通过紫外分光光度计检测发现，阳性样品反应前后的紫外吸收光谱有明显变化，其中620nm处的光吸收改变尤其显著。这意味着除了肉眼检测以外，本试剂盒还适用于具备紫外吸收检测的仪器。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。