一种具有二肽基肽酶Ⅳ抑制作用的马乳源小分子肽及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种来源于发酵马乳的小分子肽及应用。

背景技术

糖尿病是胰岛素分泌减少、或胰岛素作用缺陷、或两者同时存在而造成血糖升高、脂肪代谢紊乱等诱发的代谢疾病。90％以上的糖尿病患者为2型糖尿病(Type2 Di abetesMe l l itus，T2DM)。目前已有多类降血糖药物，例如DPP-Ⅳ抑制剂类、α-葡萄糖苷酶抑制剂类、胰高血糖素样肽-1受体激动剂等，但这些药物的长期服用对人体有副作用，因此人们越来越倾向于保健预防和食疗，而来源于食品且无副作用的乳源DPP-Ⅳ抑制剂、α-葡萄糖苷酶抑制剂等在国内具有巨大的潜在市场，具有副作用小、成本低等优点。马乳的营养物质含量较高且不含或少含β-乳球蛋白，因此过敏可能性低，易消化吸收和代谢。

发明内容

本发明目的是提供了一种发酵马乳源小分子肽，氨基酸序列为Pro-G l n-Pro-Phe-Pro-G l n-Leu，分子量为934.05Da，该小分子肽具有DPP-Ⅳ抑制活性和改善Hepg2细胞胰岛素抵抗的作用。

本发明目的通过如下方案实现：

1、在鲜马乳中接种乳酸菌及酵母菌，接种量为0.1～10％，发酵温度为20～37℃，摇床转速为50～300rpm，发酵时长为16～90h；所述乳酸菌为保加利亚乳杆菌、瑞士瑞杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、乳酸乳球菌、嗜热链球菌中的一种或几种；所述酵母菌为酿酒酵母、毕赤酵母、解脂耶氏酵母、汉逊酵母中的一种或几种；

2、马乳发酵完毕后调节pH至4.8～4.0，于4℃、3000～12000g下离心5～20mi n，取上清用NaOH调节pH至7.0～8.0，3000～12000g离心5～20mi n取上清用冻干机冻干，收集冻干粉；

3、冻干粉溶于双蒸水制得0.05～0.5g/mL的溶液，用截留不同分子量的超滤截留膜过滤溶液，获得不同组分的液体，测定各液体的DPP-Ⅳ抑制活性，选择抑制活性最好的超滤组分进行葡聚糖凝胶柱层析和反式高效液相色谱(RP-HPLC)分离纯化，选择RP-HPLC纯化后具有DPP-Ⅳ抑制活性的峰进行LC-MS鉴定，鉴定后获得的肽序列在Biope数据库进行DPP-Ⅳ抑制活性预测，选择预测活性最好的进行固相合成验证，最终获得本发明的小分子肽。

本发明公开的发酵马乳小分子肽Pro-G l n-Pro-Phe-Pro-G l n-Leu可显著抑制DPP-Ⅳ活性，改善高糖诱导的Hepg2细胞胰岛素抵抗，显著提高Hepg2细胞活性，促进Hepg2细胞对葡萄糖的消耗与摄取；本发明小分子肽可应用于制备治疗或辅助治疗2型糖尿病的特医食品、保健品和药物，且制备简单，适用于工业化生产和市场推广应用。

附图说明

图1为超滤截留后含不同分子量物质的溶液对DPP-Ⅳ抑制活性结果；

图2为葡聚糖凝胶层析色谱分峰结果示意图；

图3为葡聚糖凝胶层析色谱分离后获得的液体的DPP-Ⅳ抑制活性检测结果

图4为采用RP-HPLC分离后分离峰示意图；

图5为分离后分离峰对应的液体的DPP-Ⅳ抑制活性检测结果；

图6为RP-HPLC分离的9个峰对应的液体的DPP-Ⅳ抑制活性检测结果；

图7为20-25mi n内，第2号峰样品的高效液相色谱图；

图8为活性肽的质谱鉴定图；

图9为小分子肽PQPFPQL的酶抑制动力学实验结果；

图10为小分子肽PQPFPQL与DPP-Ⅳ分子对接结果示意图(二维)；

图11为小分子肽PQPFPQL对Hepg2细胞活力的影响，其中Met为二甲双胍，NT为阴性对照；

图12为小分子肽PQPFPQL对高糖诱导的胰岛素抵抗Hepg2细胞葡萄糖消耗的影响；

图13为小分子肽PQPFPQL对高糖诱导的胰岛素抵抗Hepg2细胞葡萄糖摄取的影响；

图14为小分子肽PQPFPQL与DPP-Ⅳ分子对接结果示意图(三维)。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明，但本发明的内容并不局限于此，本实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，所用材料、试剂等如无特殊说明均从商业途径所得到；

下述实施例中DPP-Ⅳ抑制活性检测的方法为：

用pH8.0的100mmo l/L Tr i s-HCL缓冲液将DPP-Ⅳ酶和甘氨酰脯氨酸对硝基苯胺(GPP)分别配置成0.025U/mL和2mmo l/L的溶液。移取25μL GPP和25μL样品多肽溶液于96孔板中，充分混合，在37℃下孵育10mi n，然后再加入50μL DPP-Ⅳ酶溶液启动反应，37℃条件下充分反应60mi n；加入100μL pH4.0浓度为1mmo l/L的乙酸-乙酸钠溶液终止反应，酶标仪检测并记录405nm波长下的吸光值，每个样品做三个平行反应；

由于反应体系略带浑浊，因此实验设置酶活性组(缓冲液+酶+底物)、酶空白组(缓冲液+底物)、样品组(酶+样品+底物)和样品对照组(缓冲液+样品+底物)。酶活性组只有GPP和DPP-Ⅳ酶进行反应，等量缓冲液代替多肽样品溶液，得到同等反应条件下可生成PNP的最高含量，以此比对出多肽样品是否具起到抑制作用；酶空白组只添加GPP，其余用等量缓冲液代替，排除GPP在孵育过程中自然分解生成显示物质PNP的干扰；样品对照组同时添加缓冲液、样品多肽和底物，排除在孵育过程中样品多肽对吸光度的干扰。DPP-Ⅳ酶抑制活性的计算：

抑制率(％)＝1-(A样品组-A样品对照组)/(B酶活性组-B酶空白组)×100％

A样品组(DPP-IV+样品+GPP)：加入多肽样品后测定的多肽样品和PNP吸光度；

A样品对照组(缓冲液+样品+GPP)：多肽样品的吸光度；

B酶活性组(缓冲液+DPP-IV+GPP)：不加样品时测定的PNP吸光度；

B酶空白组(缓冲液+GPP)：用缓冲液代替酶测定的PNP吸光度。

实施例1：小分子肽的获取

1、马乳发酵：取400mL鲜马乳在60℃灭菌30mi n，将活化两代后生理盐水洗净重悬的乳酸乳球菌(Lactococcus l act i s)和解脂耶氏酵母(Yarrowi al i po l yt i ca)Y7，各接种2mL至灭菌的马乳中，然后在32℃、225rpm下发酵68h；其中解脂耶氏酵母(Yarrowi a l i po l yt i ca)Y7在“唐蓉等.酵母菌与乳酸菌发酵马乳产ACE抑制肽的研究，食品科学，2021”中公开过，乳酸乳球菌(Lactococcus l act i s)购买于科汉森公司；

2、发酵液预处理：发酵后的马乳用0.1mo l/L的HCL调节pH至4.3，在10000g、4℃下离心10mi n，取上清；用0.1mo l/L NaOH调节pH至7.0，如然后再10000g、4℃下离心10mi n取上清液用冻干机冻干；

3、小分子肽制备：冻干粉溶于双蒸水，制备为0.1g/mL的溶液，用截留量为10kDa及3kDa的超滤截留膜过滤组分，获得含有分子量>10kDa、3-10kDa、<3kDa组分的溶液，将各级溶液冻干，用双蒸水配为50mg/mL的溶液，测定溶液对DPP-Ⅳ抑制活性；结果见图1，从图1可知，抑制活性最好的是含有分子量<3kDa组分的溶液，将0.1g/mL的含有分子量<3kDa组分的溶液用葡聚糖凝胶Sephedax G-10层析，用0.5mL/mi n的双蒸水洗脱，280nm监测洗脱液的吸光度值变化，观察组分分离情况，然后收集分离峰对应的液体F1、F2、F3(图2)，液体冷冻干燥后，再用水配制成浓度50mg/mL的溶液，并测定各溶液对DPP-Ⅳ抑制活性(图3)，选取活性最好的F2液体用半制备RP-HPLC进一步分离(图4)，收集不同时间段的分离液并旋蒸后冷冻干燥(不同时间段的峰对应的编号为F2-1至F2-5)，用水制成浓度为10mg/mL的溶液，测定不同溶液对DPP-Ⅳ抑制活性，结果见图5，从中选择活性最高的F2-3(20-25mi n)分段对应的液体使用RP-HPLC进行下一步分离，收集分离峰对应的9个液体并旋蒸后冷冻干燥，用水制成浓度5mg/mL的溶液，测定不同溶液对DPP-Ⅳ抑制活性，结果见图6，图中显示20-25mi n内的第2号峰(F2-3-2)的液体活性最高，其高效液相色谱图见图7，从图中看出液相结果为单峰，纯化完成。

将F2-3-2号峰液体用Q Exact i ve质谱仪(Thermo Fi sher)进行质谱分析，分析时长：35mi n。检测方式：正离子。多肽和多肽碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描(fu l l scan)后采集10个碎片图谱(MS2 scan)；数据分析(北京百泰派克)：质谱测试原始文件(Raw Fi l e)用软件Mascot2.2检索相应的数据库(Equus caba l l us)，最后得到蛋白质鉴定结果，结果见图8，从图中可以得到相应碎片的相应强度与荷质比，通过数据库母序列比对，确认小分子肽序列为PQPFPQL；通过上海生工合成纯度≥98％的小分子肽PQPFPQL，梯度溶解成不同浓度的小分子肽溶液，检测不同浓度小分子肽的DPP-Ⅳ抑制活性，通过计算得到小分子肽PQPFPQL半抑制浓度(I C50)为0.464mg/mL。

上述方法中半制备RP-HPLC的色谱条件：进样量1mL，流速2mL/mi n，检测波长215nm；流动相A含0.1％(v/v)三氟乙酸(TFA)的超纯水，流动相B为含0.1％(v/v)TFA的乙腈，洗脱条件：用流动相A和B梯度洗脱(0-5mi n，10％B；5-40mi n，10-50％B；40-50mi n，50-80％B；50-60mi n，80-10％B；60-70mi n，10％B)。

实验例2：小分子肽PQPFPQL对DPP-Ⅳ(DPP-Ⅳ)的酶抑制动力学实验

以0.1mo l/L Tr i s-HCL缓冲液(pH8.0)为溶剂配制以下溶液：酶活力80U/L的DPP-Ⅳ溶液；浓度0.4、0.6、0.8、1.2、1.6和2mmo l/L的GPP底物溶液；浓度范围在0-2000μm的小分子肽PQPFPQL溶液，采用上述DPP-Ⅳ抑制活性检测实验方法，获得不同浓度小分子肽对不同浓度底物的吸光值变化(即反应初速度)，采用Li neweaver-Burk双倒数作图，确定小分子肽PQPFPQL对DPP-Ⅳ的抑制作用类型；结果见图9，由图可得小分子肽PQPFPQL是通过反竞争性抑制作用于DPP-Ⅳ。

实验例3：小分子肽PQPFPQL与DPP-Ⅳ分子对接

在RCBS PDB蛋白质数据库(https://www.rcsb.org/)中下载相应的DPP-Ⅳ(1N1M)模型。采用Chem Draw 19.0绘制小分子肽模型，添加NM2力场，使其能量最小化。使用Go ld 5.3.0进行柔性分子对接，对受体进行配体提取，去除水分子，添加极性氢，使用Go l dscore评分系统进进行对接模型筛选。利用Moe2019.10软件进行对接分子复合物的可视化分析，结果见图10，由图可知，PQPFPQL与DPP-Ⅳ形成8个氢键，1个C-H键，1个σ-π超共轭以及2个烷基和2个π-烷基作用，总结合能为-8.9kca l/mo l。

实验例4：小分子肽PQPFPQL功能评价

1、高糖诱导的Hepg2细胞造模

将Hepg2细胞复苏后，用含有10％ FBS及1％青霉素-链霉素的高糖DMEM培养基进行培养；在37℃、5％ CO2的二氧化碳培养箱培养至融合度为90％，用0.25％的胰酶进行消化，按照1:3进行传代，每2d更换一次培养基；待Hepg2细胞铺板后，弃原培养基上清，用含36mmo l/L葡萄糖的DMEM培养基诱导胰岛素抵抗模型；

阴性对照组(NT)用含5.5mmo l/L葡萄糖的DMEM培养基培养Hepg2细胞；

小分子肽组用不同浓度的多肽(50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL)及含36mmo l/L葡萄糖的DMEM进行培养；

阳性对照组(Metformi n)采用36mmo l/L葡萄糖及50μmo l/L二甲双胍的DMEM培养基进行培养；

模型组(I R)是采用含36mmo l/L葡萄糖的DMEM培养基培养Hepg2细胞；

所有组在培养24h后收获细胞进行后续实验；

2、CCK8细胞活力检测

将培养的Hepg2细胞用胰蛋白酶消化后，用含10％FBS的DMEM培养基制成细胞悬液，按照1.5×104

加入于96孔板内，按步骤1进行分组建模，于37℃、5％ CO2的细胞培养箱内培养24h，然后在各组的每孔中加入10μL CCK8试剂，在细胞培养箱中培养4h，于OD450检测吸光度，每组设置4个副孔作为对照，结果见图11，由图11可知，小分子肽PQPFPQL对Hepg2细胞无毒副作用且可提高细胞活性并呈剂量依赖性；

3、葡萄糖消耗

将培养的Hepg2细胞用胰蛋白酶消化后，用含10％FBS的DMEM培养基制成细胞悬液，按照1.5×104加入于96孔板内，按步骤1进行分组建模，于37℃、5％CO2的细胞培养箱内培养24h；弃去原培养基，每孔加入100μL含100nmo l/L胰岛素的DMEM培养基于37℃、5％CO2的细胞培养箱内培养10mi n，弃去培养基，在各组的孔中加入100μL含11mmo l/L葡萄糖的DMEM无血清培养基培养24h；采用GOD-POD葡萄糖检测试剂盒检测培养基中的葡萄糖浓度，按试剂盒操作说明进行检测；使用96孔板每孔加入3μL待测样品与300μL工作试剂(酚试剂与酶试剂按照1:1混匀)，37℃孵育15mi n，使用酶标仪在OD 505nm处进行测定；每组设置4个副孔作为对照，结果见图12，由图12可知，小分子肽PQPFPQL可显著改善高糖诱导的Hepg2胰岛素抵抗细胞葡萄糖消耗。

4、葡萄糖摄取检测

将培养的Hepg2细胞用胰蛋白酶消化后，用含10％ FBS的DMEM培养基制成细胞悬液，按照2×105加入于24孔板内，按步骤1进行分组建模，于37℃、5％CO2的细胞培养箱内培养24h；弃去原培养基，每孔加入1mL含100nmo l/L胰岛素的DMEM培养基于37℃、5％ CO2的细胞培养箱内培养10mi n，弃去培养基，每孔加入1mL含100nmo l/L 2-NBDG的无血清DMEM培养基在37℃细胞培养箱中培养1h，然后用1×PBS冲洗两遍停止反应，使用荧光酶标仪检测葡萄糖摄取，激发波长为475nm，发射波长为535nm，每组设置4个副孔作为对照；结果见图13，由图可知，小分子肽PQPFPQL可显著改善高糖诱导的Hepg2胰岛素抵抗细胞葡萄糖摄取。