一种磺酰脲类除草剂水解酶TsmE突变体、其编码基因及用途

技术领域

本发明属于酶的蛋白质工程技术领域，涉及一种磺酰脲类除草剂水解酶TsmE突变体、其编码基因及用途。

背景技术

除草剂的使用在减轻农业劳动强度、保证农业正常生产的同时，其残留也带来了严重的作物药害问题，据统计我国每年农田受除草剂药害面积达到3000万亩，其中严重药害面积达到500万亩，每年造成几十亿元的损失，而抗除草剂转基因是解决除草剂药害的最佳途径。磺酰脲类除草剂在中国使用量大，研究和应用发展迅速，已经成为继有机磷、乙酰胺类除草剂后的第三大除草剂，全球年销售额达到20亿美元以上，约占整个除草剂市场的10％。我国磺酰脲类除草剂每年的应用面积已超过200万公顷，并仍呈扩大的趋势。

部分重要的磺酰脲除草剂如甲基二磺隆(又名甲磺胺磺隆)和甲基碘磺隆钠盐芳环上除酯结构外还有其他取代基团，因此其分子量较其他品种大得多。近年来大分子磺酰脲除草剂发展迅速，已成为磺酰脲除草剂的重要品种，目前其全球年销售额达到约5亿美元，占磺酰脲除草剂总销售额的20％。其中，甲基二磺隆作为小麦田专用除草剂，对大部分禾本科杂草，尤其是与小麦亲缘关系很近的恶性杂草节节麦有很好的防除效果，而市面上的其他除草剂防效很差，因此其在小麦除草剂市场中占有举足轻重的地位，未来发展前景广阔。

尽管磺酰脲类除草剂对哺乳动物低毒，但部分磺酰脲类除草剂土壤残留期较长，且残留期会随土壤pH上升而延长，在碱性土壤中甚至可长达2-3年。对后茬作物产生严重的药害。近年来我国因磺酰脲除草剂使用不当导致的作物药害时有发生，对农业带来严重损失。因此，磺酰脲除草剂降解脱毒酶及其基因在磺酰脲除草剂残留生物修复技术研发中具有重要的应用价值。此外，磺酰脲除草剂降解脱毒基因还可以应用于构建抗磺酰脲类除草剂转基因作物。

TsmE是从细菌Hansschlegelia zhihuaiae S113中鉴定的一个酯酶，催化磺酰脲除草剂酯结构COOR的酯键断裂，生成相应的没有除草活性的磺酰脲酸。TsmE能够催化噻磺隆、甲磺隆、苄嘧磺隆、甲嘧磺隆和苯磺隆等多种小分子量的磺酰脲类除草剂的去酯化脱毒。但是，TsmE不能催化甲基二磺隆和甲基碘磺隆钠盐等大分子磺酰脲除草剂的去酯化，因此无法使这些大分子磺酰脲除草剂脱毒，其应用价值受到极大限制。

发明内容

因此，本发明所要解决的技术问题是，针对目前磺酰脲类除草剂水解酶TsmE不能催化甲基二磺隆和甲基碘磺隆钠盐等大分子磺酰脲类除草剂水解去酯化脱毒问题，提供一种TsmE突变体蛋白质及其基因，含有该基因的重组表达载体和重组基因工程菌。与野生型磺酰脲类除草剂水解酶TsmE相比，本发明提供的TsmE突变体蛋白质可以降解甲基二磺隆和甲基碘磺隆钠盐等大分子磺酰脲类除草剂。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一是：本发明提供了一种磺酰脲类除草剂水解酶TsmE突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；具体是在SEQ ID NO.2的第80位具有精氨酸替换、第81位具有丙氨酸替换、第176位具有丙氨酸替换、第178位具有缬氨酸替换、第182位具有精氨酸替换，且在第329位具有丙氨酸替换。

本发明还提供了编码所述磺酰脲类除草剂水解酶突变体的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明提供编码所述突变体基因的重组表达载体。

所述重组表达载体优选原核表达载体pET-29a(+)。

本发明还提供了携带所述突变体基因的基因工程菌。

所述基因工程菌优选大肠杆菌BL21(DE3)为出发菌株。

本发明的有益效果如下：

本发明以磺酰脲类除草剂水解酶TsmE为出发模板，通过定向进化技术，获得了对甲基二磺隆和甲基碘磺隆钠盐等大分子磺酰脲类除草剂具有去酯化活性的突变体M6(P80R/Y81A/G176A/S178V/G182R/F329A)。突变体M6对大分子磺酰脲除草剂甲基二磺隆和甲基碘磺隆钠盐的比酶活分别为0.10和0.15U/mg。所述突变体及其编码基因可用于构建抗磺酰脲类除草剂转基因作物，也可用于土壤、水体中磺酰脲类除草剂的去除，具有非常重要的理论和应用价值。

附图说明：

图1重组菌株E.coli DH10B(ilvG

图2重组菌株E.coli DH10B(ilvG

图3突变体M6重组表达载体的构建图

图4突变体M6的SDS-PAGE图谱。其中，泳道1为蛋白Marker，其余泳道依次为野生型TsmE、突变体M6

具体实施方式

实施例1.定向进化筛选对甲基二磺隆具有去酯化活性的TsmE突变体

1.1野生型tsmE基因的合成

合成所述tsmE基因的核苷酸序列(1197bp)，如序列表中SEQ ID NO.1所示，其编码TsmE蛋白(398个氨基酸)，如序列表中SEQ ID NO.2所示。合成的tsmE克隆至pUC57载体，重组载体命名为pUC-tsmE，然后转化至大肠杆菌DH5α。

1.2构建tsmE基因突变文库

以质粒pUC-tsmE为模板，用引物1和引物2进行易错PCR，使得tsmE基因由于碱基随机错配而发生突变。易错PCR产物克隆至pMD19-T载体，酶连产物热击转化至对甲磺隆敏感的大肠杆菌DH10B(ilvG

引物和易错PCR反应体系如下：

引物1：ATGGAAACCGATAAAAAAACCG，

引物2：TCAGCTTTCGTTCTGATCTAAG，

易错PCR扩增体系为：

PCR扩增程序：

a.95℃预变性3min；

b.94℃变性0.5min，52℃退火1.0min，72℃延伸1.5min，进行30个循环；

c.72℃延伸10min，冷却到室温。

1.3对tsmE基因突变文库进行筛选

将上述突变文库中的转化产物接种于含有浓度为5μM的甲基二磺隆的基础盐培养基(添加5g L

上述基础盐培养基配方为：1.0g NH4Cl，0.5g NaCl，1.5g K

1.4获得突变的抗性基因

对突变体M6基因进行测序发现其核苷酸序列第2 3 9-2 4 2位由原来的C A T A依次突变为G A G C，且第5 2 7位由原来的G突变为C，第532-533位由原来的TC突变为GT,第5 4 4位由原来的G突变为A，第985-986位由原来的的TT突变为GC；导致其氨基酸序列第80-81位由原来的脯氨酸和酪氨酸突变为精氨酸和丙氨酸，第176、178和182位由原来的甘氨酸、丝氨酸和甘氨酸突变为丙氨酸、缬氨酸和精氨酸，且第329为由原来的苯丙氨酸突变为丙氨酸。

实施例2突变体M6基因在BL21(pET-29a(+))中的高效表达

2.1细菌表达载体的构建和重组微生物的获得

合成带有Nde I/HindⅢ酶切位点的M6基因的核苷酸序列(1215bp)，如序列表中SEQ ID NO.5所示。合成的M6基因克隆至pUC57载体，得到重组载体pUC-M6。重组载体pUC-M6与pET-29a(+)质粒分别用限制性内切酶Nde I和HindⅢ进行酶切，酶切体系如下：

10×M Buffer 5μL

Nde I(10U·μL

HindⅢ(10U·μL

DNA(pUC-M6或pET-29a(+)质粒)30μL

ddH

37℃酶切12h，然后将切下的上述M6基因片段与酶切后的细菌表达载体pET-29a(+)进行酶连，构建好的重组表达载体命名为pET29a-M6，如图3所示。将重组表达载体转化到表达宿主菌BL21(DE3)中，获得重组微生物BL21(M6)。

2.3TsmE突变体的表达和纯化

将BL21(M6)接种于LB培养基中，37℃，200rpm摇床培养至OD

实施例3、TsmE突变体酶活力测定

酶活反应体系(1mL)：在50mM PBS缓冲液(pH 7.4)中添加纯化的TsmE突变体酶和100μM磺酰脲类除草剂底物。每个反应以加入反应酶开始计时，在30℃反应10min后迅速添加等体积的乙腈终止反应。以不添加酶作为对照，利用高效液相色谱(HPLC)检测每种磺酰脲底物的减少量来测定突变体的活性。HPLC条件为：

酶活测定结果表明突变体M6对大分子磺酰脲除草剂甲基二磺隆和甲基碘磺隆钠盐具有去酯化活性，比酶活分别为0.10和0.15U/mg。

以上实施例中使用的微生物来源如下：大肠杆菌DH5α购自宝生物工程(大连)有限公司，大肠杆菌高表达载体pET-29a(+)购自Novegen公司，表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)购自上海英骏生物技术有限公司。