一种脆弱拟杆菌灭活菌粉及其制备方法

技术领域

本发明涉及脆弱拟杆菌灭活菌粉的制备和应用技术，特别是一种脆弱拟杆菌灭活菌粉及其制备方法。

背景技术

脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)是革兰氏阴性厌氧细菌中拟杆菌属的成员，属于拟杆菌门，完全不同于厚壁菌门的双歧杆菌、乳酸菌等。拟杆菌属有25个菌种，仅来自人类的有10个菌种，仅来自动物的有10个菌种，来自人和动物的有5个菌种。脆弱拟杆菌是一种专性厌氧细菌，依据能否合成、分泌脆弱拟杆菌肠毒素(BFT)可将其分为产肠毒素型脆弱拟杆菌(Enterotoxigenic Bacteroides fragilis,ETBF)和非产肠毒素型脆弱拟杆菌(Nontoxigenic Bacteroides fragilis，NTBF)。脆弱拟杆菌作为人及动物肠道正常菌群的一部分，主要存在于结肠中。此外，呼吸道、胃肠道及泌尿生殖道粘膜也可定植生长。

已有文献报道了NTBF作为益生菌的可能性(Sun F,Zhang Q,Zhao J,Zhang H,Zhai Q,Chen W.A potential species of next-generation probiotics？The dark andlight sides of Bacteroides fragilis in health.Food Res Int.2019Dec；126:108590.doi:10.1016/j.foodres.2019.108590.Epub 2019 Jul 27.PMID:31732047.)。但是，由于益生菌的活菌特性，在它的使用中，存在以下副作用：1)在危重病人、老人及新生儿，特别是早产儿中存在易位到局部组织和血液的风险；2)活菌可能获得/转移抗生素抗性基因和/或毒力基因；3)活菌对环境条件要求严格，易在提取、运输和储存中失活，且不易标准化；4)产品质地随活菌状态改变，稳定性和适口性波动。

针对上述问题，副益生菌(Paraprobiotic)应运而生。副益生菌被定义为“无活力的微生物细胞，如果口服或局部使用足够的数量，即可为使用者带来好处”。该定义包括形态不完整的微生物细胞和形态完整的微生物细胞，主流研究观点认为，破碎的微生物细胞能够更好地释放功能分子，因此具有更好的效果；但对于完整的灭活微生物细胞，没有统一的观点能够说明其在某些应用中优于活菌的原因。目前针对副益生菌的研究集中在乳杆菌、双歧杆菌等一代益生菌上，研究方向相对固定。因此，有必要开发新型副益生菌，扩展副益生菌的适应症范围。

发明内容

鉴于以上背景技术，本发明提供如下技术方案：

在第一方面，本发明提供了一种脆弱拟杆菌灭活菌粉，其中包括脆弱拟杆菌灭活菌(脆弱拟杆菌的保藏号为CGMCC NO.10685的脆弱拟杆菌ZY-312)；所述脆弱拟杆菌灭活菌的菌体包括完整的细胞形态结构；菌数达到1×10

根据本发明的实施方案，所述脆弱拟杆菌灭活菌粉还包括辅料。

根据本发明的实施方案，所述脆弱拟杆菌灭活菌粉中，所述脆弱拟杆菌灭活菌与所述辅料的质量比为1:(0.05-4)。

根据本发明的实施方案，所述辅料包括赋形剂。优选地，所述辅料在室温下为固体。

优选地，所述赋形剂包括甘露醇、山梨醇、麦芽糊精、乳糖、氯化钠、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、海藻糖、右旋糖酐、脯氨酸、赖氨酸、丙氨酸、酪蛋白、脱脂乳中的至少一种或两种以上的组合。

根据本发明的实施方案，所述赋形剂中包括氯化钠。优选地，所述赋形剂中，氯化钠的质量分数为0-25wt％。

在第二方面，本发明还提供脆弱拟杆菌灭活菌粉的制备方法，特别地，通过所述制备方法制得的脆弱拟杆菌灭活菌粉，其菌体细胞结构完整，所述制备方法包括以下步骤：

(1)取脆弱拟杆菌发酵培养；

(2)发酵培养结束后，对发酵液进行离心，收集菌体，按菌体与氯化钠水溶液的重量体积比为1g:(10～30)mL加入氯化钠水溶液洗涤、离心，得到洗涤后菌体；

(3)向洗涤后菌体中加入第一赋形剂溶液混合重悬得到菌体溶液，再进行灭活处理，离心，收集灭活菌泥；

(4)向步骤(3)获得的灭活菌泥中加入第二赋形剂溶液，得灭活菌原液；

(5)将步骤(4)获得的灭活菌原液干燥至残留水分低于5wt％，即得脆弱拟杆菌灭活菌粉。

根据本发明的实施方案，步骤(2)中，发酵液的菌数达到10

根据本发明的实施方案，步骤(2)中，所述氯化钠水溶液的质量浓度为0.6-1.5wt％，优选为0.65-1.2wt％，更优选为0.8-1.0wt％，最优选0.85-0.95wt％，例如为0.9wt％的氯化钠水溶液。

根据本发明的实施方案，步骤(3)中，所述菌体与第一赋形剂溶液的重量体积比为1g:(5～40)mL。

根据本发明的实施方案，步骤(3)中，所述第一赋形剂溶液中，赋形剂的质量分数为4～30wt％，所述赋形剂具有如上所述含义。

根据本发明的实施方案，步骤(3)中，所述第一赋形剂溶液的溶剂选自氯化钠水溶液，其中，所述氯化钠水溶液具有如上所述含义。进一步优选地，所述第一赋形剂溶液的溶剂选自生理盐水，例如0.9wt％氯化钠水溶液。

根据本发明的实施方案，步骤(3)中，所述灭活处理的方法选自热灭活、冷冻灭活或者化学灭活中的至少一种，优选为热灭活。

优选地，所述热灭活的温度为60～100℃，热灭活的时间为10～60min。

根据本发明的实施方案，步骤(4)中，加入第二赋形剂溶液使灭活菌原液的总重量与步骤(3)灭活前的菌体溶液重量一致。优选地，所述第二赋形剂溶液与所述第一赋形剂溶液相同或不相同。

根据本发明的实施方案，所述第二赋形剂溶液中，赋形剂的质量分数为4～30wt％，所述赋形剂具有如上所述含义。

优选地，所述第二赋形剂溶液的溶剂选自氯化钠水溶液，其中，所述氯化钠水溶液具有如上所述含义。进一步优选地，所述第一赋形剂溶液的溶剂选自生理盐水，例如0.9wt％氯化钠水溶液。

示例性地，所述第二赋形剂溶液与所述第一赋形剂溶液相同。

根据本发明的实施方案，步骤(5)中，所述干燥的方式选自真空冷冻干燥和/或喷雾干燥，优选为真空冷冻干燥。

优选地，所述真空冷冻干燥的条件包括：冷冻温度为-20～-40℃，冷冻时间为1～3小时，真空度为0.20～0.25mbar。

示例性地，所述真空冷冻干燥的工艺包括：-40±2℃预冻1～3小时后，-20±2℃预冻0.5～1h，最后-40±2℃再预冻0.5～2h，0.25mbar真空度下经一次干燥、解析干燥制备成灭活菌粉。

根据本发明的实施方案，所述制备方法中，对所述离心的条件不做具体限定，只要能实现所需的离心效果即可，例如所述离心的转速为10000～20000rpm。

在第三方面，本发明还提供一种药物制剂，所述药物制剂含有上述脆弱拟杆菌灭活菌粉。

根据本发明的实施方案，所述药物制剂选自经口给药制剂、灌肠剂或凝胶剂中的至少一种或两种以上的组合。

本领域技术人员能够理解，根据本发明的各个方面以及各个实施方案中所包含的特征可以彼此独立进行组合，只要进行组合的特征之间不存在冲突。

有益效果：

本发明的发明人通过开发了能够保证脆弱拟杆菌灭活菌体完整的菌粉及其制备方法，通过本发明的制备方法所制得的脆弱拟杆菌灭活菌粉能够更有效保证与活菌制剂相关性质的一致性，尤其是在使用时能够减轻癌症相关的胃肠道副作用。另外，与活菌制剂相比，通过本发明的灭活菌粉制备的药物制剂的存储方式更为简单，还延长了药物制剂的有效期。

附图说明

图1是实施例1的以5wt％甘氨酸作为赋形剂所得的菌粉镜检图；

图2是实施例2的以5wt％甘露醇作为赋形剂所得的菌粉镜检图；

图3是实施例3的以5wt％右旋糖酐作为赋形剂所得的菌粉镜检图；

图4是实施例4的以5wt％麦芽糊精作为赋形剂所得的菌粉镜检图；

图5是实施例7的以5wt％麦芽糊精+0.9wt％生理盐水作为赋形剂所得的菌粉镜检图；

图6是对比例2中以氯化钠水溶液作为赋形剂所得的菌粉镜检图；

图7从左至右分别是实施例17、实施例19和对比例4灭活温度所得的灭活菌透射电子显微镜照片。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。

以下实施例和对比例中，如无特殊说明，均采用本领域已知的方法发酵培养脆弱拟杆菌，其中，脆弱拟杆菌的保藏号为CGMCC NO.10685的脆弱拟杆菌ZY-312。

实施例1

(1)发酵培养脆弱拟杆菌，使其发酵液菌数达到10

(2)将发酵液进行离心处理，然后收集湿菌体，按菌体：生理盐水＝1:15(g:mL)比例加入0.9wt％生理盐水对菌泥进行重悬洗涤，再次离心，收集洗涤后的菌体；

(3)向步骤(2)所得菌体中加入5wt％甘氨酸的赋形剂溶液(5wt％是指赋形剂甘氨酸在赋形剂溶液中的质量分数，下同)，按菌体：赋形剂溶液＝1:10(g:mL)比例进行添加，搅拌分散后在80±5℃温度下热灭活20±5分钟，得灭活菌液，以14000rpm转速离心处理，收集灭活菌泥；

(4)向步骤(3)收集的灭活菌泥中加入5wt％甘氨酸赋形剂溶液，使总重量与灭活前菌液重量一致，搅拌完全溶解，得灭活菌原液；

(5)将步骤(4)所得的灭活菌原液进行真空冷冻干燥，-40±2℃预冻1～3小时后，-20±2℃预冻0.5～1h，最后-40±2℃再预冻0.5～2h，0.25mbar真空度下经一次干燥(-5±2℃和0±2℃)、解析干燥(35±2℃)制备成灭活菌粉。

实施例2

(1)发酵培养脆弱拟杆菌，使其发酵液菌数达到10

(2)将发酵液进行离心处理，然后收集湿菌体，按菌体：生理盐水＝1:25(g:mL)比例加入0.9wt％生理盐水对菌泥进行重悬洗涤，再次离心，收集洗涤后的菌体；

(3)向步骤(2)所得菌体中加入5wt％甘露醇赋形剂溶液，按菌体：赋形剂溶液＝1:15(g:mL)比例进行添加，搅拌分散后在80±5℃热灭活20±5分钟，得灭活菌液，收集灭活菌泥；

(4)向步骤(3)收集的灭活菌泥中加入5wt％甘露醇赋形剂溶液,使总重量与灭活前菌液重量一致，搅拌完全溶解，得灭活菌原液；

(5)将步骤(4)所得的灭活菌原液进行真空冷冻干燥，-40±2℃预冻1～3小时后，-20±2℃预冻0.5～1h，最后-40±2℃再预冻0.5～2h，0.25mbar真空度下经一次干燥(-5±2℃和0±2℃)、解析干燥(35±2℃)制备成灭活菌粉。

实施例3

(1)发酵培养脆弱拟杆菌，使其发酵液菌数达到10

(2)将发酵液进行离心处理，然后收集湿菌体，按菌体：生理盐水＝1:16(g:mL)比例加入0.9wt％生理盐水对菌泥进行重悬洗涤，再次离心，收集洗涤后的菌体；

(3)向步骤(2)所得菌体中加入5wt％右旋糖酐赋形剂溶液，按菌体：赋形剂溶液＝1:10(g:mL)比例进行添加，搅拌分散后在70±5℃热灭活40±5分钟，得灭活菌液，收集灭活菌泥；

(4)向步骤(3)收集的灭活菌泥中加入5wt％右旋糖酐赋形剂溶液，使总重量与灭活前菌液重量一致，搅拌完全溶解，得灭活菌原液；

(5)将步骤(4)所得的灭活菌原液进行真空冷冻干燥，-40±2℃预冻1～3小时后，-20±2℃预冻0.5～1h，最后-40±2℃再预冻0.5～2h，0.25mbar真空度下经一次干燥(-5±2℃和0±2℃)、解析干燥(35±2℃)制备成灭活菌粉。

实施例4

(1)发酵培养脆弱拟杆菌，使其发酵液菌数达到10

(2)将发酵液进行离心处理，然后收集湿菌体，按菌体：生理盐水＝1:22(g:mL)比例加入0.9wt％生理盐水对菌泥进行重悬洗涤，再次离心，收集洗涤后的菌体；

(3)向步骤(2)所得菌体中加入5wt％麦芽糊精赋形剂溶液，按菌体：赋形剂溶液＝1:8(g:mL)比例进行添加，搅拌分散后在65±5℃热灭活20±5分钟，得灭活菌液，以14000rpm转速离心处理，收集灭活菌泥。

(4)向步骤(3)收集的灭活菌泥中加入5wt％麦芽糊精赋形剂溶液，使总重量与灭活前菌液重量一致，搅拌完全溶解，得灭活菌原液；

(5)将步骤(4)所得的灭活菌原液进行真空冷冻干燥，-40±2℃预冻1～3小时后，-20±2℃预冻0.5～1h，最后-40±2℃再预冻0.5～2h，0.25mbar真空度下经一次干燥(-5±2℃和0±2℃)、解析干燥(35±2℃)制备成灭活菌粉。

实施例5

(1)发酵培养脆弱拟杆菌，使其发酵液菌数达到10

(2)将发酵液进行离心处理，然后收集湿菌体，按菌体：生理盐水＝1:15(g:mL)比例加入0.9wt％生理盐水对菌泥进行重悬洗涤，再次离心，收集洗涤后的菌体；

(3)向步骤(2)所得菌体中加入5wt％乳糖赋形剂溶液，按菌体：赋形剂溶液＝1:10(g:mL)比例进行添加，搅拌分散后在85±5℃热灭活35±5分钟，得灭活菌液，收集灭活菌泥。

(4)向步骤(3)收集的灭活菌泥中加入5wt％乳糖赋形剂溶液，使总重量与灭活前菌液重量一致，搅拌完全溶解，得灭活菌原液；

(5)将步骤(4)所得的灭活菌原液进行真空冷冻干燥，-40±2℃预冻1～3小时后，-20±2℃预冻0.5～1h，最后-40±2℃再预冻0.5～2h，0.25mbar真空度下经一次干燥(-5±2℃和0±2℃)、解析干燥(35±2℃)制备成灭活菌粉。

实施例6

(1)发酵培养脆弱拟杆菌，使其发酵液菌数达到10

(2)将发酵液进行离心处理，设置转速为14000rpm，然后收集湿菌体，按菌体：生理盐水＝1:25(g:mL)比例加入0.9wt％生理盐水对菌泥进行重悬洗涤，再次离心，收集洗涤后的菌体；

(2)向步骤(2)所得菌体中加入5wt％脱脂乳赋形剂溶液，按菌体：赋形剂溶液＝1:9(g:mL)比例进行添加，搅拌分散后在85±5℃热灭活25±5分钟，得灭活菌液，以14000rpm转速离心处理，收集灭活菌泥；

(4)向步骤(3)收集的灭活菌泥中加入5wt％脱脂乳赋形剂溶液，使总重量与灭活前菌液重量一致，搅拌完全溶解，得灭活菌原液；

(5)将步骤(4)所得的灭活菌原液进行真空冷冻干燥，-40±2℃预冻1～3小时后，-20±2℃预冻0.5～1h，最后-40±2℃再预冻0.5～2h，0.25mbar真空度下经一次干燥(-5±2℃和0±2℃)、解析干燥(35±2℃)制备成灭活菌粉。

实施例7

(1)发酵培养脆弱拟杆菌，使其发酵液菌数达到10

(2)将发酵液进行离心处理，然后收集湿菌体，按菌体：生理盐水＝1:25(g:mL)比例加入0.9wt％生理盐水对菌泥进行重悬洗涤，再次离心，收集洗涤后的菌体；

(3)向步骤(2)所得菌体中加入5wt％麦芽糊精加0.9wt％生理盐水赋形剂溶液，按菌体：赋形剂溶液＝1:8(g:mL)比例进行添加，搅拌分散后在85±5℃热灭活40±5分钟，得灭活菌液，收集灭活菌泥；

(4)向步骤(3)收集的灭活菌泥中加入5wt％麦芽糊精加0.9wt％生理盐水赋形剂溶液(其中，溶剂为0.9wt％生理盐水，下同)，使总重量与灭活前菌液重量一致，搅拌完全溶解，得灭活菌原液；

(5)将步骤(4)所得的灭活菌原液进行真空冷冻干燥，-40±2℃预冻1～3小时后，-20±2℃预冻0.5～1h，最后-40±2℃再预冻0.5～2h，0.25mbar真空度下经一次干燥(-5±2℃和0±2℃)、解析干燥(35±2℃)制备成灭活菌粉。

实施例8

(1)发酵培养脆弱拟杆菌，使其发酵液菌数达到10

(2)将发酵液进行离心处理，设置转速为14000rpm，然后收集湿菌体，按菌体：生理盐水＝1:23(g:mL)比例加入0.9wt％生理盐水对菌泥进行重悬洗涤，再次离心，收集洗涤后的菌体；

(3)向步骤(2)所得菌体中加入15wt％麦芽糊精加0.9wt％生理盐水赋形剂溶液，按菌体：赋形剂溶液＝1:12(g:mL)比例进行添加，搅拌分散后在85±5℃热灭活40±5分钟，得灭活菌液，以14000rpm转速离心处理，收集灭活菌泥；

(4)向步骤(3)收集的灭活菌泥中加入10％麦芽糊精加0.9wt％生理盐水赋形剂溶液，使总重量与灭活前菌液重量一致，搅拌完全溶解，得灭活菌原液；

(5)将步骤(4)所得的灭活菌原液进行真空冷冻干燥，-40±2℃预冻1～3小时后，-20±2℃预冻0.5～1h，最后-40±2℃再预冻0.5～2h，0.25mbar真空度下经一次干燥(-5±2℃和0±2℃)、解析干燥(35±2℃)制备成灭活菌粉。

实施例9

(1)发酵培养脆弱拟杆菌，使其发酵液菌数达到10

(2)将发酵液进行离心处理，然后收集湿菌体，按菌体：生理盐水＝1:25(g:mL)比例加入0.9wt％生理盐水对菌泥进行重悬洗涤，再次离心，收集洗涤后的菌体；

(3)向步骤(2)所得菌体中加入20％麦芽糊精加0.9wt％生理盐水赋形剂溶液，按菌体：赋形剂溶液＝1:12(g:mL)比例进行添加，搅拌分散后在90±5℃热灭活15±5分钟，得灭活菌液，离心处理，收集灭活菌泥；

(4)向步骤(3)收集的灭活菌泥中加入20％麦芽糊精加0.9wt％生理盐水赋形剂溶液，使总重量与灭活前菌液重量一致，搅拌完全溶解，得灭活菌原液；

(5)将步骤(4)所得的灭活菌原液进行真空冷冻干燥，-40±2℃预冻1～3小时后，-20±2℃预冻0.5～1h，最后-40±2℃再预冻0.5～2h，0.25mbar真空度下经一次干燥(-5±2℃和0±2℃)、解析干燥(35±2℃)制备成灭活菌粉。

实施例10

(1)发酵培养脆弱拟杆菌，使其发酵液菌数达到10

(2)将发酵液进行离心处理，设置转速为14000rpm，然后收集湿菌体，按菌体：生理盐水＝1:20(g:mL)比例加入0.9wt％生理盐水对菌泥进行重悬洗涤，再次离心，收集洗涤后的菌体；

(3)向步骤(2)所得菌体中加入25％麦芽糊精加0.9wt％生理盐水赋形剂溶液，按菌体：赋形剂溶液＝1:15(g:mL)比例进行添加，搅拌分散后在80±5℃热灭活20±5分钟，得灭活菌液，离心处理，收集灭活菌泥；

(4)向步骤(3)收集的灭活菌泥中加入25％麦芽糊精加0.9wt％生理盐水赋形剂溶液，使总重量与灭活前菌液重量一致，搅拌完全溶解，得灭活菌原液；

(5)将步骤(4)所得的灭活菌原液进行真空冷冻干燥，-40±2℃预冻1～3小时后，-20±2℃预冻0.5～1h，最后-40±2℃再预冻0.5～2h，0.25mbar真空度下经一次干燥(-5±2℃和0±2℃)、解析干燥(35±2℃)制备成灭活菌粉。

实施例11

(1)发酵培养脆弱拟杆菌，使其发酵液菌数达到10

(2)将发酵液进行离心处理，设置转速为14000rpm，然后收集湿菌体，按菌体：生理盐水＝1:18(g:mL)比例加入0.9wt％生理盐水对菌泥进行重悬洗涤，再次离心，收集洗涤后的菌体；

(3)向步骤(2)所得菌体中加入5wt％麦芽糊精加0.6wt％氯化钠水溶液赋形剂溶液，按菌体：赋形剂溶液＝1:12(g:mL)比例进行添加，搅拌分散后在80±5℃热灭活20±5分钟，得灭活菌液，离心处理，收集灭活菌泥；

(4)向步骤(3)收集的灭活菌泥中加入5wt％麦芽糊精加0.6wt％氯化钠水溶液赋形剂溶液，使总重量与灭活前菌液重量一致，搅拌完全溶解，得灭活菌原液；

(5)将步骤(4)所得的灭活菌原液进行真空冷冻干燥，-40±2℃预冻1～3小时后，-20±2℃预冻0.5～1h，最后-40±2℃再预冻0.5～2h，0.25mbar真空度下经一次干燥(-5±2℃和0±2℃)、解析干燥(35±2℃)制备成灭活菌粉。

实施例12

(1)发酵培养脆弱拟杆菌，使其发酵液菌数达到10

(2)将发酵液进行离心处理，然后收集湿菌体，按菌体：生理盐水＝1:20(g:mL)比例加入0.9wt％生理盐水对菌泥进行重悬洗涤，再次离心，收集洗涤后的菌体；

(3)向步骤(2)所得菌体加入5wt％麦芽糊精加1.2wt％氯化钠水溶液赋形剂溶液，按菌体：赋形剂溶液＝1:8(g:mL)比例进行添加，搅拌分散后在90±5℃热灭活30±5分钟，得灭活菌液，以14000rpm转速离心处理，收集灭活菌泥；

(4)向步骤(3)收集的灭活菌泥中加入5wt％麦芽糊精加1.2wt％氯化钠水溶液赋形剂使总重量与灭活前菌液重量一致，搅拌完全溶解，得灭活菌原液；

(5)将步骤(4)所得的灭活菌原液进行真空冷冻干燥，-40±2℃预冻1～3小时后，-20±2℃预冻0.5～1h，最后-40±2℃再预冻0.5～2h，0.25mbar真空度下经一次干燥(-5±2℃和0±2℃)、解析干燥(35±2℃)制备成灭活菌粉。

实施例13

(1)发酵培养脆弱拟杆菌，使其发酵液菌数达到10

(2)将发酵液进行离心处理，设置转速为14000rpm，然后收集湿菌体，按菌体：生理盐水＝1:18(g:mL)比例加入0.9wt％生理盐水对菌泥进行重悬洗涤，再次离心，收集洗涤后的菌体；

(3)向步骤(2)所得菌体中加入5wt％麦芽糊精加0.9wt％生理盐水赋形剂溶液，按菌体：赋形剂溶液＝1:6(g:mL)比例进行添加，搅拌分散后在70±5℃热灭活40±5分钟，得灭活菌液，离心处理，收集灭活菌泥；

(4)向步骤(3)收集的灭活菌泥中加入5wt％麦芽糊精加0.9wt％生理盐水赋形剂溶液，使总重量与灭活前菌液重量一致，搅拌完全溶解，得灭活菌原液；

(5)将步骤(4)所得的灭活菌原液进行真空冷冻干燥，-40±2℃预冻1～3小时后，-20±2℃预冻0.5～1h，最后-40±2℃再预冻0.5～2h，0.25mbar真空度下经一次干燥(-5±2℃和0±2℃)、解析干燥(35±2℃)制备成灭活菌粉。

实施例14

(1)发酵培养脆弱拟杆菌，使其发酵液菌数达到10

(2)将发酵液进行离心处理，设置转速为14000rpm，然后收集湿菌体，按菌体：生理盐水＝1:15(g:mL)比例加入0.9wt％生理盐水对菌泥进行重悬洗涤，再次离心，收集洗涤后的菌体；

(3)向步骤(2)所得菌体中加入5wt％麦芽糊精加0.9wt％生理盐水赋形剂溶液，按菌体：赋形剂溶液＝1:18(g:mL)比例进行添加，搅拌分散后在70±5℃热灭活40±5分钟，得灭活菌液，以14000rpm转速离心处理，收集灭活菌泥；

(4)向步骤(3)收集的灭活菌泥中加入5wt％麦芽糊精加0.9wt％生理盐水赋形剂溶液，使总重量与灭活前菌液重量一致，搅拌完全溶解，得灭活菌原液；

(5)将步骤(4)所得的灭活菌原液进行真空冷冻干燥，-40±2℃预冻1～3小时后，-20±2℃预冻0.5～1h，最后-40±2℃再预冻0.5～2h，0.25mbar真空度下经一次干燥(-5±2℃和0±2℃)、解析干燥(35±2℃)制备成灭活菌粉。

实施例15

(1)发酵培养脆弱拟杆菌，使其发酵液菌数达到10

(2)将发酵液进行离心处理，然后收集湿菌体，按菌体：生理盐水＝1:20(g:mL)比例加入0.9wt％生理盐水对菌泥进行重悬洗涤，再次离心，收集洗涤后的菌体；

(3)向步骤(2)所得菌体加入5wt％麦芽糊精加0.9wt％生理盐水赋形剂溶液，按菌体：赋形剂溶液＝1:30(g:mL)比例进行添加，搅拌分散后在80±5℃热灭活20±5分钟，得灭活菌液，离心处理，收集灭活菌泥；

(4)向步骤(3)收集的灭活菌泥中加入5wt％麦芽糊精加0.9wt％生理盐水赋形剂溶液，使总重量与灭活前菌液重量一致，搅拌完全溶解，得灭活菌原液；

(5)将步骤(4)所得的灭活菌原液进行真空冷冻干燥，-40±2℃预冻1～3小时后，-20±2℃预冻0.5～1h，最后-40±2℃再预冻0.5～2h，0.25mbar真空度下经一次干燥(-5±2℃和0±2℃)、解析干燥(35±2℃)制备成灭活菌粉。

实施例16

(1)发酵培养脆弱拟杆菌，使其发酵液菌数达到10

(2)将发酵液进行离心处理，然后收集湿菌体，按菌体：生理盐水＝1:10(g:mL)比例加入0.9wt％生理盐水对菌泥进行重悬洗涤，再次离心，收集洗涤后的菌体；

(3)向步骤(2)所得菌体中加入5wt％麦芽糊精加0.9wt％生理盐水赋形剂溶液，按菌体：赋形剂溶液＝1:40(g:mL)比例进行添加，搅拌分散后在80±5℃热灭活20±5分钟，得灭活菌液，离心处理，收集灭活菌泥；

(4)向步骤(3)收集的灭活菌泥中加入5wt％麦芽糊精加0.9wt％生理盐水赋形剂溶液，使总重量与灭活前菌液重量一致，搅拌完全溶解，得灭活菌原液；

(5)将步骤(4)所得的灭活菌原液进行真空冷冻干燥，-40±2℃预冻1～3小时后，-20±2℃预冻0.5～1h，最后-40±2℃再预冻0.5～2h，0.25mbar真空度下经一次干燥(-5±2℃和0±2℃)、解析干燥(35±2℃)制备成灭活菌粉。

实施例17

(1)发酵培养脆弱拟杆菌，使其发酵液菌数达到10

(2)将发酵液进行离心处理，然后收集湿菌体，按菌体：生理盐水＝1:25(g:mL)比例加入0.9wt％生理盐水对菌泥进行重悬洗涤，再次离心，收集洗涤后的菌体；

(3)向步骤(2)所得菌体加入5wt％麦芽糊精加0.9wt％生理盐水赋形剂溶液，按菌体：赋形剂溶液＝1:15(g:mL)比例进行添加，搅拌分散后在60±5℃热灭活20±5分钟，得灭活菌液，离心处理，收集灭活菌泥；

(4)向步骤(3)收集的灭活菌泥中加入5wt％麦芽糊精加0.9wt％生理盐水赋形剂溶液，使总重量与灭活前菌液重量一致，搅拌完全溶解，得灭活菌原液；

(5)将步骤(4)所得的灭活菌原液进行真空冷冻干燥，-40±2℃预冻1～3小时后，-20±2℃预冻0.5～1h，最后-40±2℃再预冻0.5～2h，0.25mbar真空度下经一次干燥(-5±2℃和0±2℃)、解析干燥(35±2℃)制备成灭活菌粉。

实施例18

(1)发酵培养脆弱拟杆菌，使其发酵液菌数达到10

(2)将发酵液进行离心处理，然后收集湿菌体，按菌体：生理盐水＝1:18(g:mL)比例加入0.9wt％生理盐水对菌泥进行重悬洗涤，再次离心，收集洗涤后的菌体；

(3)向步骤(2)所得菌体加入5wt％麦芽糊精加0.9wt％生理盐水作为赋形剂，按菌体：赋形剂溶液＝1:12(g:mL)比例进行添加，搅拌分散后在90±5℃热灭活20±5分钟，得灭活菌液，离心处理，收集灭活菌泥；

(4)向步骤(3)收集的灭活菌泥中加入5wt％麦芽糊精加0.9wt％生理盐水赋形剂溶液，使总重量与灭活前菌液重量一致，搅拌完全溶解，得灭活菌原液；

(5)将步骤(4)所得的灭活菌原液进行真空冷冻干燥，-40±2℃预冻1～3小时后，-20±2℃预冻0.5～1h，最后-40±2℃再预冻0.5～2h，0.25mbar真空度下经一次干燥(-5±2℃和0±2℃)、解析干燥(35±2℃)制备成灭活菌粉。

实施例19

(1)发酵培养脆弱拟杆菌，使其发酵液菌数达到10

(2)将发酵液进行离心处理，然后收集湿菌体，按菌体：生理盐水＝1:25(g:mL)比例加入0.9wt％生理盐水对菌泥进行重悬洗涤，再次离心，收集洗涤后的菌体；

(3)向步骤(2)所得菌体加入5wt％麦芽糊精加0.9wt％生理盐水赋形剂溶液，按菌体：赋形剂溶液＝1:8(g:mL)比例进行添加，搅拌分散后在100℃热灭活10±5分钟，得灭活菌液，离心处理，收集灭活菌泥；

(4)向步骤(3)收集的灭活菌泥中加入5wt％麦芽糊精加0.9wt％生理盐水赋形剂溶液，使总重量与灭活前菌液重量一致，搅拌完全溶解，得灭活菌原液；

(5)将步骤(4)所得的灭活菌原液进行真空冷冻干燥，-40±2℃预冻1～3小时后，-20±2℃预冻0.5～1h，最后-40±2℃再预冻0.5～2h，0.25mbar真空度下经一次干燥(-5±2℃和0±2℃)、解析干燥(35±2℃)制备成灭活菌粉。

实施例20

(1)发酵培养脆弱拟杆菌，使其发酵液菌数达到10

(2)将发酵液进行离心处理，然后收集湿菌体，按菌体：生理盐水＝1:12(g:mL)比例加入0.9wt％生理盐水对菌泥进行重悬洗涤，再次离心，收集洗涤后的菌体；

(3)向步骤(2)所得菌体中加入5wt％麦芽糊精加0.9wt％生理盐水赋形剂中，按菌体：赋形剂溶液＝1:15(g:mL)比例进行添加，搅拌分散后在80℃热灭活30±5分钟，得灭活菌液，离心处理，收集灭活菌泥；

(4)向步骤(3)收集的灭活菌泥中加入5wt％麦芽糊精加0.9wt％生理盐水赋形剂溶液使总重量与灭活前菌液重量一致，搅拌完全溶解，得灭活菌原液；

(5)将步骤(4)所得的灭活菌原液进行真空冷冻干燥，-40±2℃预冻1～3小时后，-20±2℃预冻0.5～1h，最后-40±2℃再预冻0.5～2h，0.25mbar真空度下经一次干燥(-5±2℃和0±2℃)、解析干燥(35±2℃)制备成灭活菌粉。

实施例21

(1)发酵培养脆弱拟杆菌，使其发酵液菌数达到10

(2)将发酵液进行离心处理，然后收集湿菌体，按菌体：生理盐水＝1:20(g:mL)比例加入0.9wt％生理盐水对菌泥进行重悬洗涤，再次离心，收集洗涤后的菌体；

(3)向步骤(2)所得菌体加入5wt％麦芽糊精加0.9wt％生理盐水赋形剂溶液，按菌体：赋形剂溶液＝1:10(g:mL)比例进行添加，搅拌分散后在80℃热灭活40±5分钟，得灭活菌液，离心处理，收集灭活菌泥；

(4)向步骤(3)收集的灭活菌泥中加入5wt％麦芽糊精加0.9wt％生理盐水赋形剂溶液，使总重量与灭活前菌液重量一致，搅拌完全溶解，得灭活菌原液；

(5)将步骤(4)所得的灭活菌原液进行真空冷冻干燥，-40±2℃预冻1～3小时后，-20±2℃预冻0.5～1h，最后-40±2℃再预冻0.5～2h，0.25mbar真空度下经一次干燥(-5±2℃和0±2℃)、解析干燥(35±2℃)制备成灭活菌粉。

实施例22

(1)发酵培养脆弱拟杆菌，使其发酵液菌数达到10

(2)将发酵液进行离心处理，然后收集湿菌体，按菌体：生理盐水＝1:20(g:mL)比例加入0.9wt％生理盐水对菌泥进行重悬洗涤，再次离心，收集洗涤后的菌体；

(3)向步骤(2)所得菌体中加入5wt％麦芽糊精加0.9wt％生理盐水赋形剂溶液，按菌体：赋形剂溶液＝1:10(g:mL)比例进行添加，搅拌分散后在80℃热灭活50±5分钟，得灭活菌液，离心处理，收集灭活菌泥；

(4)向步骤(3)收集的灭活菌泥中加入5wt％麦芽糊精加0.9wt％生理盐水赋形剂溶液，使总重量与灭活前菌液重量一致，搅拌完全溶解，得灭活菌原液；

(5)将步骤(4)所得的灭活菌原液进行真空冷冻干燥，-40±2℃预冻1～3小时后，-20±2℃预冻0.5～1h，最后-40±2℃再预冻0.5～2h，0.25mbar真空度下经一次干燥(-5±2℃和0±2℃)、解析干燥(35±2℃)制备成灭活菌粉。

对比例1

(1)发酵培养脆弱拟杆菌，使其发酵液菌数达到10

(2)将发酵液进行离心处理，然后收集湿菌体，按菌体：纯水＝1:20(g:mL)比例加入纯化水对菌泥进行重悬洗涤，再次离心，收集洗涤后的菌体；

(3)向步骤(2)所得菌体中加入0.9wt％生理盐水，按菌体：生理盐水＝1:10(g:mL)比例进行添加，搅拌分散后在80±5℃热灭活20±5分钟，得灭活菌液，离心处理，收集灭活菌泥；

(4)向步骤(3)收集的灭活菌泥中加入纯化水使总重量与灭活前菌液重量一致，搅拌完全溶解，得灭活菌原液；

(5)将步骤(4)所得的灭活菌原液进行真空冷冻干燥，-40±2℃预冻1～3小时后，-20±2℃预冻0.5～1h，最后-40±2℃再预冻0.5～2h，0.25mbar真空度下经一次干燥(-5±2℃和0±2℃)、解析干燥(35±2℃)制备成灭活菌粉。

对比例2

(1)发酵培养脆弱拟杆菌，使其发酵液菌数达到10

(2)将发酵液进行离心处理，然后收集湿菌体，按菌体：生理盐水＝1:20(g:mL)比例加入0.9wt％生理盐水对菌泥进行重悬洗涤，再次离心，收集洗涤后的菌体；

(3)向步骤(2)所得菌体中加入0.9wt％生理盐水，按菌体：生理盐水＝1:10(g:mL)比例进行添加，搅拌分散后在80±5℃热灭活20±5分钟，得灭活菌液，得灭活菌液，离心处理，收集灭活菌泥；

(4)向步骤(3)收集的灭活菌泥中加入生理盐水使总重量与灭活前菌液重量一致，搅拌完全溶解，得灭活菌原液；

5)将步骤(4)所得的灭活菌原液进行真空冷冻干燥，-40±2℃预冻1～3小时后，-20±2℃预冻0.5～1h，最后-40±2℃再预冻0.5～2h，0.25mbar真空度下经一次干燥(-5±2℃和0±2℃)、解析干燥(35±2℃)制备成灭活菌粉。

对比例3

(1)发酵培养脆弱拟杆菌，使其发酵液菌数达到10

(2)将发酵液进行离心处理，然后收集湿菌体，按菌体：生理盐水＝1:25(g:mL)比例加入0.9wt％生理盐水对菌泥进行重悬洗涤，再次离心，收集洗涤后的菌体；

(3)向步骤(2)所得菌体中加入5wt％麦芽糊精加0.9wt％生理盐水赋形剂溶液，分别按菌体：赋形剂溶液＝1:8(g:mL)的质量比进行添加，搅拌分散后在50±5℃热灭活20±5分钟，得灭活菌液，离心处理，收集灭活菌泥；

(4)向步骤(3)收集的灭活菌泥中加入5wt％麦芽糊精加0.9wt％生理盐水赋形剂溶液，使总重量与灭活前菌液重量一致，搅拌完全溶解，得灭活菌原液；

(5)将步骤(4)所得的灭活菌原液进行真空冷冻干燥，-40±2℃预冻1～3小时后，-20±2℃预冻0.5～1h，最后-40±2℃再预冻0.5～2h，0.25mbar真空度下经一次干燥(-5±2℃和0±2℃)、解析干燥(35±2℃)制备成灭活菌粉。

对比例4

(1)发酵培养脆弱拟杆菌，使其发酵液菌数达到10

(2)将发酵液进行离心处理，然后收集湿菌体，按菌体：生理盐水＝1:20(g:mL)比例加入0.9wt％生理盐水对菌泥进行重悬洗涤，再次离心，收集洗涤后的菌体；

(3)向步骤(2)所得菌体中加入5wt％麦芽糊精加0.9wt％生理盐水赋形剂溶液，按菌体：赋形剂溶液＝1:10(g:mL)比例进行添加，搅拌分散后在120±5℃热灭活20±5分钟，得灭活菌液，离心处理，收集灭活菌泥；

(4)向步骤(3)收集的灭活菌泥中加入5wt％麦芽糊精加0.9wt％生理盐水赋形剂溶液，使总重量与灭活前菌液重量一致，搅拌完全溶解，得灭活菌原液；

(5)将步骤(4)所得的灭活菌原液进行真空冷冻干燥，-40±2℃预冻1～3小时后，-20±2℃预冻0.5～1h，最后-40±2℃再预冻0.5～2h，0.25mbar真空度下经一次干燥(-5±2℃和0±2℃)、解析干燥(35±2℃)制备成灭活菌粉。

测试例

对上述实施例1-22和对比例1-4制备的灭活菌粉进行如下测试：

(一)灭活菌粉性能测试

1、上清DNA检测

1)试验方法：

a)将实施例7和对比例1经步骤(2)离心后获得的菌泥进行三次洗涤，分别得到洗涤一次离心上清、洗涤二次离心上清及洗涤三次离心上清，并分别测定离心后上清液的DNA含量；并将经步骤(4)处理后获得的灭活菌原液进行离心，测定上清液的DNA含量，检测结果见表1。

b)将实施例7、实施例11-12经步骤(2)的初次离心后获得的菌泥离心，测定上清液的DNA含量和菌体沉淀的DNA含量，检测结果见表2。

2)检测结果如下：

表1

由表1可知，对比例1中采用纯化水作为洗涤溶剂，上清液DNA含量远高于采用0.9％生理盐水作为溶剂的赋形剂溶液，该结果说明纯化水会损坏菌体，而采用0.9wt％生理盐水作为洗涤溶剂能够保持菌体形态结构完整。

表2

由表2可知，采用0.9wt％生理盐水作为洗涤溶剂能够更好地保持菌体形态完整。

2、不同赋形剂对灭活菌粉的结构形态的影响

图1-6分别为实施例1-4、7和对比例2的灭活菌粉的革兰氏染色镜检图，经过图1-5与图6之间的对比可以看出，在制备方法中使用本发明的赋形剂溶液可保证灭活菌粉中的菌体形态完整，特别是实施例7的以5wt％麦芽糊精+0.9wt％生理盐水作为冻干赋形剂效果最佳。

3、不同浓度麦芽糊精(即赋形剂)对灭活菌粉制备的影响

肉眼观察实施例7、8、9、10制得的灭活菌粉，并记录观察结果于表3中。

表3

通过观察实施例7-10制备的灭活菌粉的外观形态，实施例7的灭活菌粉外观较为蓬松，呈淡黄色。在灭活菌粉中菌体完整性相同的前提下，5wt％麦芽糊精(即赋形剂)制得的灭活菌粉的性状更利于规模化生产。

4、菌体：赋形剂溶液浓度和灭活温度对制备灭活菌粉的影响

采用稀释平板涂布法检测实施例7、实施例19、对比例3活菌，并将检测结果记录于表4。

表4

由表4可知，在50℃时，存在灭活不完全的情况；在85℃及以上时，可有效灭活。由图7从左到右附图可知，在60-100℃区间，菌体能够保持形态完整；在100℃以上(120℃)时，菌体破损，不能保持完整形态。

5、灭活时间对灭活菌粉制备的影响

采用稀释平板涂布法测定活菌，并将检测结果记录于表5。

表5

如表5所示，15-55分钟的灭活时间均能有效灭活。考虑规模化生产，节约成本，采用20±5分钟作为灭活时间。

(二)本发明的脆弱拟杆菌灭活菌粉治疗癌症副作用的药效实验

1.试验方法

试验设计：选用BALB/c小鼠80只，雌雄各半，按动物性别和体重区间随机分为8组，即空白组、模型组、阳性组(洛哌丁胺4mg/kg)、对比组(使用脆弱拟杆菌NCTC9343灭活菌粉)，和实施例2、7、9、17所制得的脆弱拟杆菌灭活菌粉组(10

检测方法与频率：

摄食量：采用电子天平进行饲料添加和剩余量的称量操作，在给药前(D0)、D4分别记录加入量，分别在D4、D8、D11(试验结束)称剩余量1次，并记录，按公式计算：日平均摄食量(g)＝(加入量-剩余量)/动物数/天数。

腹泻记录及评分标准：每天记录每只试验鼠腹泻情况，腹泻的评分标准参照Kurita A等研究中的腹泻评分方法。0分：大便正常或没有；1分：轻度腹泻，大便可见轻微湿软；2分：中度腹泻，大便较湿且不成形，并且有轻度的肛周着色；3分：重度腹泻，水样便并伴有重度肛周着色。

肠道组织病理学检查：所有存活动物安乐死后取全部肠道，用10％甲醛溶液固定，制备病理组织切片，采用HE染色，在显微镜下进行肠道组织病理学检查。

数据统计与分析：对体重、摄食量、腹泻评分和病理学检查结果等数据以均数±标准差(Mean±SD)表示，使用SPSS统计软件25.0进行统计学分析。

2.试验结果

1)摄食量：各组动物摄食量检测结果如下表。

表6各组动物摄食量统计结果(均数±标准差，n＝10)

注：与模型组比较，*表示差异显著p<0.05；**表示差异极显著p<0.01。

由表6可知，在D4(即造模前)，空白组、模型组及各给药组(即阳性组及实施例2、7、9、17的灭活菌粉组，下同)的动物的日均摄食量均无明显差异(p>0.05)。与模型组相比，在D8、D11(即造模后)，空白组雌雄动物的日均摄食量均显著增高(p<0.01)；在D8时，各给药组与模型组的摄食量差异不大；D11时，阳性组的摄食量相比模型组下降；脆弱拟杆菌灭活菌粉组(包括实施例2、7、9、17的灭活菌粉组，下同)的摄食量与模型组相似；脆弱拟杆菌灭活菌粉摄食量与模型组相似，NCTC 9343灭活菌粉略低于ZY-312菌粉。脆弱拟杆菌灭活菌粉组内不存在药效的显著性差异。

2)粪便湿重、含水量和腹泻评分：

各组动物粪便湿重和含水量检测结果如下表7。

表7

各组动物的粪便湿重和含水量统计结果(均数±标准差，n＝10)

注：与模型组比较，*表示差异显著p<0.05；**表示差异极显著p<0.01。

由表7可知，在粪便湿重及粪便含水量上，空白组造模结束到试验结束没有明显差异。造模结束后，模型组及各给药组的粪便湿重相对空白组均有所下降，其中，阳性组出现显著性差异。试验结束时，各给药组的粪便湿重相差不大。但是，造模结束后，模型组及各给药组的粪便含水量相对空白组有所升高，试验结束时，模型组的粪便含水量已与空白组出现显著性差异。阳性组没有遏制粪便含水量的上升趋势，甚至使这种趋势恶化；脆弱拟杆菌灭活菌粉各组有效遏制了粪便含水量升高的趋势，NCTC 9343灭活菌粉遏制效果差于ZY-312菌粉。灭活菌粉各组组内不存在药效的显著性差异。

各组动物腹泻评分如下表8。

表8

各组动物的腹泻评分统计结果(均数±标准差，n＝5)

/>

注：与模型组比较，*表示差异显著p<0.05；**表示差异极显著p<0.01。

由表8可知，模型组及各给药组的动物在第4天(D7)开始出现腹泻，与空白组相比，试验期间的腹泻评分显著升高，且腹泻评分随时间增高。

对于雄性动物而言，阳性组呈现与模型组相同的腹泻评分趋势，但表现出遏制腹泻评分增高的效果；不同于阳性组，脆弱拟杆菌灭活菌粉各组显示出维持腹泻评分稳定的效果，尽管各剂量组腹泻评分均呈现升高态势，但升高幅度小于模型组和低剂量组；各剂量组D7、D8与模型组、阳性组评分相似，自D9开始显示出遏制作用，在D11天时，出现了较大差异。显示出较优的遏制评分上升的效果。NCTC9343灭活菌粉的效果略差于ZY-312菌粉。

对于雌性动物而言，上述药效结果基本相似。

脆弱拟杆菌灭活菌粉组内药效不存在显著性差异。

3)炎症因子

各组动物炎症因子检测结果如下表9。

表9

各组动物的炎症因子统计结果(均数±标准差，n＝10)

注：与模型组比较，*表示差异显著p<0.05；**表示差异极显著p<0.01。

由表9可知，相对于空白组，模型组的炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-5、IL-6、IL-17、INF-γ及ICAM-1蛋白显著升高；抗炎因子IL-4、IL-10、IL-13显著下降。阳性组对炎性因子水平具有下调作用，对抗炎因子水平具有上调作用。脆弱拟杆菌灭活菌粉组的各组同样体现出相似的对细胞因子的调节作用；NCTC 9343灭活菌粉的调节作用略差于ZY-312菌粉。组内不存在药效的显著性差异。

4)病理检查：选取空肠、回肠和结直肠组织，HE染色评价病理学损伤程度，结果见表10。

表10

各组动物肠道病理学损伤程度评分(均数±标准差，n＝10)

注：与模型组比较，*表示差异显著p<0.05；**表示差异极显著p<0.01。

由表10可知，与空白组相比，模型组多个指标(腺体扩张、肠黏膜损伤、炎细胞浸润及黏膜充血)均出现恶变。在某些指标，如炎细胞浸润、黏膜充血中，阳性药起到治疗及遏制损伤的能力；在另一些指标，如腺体扩张中，阳性药使这种情况恶化。脆弱拟杆菌灭活菌粉组的各组均体现出一定的对肠道损伤的保护和治疗作用。在肠黏膜损伤中，脆弱拟杆菌起到了明显的保护作用；在黏膜充血中，尽管疗效不及阳性药，但脆弱拟杆菌仍旧具有治疗效果；而在腺体扩张中，ZY-312和NCTC 9343都起到了优于阳性药的治疗作用。上述作用中，ZY-312的效果均略高于NCTC 9343。

上述实验结果说明，本发明的脆弱拟杆菌灭活菌粉能够有效防治癌症治疗相关的副作用，尤其是腹泻。

以上对本发明示例性的实施方式进行了说明。但是，本申请的保护范围不拘囿于上述实施方式。本领域技术人员在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。