适用于大肠杆菌发酵生产L-苯丙氨酸的组方及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其是适用于大肠杆菌发酵生产L-苯丙氨酸的组方及其应用。

背景技术

L-苯丙氨酸(L-Phenylalanine，L-Phe)与L-酪氨酸(L-tyrosine，L-Tyr)、L-色氨酸(L-tryptophan，L-Trp)同属芳香族氨基酸，为莽草酸途径产物之一，可作为新型甜味剂阿斯巴甜的合成前体，也可作为抗癌药物的载体，在食品与医药方面具有极大的应用价值，目前常采用微生物发酵法获取。

微生物利用葡萄糖等为碳源合成L-Phe的代谢途径较长，需要经过糖酵解途径(EMP)、柠檬酸循环(TCA)、戊糖磷酸途径(PPP)与莽草酸途径(shikimic acid pathway)，其中多个关键酶与L-Phe的合成关系密切。金属离子作为重要的酶激活剂，其种类与用量影响到关键酶酶活力的强弱进而影响到L-Phe产量与糖酸转化率。金属离子对酶的激活/抑制作用机理错综复杂，表现为：不添加或添加过少的金属离子无法对酶起激活作用，如5-10×10

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种适用于大肠杆菌发酵生产L-苯丙氨酸的组方。

本发明所要解决的技术问题在于提供一种应用上述组方发酵生产L-苯丙氨酸的方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种适用于大肠杆菌发酵生产L-苯丙氨酸的组方，功效成分由CaCl

优选的，上述适用于大肠杆菌发酵生产L-苯丙氨酸的组方，所述CaCl

优选的，上述适用于大肠杆菌发酵生产L-苯丙氨酸的组方，各组分用量为CaCl

优选的，上述适用于大肠杆菌发酵生产L-苯丙氨酸的组方，所述生物素(V

优选的，权利要求1所述组方发酵生产L-苯丙氨酸的方法，其特征在于：采用菌株为大肠杆菌，具体步骤如下：

(1)发酵所需基础培养基为：葡萄糖30g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨1g/L，柠檬酸1.2g/L，MgSO

(2)摇瓶培养：摇瓶培养基如(1)所示，并根据需要添加不同种类与用量的权利要求1中的功效成分，以确定最适组方。培养方法为：接种量10％，以苯酚红作酸碱指示剂，过程使用注射器注射氨水调节pH(7.0)，培养36h；

(3)种子罐培养：种子培养基如(1)所示，且不添加功效成分。培养方法为：初始发酵液发酵温度为37℃，初始通气量为1.6L/min，初始搅拌转速为200r/min，后期调节通气量与转速维持DO在50％左右，通过流加25％氨水调节发酵液pH为6.8～7.0，OD600 nm＞25时接发酵；

(4)分批补料发酵培养：发酵培养基如(1)所示，同时根据需求添加权利要求1、2中的组方，混匀后使用。培养方法为：接种量为20％～30％，发酵温度为37℃，初始通气量为0.65L/min，初始搅拌转速为200r/min，后期调节通气量与转速维持DO在35-50％，当溶氧低于35％时交替提高转速和风量，通过流加氨水控制pH为7.0，当发酵罐残糖降到0.5-1.0g/L时开始补充80％浓度葡萄糖溶液，且保持后续发酵阶段亚适量控糖。

上述适用于大肠杆菌发酵生产L-苯丙氨酸的组方的制备方法，具体步骤如下：

(1)CaCl

(2)磷酸吡哆醛(PLP)、维生素B2(V

(3)将步骤(1)、(2)各组分混合均匀，即得。

优选的，上述适用于大肠杆菌发酵生产L-苯丙氨酸的组方的制备方法，存在生物素(V

有益效果：

本发明所述适用于大肠杆菌发酵生产L-苯丙氨酸的组方对L-Phe发酵中使用的微量元素(Mg

所述组方首次将VB2用于L-Phe的发酵，并取得了有益效果，首次优化了CoCl

所述发酵方法可以达到加快菌体生长繁殖，提高生物量，延长生物量稳定期与产酸高峰期，提高L-苯丙氨酸产量与转化率，节约成本等目的。

附图说明

图1为单一微量元素对L-Phe产量的影响。

图2为单一微量元素对生物量的影响。

图3为微量元素缺失对发酵的影响。

图4为微量元素缺失对酶活力的影响。

图5为耗糖速率与生物量过程变化图。

图6为实时转化率与产量过程变化图。

图7为副产物产量对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。

下述实施例中采用的大肠杆菌生产菌购自天津科技大学的代谢工程实验室。

实施例1

本实施例使用摇瓶培养，测评单一微量元素时对发酵的影响：

以大肠杆菌为生产菌株，以生物量、L-苯丙氨酸产量、糖酸转化率、副产物产量、酶活力为测评指标，生物量检测方式为：每隔2h取样，适当稀释至吸光值可测浓度范围(0.2-0.9)，用紫外可见分光光度计测量样品在600nm波长处吸光值；L-苯丙氨酸、丙氨酸(L-Ala)、乙酸产量采用LC20AT高效液相色谱仪测定，谷氨酸检测采用SBA生物传感分析仪测定；酶活定义方式为每g鲜重菌体在每mL反应体系中每h产生1μmoL产物定义为1个酶活力单位(μmoL/(h.g鲜重))；糖酸转化率计算方法为总产酸量/总耗糖量。

表1微量元素及其用量

按表1所示微量元素设置10组实验，每组添加单一微量元素，设置5个浓度梯度与三个平行实验，实验结果取三组平行试验平均值，结果如图1、2所示。

如图1所示，实验涉及的10种微量元素对L-Phe产量的影响主要有四种形式，以CuSO

如图2所示，FeSO

实施例2

本部分使用摇瓶培养，以大肠杆菌为生产菌株，探究缺失单一微量元素时对发酵的影响：

综合实施例1中的实验结果，认为CaCl

如图3所示，从生物量差异来看，FeSO

实施例3

本部分使用摇瓶培养，以大肠杆菌为生产菌株，探究微量元素对酶活的影响。

根据实施例2中实验结果，可以得出CoCl

对照组DAHP酶活力为4347.3μmoL.(h.g)

实施例4

本实施例使用摇瓶培养，以大肠杆菌为生产菌株，利用正交实验对微量元素用量进行进一步优化。

根据实施例1、2、3中的结果得知，实验涉及的10种微量元素对提高L-Phe产量的影响顺序为：MnSO

表2正交实验因素水平表

表3L-Phe产量正交实验结果

根据表3所示，因素FeSO

表4 L-Phe糖酸转化率正交实验结果

由表4可知，因素FeSO

综合L-Phe产量与糖酸转化率来看，FeSO

CoCl

实施例5

本实施例使用5L发酵罐培养，以大肠杆菌为生产菌株，进行发酵罐验证实验，包括种子罐培养与分批补料发酵培养。

实施例1、2、3、4确定了生物素对L-phe发酵的不利影响，并通过单因素实验确定了其余9种微量元素的添加量，分析得知了影响关键酶活的关键微量元素，并通过正交实验进一步优化了关键的5种微量元素，但由于摇瓶发酵具有较大的局限性，因此在之前实验的基础上，以大肠杆菌为生产菌株，以CaCl

由图5可知，实验组生物量与耗糖速率在发酵过程中始终高于对照组，最大生物量122.8远远大于对照组最大生物量101.3，达到最大耗糖速率的时间比对照组提前了4h，但在数值上相近；在发酵进行到34h时，对照组生物量开始呈现下降趋势，耗糖速率也呈现大幅度的下滑，此时实验组生物量与耗糖速率均处于稳定期；当发酵进行到40h，对照组几乎无法继续摄糖，生物量持续下降，无法继续进行发酵，此时实验组生物量依据处于稳定期，但耗糖速率有所下降；发酵50h，实验组生物量依旧没有明显的下降趋势，但此时耗糖速率下降严重，因此结束发酵，发酵周期较对照组延长了10h。

由图6可知，当微量元素缺陷时，L-Phe产量总体偏低，且增加趋势平稳，最终产量为56.4g/L，这与转化率曲线趋势大致相同，整体呈上升趋势，在22-26h出现下降趋势，这是因为L-Phe在临近结晶浓度时会形成松软的假晶体状态，同时伴随大量的发酵泡沫，此时难以继续生成L-Phe，但菌体持续耗糖，导致转化率下降；实验组产量在经历了0-20h的缓慢积累后，在20-35h达到了产酸的高峰期，之后增长速度减缓，但总量依旧在增长，最终产量为85.4g/L，较对照组增加了51.4％。实验组实时转化率曲线波动程度较对照组较大，在0-6h急剧上升，由于种子液培养时间较长，因此在接发酵后菌体立即开始产酸，且此时菌体扩增速度较缓慢，转换率急剧上升，在6h后，生物量开始迅速增加，虽然产酸也在增加，但大部分葡萄糖用于菌体生长，因此糖酸转化率呈现下降趋势，在24h前后，产量接近结晶浓度，与对照组相同，此时转化率进一步下降，当L-Phe结晶后，菌体进入产酸高峰期，此时转化率与产量均迅速增加，直至发酵后期(40h后)产酸速率再次减缓，但耗糖速率下降并不明显，转化率再次降低，最终转化率为26.3％，远大于对照组的21.4％，即使实验组转化率曲线波动较大，但在整个发酵过程中，实时转化率均高于对照组，因此实验组更具优势。

如图7所示，实验组产生了0.8g/L的乙酸、1.2g/L的谷氨酸(L-Glu)与0.2g/L的色氨酸(L-Trp)，均不会对菌体的生长代谢以及后续提取造成影响。对照组乙酸含量为6.7g/L，此时的乙酸含量可严重影响菌体的生长代谢，是对照组发酵后期生物量迅速下降的主要原因；谷氨酸与色氨酸含量达到了3.3g/L、1.4g/L，分别比对照组增加了175％、600％，既影响转化率，又提高了后续分离提取难度；对照组发酵液中检测出来了丙氨酸(1.8g/L)，这在实验组并未检出，推测是由于莽草酸途径关键酶活力不够，导致糖酵解途径大量积累丙酮酸，而丙酮酸作为丙氨酸的直接前体，经过一步反应即可生成丙氨酸。

结果表明，优化后的微量元素种类及用量提高了L-苯丙氨酸的产量糖酸转化率，提高了产品竞争力。

实施例6

本实施例使用5L发酵罐培养，以大肠杆菌为生产菌株，进行发酵罐验证实验，包括种子罐培养与分批补料发酵培养。

一种适用于大肠杆菌发酵生产L-苯丙氨酸的组方，功效成分由CaCl

上述组分的具体制备方法如下：

分别使用分析天平精准称取CaCl

应用上述组方发酵生产L-苯丙氨酸的方法，具体步骤如下：

(1)从-80℃冰箱取出菌株，在超净台内使用接种环将液体菌均匀的划在LB固体培养基上，37℃倒置培养12h，共传代两次。

(2)5L种子罐培养：使用0.9％的无菌生理盐水从固体斜面上将菌洗下，接入种子罐培养，初始发酵液体积为3L，发酵温度为37℃，初始通气量为1.6L/min，初始搅拌转速为200r/min，后期调节通气量与转速维持DO在50％左右，通过流加25％氨水调节发酵液pH为6.8～7.0，OD600 nm＞25时接发酵；种子培养基为：葡萄糖30g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨1g/L，柠檬酸1.2g/L，MgSO

(3)5L罐分批补料发酵培养：接种量为25％，发酵温度为37℃，初始通气量为0.65L/min，初始搅拌转速为200r/min，后期调节通气量与转速维持DO在35-50％，当溶氧低于35％时交替提高转速和风量，通过流加氨水控制pH为7.0，当发酵罐残糖降到0.5-1.0g/L时开始补充80％浓度葡萄糖溶液，且保持后续发酵阶段亚适量控糖，直至发酵结束。发酵培养基为：葡萄糖30g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨1g/L，柠檬酸1.2g/L，MgSO

最终实验结果为：L-苯丙氨酸产量为85.4g/L，糖酸转化率为26.3％，生物量为122.8，副产物丙氨酸、谷氨酸、色氨酸、乙酸分别为0、1.2、0.2、0.8g/L。

实施例7

本实施例使用5L发酵罐培养，以大肠杆菌为生产菌株，进行发酵罐对比实验，包括种子罐培养与分批补料发酵培养。

一种适用于大肠杆菌发酵生产L-苯丙氨酸的组方，功效成分由CaCl

以大肠杆菌为生产菌，发酵步骤同实施例6，检测分析方法同实施例1，上述组分的制备方法参照实施例6，另外使用分析天平精准称生物素(V

最终实验结果为：L-苯丙氨酸产量为78.6g/L，糖酸转化率为24.8％，生物量为117.6，副产物丙氨酸、谷氨酸、色氨酸、乙酸分别为0、2.4、2.1、1.3g/L。

实施例8

本实施例使用5L发酵罐培养，以大肠杆菌为生产菌株，进行发酵罐对比实验，包括种子罐培养与分批补料发酵培养。

一种适用于大肠杆菌发酵生产L-苯丙氨酸的组方，功效成分由CaCl

以大肠杆菌为生产菌，发酵步骤同实施例6，检测分析方法同实施例1，上述组分的制备方法参照实施例6，另外使用分析天平精准称生物素(V

最终实验结果为：L-苯丙氨酸产量为81.4g/L，糖酸转化率为25.4％，生物量为103.2，副产物丙氨酸、谷氨酸、色氨酸、乙酸分别为0.6、1.3、0.8、1.5g/L。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，本发明菌株的构建步骤不分先后顺序，本技术领域技术人员以本发明的方法或以本方法为基础进行的菌种改造等改进和润饰均视为本发明的保护范围。