化合物、包括所述化合物的药物组合物及其用途
文献发布时间：2023-06-19 19:30:30
技术领域
本公开内容涉及医药领域，并且更具体地，本公开内容涉及由式1表示的化合物、其药物可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体，包括所述由式1表示的化合物以及一种或多种药物可接受的辅料的药物组合物，包括所述由式1表示的化合物或其药物组合物的转录因子调节剂，以及其在制备用于治疗与肌细胞增强因子2的调节相关的疾病的药物中的用途。
背景技术
真核生物转录起始过程十分复杂，往往需要多种蛋白因子的协助。转录因子是与特定DNA序列结合的蛋白，其直接调控基因表达或通过诸如辅激活子和辅阻遏子等相关蛋白调控基因表达，或者通过募集诸如组蛋白乙酰转移酶(HAT)和组蛋白脱乙酰酶(HDAC)等组蛋白修饰酶而调控基因表达。
肌细胞增强因子2(MyoCyte Enhancer Factor 2，MEF2)是一种特定的转录因子，属于转录调节因子MADS-Box家族，广泛存在于肌细胞、淋巴细胞和神经元中，通过控制肌细胞分化过程中的基因转录参与肌肉形成、骨骼发育、神经系统发育、肝脏纤维化等多种生理过程。在脊椎动物中，该家族包括：MEF2A、MEF2B、MEF2C和MEF2D四个成员，它们具有MADS超家族所共有的由56个氨基酸组成的单元，其功能是使蛋白质之间形成二聚体以及识别靶DNA并与之结合，对细胞增殖、分化、存活、凋亡过程中相关的基因表达进行调控。它们对多种细胞的存活与分化进行调节，涉及基因调节的不同环节和功能调节机制，正日益受到高度重视，其突出功能是控制肌细胞分化过程中的基因转录，在骨骼肌、心肌和平滑肌中介导细胞的分化。
虽然本领域已知MEF2参与各种细胞过程，但迄今为止由于缺乏合适的分子工具而无法将其合理利用。特别地，如何通过小分子调节MEF2的活性一直是个长期存在的挑战。这是因为MEF2是相对较小的转录因子，没有任何明显的酶活性；其主要功能在于结合特定的DNA并且将诸如Cabin1、组蛋白去乙酰化酶(HDAC)以及组蛋白乙酰转移酶(HAT)CBP/赖氨酸乙酰转移酶(KAT)p300等转录辅调控子(co-regulator)募集至特异性启动子。通常认为该功能模式不具有可药性，或至少非常难以被靶向。
在WO2010/028193中公开了几类靶向转录辅调控子HDAC的化合物，可以通过使化合物接触HDAC达到抑制HDAC的作用。HDAC通常分为四类，I型(HDAC1、2、3和8)、II型(HDAC4、5、7、9、6和10)、III型(去乙酰化酶，Sirt1-Sirt7)和IV型(HDAC11)。II型HDAC可以进一步细分为IIa型(HDAC4、5、7和9)和IIb型(HDAC6和10)。一般情况下，使用活性位点抑制剂广谱抑制HDAC会引起细胞复杂的反应，因此，在WO2010/028193中主要研究了针对I型HDAC，主要是HDAC3的有效抑制剂。
在CN101851173A中也公开了几类靶向转录辅调控子HDAC的化合物，但其主要研究的也是针对I型HDAC，主要是HDAC1的有效抑制剂。
但针对I型HDAC的抑制剂对于与MEF2的调节相关的疾病并不具备普适性。发明人发现，MEF2以配体样袋(ligandlike pocket)结合短的两亲性螺旋以与相关转录辅调控子相互作用，这为使用小分子调节MEF2提供了新的思路。通过使用小分子与转录辅调控子竞争性结合MEF2的配体样袋，可以阻断MEF2与转录调控子的相互作用。这种能够调节MEF2的化合物会促进该领域的发展，并且会推动与MEF2的调节相关的疾病的治疗进展。
发明内容
本文提供了由式1表示的化合物：
或其药物可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体，
其中：
Y可以是羟基基团、未取代的或被至少一个R
X可以是未取代的或被至少一个R
R
R
R
在实施方案中，Y可以是羟基基团、未取代的或被至少一个R
在另一个实施方案中，Y可以是羟基基团、未取代的或被至少一个R
在又一个实施方案中，Y可以是羟基基团、任选地被羟基或氨基基团取代的苯基基团、任选地被羟基或氨基基团取代的萘基基团、任选地被羟基或氨基基团取代的吡啶基团、任选地被羟基或氨基基团取代的吡啶基团、任选地被羟基或氨基基团取代的吡嗪基团、任选地被羟基或氨基基团取代的吲哚基团、任选地被羟基或氨基基团取代的苯并咪唑基团、或者任选地被羟基或氨基基团取代的苯并三唑基团。
在其它实施方案中，Y可以是2-氨基苯基。
在实施方案中，X可以是未取代的或被至少一个R
在另一个实施方案中，X可以是任选地被卤素或氧亚基基团取代的亚乙基、任选地被卤素或氧亚基基团取代的亚丙基、任选地被卤素或氧亚基基团取代的亚丁基、任选地被卤素或氧亚基基团取代的亚戊基基团、或者任选地被卤素或氧亚基取代的亚己基。
在又一个实施方案中，X可以是亚乙基、亚丙基、亚丁基、氟代亚乙基、溴代亚乙基、氧代亚乙基、氟代亚丙基、溴代亚丙基、氧代亚丙基、氟代亚丁基、溴代亚丁基或氧代亚丁基。
在其它实施方案中，X可以是亚乙基、亚丙基、二氟亚乙基、二氟亚丙基、氧代亚乙基或氧代亚丙基。
在实施方案中，R
在另一个实施方案中，R
在又一个实施方案中，R
在其它实施方案中，R
在实施方案中，R
在另一个实施方案中，R
在又一个实施方案中，R
在实施方案中，所述由式1表示的化合物可以选自以下化合物1至化合物5：
本文还提供了药物组合物，所述药物组合物可以包括上述化合物；以及一种或多种药物可接受的辅料。
在实施方案中，所述药物可接受的辅料可以选自载体、赋形剂、粘合剂、助悬剂、助流剂、调味剂、甜味剂、崩解剂、分散剂、表面活性剂、润滑剂、着色剂、稀释剂、增溶剂、润湿剂、增塑剂、稳定剂、渗透促进剂、润湿剂、消泡剂、抗氧化剂、防腐剂、溶剂或其组合。
本文又提供了转录因子调节剂，所述转录因子调节剂可以包括上述化合物或上述药物组合物。
在实施方案中，所述转录因子调节剂可以是肌细胞增强因子2调节剂。
本文另外提供了上述化合物或者上述药物组合物在制备用于治疗与肌细胞增强因子2的调节相关的疾病的药物中的用途。
在实施方案中，所述与肌细胞增强因子2的调节相关的疾病可以选自心肌肥厚、心力衰竭、冠状动脉粥样硬化、冠心病和糖尿病心肌病。
附图说明
图1示出了根据本公开内容的实施方案的化合物2在SD大鼠和比格犬的血浆中的可能代谢产物。
图2示出了根据本公开内容的实施方案的化合物2在不同种属(小鼠(MI)、大鼠(R)、比格犬(D)、食蟹猴(MO)、迷你猪(P)和人(H))肝微粒体内可能的代谢途径。
图3A示出了根据本公开内容的实施方案的化合物2在人(H)、恒河猴(Mo)、比格犬(D)、迷你猪(P)、大鼠(R)的血浆中的剩余百分率，并且图3B示出了根据本公开内容的实施方案的化合物2在小鼠(Mi)的血浆中的剩余百分率。
图4A至图4C示出根据本公开内容的实施方案的化合物2的代谢产物M1(m/z＝323.1278)在6个种属血浆中的含量变化，其中图4A示出了在比格犬(D)、迷你猪(P)、恒河猴(Mo)和小鼠(Mi)的血浆中代谢产物M1的含量随时间的变化，图4B示出了在大鼠(R)的血浆中代谢产物M1的含量随时间的变化，并且图4C示出了在人(H)的血浆中代谢产物M1的含量随时间的变化。
图5A示出了化合物2对HDAC1的抑制曲线；并且图5B示出了化合物2对MEF2与HDAC4的相互作用的抑制曲线。
图6A示出了诱导前、诱导后、用相同浓度的比较化合物1、m3以及化合物1-2处理后心肌细胞的免疫荧光图像，图6B示出了诱导前、诱导后、用相同浓度的比较化合物1(CC1H)、m3(m3H)以及化合物1(C1 H)和2(C2 H)处理后心肌细胞的平均面积。
图7示出了诱导前、诱导后、用不同浓度的本公开内容的化合物3-5(C3 L、C3 M、C4L、C4 M、C4 H、C5 L、C5 M、C5 H)处理后心肌细胞的平均面积。
图8A和图8B分别示出了大鼠左室舒张末期内径(图8A)和左室收缩末期内径(图8B)的比较图。
图9A和图9B分别示出了大鼠左室舒张末期容积(图8A)和左室收缩末期容积(图8B)的比较图。
图10A和图10B分别示出了大鼠的射血分数(图9A)和缩短分数(图9B)的比较图。
具体实施方式
当结合附图阅读时，将更好地理解以下的详细描述。为了说明本发明，附图例示出本发明的实施方案。然而，本发明不限于所示的精确布置、实例和手段。
如本文使用，术语“和/或”包括相关的列出项中的一个或多个的任何组合和所有组合。
本文使用的术语出于描述具体实施方案的目的，而不旨在限制。此外，术语“包含”和/或“包括”当用于本说明书时指明规定的特征、整数、步骤、操作、元件、组件和/或其群组的存在，但不排除一个或多于一个的其它的特征、整数、步骤、操作、元件、组件和/或其群组的存在或增添。
除非另外定义，本文使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。术语(例如在常用词典中定义的那些术语)应解释为具有与其在相关领域的语境中的含义相符的含义，并且不应以理想化或过于形式的含义进行解释，除非在本文明确如此定义。
定义
如本文使用，术语“取代的”当关于化学取代基或部分(例如，C
如本文使用，术语“约”或“大约”当与数值变量一起使用时是指变量的指示值以及变量在指示值的实验误差内或者在指示值的±15％、
±10％、±5％内的所有值。
如本文使用，术语“烷基基团”是指通常具有指定数量的碳原子的直链和支链饱和烃基(例如，C
如本文使用，术语“烯基基团”是指在烷基基团的中间或末端处具有至少一个碳碳双键的单价烃基团(例如，C
如本文使用，术语“炔基基团”是指在烷基基团的中间或末端处具有至少一个碳碳叁键的单价烃基团(例如，C
如本文使用，术语“环烷基基团”是指通常具有构成环的指定数量的碳原子的饱和环烃基(例如，C
如本文使用，术语“杂环烷基基团”是指进一步包含除了碳原子之外的至少一个杂原子(其中杂原子数可以是1至5或1至3，例如1、2、3、4或5)作为成环原子的环状基团(例如，C
如本文使用，术语“氧亚基”和“氧代”可以互换使用，并且是指双键氧(＝O)。
如本文使用，术语“卤代”和“卤素”可以互换使用，并且是指氟、氯、溴和碘。
如本文使用，术语“C
如本文使用，术语“C
如本文使用，术语“C
如本文使用，术语“杂原子”是指除了碳原子和氢原子之外的任何原子。杂原子的实例是O、S、N、P、Si、B、Ge、Se或其任意组合。
如本文使用，术语“药物可接受的”是指在合理的医学判断范围内，适合与人类和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，符合合理的收益/风险比的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
如本文使用，术语“药物可接受的辅料”是指在药物制剂中除了活性成分，例如本文所述化合物之外的其它成分，其与活性成分相容，同时并适合与生物检体的组织或器官接触而不引发过度的毒性、刺激性、过敏反应、免疫原性、或其它问题或并发症、与合理的利益/风险比相称。
如本文使用，术语“药物可接受的盐”是指所公开的化合物的衍生物，其中母体化合物通过制备其酸或碱盐而被修饰。药物可接受的盐的实例包括但不限于衍生自以下有机酸或无机酸的盐：1,2-乙二磺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、2-羟基乙磺酸、乙酸、抗坏血酸、苯磺酸、苯甲酸、重碳酸、碳酸、柠檬酸、乙二胺四乙酸、乙二磺酸、乙磺酸、富马酸、葡庚糖酸、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、己基间苯二酚酸、海巴酸、氢溴酸、盐酸、氢碘酸、羟基马来酸、羟基萘甲酸、羟乙基磺酸、乳酸、乳糖酸、月桂基磺酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、萘磺酸、硝酸、草酸、扑酸、泛酸、苯乙酸、磷酸、聚半乳糖醛酸、丙酸、水杨酸、硬脂酸、亚乙酸、琥珀酸、氨基磺酸、磺胺酸、硫酸、单宁酸、酒石酸和甲苯磺酸。
如本文使用，术语“溶剂化物”是指由溶质(例如，本文所提供的化合物)和溶剂形成的可变化学计量的复合物。这些溶剂不会干扰溶质的生物学活性。合适的溶剂的实例包括但不限于，水、甲醇、乙醇和乙酸。在一个实施方案中，溶剂化物是指水合物。
如本文使用，术语“患者”或“个体”用于表示温血动物如哺乳动物，例如猫、狗、小鼠、豚鼠、马、牛、绵羊、非人类和人类。
如本文使用，术语“治疗有效量”是指当与相应的未接受该活性成分的个体相比，该剂量的活性成分可以预防、改善、缓和或治愈疾病的状态，减少一种或多种与疾病相关的症状，或者减缓、遏制或逆转疾病的发展进程。治疗有效量可以受到多种因素的影响，包括但不限于活性成分的属性(例如，活性、药动学、药效学、生物利用度等)、待治疗的个体的状况(例如，年龄、性别、疾病类型和阶段、一般健康情况、对给定剂量的响应等)、药物剂型及给药途径等。
如本文使用，术语“与肌细胞增强因子2的调节相关的疾病”包括但不限于由肌细胞增强因子2的失调或异常而引起的疾病，还包括通过调节肌细胞增强因子2可以预防、改善、缓和或治愈的疾病。与肌细胞增强因子2的调节相关的疾病包括但不限于心脑血管疾病，例如心肌肥厚、心力衰竭、冠状动脉粥样硬化、冠心病和糖尿病心肌病等；神经系统疾病，例如阿尔兹海默症、帕金森症、脑中风等；白血病，例如急性骨髓性白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病等。
化合物
本文提供了由式1表示的化合物：
或其药物可接受的盐、溶剂化物、前药或立体异构体，
其中：
Y可以是羟基基团、未取代的或被至少一个R
X可以是未取代的或被至少一个R
R
R
R
在实施方案中，Y可以是羟基基团、未取代的或被至少一个R
在其它实施方案中，Y可以是羟基基团、任选地被羟基或氨基基团取代的苯基基团、任选地被羟基或氨基基团取代的萘基基团、任选地被羟基或氨基基团取代的吡啶基团、任选地被羟基或氨基基团取代的吡啶基团、任选地被羟基或氨基基团取代的吡嗪基团、任选地被羟基或氨基基团取代的吲哚基团、任选地被羟基或氨基基团取代的苯并咪唑基团、或者任选地被羟基或氨基基团取代的苯并三唑基团。在优选实施方案中，Y可以是2-氨基苯基。
在实施方案中，X可以是未取代的或被至少一个R
在其它实施方案中，X可以是任选地被卤素或氧亚基基团取代的亚乙基、任选地被卤素或氧亚基基团取代的亚丙基、任选地被卤素或氧亚基基团取代的亚丁基、任选地被卤素或氧亚基基团取代的亚戊基基团、或者任选地被卤素或氧亚基取代的亚己基。在具体实施方案中，X可以是亚乙基、亚丙基、亚丁基、氟代亚乙基、溴代亚乙基、氧代亚乙基、氟代亚丙基、溴代亚丙基、氧代亚丙基、氟代亚丁基、溴代亚丁基或氧代亚丁基。在其它具体实施方案中，X可以是亚乙基、亚丙基、二氟亚乙基、二氟亚丙基、氧代亚乙基或氧代亚丙基。
在实施方案中，R
在优选实施方案中，R
在实施方案中，R
在实施方案中，由式1表示的化合物可以选自以下化合物1至化合物5：
本文提供的化合物包括所有非对映异构体、对映异构体和差向异构体形式以及其适当的混合物。本文提供的化合物和方法包括所有顺式和反式异构体及其适当的混合物。在某些实施方案中，通过使化合物的外消旋混合物与旋光拆分剂反应以形成一对非对映异构化合物/盐，分离非对映异构体并回收旋光纯的对映异构体，将本文描述的化合物制备为其单独的立体异构体。在一些实施方案中，使用本文描述的化合物的共价非对映异构体衍生物进行对映异构体的拆分。在另一个实施方案中，通过基于溶解度差异的分离/拆分技术分离非对映异构体。在其它实施方案中，立体异构体的分离通过色谱法或通过形成非对映异构体盐并通过重结晶或色谱法或其任何组合分离来进行。
在一些实施方案中，本文描述的化合物可以被制备为前药。“前药”是指在体内转化为母体药物的药剂。前药通常是有用的，因为在一些情况下，它们可以比母体药物更容易施用。例如，在母体药物不适合口服给药时，通过将其制备为前药，进而通过口服给药而具有良好的生物利用度。与母体药物相比，前药还可以在药物组合物中具有改善的溶解性。在一些实施方案中，前药的设计增加了有效水溶性。前药的实例是(但不限于)本文描述的化合物，其作为酯(“前药”)施用以促进其中水溶性损害移动性的跨细胞膜的传递，但一旦在其中水溶性是有益的细胞内，其随后代谢水解成羧酸(活性实体)。前药的另一个实例可以是与酸基团键合的短肽(聚氨基酸)，其中肽被代谢以表现出活性部分。在某些实施方案中，在体内施用时，前药被化学转化成化合物的生物学、药学或治疗活性形式。在某些实施方案中，前药通过一个或多个步骤或过程酶促代谢为化合物的生物学、药学或治疗活性形式。
药物组合物
本文还提供了药物组合物，所述药物组合物包含至少一种由式1表示的化合物，以及一种或多于一种的药物可接受的辅料。
在实施方案中，本文提供的药物组合物还可以包含额外的药物。该额外的药物可以与由式1表示的化合物针对个体所患疾病或病症起到相同或类似的生物学作用，例如同时以相同的作用机制减轻该疾病或病症的某种症状；或者可以与由式1表示的化合物针对个体所患疾病或病症起到协同的生物学作用，例如以不同的作用机制协同地减轻该疾病或病症的某种症状；或者可以与由式1表示的化合物独立地起到不同的生物学作用但对个体所患疾病或病症起到预防、缓解或治愈的作用，例如以不同的作用机制预防可能由式1表示的化合物引起的不良反应；等等。
如本文使用，术语“辅料”可以选自本领域常用的载体、赋形剂、粘合剂、助悬剂、助流剂、调味剂、甜味剂、崩解剂、分散剂、表面活性剂、润滑剂、着色剂、稀释剂、增溶剂、润湿剂、增塑剂、稳定剂、渗透促进剂、润湿剂、消泡剂、抗氧化剂、防腐剂、溶剂或其组合。
如本文使用，术语“载体”是指在制剂中参与将活性成分从一个位置、体液、组织、器官(内部或外部)或身体部分携带或运输到另一个位置、体液、组织、器官、或身体部分的药物可接受的液体或固体的载体或载体的组合。药物可接受的载体是本领域所熟知的，包括但不限于，糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉末状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；可可脂和栓剂蜡；油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，如丙二醇；多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；氢氧化镁和氢氧化铝；藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；醇，如乙醇和丙烃醇；磷酸盐缓冲溶液；以及其它药物制剂中使用的非毒性相容物质。
如本文使用，术语“赋形剂”通常是指用于片剂的辅料。
如本文使用，术语“稀释剂”是指用于在递送之前稀释活性药物成分的物质。稀释剂也可以用作稳定剂。稀释剂的非限制性实例包括淀粉及其加工和共加工的衍生物、糖、二糖、蔗糖、乳糖、多糖、纤维素、纤维素醚、乙酸纤维素、羟丙基纤维素、糖醇、木糖醇、山梨糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇；微晶纤维素、碳酸镁或碳酸钙或碳酸钠、乳糖、乳糖一水合物、磷酸二钙、可压缩糖、磷酸氢钙二水合物、甘露糖醇、无水乳糖、氧化镁、麦芽糖糊精、麦芽糖、支链淀粉、海藻酸钠、碳酸氢钠、硅酸钙、硫酸钙、细胞和磷酸三钙或其合适的组合。
如本文使用，术语“粘合剂”是指可用于将活性和惰性组分结合在一起以保持内聚和离散部分的任何药物可接受的物质。粘合剂的非限制性实例是聚乙二醇12-羟基二醇(SOLUTOL HS-15)、聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40、聚乙二醇PEG400、壳聚糖、氢化蓖麻油、海藻酸钠、卡波姆、邻苯二甲酸乙酸纤维素、聚维酮、糖、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、淀粉、海藻酸、预胶化淀粉、阿拉伯胶、黄芪胶、乙基纤维素、丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物或其合适的组合。
如本文使用，术语“崩解剂”是指在添加至固体制剂后促进其在施用后分解或崩解并允许尽可能有效地释放活性成分以允许其快速溶解的物质。崩解剂的非限制性实例包括玉米淀粉、羟基乙酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、微晶纤维素、改性玉米淀粉、羧甲基淀粉钠、聚维酮、预胶化淀粉、琼脂、羧甲基纤维素钙或钠、胶体二氧化硅、壳聚糖、多库酯钠、羟丙基纤维素、硅酸镁铝、麦芽糖、甲基纤维素、波拉克林钾和海藻酸或其合适的组合。
如本文使用，术语“润滑剂”是指赋形剂，其被添加至粉末共混物中以防止压实的粉末物质在压片或包封过程期间粘附到设备上。它有助于片剂从模具中弹出，并且可以改善粉末流动。润滑剂的非限制性实例包括硬脂酸镁、硬脂酸、二氧化硅、脂肪、硬脂酸锌或蔗糖硬脂酸酯或硬脂酸钠或硬脂酸钙、蓖麻油、氢化蓖麻油。聚乙二醇及其衍生物、硬脂酰富马酸钠、滑石或脂肪酸，包括月桂酸、油酸、山嵛酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯和C
如本文使用，术语“助流剂”旨在意指用于片剂和胶囊制剂中以改善片剂压制过程中的流动性并产生防结块作用的试剂。助流剂的非限制性实例包括胶体二氧化硅、滑石、气相二氧化硅、淀粉、淀粉衍生物和膨润土或其合适的组合。
如本文使用，术语“增塑剂”是指，但不限于多元醇，例如聚乙二醇、丙二醇、丙三醇(甘油)，有机酯，例如邻苯二甲酸酯(二乙酯、二丁酯)、癸二酸二丁酯、柠檬酸酯(三乙酯、乙酰基三乙酯、乙酰基三丁酯)、三乙酸甘油酯、油/甘油酯如蓖麻油；乙酰化甘油单酯、分馏椰子油或其合适的组合。
在具体实施方案中，溶剂可以选自水、丙酮、氯仿、二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯、甲醇、异丙醇、N,N-二甲基甲酰胺及其组合和本领域普通技术人员已知的其它此类物质。
在具体实施方案中，本文提供的药物组合物可以制备成口服液通过灌胃的方式向哺乳动物给药。在具体实施方案中，本文提供的药物组合物可以制备成注射液通过静脉内注射的方式向哺乳动物给药。但本文提供的药物组合物的剂型和给药途径不限于此。
本文提供的药物组合物可以根据需要制备成多种药物制剂，其可以通过多种给药途径以多种方式向哺乳动物，例如人给药，包括但不限于口服、肠胃外(例如静脉内、皮下、肌内、髓内注射、鞘内、直接心室内、腹膜内、淋巴内、鼻内注射)、鼻内、口腔、局部或透皮给药途径。本文提供的药物制剂包括但不限于水性液体分散体、自乳化分散体、固溶体、脂质体分散体、气溶胶、固体剂型、粉剂、速释制剂、控释制剂、速溶制剂、片剂、胶囊剂、丸剂、延迟释放制剂、延长释放制剂、脉冲释放制剂、多颗粒制剂以及混合的速释和控释制剂。
例如，在具体实施方案中，本文提供的药物组合物可以以适当的剂型和剂量：(a)全身施用于哺乳动物；和/或(b)口服施用于哺乳动物；和/或(c)静脉内施用于哺乳动物；和/或(d)通过吸入施用于哺乳动物；和/或(e)通过经鼻给药施用于哺乳动物；和/或(f)通过注射施用于哺乳动物；和/或(g)局部施用于哺乳动物；和/或(h)通过眼部施用于哺乳动物；和/或(i)通过直肠施用于哺乳动物；等等。
本文提供的药物组合物也可以以适当的剂型和剂量通过以下方案施用：(i)单次施用于哺乳动物；(ii)化合物在一天的跨度内多次施用于哺乳动物；(iii)不断地施用于哺乳动物；或(iv)连续施用于哺乳动物。
本文提供的药物组合物可以以治疗有效量施用。尽管对于本文描述的药物组合物仍待优化人剂量水平，但通常治疗有效量可以是约0.25mg/kg体重至约120mg/kg体重或更多、约0.5mg/kg体重或更少至约70mg/kg体重、约1.0mg/kg体重至约50mg/kg体重、或者约1.5mg/kg体重至约10mg/kg体重。例如，治疗有效量可以是约0.25mg/kg体重、约0.5mg/kg体重、约1.0mg/kg体重、约5.0mg/kg体重、约10.0mg/kg体重、约50mg/kg体重、或约100mg/kg体重。在具体实施方案中，本文提供的药物组合物可以以口服液的形式以5mg/kg体重施用。在另一个具体实施方案中，本文提供的药物组合物可以以注射液的形式以1mg/kg体重施用。但本文提供的药物组合物的施用方案不限于此。
肌细胞增强因子2调节剂
在本文中，转录因子调节剂主要是指肌细胞增强因子2(MEF2)调节剂。
MEF2在包括肌细胞、淋巴细胞和神经元在内的广泛细胞的分化、增殖以及存活/凋亡中起到重要的作用。例如，MEF2是用于在淋巴系统发育中介导钙信号传导的重要转录因子之一。MEF2可以调控细胞因子表达和免疫响应。MEF2还可以调控作为神经元存活和突触重塑的基础的转录程序。MEF2的主要功能在于结合特定的DNA并且将诸如Cabin1、HDAC、CBP/p300和心肌素等转录辅调控子募集至特异性启动子；其中，CBP/p300和心肌素是常见的共激活分子，其促进MEF2DNA的结合和转录激活；而II型HDAC和Cabin1是常见的共抑制分子，其维持MEF2处于转录失活状态。
在本领域中，普遍认为，MEF2是相对较小的转录因子，没有任何明显的酶活性且很难实现被靶向，因此，现有技术中的抑制剂通常是针对辅调控子的抑制剂，例如，针对HDAC的抑制剂，从而间接地实现对MEF2的调控。而且，为了避免广谱抑制辅调控子可能产生的严重副作用，辅调控子抑制剂通常只针对非常窄范围的辅调控子。
而本文提供的化合物可以直接靶向MEF2，通过阻断MEF2与转录辅调控子的相互作用而发挥其生物学活性。例如，本文提供的化合物可以与IIa型HDAC竞争性绑定到MEF2的一个高度保守的疏水性MAD-box结构域上，从而阻止IIa型HDAC与靶向基因结合，进而抑制IIa型HDAC的功能。本文提供的化合物与MEF2的结合能力通常是HDAC4与MEF2的结合能力的数倍，因此可以通过靶向MEF2间接地提供对HDAC4的抑制作用。
发明人通过HDAC1试剂盒测定了本文提供的化合物2对HDAC1的半数抑制浓度(IC
因此，本文提供的化合物或其药物组合物可以直接靶向MEF2，一方面直接且有效地治疗与MEF2的调节相关的疾病，另一方面从根源上避免了广谱辅调控子抑制剂可能产生的副作用。
例如，在实施方案中，本文提供的化合物可以与p300竞争性绑定到MEF2的疏水性MAD-box结构域上，从而阻止p300与靶向基因结合，进而抑制p300的功能。
例如，心肌肥厚可以分为生理性肥厚和病理性肥厚，生理性肥厚是指出生后生长和运动训练期间心脏尺寸增加的正常机制；而病理性肥厚是指随着高血压和瓣膜功能障碍等疾病而引起的工作量持续增加而引发的心脏尺寸增加。据统计，心肌肥厚的全球发病率高达约1/500。心肌肥厚可能导致心脏收缩功能障碍、心肌僵硬、纤维化、循环衰竭和死亡风险增加。心肌肥厚也是心力衰竭的常见前兆，尤其是射血分数保留型心力衰竭，这是一种及其常见且致命的疾病，目前尚无有效治疗方法。10％的心肌肥厚患者可能死于心衰或心源性猝死。
近来研究发现，心肌肥厚是由需要MEF2 DNA结合转录因子家族以及核赖氨酸乙酰转移酶(KAT)p300的心肌基因表达变化驱动的。MEF2乙酰化是病理性心肌肥厚的发展和维持所必须的，在心肌肥厚的个体中，MEF2和p300的水平均显著增加，这可能是由于MEF2和p300形成MEF2转录复合物并促使II型HDAC从细胞核转移至细胞质以与MEF2分离的结果。在这种情况下，HDAC抑制剂将不再适用。
在实施方案中，在通过使用主动脉缩窄术而引起心肌肥厚的个体中，本文提供的化合物可以阻断MEF2与p300的相互作用，进而抑制MEF2和p300的异常激活，由此可以在不损害生理适应的情况下缓解，甚至逆转心肌肥厚。
实施例
本发明的化合物可以使用以下描述的反应和技术，以及有机合成领域技术人员已知的常规技术或本领域技术人员所理解的其变化形式来制备。反应可以在适于所用试剂和材料且适于受影响进行转化的溶剂中进行。优选的方法包括但不限于以下描述的那些方法。
通过描述实施本发明的优选方式的以下非限制性实施例进一步说明本发明。这些不以任何方式限制本发明的范围。
实施例中给出的
在描述合成例中使用的措辞“使用B代替A”表示使用等摩尔当量的B代替A。
合成例1：化合物1的合成
1.1中间体2的合成
将中间体1(6.4g,38mmol)添加至50mL DMF中，随后添加溴代环丙烷(9.18g,76mmol),最后添加Cs
1.2中间体4的合成
向中间体3(21.5g，100mmol)的200mL DMF溶液中添加N,O-二甲基羟胺盐酸盐(14.6g，150mmol)，随后添加HATU(57g，150mmol)。将得到的混合物在冰水浴中冷却，滴加DIEA(38.7g,300mmol)，滴加完成后，将得到的混合物在20-30℃下搅拌16小时。将混合物用600mL水稀释，用EA(200mL*3)萃取。将合并的有机相用盐水(500mL*2)、水(500mL*2)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。将粗残余物通过硅胶色谱纯化，用EA/PE＝1/3洗脱，得到为淡黄色油状物的中间体4(20g)。
1.3中间体5的合成
向在氮气下冷却到-78℃的中间体2(2g，9.38mmol)的20mL无水四氢呋喃溶液中添加n-BuLi(4.8mL，12.19mmol)，保持温度低于-75℃，并将混合物在-78℃搅拌1小时。然后滴加中间体4(2.4g,9.38mmol)的10mL THF溶液，保持温度低于-75℃，滴加完成后，将混合物慢慢升温到室温，然后用饱和NH
1.4中间体6的合成
在0℃下，向中间体5(1g，3.02mmol)的30mL MeOH溶液中添加NaBH
1.2中间体7的合成
向中间体6(1g，粗品)的10mL DCM溶液中添加Et
1.3中间体8的合成
向中间体7(1.2g，粗品)的10mL DMF溶液中添加丙烯酸甲酯(1.51g，15.09mmol)，然后添加PPh
1.4中间体9的合成
向中间体8(360mg，粗品)的10mL THF溶液中添加5mL水，然后添加420mg LiOH.H
1.5化合物1的合成
向中间体9(180mg,0.62mmol)的10mL DMF溶液中添加苯-1,2-二胺(80mg,0.75mmol)，然后添加HATU(354mg,0.93mmol)。将得到的混合物在冰水浴中冷却，滴加DIEA(240mg,1.86mmol)，滴加完成后，将得到的混合物在20-30℃下搅拌16小时。将混合物用30mL水稀释，用EA(20mL*3)萃取。将合并的有机相用盐水(50mL*2)、水(50mL*2)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。将粗残余物通过硅胶色谱纯化，用EA/PE＝1/1洗脱，然后通过Pre-HPLC进一步纯化，得到为淡黄色固体的化合物1(51mg,产率21％)。
1
合成例2：化合物2和3的合成
2.1中间体10的合成
以与合成例1中相同的方式合成中间体2。将中间体2(2.13g，10毫摩尔)添加至20mL无水四氢呋喃中，在氮气保护下，降温至-78℃。滴加n-BuLi(4.8mL，1.2当量)，滴加完成后，继续在-78℃下搅拌1小时，滴加3.6g DMF，滴加完成后，逐渐升温至室温，搅拌1小时。将反应溶液用20mL饱和氯化铵水溶液淬灭，并用乙酸乙酯(20mL*3)萃取。乙酸乙酯相用饱和食盐水(100mL*2)反洗2次，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将残余物用柱层析纯化(EA/PE＝1/50)，得到黄色油状物的中间体10(1.3g)。
2.2中间体12的合成
将12.5g的中间体11和9.1g的亚磷酸三乙酯均匀混合，并加热到140℃反应5小时。将反应液冷却至室温，得到中间体12，其无需进一步纯化即用于下一步骤。
2.3中间体13的合成
将中间体10(1.62g)添加至20mL无水四氢呋喃中，在氮气保护下添加480mg氢化钠，室温搅拌15分钟后添加中间体12(2.86g)，并继续在室温下搅拌16小时。将反应液用20mL饱和氯化铵水溶液淬灭，并用乙酸乙酯(20mL*3)萃取。将乙酸乙酯相用饱和食盐水(100mL*2)反洗2次，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将残余物用柱层析纯化(EA/PE＝1/50)，得到黄色油状物的中间体13(2.7g)。
2.4中间体14和15的合成
将中间体13(294mg)添加至2mL四氢呋喃中，添加0.1mL10NBH
2.5中间体16和17的合成
将中间体14和15的混合物(333mg)溶解在10mLDCM中，添加430mg PCC，并在室温下搅拌2小时。反应完成后，向反应液中添加2g 200-300目硅胶，浓缩至干后直接柱层析，EA/PE＝1/3洗脱，得到黄色油状物的中间体16和17的混合物(256mg)。
2.6中间体18和19的合成
将中间体16和17的混合物(1g)溶解在10mL DMF中，添加丙烯酸甲酯(1.94g,15.09mmol)，然后一次添加Pd(OAc)
2.7中间体20和21的合成
将中间体18和19的混合物(650mg)添加至10mL THF和5mL水中。添加LiOH.H
2.8化合物2和3的合成
将中间体20和21的混合物(200mg)添加至10mL DMF中，依次添加邻苯二胺(67mg)、HATU(283mg)、DIEA(120mg)，并在室温下搅拌16小时。反应完成后，添加30mL水，并用乙酸乙酯(20mL*3)萃取。将乙酸乙酯相用饱和食盐水(100mL*2)反洗2次，水(100mL*2)反洗两次，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将残余物先用Pre-HPLC纯化，得到化合物2和3的混合物(150mg)。通过Chiral-HPLC进行分离，得化合物2(46mg)和化合物3(53mg)。
化合物2：
1
化合物3：
1
合成例3：化合物4和5的合成
3.1中间体22和23的合成
以与合成例2中相同的方式合成中间体18和19。将中间体18和19的混合物(1g)添加至10mL二氯甲烷中，然后添加1,2-二硫醇(426mg)和三氟化硼乙醚(642mg)，并在室温下搅拌16小时。反应完成后添加30mL水，搅拌30分钟，分离出二氯甲烷相，浓缩至干，得到中间体22和23的混合物(2.2g)，其无需纯化即直接用于下一步骤。
3.2中间体24和25的合成
将NIS(2.4g)添加至20mL无水DCM中，在氮气保护下降温到-78℃，滴加氢氟酸吡啶溶液(2.67g)，并在-78℃下搅拌10分钟。将中间体22和23的混合物(2.2g)溶解在10mL DCM中，并滴加至上述反应液中，将温度保持在-78℃，并在-78℃反应30分钟。然后缓慢升温至室温，继续反应2小时。反应完成后，添加水(30mL)淬灭反应。将二氯甲烷相分离，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。得到中间体24和25的混合物(1g)，其无需纯化即直接用于下一步骤。
3.3中间体26和27的合成
将中间体26和27的混合物(1g)添加至10mLDMF中，然后依次添加丙烯酸叔丁酯(1.8g)、醋酸钯(200mg)、Pd
3.4中间体28和29的合成
将中间体28和29的混合物(560mg)溶解在10mLDCM中，添加2mLTFA，并在室温下搅拌16小时。在反应完成后直接浓缩，得到中间体28和29的混合物(630mg)，其无需纯化即直接用于下一步骤。
3.5化合物4和5的合成
将中间体28和29的混合物(630mg)添加至10mL DMF中，依次添加邻苯二胺(197mg)、HATU(695mg)和DIEA(354mg)，并在室温下搅拌16小时。在反应完成后添加30mL水，并用乙酸乙酯(20mL*3)萃取。将乙酸乙酯相用饱和食盐水(100mL*2)反洗2次，水(100mL*2)反洗两次，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。将残余物先用Pre-HPLC纯化，再用Chiral-HPLC进行制备分离，得到化合物4(16mg)和化合物5(19mg)。
化合物4：
1
化合物5：
1
实施例1：代谢稳定性
1.1体内代谢产物鉴定
将3.12mg的化合物2溶解在6.24mL的甲醇中，由此制备化合物2的储备溶液(浓度为500μg/mL)。取1μL的储备溶液用稀释液(乙腈：水＝1:1，V/V)稀释，得到浓度为500ng/mL的供试品稀释液。
将供试品稀释液通过灌胃给药的方式施用于SD大鼠和比格犬。在单次口服灌胃给药前、给药后0.083h、0.25h、0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、24h取血。经大鼠眼球取静脉血约300μL，加入冰水预冷的带有肝素钠的离心管中，并置于冰浴，静置后离心(4000rpm，10min)，以50μL为单位体积分装，置于无菌EP管内，-80℃保存备用。经比格犬上肢桡静脉取血400μL，加入冰水预冷的带有肝素钠的离心管中，并置于冰浴，静置后离心(4000rpm，10min)，取上层血浆，以50μL为单位体积分装，置于无菌EP管内，-80℃保存备用。
将上述样本加入200μL乙腈，在14000rpm下离心5min后，取上清，-80℃保存备用。
将给药前(空白对照)样品、给药后各时间点样品各取200μL混合均匀，氮吹挥干溶剂，加100μL复溶溶剂(水:乙腈50:50)，涡旋5min，在20000rpm下离心5min后，取上清，进行测定。
利用LC-HRMS/MS技术在SD大鼠和比格犬血浆样本中共鉴定出17个化合物2的代谢产物，其中在SD大鼠血浆中共鉴定出17个代谢产物(M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8、M9、M10、M11、M12、M13、M14、M15、M16、M17)；在比格犬血浆中共鉴定出2个代谢产物(M1、M14)；根据推测的代谢产物结构，化合物2在SD大鼠和比格犬中可能代谢途径如图1所示。代谢产物的相关数据概述于以下表1中。
表1
1.2体外代谢产物鉴定
将3.12mg的化合物2溶解在6.24mL的甲醇中，由此制备化合物2的储备溶液(浓度为500μg/mL)。取1μL的储备溶液用稀释液(乙腈：水＝1:1，V/V)稀释，得到浓度为500ng/mL的供试品稀释液。
将1μL的供试品稀释液，158.5μL的肝微粒体(小鼠(MI)、大鼠(R)、比格犬(D)、食蟹猴(MO)、迷你猪(P)和人(H))溶液(148.5μL1x PBS缓冲液(pH 7.4)，10μL肝微粒体酶)、20μLUDPGA PBS溶液、20μLNADPH PBS溶液和0.5μLAlamethicin甲醇溶液轻轻混匀，置于37℃水浴中孵育30min、60min。
加入400μL乙腈(4℃)，涡旋3min，低温离心(14000rpm，4min，4℃)，取上清液400μL氮吹挥干溶剂，用100μL 50％乙腈水复溶，涡旋混合5min,离心(24000rpm，5min，4℃)取上清，进行LC-MS/MS分析。
利用LC-HRMS/MS技术在6个不同种属动物的肝微粒体孵育样本中共鉴定出7个化合物2的代谢产物，其中在小鼠肝微粒体中共鉴定出6个代谢产物(M10、M11、M13、M14、M15、M17)；在大鼠肝微粒体中共鉴定出5个代谢产物(M13、M14、M15、M16、M17)；在比格犬肝微粒体中共鉴定出1个代谢产物(M18)；在迷你猪肝微粒体中共鉴定出2个代谢产物(M13、M17)；在食蟹猴肝微粒体和人肝微粒体中未鉴定出代谢产物。根据推测的代谢产物结构，化合物2在肝微粒体中可能代谢途径如图2所示。代谢产物的相关数据概述于以下表2中。
表2
1.3代谢稳定性
将2.34mg的化合物2溶解在4.68mL的甲醇中，由此制备化合物2的储备溶液(浓度为500μg/mL)。取5μL的储备溶液和45μL的人(H)、恒河猴(Mo)、比格犬(D)、迷你猪(P)、大鼠(R)和小鼠(Mi)的6个种属的空白血浆(1μg/mL)置于离心管中，涡旋混匀1min后，置于37℃水浴中孵育，孵育时间为2min、5min、15min、30min、60min、90min，每个时间点设置三个平行样本。随后立即添加150μL的冰乙腈溶液(含内标胺碘酮)终止反应，涡旋5min沉淀蛋白，低温离心(14000rpm，4min，4℃)，取上清150μL，进行LC-MS/MS分析。以下示出了化合物2在6个种属血浆中含量的变化(表3)，以及半衰期和清除率(表4)。在图3A和图3B中示出了化合物2在6个种属血浆中的剩余百分率，其中图3A示出了化合物2在人(H)、恒河猴(Mo)、比格犬(D)、迷你猪(P)、大鼠(R)的血浆中的剩余百分率，图3B示出了化合物2在小鼠(Mi)的血浆中的剩余百分率。图4A至4C示出化合物2的代谢产物M1(m/z＝323.1278)在6个种属血浆中的含量变化，其中图4A示出了在比格犬(D)、迷你猪(P)、恒河猴(Mo)和小鼠(Mi)的血浆中代谢产物M1的含量随时间的变化，图4B示出了在大鼠(R)的血浆中代谢产物M1的含量随时间的变化，并且图4C示出了在人(H)的血浆中代谢产物M1的含量随时间的变化。
表3
表4
实施例2：体内毒性实验
2.1动物饲养
将总计24只(12只雌鼠，12只雄鼠)的6-7周龄的SD大鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)饲养于聚丙烯大鼠群养盒中。主要环境指标的控制范围：室温20～26℃，相对湿度40～70％。最小换气次数15次/小时，人工照明，明:暗＝12h:12h。笼具规格为：笼具规格为：545mm×395mm×200mm，每盒不多于5只。整个饲养过程中保持动物饮食活动自由。
2.2动物分组和给药
按照以下方式将24只动物分组，分别将溶媒(对照组)、低剂量(低剂量组)和中剂量(中剂量组)的化合物2以10mg/kg向SD大鼠进行灌胃给药，连续给药14天，给药当天为D1。其间，每天两次笼旁观察，观察内容包括动物外观状况、被毛、体征、行为活动、呼吸状态、腺体分泌、动物姿势、粪便性状、死亡情况等。每周一次测定体重。每周一次测定24小时饲料消耗量。
2.3临床病理学检查
血液学指标：红细胞计数、血红蛋白、红细胞比容、红细胞平均体积、平均血红蛋白含量、平均血红蛋白浓度、红细胞分布宽度、白细胞计数、中性粒细胞百分比、淋巴细胞百分比、单核细胞百分比、嗜酸性粒细胞百分比、嗜碱性粒细胞百分比、血小板计数、血小板比容、血小板平均体积、血小板分布宽度、网织红计数等。
血清生化指标：天门冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、肌酸激酶、乳酸脱氢酶、尿素、尿酸、肌酐、总蛋白、白蛋白、球蛋白、A/G、葡萄糖、总胆红素、总胆固醇、甘油三酯、钙离子浓度、钾离子浓度、氯离子浓度、钠离子浓度。
凝血指标：凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间。
组织病理学检查：D15检测。
称量脏器重量的器官：心脏、肝脏、脾脏、肾脏、脑、肾上腺、胸腺、睾丸、附睾、卵巢、子宫。
固定、保存的组织器官：大体观察异常的组织和器官进行组织病理学检查。
根据一般情况观察，实验期间，各组动物的外观情况、行为活动、呼吸状态、粪便性状等均未见异常。给药后，各给药组雄鼠体重与对照组相比，均无显著性差异(P>0.05)。低剂量组雌鼠、中剂量组雄鼠第1周的摄食量稍低于对照组，第2周恢复正常。
根据临床病理学检查，SD大鼠连续14天灌胃给药化合物2(给药剂量分别为50、500mg/kg)后，部分临床病理学指标及脏器重量出现波动，但均无明确毒理学意义。
实施例3：机制研究
3.1对HDAC1的半数抑制浓度的测定
HDAC1试剂盒：Abnova
供试品：化合物2
测定过程：
在96孔板中，取3个孔添加150μL的分析缓冲液和10μL的DMSO作为对照，取3个孔添加140μL的分析缓冲液、10μL的稀释HDAC1和10μL的DMSO作为100％初始活性孔，取15个孔添加140μL的分析缓冲液、10μL的稀释HDAC1和10μL的供试品稀释液(化合物2的连续稀释液，溶剂为DMSO，浓度分别为100μM、50μM、25μM、12.5μM和6.2μM，每个浓度取3个孔)。通过向所有使用的孔中添加10μL HDAC基质来启动反应。用盖片盖住板，在37℃的摇床上培养30分钟。取下盖片并添加40μL显影剂。再次盖住板，并在室温下孵育15分钟。
使用340-360nm的激发波长和440-465nm的发射波长读取荧光，绘图，并确定半数抑制浓度(IC
图5A示出了化合物2对HDAC1的抑制曲线，根据图5A计算，化合物2对HDAC1的IC
3.2对MEF2与HDAC4的相互作用的半数抑制浓度的测定
供试品：化合物2
测定过程：
293T细胞铺在24孔板中，细胞密度40-50％；贴壁后以PEI转染试剂将1μg pVP16-HDAC4质粒，1μg pM-MEF2质粒，0.5μg GK-荧光素酶质粒，0.1μg Renilla质粒转染至每孔；
转染24小时后，分别添加溶剂(作为对照)和供试品稀释液(化合物2的连续稀释液，浓度分别为0.07μM、0.15μM、0.3μM、0.6μM、1.25μM、2.5μM和5μM)处理细胞；处理24小时后，收获细胞，准备后续测定。
将报告基因细胞裂解液充分混匀，吸尽细胞培养液，添加100μl的报告基因细胞裂解液。充分裂解后，10,000-15,000g离心3-5分钟，取上清用于测定。
溶解萤火虫萤光素酶检测试剂和海肾萤光素酶检测缓冲液，并达到室温。海肾萤光素酶检测底物(100×)置于冰浴或冰盒上备用。
按照每个样品需100微升的量，取适量海肾萤光素酶检测缓冲液，按照1:100加入海肾萤光素酶检测底物(100×)配制成海肾萤光素酶检测工作液。
使用化学发光仪或具有检测化学发光功能的多功能酶标仪对每个样品进行测定。添加100微升的萤火虫萤光素酶检测试剂，混匀后测定RLU(relative light unit)。以报告基因细胞裂解液为空白对照。
在完成上述测定萤火虫萤光素酶步骤后，添加100微升的海肾萤光素酶检测工作液，混匀后测定RLU。
在以海肾萤光素酶为内参的情况下，用萤火虫萤光素酶测定得到的RLU值除以海肾萤光素酶测定得到的RLU值。根据得到的比值来比较不同样品间荧光素酶的激活程度。
图5B示出了化合物2对MEF2与HDAC4相互作用的抑制曲线，根据图5B计算，化合物2对MEF2与HDAC4的相互作用的IC
实施例4：逆转心肌细胞肥大实验
4.1.原代细胞培养：
选用出生1-3天的SD大鼠乳鼠进行实验。正常情况下每7只乳鼠所获得的心肌细胞可接种一个T25的培养瓶。每次老鼠约30只左右。取出乳鼠，掐断其颈椎将之处死，并放入装有75％酒精的罐子中浸泡1分钟除菌，随后放入准备好的培养皿中。用大镊子夹取已经处死、消毒的乳鼠，使其呈仰卧姿态于培养皿中并固定。用眼科剪从其胸骨下缘向颈部沿乳鼠胸骨中线略微偏左剪开乳鼠胸骨(在剪开胸骨时，眼科剪前端应尽量向上挑剪，以避免剪破心脏)，暴露其胸腔。用镊子从乳鼠背部由下向上挤压，可使跳动的心脏挤出胸腔。直接剪下前端心室肌部分(心尖，约1/3心脏)，将取下的心肌组织放入装有预冷的PBS的安瓶中，清洗两次，待用。
将组织在少量PBS中剪碎至1-3mm，冷PBS在清洗一遍，转移组织至50mL离心管，尽量去除残余的PBS，加入消化液5ml，并用封口膜封住，于37℃水浴箱中匀速振摇消化(130rpm/min)10min，利用筛网收集上清(避免吸到组织)，终止消化，室温下1200rpm/min(200g)离心5min，用无血清H-DMEM培养基洗涤细胞一次(除胰酶中的EDTA)。
去上清，用10ml含10％胎牛血清的H-DMEM培养基重悬细胞，接种培养皿中。在37℃，5％CO
4.2纯度鉴定：
在37℃，5％ CO
4.3肥大诱导：
鉴定纯度大于90％的心肌细胞进行肥大诱导，采用10
4.4药物处理：
48小时后，A)使用高剂量(H，10μM)的比较化合物1(结构如下所示)以及化合物1-2(结构如下所示)进行处理；B)使用不同剂量(高剂量(H，10μM)、中剂量(M，1μM)、低剂量(L，0.1μM))的化合物3-5进行处理。处理48小时后，对细胞进行染色，观察细胞肥大情况，包括细胞的形态、融合程度、搏动情况等。
/>
图6A示出了诱导前、诱导后、用相同浓度的比较化合物1以及化合物1-2处理后心肌细胞的免疫荧光图像，图6B示出了诱导前、诱导后、用相同浓度的比较化合物1(CC1 H)以及化合物1(C1 H)和2(C2H)处理后心肌细胞的平均面积。可以看出，加入Ang II后，心肌细胞的尺寸明显增大，而在高剂量(10μM)的比较化合物1以及化合物1-2处理后，心肌细胞的尺寸均明显减小，甚至小于诱导前的心肌细胞的尺寸，并且化合物1-2逆转心肌细胞肥大的效果明显优于比较化合物1。与比较化合物1相比，化合物1和2由于在两个苯环之间引入了低级链烷基而对MEF具有更好的结合亲和力，从而表现出更好的逆转心肌细胞肥大的效果。
图7示出了诱导前、诱导后、用不同浓度的化合物3-5(C3 L、C3M、C4 L、C4 M、C4 H、C5 L、C5 M、C5 H)处理后心肌细胞的平均面积。结果表明，低浓度的化合物3和4逆转心肌细胞肥大的效果不明显，但具备一定的改善作用；经中等浓度的化合物3和4处理的心肌细胞已经与诱导前的心肌细胞相当，表明大于1μM的化合物3和4已经可以逆转心肌细胞肥大；大于0.1μM的化合物5已经可以表现出良好的心肌细胞肥大逆转作用。
实施例5：缓解TAC(主动脉缩窄术)引起的心肌肥厚、心衰实验
5.1TAC模型制备
术前称重，应用小动物呼吸麻醉机将动物麻醉，待动物出现角膜反射消失、肌力下降、软瘫等麻醉反应后，仰卧于手术板固定。备好体视显微镜、小动物呼吸机及管路。呼吸机参数设定：呼吸频率105-110次/分钟，潮气量2-3毫升/分钟。局部皮肤消毒。沿胸骨左缘剪开皮肤，逐层分离皮下组织，沿胸骨左侧的第二肋骨处剪断第二肋骨，用无齿显微镊分离胸腺组织，剥离暴露出升主动脉。在主动脉凸侧分支的第一和第二分支之间，将6-0丝线穿过主动脉弓并将特制的光滑不锈钢圆管(直径0.75mm)沿主动脉方向与分离的主动脉弓一起结扎，随即小心拔除该圆管，造成升主动脉环行缩窄，之后逐层缝合，缩窄后的血管直径约为原血管直径1/3左右。术后镇痛，保温，密切观察动物状态。
5.2实验动物筛选和分组
术后一周内，将所有大鼠进行超声检测，计算主动脉弓部血流速度，选择血流速度均一且稳定为3m/s的动物进行实验。其中，对照组分配动物12只，阳性药物(倍他洛克)组分配动物10只，测试药物(化合物2)组分配动物10只。
5.3药物处理
造模1周后，各组按照如下方案进行处理，每日1次，连续4周。
5.4药效评价
每周2次称取大鼠体重；
超声检测：术后1周(给药前)检测1次，给药2周检测1次，给药4周后取材前检测1次；
心脏取材，进行病理实验，HE染色、马松染色。
在以下表5中示出了大鼠压力超负荷型心肌肥厚、心衰模型在各测试时间点的左心室舒张(LVID；d)和收缩末期内径(LVID；s)。在图8A和图8B中也示出了大鼠左室舒张末期内径和左室收缩末期内径的比较图。可以看出，在造模后各组动物的左室内径随着造模时间呈现扩大的趋势，这表明，心肌在过度的容量负荷作用下，室壁张力持续增加，心肌肌节呈串联性增生，心肌细胞增长，心腔容积增大，这个指标指征从心肌肥厚过渡到心衰的进程。在给药后，对照组的心室内径较其它各组更大，增大趋势也更为明显，而阳性药物组和测试药物组的心室内径变化不明显，尤其是测试药物组心室内径变化更为微小，预示本申请的化合物对大鼠心衰进程有一定缓解作用。从给药2周起至给药4周后，高剂量组与对照组比较均有显著性差异(p<0.05p<0.01)。
表5
p<0.05*,p<0.01**
在以下表6中示出了大鼠压力超负荷型心肌肥厚心衰模型在各测试时间点的左室舒张末期容积(LV Vol；d)和收缩末期容积(LV Vol；s)。在图9A和图9B中也示出了大鼠左室舒张末期容积和左室收缩末期容积的比较图。可以看出，各组在主动脉弓缩窄手术后，初始阶段心脏会因为压力超负荷导致心室壁代偿性增厚，心功能也出现代偿性增强，当进入失代偿期后，心脏收缩及舒张力减弱，心室容积逐渐扩大，动物逐渐进入心衰阶段。给药2周后，对照组已经进入失代偿期，心室容积显著升高，而测试药物组心室容积升高不显著，可见测试药物组对动物的心功能有一定改善作用，减缓了心衰的发展进程。给药2周后，与对照组相比，测试药物组的左室舒张末期容积有显著性差异(p<0.01)，给药4周后，与对照组相比，测试药物组的左室舒张和收缩末期容积均有显著性差异(p<0.01)。
表6
p<0.05*，p<0.01**
在以下表7中示出了大鼠压力超负荷型心肌肥厚心衰模型在各测试时间点的射血分数(EF)和短轴缩短率(FS)。在图10A和图10B中也示出了大鼠的射血分数和缩短分数的比较图。可以看出，各组在主动脉弓缩窄手术后，初始阶段心脏会因为压力超负荷导致心室壁代偿性增厚，心功能也出现代偿性增强，当进入失代偿期后，心功能开始有所降低。从给药2周后开始至给药4周后，对照组已经进入失代偿期，EF和FS值均未持续升高；阳性药物组的EF和FS值出现了一定的下降；而测试药物组则维持较高的水平，并未出现下降。可见测试药物对动物的心功能有一定改善作用，并且减缓了心衰的发展进程。
表7
综上所述，本文提供的化合物对于动物的心功能有一定的改善作用，减缓了心室重构和心衰的发展。
实施例6：对稳定过表达的hERG通道电流的影响
6.1细胞培养
采用了稳定表达hERG钾通道的HEK-293细胞系，hERG钾通道细胞商购自Creacell公司(货号：A-0320)。hERG钾通道稳定表达的HEK293细胞系在含有10％胎牛血清及0.8mg/mL G418的DMEM培养基中培养，培养温度为37℃，二氧化碳浓度为5％。
除去旧培养基并用PBS洗一次，然后加入1mL TrypLE
6.2膜片钳检测
检测之前将细胞用TrypLE
全细胞膜片钳记录hERG钾电流的电压刺激方案如下：当形成全细胞封接后细胞膜电压钳制于-80mV。钳制电压由-80mV除极至-50mV维持0.5s(作为漏电流检测)，然后阶跃至30mV维持2.5s，再迅速恢复至-50mV维持4s可以激发出hERG通道的尾电流。每隔10s重复采集数据，观察药物对hERG尾电流的作用。以0.5s的-50mV刺激作为漏电流检测。试验数据由EPC-10放大器(HEKA)进行采集并储存于PatchMaster(HEKA)软件中。
用微电极拉制仪将毛细玻璃管拉制成记录电极。在倒置显微镜下操纵微电极操纵仪将记录电极接触到细胞上，给予负压抽吸，形成GΩ封接。形成GΩ封接后进行快速电容补偿，然后继续给予负压，吸破细胞膜，形成全细胞记录模式。然后进行慢速电容的补偿并记录膜电容及串联电阻。不给予漏电补偿。
当全细胞记录的hERG电流稳定后开始给药(包括阳性药物西沙比利和测试药物化合物2)，将如以下所示的药物浓度作用至5min(或者电流至稳定)后检测下一个浓度，每一个测试化合物检测两个浓度。将铺有细胞的盖玻片置于倒置显微中的记录浴槽中，测试化合物以及不含化合物的外液利用重力灌流的方法从低浓度到高浓度依次流经记录浴槽从而作用于细胞，在记录中利用真空泵进行液体交换。每一个细胞在不含化合物的外液中检测到的电流作为自己的对照组。每个浓度至少使用两个细胞独立重复检测两次。所有电生理试验在室温下进行。
在以下表8和表9中示出阳性药物西沙比利和测试药物化合物2对hERG电流的抑制比例结果。
表8
表9
在本申请中，使用通用的标准来判断对hERG的抑制效应：
极强抑制：IC
强抑制：0.1μM≤IC
中度抑制：1μM 弱抑制或无抑制：IC 抑制hERG编码的快速激活钾通道会引起复极时间延长，在心电图中表现为QT间期延长，称为QT间期综合征。很多药物因为引起QT间期延长而退出中国市场。根据以上数据，阳性药物西沙比利IC 实施例7：心肌梗死模型药效实验 7.1测试材料 测试药物：化合物2。用生理盐水配置化合物2的口服溶液，浓度为10mg/ml，配制完成后在1.5小时内使用，以75mg/kg灌胃给药。 阳性药物：盐酸普萘洛尔，江苏亚邦爱普森药业有限公司。批号：E210630；生产日期：20210620；有效期：36个月；规格10mg/片。适应症：作为二级预防，降低心肌梗死死亡率、高血压、劳力性心绞痛、控制室上性快速心律失常、室性心律失常、肥厚性心肌病、嗜铬细胞瘤。用生理盐水配置阳性药物的口服溶液，浓度为1.8mg/ml，以18mg/kg灌胃给药。 实验动物：动物品系：C57BL/6j小鼠；等级：SPF级；周龄：8周；性别：雄性60只；动物生产单位：斯贝福(北京)生物技术有限公司 7.2测试方法 将60只小鼠普通饲料适应性喂养一周后，进行结扎冠脉左前降支手术构建心肌梗死模型。手术结扎冠脉左前降支后心电图显示为明显的ST段抬高，证明模型构建成功，将模型构建成功的动物分组，分为对照组(20只)、阳性药物组(20只)、测试药物组(20只)。阳性药物组用盐酸普萘洛尔的口服溶液以18mg/kg进行灌胃给药，每天一次；测试药物组用化合物2的口服溶液以75mg/kg进行灌胃给药，每天一次。 7.3测试检测指标 ①超声检测：术后3天、术后14天 测量左室收缩末期内径、左室舒张末期内径、左室后壁收缩末期厚度、左室后壁舒张末期厚度、左室前壁收缩末期厚度、左室前壁舒张末期厚度、左室射血分数、缩短分数。 ②心肌酶检测：术后3天、术后14天 测量CK-MB(肌酸激酶同工酶)和ctnt(肌钙蛋白)。 ③取材后： 术后3天：病理染色及心肌纤维化评价；冻存组织检测IL-6、TNF-α、TGF-β评价炎性指标。 术后14天：病理染色及心肌纤维化评价、免疫组化CD31染色评价新生血管。 在以下各表中，*p<0.05，**p<0.01。 表10实验期间动物存活率 表11各组小鼠的射血分数(EF)和短轴缩短率(FS) 表11的结果显示，术后3天和术后14天的测试药物组的射血分数(EF)和短轴缩短率(FS)有高于对照组的趋势，但由于标准差太大，并未显现差异性；从病程发展来看，对照组射血分数和短轴缩短率显著降低，阳性药物组和测试药物组的射血分数和短轴缩短率均变化不大，术后14天和术后3天基本一致，因此，测试药物有延缓疾病发展的趋势。 表12各组小鼠的左室前壁的舒张期厚度(LVAW；d)和收缩期厚度(LVAW；s) 表12结果显示，术后3天，测试药物组与对照组相比，左室前壁的舒张期厚度和收缩期厚度均低于对照组，但并未显现差异性；术后14天，测试药物组与对照组相比，左室前壁的舒张期厚度和收缩期厚度均高于对照组，但并未显现差异性；从病程发展看，测试药物组的前壁厚度具有逐渐增厚的趋势。 表13各组小鼠的左室后壁的舒张期厚度(LVPW；d)和收缩期厚度(LVPW；s) 表13结果显示，术后3天，测试药物组的左室后壁的舒张期厚度比对照组低，具有差异性(p<0.05)，左室后壁的收缩期厚度也低于对照组；但术后14天，与术后3天相比，对照组的左室后壁的舒张期厚度和收缩期厚度均呈现出显著变薄的趋势，阳性药物组也呈现出变薄的趋势，但测试药物组并未出现变薄趋势 表14各组小鼠的左心室的舒张期内径(LVID；d)和收缩期内径(LVID；s) 表14结果显示，无论是术后3天还是术后14天，测试药物组、阳性药物组与对照组相比，左心室的舒张期内径(LVID；d)和收缩期内径(LVID；s)的趋势并无明显差异性。 表15各组小鼠的左室舒张末期容积(LV Vol；d)和收缩末期容积(LV Vol；s) 表15结果显示，无论是术后3天还是术后14天，测试药物组、阳性药物组与对照组相比，左室舒张末期容积和收缩末期容积的趋势并无明显差异性。 表16各组小鼠的左室重量(LV Mass)和校正后的左室重量(LV Mass(校正后)) 表16结果显示，术后3天，测试药物组与对照组相比，左室重量低于对照组，具有差异性(p<0.05)；术后14天，测试药物组与对照组相比，左室重量高于对照组。 表17术后3天组织ELISA检测结果 表17结果显示，检测的上述炎性因子均未显示出差异性。 表18术后3天血清心肌酶检测结果 表18结果显示：测试药物组与对照组相比，术后3天，血清中ctnt明显增加，CK-MB并未显现差异性。 表19各组小鼠的胶原容积分数 表19结果显示，测试药物组与对照组相比，术后3天并无明显差异性，但术后14天有低于对照组的趋势，但并未显现差异性。 表20各组小鼠的CD31 /> 表20结果显示，测试药物组与对照组相比，术后14天新生血管数量有高于对照组的趋势，但并未显现差异性。 实施例8：缺血再灌注模型药效实验 8.1测试材料 测试药物：化合物2。用生理盐水配置化合物2的口服溶液，浓度为10mg/ml，配制完成后在1.5小时内使用，以75mg/kg灌胃给药。 阳性药物：依达拉奉，南京先声东元制药有限公司。批号：80-190902；有效日期至：20220907；规格2ml：10mg；用法用量：冠脉结扎术后再灌注前10min，静脉注射1次，注射剂量为：15mg/kg。用生理盐水配置阳性药物的注射溶液，以15mg/kg进行尾静脉注射。 实验动物：动物品系：C57BL/6j小鼠；等级：SPF级；周龄：8周；性别：雄性60只；动物生产单位：斯贝福(北京)生物技术有限公司 8.2测试方法 将60只小鼠普通饲料适应性喂养一周后，根据体重分成对照组(20只)、阳性药物组(20只)、测试药物组(20只)。测试药物组在结扎冠脉左前降支手术前进行预治疗，预治疗以75mg/kg进行灌胃给药，每天1次，连续7天，预治疗结束后所有动物进行结扎冠脉左前降支手术，阳性药物组在再灌注前10分钟进行尾静脉注射依达拉奉。 8.3测试检测指标 ①造模后24小时进行超声检测； ②超声后一部分动物进行TTC+Evans Blue双染以评估心肌梗死面积； ③一部分动物取材，留存心脏，固定组织进行HE染色、荧光tunel+IF染色，冻存组织检测IL-6、IL-1β、ROS、TNF-α评价炎性指标。 表21实验期间动物存活率 在TTC+Evans Blue染色方法中，采集图像后，应用Image-Pro Plus图像分析软件分别计算非梗死区心肌组织、危险区组织和梗死区组织的面积，并用梗死区组织面积与危险区组织面积的比值表示心肌梗死面积百分比。表22列出了各组的心肌梗死面积百分比。测试药物组与对照组相比具有显著降低的梗死面积百分比，且与阳性药物组相当，具有差异性(P<0.05)。 表22各组心肌梗死面积百分比 通过心脏超声测量各组的左室收缩末期内径、左室舒张末期内径、左室后壁收缩末期厚度、左室后壁舒张末期厚度、左室前壁收缩末期厚度、左室前壁舒张末期厚度、左室射血分数、缩短分数。 表23各组小鼠的射血分数(EF)和短轴缩短率(FS) 表23结果显示：测试药物组和阳性药物组的射血分数(EF)和短轴缩短率(FS)明显高于对照组，且测试药物组的射血分数(EF)和短轴缩短率(FS)略高于阳性药物组，但测试药物组具有显著性差异(p<0.01)。 表24各组小鼠的左心室舒张(LVID；d)和收缩末期内径(LVID；s) 表24结果显示：测试药物组和阳性药物组的左心室舒张(LVID；d)和收缩末期内径(LVID；s)明显低于对照组，且测试药物组的左心室舒张(LVID；d)和收缩末期内径(LVID；s)也低于阳性药物组，但测试药物组具有显著性差异(p<0.01)。 表25各组小鼠的左室舒张末期容积(LVVol；d)和收缩末期容积（LVVol；s) 表25结果显示：测试药物组和阳性药物组的左室舒张末期容积明显低于对照组，且测试药物组的左室舒张末期容积也低于阳性药物组，但测试药物组的左室舒张末期容积具有差异性(p<0.05)；测试药物组和阳性药物组的收缩末期容积明显低于对照组，且测试药物组的收缩末期容积也低于阳性药物组，但测试药物组的收缩末期容积具有显著性差异(p<0.01)。 表26各组小鼠的左室重量(LV Mass)和校正后的左室重量(LV Mass(校正后)) 表26结果显示：测试药物组和阳性药物组的左室质量明显低于对照组，且测试药物组的左室质量也低于阳性药物组，但测试药物组具有差异性(p<0.05)。 表27各组小鼠的舒张期左室前壁厚度(LVAW；d)和收缩期左室前壁厚度(LVAW；s) 表27结果显示：测试药物组和阳性药物组的舒张期左室前壁厚度和收缩期左室前壁厚度与对照组相比并无明显变化。 表28各组小鼠的舒张期左室后壁厚度(LVPW；d)和收缩期左室后壁厚度(LVPW；s) 表28结果显示：阳性药物组与对照组相比，舒张期左室后壁厚度和收缩期左室后壁厚度有降低趋势，而测试药物组与对照组相比，舒张期左室后壁厚度和收缩期左室后壁厚度有增加趋势，但并未显现差异性。 表29各组小鼠的炎性指标(活性氧(ROS)、IL-6、IL-1β和TNF-α) 表29结果显示：测试药物组和阳性药物组的各炎性指标均明显低于对照组，且测试药物组的各炎性指标均略高于阳性药物组，但测试药物组和阳性药物组均具有显著性差异(p<0.01)。 综上所述，测试药物可以明显降低小鼠的心肌梗死面积比，还可以显著提高心肌缺血再灌注小鼠的心功能，且明显降低心肌缺血再灌注过程中的验证因子表达。 实施例9：药代动力学研究 9.1在恒河猴体内的药代动力学研究 9.1.1供试品溶液配制 化合物2的口服液：称取50.00mg的化合物2，添加1.00mL DMSO溶解，得到50.00mg/mL的液体1。称取聚乙二醇PEG400(8g)：聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40(1g)质量比8:1，混合均匀，得到液体2。将液体1和液体2按照体积比1:9混合，得到化合物2的口服液，药物浓度5.00mg/mL。现用现配。 化合物2的注射液：称取10.00mg的化合物2，添加1.00mL DMSO溶解，得到10.00mg/mL的液体3。将液体3和液体2以4:1的体积比混合，得到化合物2的混合溶液。将化合物2的混合溶液用注射用水稀释4倍，得到化合物2的注射液，药物浓度0.50mg/mL。现用现配。 9.1.2给药途径及方法 给药途径及频率：灌胃给药/静脉注射，单次给药。恒河猴每组两只，雌1只雄1只，体重约5.5kg。给药前按恒河猴体重及给药剂量计算各动物给药量，剂量：灌胃2.5mg/kg，静脉0.3mg/kg。 9.1.3采血时间点的设置及依据 根据《药物非临床药代动力学研究技术指导原则》，参照前期预实验结果设置采血时间点为：采集给药前0h及给药后0.25、0.5、1、2、4、6、8、24h。 9.1.4样品采集及保存 全血采集处理：后肢静脉采血0.3～0.5mL，加入冰水预冷的带有肝素钠的离心管中，并置于冰浴，以50μL为单位体积分装2份，后立即加入3倍体积(150μL)乙腈，-80℃保存备用。 血浆采集处理：剩余血样加入冰水预冷的带有肝素钠的离心管中，并置于冰浴，静置后离心(4000rpm，10min)，取上层血浆，置于无菌EP管内，-80℃保存备用。 表30静脉注射给药全血血药浓度 表31口服液灌胃给药全血血药浓度 表32静脉注射给药血浆血药浓度 /> 表33口服液灌胃给药血浆血药浓度 绝对生物利用度： F％＝AUClastD 100％＝14.44％ 9.2在大鼠体内的药代动力学研究 9.2.1供试品溶液配制 化合物2的口服液：称取50.00mg的化合物2，添加1.00mL DMSO溶解，得到50.00mg/mL的液体1。称取聚乙二醇PEG400(8g)：聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40(1g)质量比8:1，混合均匀，得到液体2。将液体1和液体2按照体积比1:9混合，得到化合物2的口服液，药物浓度5.00mg/mL。现用现配。 化合物2的注射液：将化合物2的口服液用注射用水稀释5倍，得到化合物2的注射液，药物浓度1.00mg/mL。现用现配。 9.2.2给药途径及方法 给药途径及频率：灌胃给药/静脉注射，单次给药。SD大鼠给药前禁食12h不禁水，给药后4h统一给食，自由饮水。给药前按大鼠体重及给药剂量计算各动物给药量，剂量：灌胃给药5.0mg/kg，静脉注射1.0mg/kg。 9.1.3采血时间点的设置及依据 根据《药物非临床药代动力学研究技术指导原则》，参照前期预实验结果设置采血时间点为：灌胃给药的动物采集时间点为给药前0h及给药后0.25、0.5、1、2、3、5、7、10、24h。尾静脉给药的动物采集时间点为给药前0h及给药后0.083、0.25、0.5、1、1.5、2、3、5、10、24h。 9.1.4样品采集及保存 在计划的采血点，颈静脉取血约0.2mL置于已写上临时编号的肝素钠抗凝管中，12000rpm离心2min分离血浆，取上清置于贴好标签的EP管中，置-20℃冰箱保存。 表34口服给药的相关数据 表35静脉给药的相关数据 绝对生物利用度：F％＝AUClast_D 虽然本发明已经就其具体实施方案进行了描述，但某些修改和等同对于本领域技术人员而言是显而易见的，并且旨在包括在本发明的范围内。