一种非均相生物催化丝氨酸的生产方法

技术领域

本发明涉及生物催化生产的技术领域，尤其是涉及一种非均相生物催化丝氨酸的生产方法。

背景技术

丝氨酸是一种非必需氨基酸，它在脂肪和脂肪酸的新陈代谢及肌肉的生长中发挥着作用，因为它有助于免疫血球素和抗体的产生，维持健康的免疫系统也需要丝氨酸。丝氨酸在细胞膜的制造加工、肌肉组织和包围神经细胞的鞘的合成中都发挥着作用。

L-丝氨酸是氨基酸输液的重要成分，化妆品的添加剂，酶法生产色氨酸的前体物质。由于L-丝氨酸处于其他几种氨基酸、核苷酸、和磷脂的合成代谢的中间位置，较其他氨基酸来说，它的体内代谢运转速度极快。因此，直接发酵生产L-丝氨酸是很困难的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种非均相生物催化丝氨酸的生产方法，解决了现有技术中生产丝氨酸比较困难的技术问题。

发明方案：

本发明提供了一种非均相生物催化丝氨酸的生产方法，包括以下步骤：

S1、菌种选育：将丝氨酸产生菌在选育培养基中进行培养，筛选出具有酶活较高的菌体；

S2、发酵：将选育的菌种投入发酵培养基中发酵，在发酵1.5h后开始向发酵罐中流加诱导剂，在发酵结束前1h流加完，发酵2h后开始补加培养基，发酵前1h补完，发酵6-7h后得发酵液，对发酵液离心最后得菌体；

S3、菌体处理：采用催化空气氧化的方法对菌体进行破壁处理；

S4、转化：将处理好的菌体加入反应器搅拌，加入磷酸缓冲液溶解的磷酸吡哆醛，避光通氮气30min.，加入甘氨酸于反应器中，用NaOH调PH处于6.8-7.0，用纯水溶解半胱氨酸加入反应器，取辅酶、巯基乙醇投入反应器，加入多聚甲醛于反应器中反应，反应温度为40-41℃，反应时间为27-29h；

S5、分离转化液：用离子交换法对转化液进行分离得到丝氨酸解析液；

S6、解析液处理：将丝氨酸解析液初步浓缩、脱色和过滤，将滤液浓缩至干用乙醇浸泡，对浸泡液进行抽滤干燥即得丝氨酸产品。

进一步的，发酵中，所述诱导剂采用0.5%乳糖。

进一步的，菌体处理时，将菌体加入高压反应釜中，加入1%的十二烷基三甲基溴化铵，充入压缩空气保压0.3Mpa，温度42℃，搅拌220转/min，破壁6h。

进一步的，转化中，所述辅酶采用四氢叶酸。

进一步的，分离转化液时，采用732树脂进行分离。

有益效果：

本发明提供了一种非均相生物催化丝氨酸的生产方法，其中，非均相生物催化丝氨酸由于利用了甘氨酸和甲醛特异的合成L-丝氨酸的技术线路，具有原料来源方便，原料成本低和可合成高浓度产品的优点。

具体实施方式

本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本实施例提供了一种非均相生物催化丝氨酸的生产方法，其中，非均相生物催化丝氨酸的方法中，由于利用了甘氨酸和甲醛特异的合成L-丝氨酸，具有原料来源方便，原料成本低和可合成高浓度产品的优点。

具体包括以下内容：

菌种选育

此过程与一般的菌种选育过程相似，在加入氨苄的LB培养基中，划单菌落，在恒温生化培养箱内培养，筛选出具有酶活较高的菌体。

培养基组成：蛋白胨1%，酵母粉0.5%，Nacl1%，固体培养基加2%琼脂粉。

发酵

1.根据试验确定培养基的组成部分,确定了最佳PH值在6.8~7.0，发酵温度，36-37℃。

种子培养基：玉米浆2%，味精1%，硫酸镁0.05%，磷酸氢二钾0.05%；

主发酵培养基：玉米浆3%，味精1.5%，硫酸镁0.05%，磷酸氢二钾0.05%；

补料培养基：玉米浆2%，味精1%

诱导剂：乳糖0.5%

2.发酵控制

溶氧：通过调节转速及通气量，在开始发酵时控制溶解氧在30%~15%左右，最后两小时在10%左右，转速及通气量应交错调整上升。

3．诱导剂选择

采用IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）与乳糖作为诱导剂进行试验，在以IPTG作为诱导剂时菌体在存放过程中存在自溶现象，分析可能是在诱导表达过程中外源蛋白表达量过大，造成细菌其它方面的营养缺乏，以致细菌细胞壁不完整，引起细菌的脆弱和自溶；而采用乳糖作为诱导剂大部分细菌完好无损，蛋白高效表达，适用于本生产。

最终确定以0.5%乳糖作为诱导剂，在发酵1.5h后开始向发酵罐中流加诱导剂，在发酵结束前1小时流加完，菌体蛋白表达效果明显。

4.发酵2小时后开始补加培养基，发酵前1小时补完。发酵6-7小时后发酵结束,放出菌液，离心，最后得湿菌体用85%生理盐水洗涤菌体之后,将菌体悬浮于PH7.0的0.1M磷酸缓冲液中（加缓冲液的量能把菌体混匀即可）置于-18℃环境中冷冻备用。

5．发酵刚开始时因为菌消耗糖PH值下降，用2NHCL控制PH在6.9~7.2；加诱导剂后PH值会下降，生产变慢。

菌体处理

通过试验，采用催化空气氧化、0.3Mpa使菌体破壁的方法，酶活较高。

在37℃恒温水浴中将冷冻菌体解冻，取菌体，用纯水定容。加入1%的十二烷基三甲基溴化铵，将其投入高压反应釜中，充入压缩空气保压0.3Mpa，42℃，220转/min，破壁6h。

转化

1.处理好的投入反应器中，开动搅拌100转/min，根据酶活性在25℃~50℃之间随温度的升高而加强，通过试验确定最终反应温度为40℃，加入0.1M磷酸缓冲液溶解的磷酸吡哆醛，避光通氮气30min。

2.加入甘氨酸于反应器，用2MNaOH调PH6.8-7.0，由于辅酶与甲醛反应对PH值有很强的依赖性，其为保证最大酶活则确定最佳PH为6.8-7.0。

3.用纯水溶解相应剂量的半胱氨酸，加入反应器；

4.取辅酶四氢叶酸、巯基乙醇投入反应器；

5.因甲醛是一种蛋白变性剂，甲醛浓度过高对酶有失活作用，为保证转化反应的顺利进行，通过试验本工艺采用多聚甲醛替代乌洛托品和甲醛效果较好，多聚甲醛在溶液中缓慢释放出甲醛，形成非均相转化体系，既避免了甲醛投入过多使酶失活问题，又保证了反应体系中甲醛的量，提高了酶催化反应效率。

6.控制PH值在7.0左右，反应温度40-41℃，如可采用40℃或41℃，根据试验结果确定反应时间27-29小时，如可采用28小时。

检测

1.OD检测

取发酵液0.5ml，加水稀释到5ml(稀释10倍)，用上清（发酵液离心所得）做空白，以752型分光光度计在600nm处测A值。

OD（0-6）稀释10倍

OD（6-10）稀释15倍

OD（10-14）稀释20倍

OD（14-18）稀释25倍

OD（18-22）稀释30倍

OD（22-以上）稀释35倍

2.酶活测定

2.1.逆向酶活测定

羟醛缩合酶可催化DL-苯基丝氨酸水解成苯甲醛和甘氨酸，此反应中羟醛缩合酶不需要四氢叶酸作为辅酶因子。

用移液器吸取1ml发酵液于12000rpm离心60s弃上清得菌体，（当OD）〉3时，取发酵液量取3/OD。用移液器吸取1ml去离子水洗净，同法离心弃上清，得菌体。菌体中加入1ml0.1M的PLP溶液，混匀，于30℃摇床振荡避光反应1h离心，得上清12000rpm60s。取0.5ml上清液用纯水在容量瓶中定容至50ml，用分光光度计于279nm处测其A值，用移液器吸取0.5ml0.1M的PLP溶液加纯水定容至50ml做空白。

酶活E=AE2od=4E/ODOD>3时，E2od=A（4/3OD）

2.2.层析

展开剂：正丁醇：丙酮：水：二乙胺=10：10：5：2

在转化率（以加甲醛量计）为50%时及下罐时取样点层析，检测转化结果。

吸取转化液1ml至离心管，煮沸3min离心，取上清液，分别稀释10倍、20倍，将1%的Gly溶液、稀释10倍上清、稀释20倍上清、1%Ser溶液各取5µl，在层析纸上点样，之后放入层析缸中展层析，之后取出用吹风机吹干，喷1%茚三铜/乙醇溶液吹干显色，比较斑点大小，分析转化率。

分离与处理

由于丝氨酸与甘氨酸的等电点相近，PIGly=5.96，PISer=5.69，溶解度相差不大，分离较为困难，故采用离子交换法进行分离，在试验初期采用717树脂进行分离，分离效果不理想，丝氨酸、甘氨酸混组分解析液较多，之后采用732树脂进行分离，分离效果较好。

1.将转化液在离心机中离心使细胞沉淀分离，取上清液，再用纯水洗涤滤渣两次，离心，去上清，将两次上清液混合得到上柱液，滤渣弃去。

2.将处理好的转化液以流量20ml/min的速度上柱，2%茚三铜乙醇溶液检测，待流出液呈紫色反应时停止上柱。

3.停止上柱后以20ml/min的流速纯化水洗至PH≥5时，纯化水洗完毕。

4.纯化水洗毕后，以20ml/min流速，0.2NNaOH溶液进行空白解析，用2%茚三铜乙醇溶液检测，当反应为紫红色时，开始收集丝氨酸，当用2%茚三铜乙醇溶液检测，反应颜色出现变化时，丝氨酸解析完毕。

5.丝氨酸解析完毕后开始收集丝氨酸、甘氨酸混组分，当用2%茚三铜乙醇溶液检测，反应颜色再次出现变化时，混组分解析完毕。

当混组分解析完毕开始解析甘氨酸组分，解析完毕后以20ml/min流速，0.2NNaOH溶液正洗树脂，用2%茚三铜乙醇溶液检测，至颜色消失时清洗完毕。

6.用纯水正洗树脂流量20-24ml/min，当流出液PH≤8时清洗完毕，之后用2NHcl再生树脂，流量20ml/min。之后用纯水正洗树脂，流量20-24ml/min，当流出液PH≥5时，树脂处理完毕，待上柱。

7.丝氨酸、甘氨酸混组分解析液再次上柱。

8.洗脱流速对分离效果的影响

在洗脱液以35ml/min流速时，分离效果不理想；在流速在20ml/min时，分离效果较好，在洗脱液以10ml/min流速解析时，因为流速过慢，分离效果也不理想，因此选择洗脱流速为20ml/min。

9.丝氨酸解析液处理

丝氨酸解析液浓缩到一定体积后，用活性炭85℃左右，脱色30min过滤，滤液浓缩至干后用乙醇浸泡，降温至10℃，抽虑干燥得到丝氨酸解产品。1.投料温度60-70℃，投炭温度80；2.85℃~95℃保温，时间30min；3.结晶终点温度9~11℃；4.沸腾干燥机115~135℃，干燥3小时。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。