一种类基质囊泡的工具载体及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及病毒分子检测技术领域，特别是涉及一种类基质囊泡的工具载体及其制备方法与应用。

背景技术

血管钙化可以根据其形态和负荷分为微钙化(直径＜100μm)和大钙化(直径≥100μm)。微钙化常呈弥散性的点灶状分布，是易损斑块的重要特征，随着血管的运动和血流的冲击，微钙化会产生较高的局部应力和机械性砂轮效应，易导致斑块的破裂。从力学角度考量，当斑块的周向应力超过了承受极限就会发生斑块的破裂。近期有研究表明微钙化是斑块易损性的重要衡量指标，对斑块内微钙化进行计算机断层扫描的有限元分析显示微钙化可使斑块内拉伸应力提升5倍以上，远超出组织所能承受的强度，随时可能触发斑块破裂。在对微钙化进行相关研究时，除了关注微钙化的程度及其对斑块稳定性的危害外，研究人员也对微钙化起源进行了探索。促钙化信号刺激下血管平滑肌细胞会发生成骨分化并释放具有矿化能力的磷脂双分子层囊泡(100-300nm)，由于这些囊泡广泛分布于胞外基质中，故而被称为基质囊泡(matrix vesicle)。目前的研究观点认为基质囊泡是微钙化的起始位点，基质囊泡被释放至胞外后，会附着于胶原基质支架，继而发生富集、融合并矿化成核，为微钙化的形成提供了便利。然而目前对基质囊泡的功能特性知之甚少，尤其是基质囊泡中各组分所起的作用仍不明晰，因此需要构建新的工具载体进行基质囊泡的相关科研探索。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种类基质囊泡的工具载体，组分包括二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸和DSPE-PEG2000-罗丹明。

本发明还提供了上述工具载体的制备方法，包括以下步骤：

(1)将二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸和DSPE-PEG2000-罗丹明溶解于有机溶剂中，再加入稳定剂以稳定合成结构；

(2)转移至反应容器中旋转蒸发直至在底部成膜，悬浮在储备缓冲液中孵育；

(3)经超声和脂质体挤出器系统挤出悬浮液，除去未负载的DSPE-PEG2000-罗丹明，即可得到仿生基质囊泡。

进一步的，所述二棕榈酰磷脂酰胆碱与二棕榈酰磷脂酰丝氨酸的摩尔比为9:1，所述DSPE-PEG2000-罗丹明与二棕榈酰磷脂酰丝氨酸的摩尔比为1:30。

进一步的，所述有机溶剂包括氯仿。

进一步的，所述稳定剂包括天然磷脂HSPC和胆固醇；所述天然磷脂HSPC与二棕榈酰磷脂酰丝氨酸的摩尔比为1:1，所述胆固醇与二棕榈酰磷脂酰丝氨酸的摩尔比为1:1。

进一步的，所述旋转蒸发的温度为28-32℃，转速为70-90rpm。

进一步的，所述储备缓冲液为含2mmol/L MgCl2的Tris-HCl缓冲液，pH7.5；悬浮后脂质体浓度为1.5mg/mL。

进一步的，所述孵育条件为在70℃下孵育1h，并以10min的间隔涡旋。

进一步的，所述超声条件为100W、pulse 20％、20s/次、共10次；所述脂质体挤出器系统为孔径为200nm的滤膜；所述除去未负载的DSPE-PEG2000-罗丹明的方法为用纳米透析装置透析以除去未负载的DSPE-PEG2000-罗丹明；所述纳米透析装置孔径为50nm的聚碳酸酯膜。

本发明还提供了上述类基质囊泡的工具载体在制备斑块内微钙化研究材料中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明以二棕榈酰磷脂酰胆碱和二棕榈酰磷脂酰丝氨酸作为构建仿生基质囊泡的主要原料，将二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸和DSPE-PEG2000-罗丹明溶解于有机溶剂中，再加入稳定剂以稳定合成结构；转移至反应容器中旋转蒸发直至在底部成膜，悬浮在储备缓冲液中孵育；经超声和脂质体挤出器系统挤出悬浮液，除去未负载的DSPE-PEG2000-罗丹明，即可得到仿生基质囊泡。本发明所述仿生基质囊泡可以模拟基质囊泡的磷脂膜双分子层结构，具有基质囊泡理化性质，具有模拟基质囊泡矿化成核的特征，从而为探索基质囊泡中各组分的功能提供必要载体。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为天然磷脂HSPC结构；

图2为二棕榈酰磷脂酰胆碱结构；

图3为二棕榈酰磷脂酰丝氨酸结构；

图4为DSPE-PEG2000-罗丹明；

图5为仿生基质囊泡的荧光光谱；

图6为仿生基质囊泡的纳米粒度仪检测粒径分布；

图7为以仿生基质囊泡为载体构建的功能性基质囊泡；

图8为以仿生基质囊泡为载体的功能性基质囊泡的胶原耦联活性。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂或原料，如未特别说明，均购自商业渠道或是已公开。

实施例1罗丹明红色荧光标记仿生基质囊泡脂质体构建

将16.3mg二棕榈酰磷脂酰胆碱(dipalmitoylphosphatidylcholine,DPPC)、1.8mg二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(dipalmitoylphosphatidylserine,DPPS)和1.4mg DSPE-PEG2000-罗丹明溶解于3mL氯仿中，DPPC与DPPS的摩尔比为9:1，另加入天然磷脂HSPC 2.1mg和胆固醇0.8mg以稳定合成结构，天然磷脂HSPC的结构如图1所示，DPPC结构如图2所示，DPPS结构如图3所示，DSPE-PEG2000-罗丹明结构如图4所示。

共同转移至茄形烧瓶中，在30℃下，按80rpm转速旋转蒸发直至在瓶底成膜，并悬浮在储备缓冲液(pH7.5，含2mmol/L MgCl

实施例2仿生基质囊泡脂质体性质检测

2.1取10uL脂质体溶液，加入曲拉通x-100破膜，通过荧光分光光度计测定其荧光光谱，如图5所示，该光谱与DSPE-PEG2000-罗丹明一致。

2.2纳米粒度分析仪鉴定仿生基质囊泡模型的平均粒径为187nm，粒径分布PDI为0.19，Zeta电位为-37.23mV(如图6所示)，提示该模型是稳定的同质体系。

2.3激光共聚焦显微镜下观测仿生基质囊泡结构，并以该仿生基质囊泡为载体，通过蛋白直接插入法构建具有功能属性的基质囊泡模型，如图7所示，红色荧光为仿生基质囊泡，绿色荧光为基质囊泡蛋白组分，共同构建的功能性基质囊泡可以为明确该蛋白功能提供信息。

2.4基于该仿生基质囊泡构建的功能性基质囊泡被用于研究基质囊泡与胶原的互作特性。仿生基质囊泡载体和功能性基质囊泡被加入到胶原铺板中共培养，24h后检测仿生基质囊泡载体和功能性基质囊泡与胶原的耦联情况。如图8所示，仿生基质囊泡形态上与现实中的基质囊泡相似，均呈囊泡状，且以该载体构建的功能性基质囊泡可以模拟现实中基质囊泡的胶原耦联特性。

上述试验结果表明，基质囊泡膜中中性的磷脂酰胆碱和阴性的磷脂酰丝氨酸是其主要成分，因此通过二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和二棕榈酰磷脂酰丝氨酸(DPPS)作为构建仿生基质囊泡的主要原料，可以模拟基质囊泡的磷脂膜双分子层结构。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。