分子伴侣TF在促进A型塞内卡病毒结构蛋白VP2可溶性表达中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种分子伴侣TF在促进A型塞内卡病毒结构蛋白VP2可溶性表达中的应用。

背景技术

A型塞内卡病毒(Senecavirus A，SVA)隶属小RNA病毒科(Picornaviridae)塞内卡病毒属(Senecavirus)，是一种新发猪传染病病原。SVA主要感染猪，且对不同年龄阶段的猪都易感，主要引起母猪严重的水疱病和新生仔猪的死亡，新生仔猪病死率高达30％～70％。SVA感染后主要临床症状为猪鼻镜部、口腔上皮、舌和蹄冠等部位的皮肤、黏膜出现水疱样病变，与口蹄疫(FMD)、猪水疱疹(VES)、猪水疱病(SVD)和水疱性口炎(VS)引起的病变极为类似，临床上难以区分。猪塞内卡病毒病的暴发与流行已给全球养猪业造成了较大的经济损失。

相比较其它病原，SVA的研究较少，在蛋白免疫原性方面也处于起始阶段。虽然已有报道关于SVA的灭活疫苗、弱毒疫苗、核酸疫苗和亚单位疫苗等多种候选疫苗的研究进展，但目前仍无商品化疫苗用于预防SVA感染。SVA感染动物机体后，可以同时激活机体的B细胞和T细胞应答，从而产生大量的中和抗体抵抗和清除SVA的感染。已有研究证实小鼠是初步评价SVA疫苗免疫原性和保护效果的候选动物模型；孟媛等利用重组SVA VP1蛋白联合佐剂免疫小鼠评价了其免疫应答效果；崔川等融合表达了SVA VP2蛋白并在免疫VP2蛋白的小鼠血清中检测到高水平的特异性抗体和IFN-γ、IL-2细胞因子含量。SVA VP2结构蛋白作为诱导机体生成中和抗体的优势抗原，是SVA亚单位疫苗和诊断制剂研究候选抗原之一，制备可溶性、高活性的重组VP2蛋白是亚单位疫苗研究的关键。

通过体外表达系统制备重组蛋白时，大肠杆菌表达系统因操作简单、生产成本低、表达量高等优点常为首选的表达系统，但大多重组蛋白多以包涵体形式表达，主要原因是蛋白在形成过程中快速聚集，肽链折叠时间短，造成肽链折叠不充分、不完全，从而产生异常构象，形成包涵体。先前的研究表明SVA VP2蛋白的外源性表达多以包涵体形式存在，可能导致蛋白质无法正确折叠，从而影响其正常生物学功能。其中张永宁等和崔川等通过在VP2蛋白的编码基因中添加融合标签，分别利用原核表达载体pET-30a和pET-32a制备了可溶性表达的SVA VP2蛋白，但这种方式制备的重组蛋白的分子量明显大于正常的VP2蛋白，对准确研究VP2蛋白的功能可能存在一定影响。

分子伴侣蛋白是高度保守的蛋白质，在体内促进其他蛋白质的适当折叠。不同的伴侣系统有助于蛋白质从头折叠、运输和低聚物复合物的组装，以及从应激诱导的展开中恢复。也有研究表明分子伴侣能够提高目的蛋白的可溶性表达，但是分子伴侣促进目的蛋白可溶性表达的结果也存在一定的随机性，相反可能会抑制其他酶或蛋白的可溶性表达；而且在蛋白纯化过程中分子伴侣污染现象严重。而且本发明在研究过程中发现，大多数的分子伴侣(例如pG-KJE8，pGro7，pKJE7，pG-Tf2等)均未使A型塞内卡病毒结构蛋白VP2可溶性表达。

触发因子(Trigger Factor，TF)作为一种核糖体相关的伴侣蛋白，在核糖体释放新生肽链出口处可与大部分的新生肽链结合，形成一个受保护的折叠空间，使得新生肽链不受前导和聚集的影响进而折叠为正常构象的成熟蛋白质。虽然已经有文献公开了分子伴侣TF对其他病毒中VP2蛋白的可溶性表达研究，但是由于病毒种类不同，VP2蛋白的差异也较大，导致其可溶性表达的结果存在相反性。例如，文献(4种分子伴侣促进猫细小病毒样颗粒可溶性表达的研究)发现，分子伴侣pTf16(TF)均能促进FPV VP2蛋白的可溶性表达；文献(5种分子伴侣对水貂阿留申病毒核衣壳蛋白VP2部分基因可溶性表达的影响)发现pTf16(TF)伴侣蛋白与水貂阿留申病毒核衣壳蛋白VP2共表达，未见可溶性蛋白增加，表明pTf16(TF)不能促进水貂阿留申病毒核衣壳蛋白VP2的可溶性表达。

发明内容

针对上述问题，本发明利用SVA VP2蛋白重组质粒与分子伴侣蛋白TriggerFactor(TF)表达质粒pTF16共表达，成功实现SVAVP2蛋白的可溶性表达。纯化出可溶性的重组VP2蛋白，通过免疫小鼠，系统分析该重组蛋白诱导机体的体液免疫和细胞免疫应答水平，研究结果证明本研究制备的重组VP2蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性，为开发SVA新型亚单位疫苗及诊断制剂的研制奠定了基础。

具体包括以下内容：

第一方面，本发明提供了一种分子伴侣蛋白Trigger factor在促进A型塞内卡病毒结构蛋白VP2表达中的应用。

第二方面，本发明提供了一种可溶性表达A型塞内卡病毒结构蛋白VP2的基因工程菌，所述基因工程菌含有表达A型塞内卡病毒结构蛋白VP2的质粒和表达分子伴侣Triggerfactor的质粒。

优选地，所述方法包括：将表达分子伴侣Trigger factor的质粒与表达A型塞内卡病毒结构蛋白VP2的质粒共同转化宿主细胞，获得可同时表达A型塞内卡病毒结构蛋白VP2和分子伴侣蛋白Trigger factor的基因工程菌。

第三方面，本发明提供了一种可溶性表达重组A型塞内卡病毒结构蛋白VP2的方法，所述方法包括：将同时表达A型塞内卡病毒结构蛋白VP2和分子伴侣蛋白Triggerfactor的基因工程菌进行发酵培养，诱导表达获得重组A型塞内卡病毒结构蛋白VP2。

优选地，所述方法包括如下步骤：

基因工程菌的制备：制备同时表达A型塞内卡病毒结构蛋白VP2和分子伴侣蛋白Trigger factor的基因工程菌；

诱导表达：将获得的基因工程菌进行发酵培养，加入L-阿拉伯糖和IPTG诱导表达获得重组A型塞内卡病毒结构蛋白VP2。

优选地，所述基因工程菌的制备包括如下步骤：

(1)对A型塞内卡病毒结构蛋白VP2基因密码子进行大肠杆菌密码子优化，合成SVAVP2基因并连接到大肠杆菌表达载体，构建重组表达质粒；

(2)将分子伴侣pTF16质粒转化至大肠杆菌感受态细胞，筛选制备感受态细胞；

(3)将步骤(1)所述的重组质粒转入步骤(2)感受态细胞，筛选获得同时表达A型塞内卡病毒结构蛋白VP2和分子伴侣蛋白Trigger factor的基因工程菌。

优选地，所述大肠杆菌包括BL21(DE3)，BL21(DE3)pLysS，B834(DE3)，BLR(DE3)，JM109，XL1Blue，ER2566，Rosetta，GI698。

优选地，所述基因工程菌的制备为：

(1)合成SEQ ID NO.1所示的SVA VP2基因序列并连接到大肠杆菌表达载体pET28a(+)，构建重组表达质粒pET28a-SVA-VP2；

(2)合成含有氯霉素抗性基因的分子伴侣pTF16(Cm

(3)将步骤(1)所述的重组质粒pET-28a-SVA-VP2转入步骤(2)所述的pTF16-BL21(DE3)感受态细胞，于含卡那霉素和氯霉素的培养基上培养，挑取阳性克隆获得同时表达A型塞内卡病毒结构蛋白VP2和分子伴侣蛋白Trigger factor的基因工程菌。

优选地，所述诱导表达为：

将同时表达A型塞内卡病毒结构蛋白VP2和分子伴侣蛋白Trigger factor的基因工程菌进行发酵培养，向培养物中加入终浓度为2g/L的L-阿拉伯糖和1mmol/L的IPTG进行诱导表达；

离心收集菌体，进行PBS重悬，重悬菌体破碎后离心取上清，纯化获得重组A型塞内卡病毒结构蛋白VP2。

第四方面，本发明提供了上述第三方面所述的方法制备获得的重组A型塞内卡病毒结构蛋白VP2。

第五方面，本发明提供了上述第四方面所述的重组A型塞内卡病毒结构蛋白VP2在制备塞内卡病毒病疫苗中的应用。

第六方面，本发明提供了一种用于预防塞内卡病毒感染的疫苗，所述疫苗包括上述第五方面所述的重组A型塞内卡病毒结构蛋白VP2。

优选地，所述疫苗还包括佐剂。

优选地，佐剂为化学类免疫佐剂、微生物类免疫佐剂、植物类免疫佐剂、生化类免疫佐剂中的一种或几种。

本发明的有益效果是：

(1)本发明以编码A型塞内卡病毒结构蛋白VP2的基因序列为基础进行原核表达密码子优化，构建了SVA VP2蛋白重组表达质粒pET28a-SVA-VP2；将pET28a-SVA-VP2重组质粒与分子伴侣pTf16质粒共同转入BL21(DE3)感受态细胞，成功诱导表达可溶性的重组SVAVP2蛋白；

(2)所述重组VP2蛋白能够与SVA阳性血清发生特异性免疫反应，免疫小鼠血清抗体效价水平可达1∶32000，中和抗体水平可达1：128，免疫小鼠的脾脏CD4

附图说明

图1重组表达质粒双酶切鉴定结果；其中M为DL 10000DNA 分子标记，1为重组表达质粒的酶切产物；

图2SVA VP2重组蛋白的SDS-PAGE分析结果图，其中M为蛋白分子量标记，1为pET-28a(+)未经IPTG诱导，2为pET-28a(+)经IPTG诱导，3为pET28a-SVA VP2未经IPTG诱导，4为pET28a-SVA VP2经IPTG诱导，5为pET28a-SVA VP2经IPTG诱导菌体裂解后上清，6为pET28a-SVAVP2经IPTG诱导菌体裂解后沉淀，7为pET28a-TF16-SVAVP2未经L-阿拉伯糖和IPTG诱导，8为pET28a-TF16-SVAVP2经L-阿拉伯糖和IPTG诱导，9为pET28a-TF16-SVAVP2经L-阿拉伯糖和IPTG诱导菌体裂解后上清，10为pET28a-TF16-SVAVP2经L-阿拉伯糖和IPTG诱导菌体裂解后沉淀；

图3SVA VP2重组蛋白的纯化及免疫印迹分析，其中M为蛋白分子量标记，1为未纯化的重组SVA VP2蛋白，2为纯化的重组SVA VP2蛋白，3为重组SVA VP2蛋白与兔阴性血清的Western blotting分析，4为重组SVA VP2蛋白与兔抗SVA阳性血清的Western blotting分析；5为重组SVA VP2蛋白与抗His抗体的Western blotting分析；

图4间接ELISA检测血清抗体结果，其中A为IgG抗体水平，B为血清效价；

图5小鼠血清中和效价结果；

图6SVA VP2免疫淋巴细胞亚群分析结果；

图7SVA VP2免疫淋巴细胞增殖分析结果；

图8SVA VP2免疫细胞因子水平分析结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

以下实施例中所述的实验获得生物安全许可和口蹄疫实验室活动许可：

中国农业科学院兰州兽医研究所根据生物安全3级实验室(BSL-3)和口蹄疫相关生物安全的相关要求，经兰州兽医研究所生物安全委员会、实验动物伦理委员会、中国农业科学院生物安全委员会、兰州兽医研究所实验动物伦理委员会、兰州兽医研究所生物安全委员会逐级上报，获得农业部关于开展高致病性SVA病原及动物研究许可，并已在农业农村部备案，符合国家生物安全等级的要求。

A型塞内卡病毒SVA/CH-FJ-2017来自国家塞内卡病毒参考实验室。

Hind III、BamH I限制性内切酶购自NEB公司(美国)；pTF16(Cm+)伴侣蛋白质粒由本实验室保存；感受态细胞制备试剂盒购自生工生物工程股份有限公司(中国上海)；IPTG、L-阿拉伯糖、山羊抗小鼠IgG-HRP抗体、山羊抗猪IgG-HRP抗体、小鼠抗His Tag单克隆抗体、弗氏佐剂(完全和不完全佐剂)均购自Sigma公司(美国)；ECL显色试剂盒购自雅酶生物医药科技有限公司(中国上海)；Ni Sepharose HP、AKTA pure150纯化仪购自GE公司(美国)；小鼠淋巴细胞分离液、小鼠IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10ELISA检测试剂盒购自北京达科为生物有限公司(中国北京)；RPMI 1640和DMEM培养基购自Gibco公司(美国)；其它试剂均为国产分析纯。大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞购自全式金生物技术有限公司(中国北京)；胎牛血清(FBS)购自Gibco公司(美国)；猪抗SVA的阳性血清由本实验室制备；BALB/c小鼠购自中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心。

质粒pTF16(表达分子伴侣蛋白Trigger factor)，构建方法如下：

(1)由北京六合华大基因科技有限公司分别合成分子伴侣基因片段过渡质粒：pMV-tig；对上述过渡质粒pMV-tig进行酶切，DNA纯化回收目的片段；

(2)分子伴侣质粒的构建：

分子伴侣表达质粒pTF16：将载体质粒pACYC184进行酶切，利用NEB公司的DNA重组试剂盒

本发明以A型塞内卡病毒SVA/CH-FJ-2017为例，但不局限于A型塞内卡病毒SVA/CH-FJ-2017，参照本发所述方法可以对其他A型塞内卡病毒结构蛋白VP2进行可溶表达。

术语“疫苗”是指能够在动物中提供保护性应答的生物制剂，其中所述疫苗已经被递送并且不能造成严重疾病。

本发明的疫苗，进一步任选地包含一种或多种佐剂，赋形剂，载体和稀释剂。佐剂可以任何合适的佐剂，化学类免疫佐剂如氢氧化铝、弗氏佐剂、矿物油、司盘等；微生物类免疫佐剂如分枝杆菌、BCC、脂多糖、胞壁酰二肽、胞肽、脂溶性蜡质D、短小棒状杆菌；植物类免疫佐剂多为从植物或大真菌中提取的多糖类，如茯苓多糖、红花多糖、中草药类等。而生化类免疫佐剂如胸腺肽、转移因子、白细胞介素等。优选的佐剂可以是纳米佐剂生物佐剂，白介素、干扰素等。

本发明的疫苗也可用于联合疫苗，如与猪的其他疫苗联合，但重点在减毒活疫苗上，尤其是病毒基因的整合，如双价苗，三价苗等。

本发明的疫苗的施用可以采用方便的途径，例如肌内注射，鼻内，口服，皮下，透皮和阴道等途径。本发明的减毒疫苗优选采用肌肉注射。疫苗可以在初免-加强方案后施用。例如，在第一次接种后，受试者可以在一段时间(例如约7，14，21或28天)之后接受第二次加强施用。通常，加强施用的剂量相同或低于初免施用的剂量。此外，也可以进行第三次加强免疫，例如免疫后2-3个月、6个月或一年。

利用GraphPad Prism8.0软件对各检测数据进行分析和图表绘制。数据表示为平均值±平均标准误差(SE)。NS＝P>0.05：各组间无显著性差异；

实施例1重组A型塞内卡病毒结构蛋白VP2的可溶性表达

1.重组表达质粒的构建与鉴定

以SVA/CH-FJ-2017毒株结构蛋白VP2的基因序列为参考，对VP2基因密码子进行大肠杆菌密码子优化，委托西安擎科生物有限公司合成SVA VP2基因(852bp，基因序列如SEQID NO.1所示)并连接到大肠杆菌表达载体pET28a(+)，构建重组表达质粒pET28a-SVA-VP2，经Hind III和BamH I双酶切验证和基因测序鉴定。

构建的重组质粒pET-28a-SVA-VP2经Hind III和BamH I双酶切鉴定，结果如图1所示，产生大小约5300bp和850bp的2条特异性条带，酶切产物大小与理论值相符，测序显示SVA VP2基因正确插入。

2.重组SVA VP2蛋白的表达与鉴定

按质粒转化步骤将重组质粒pET-28a-SVA-VP2转化至BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含卡那霉素(Kan

结果如图2所示，在16℃、1mmol/L IPTG(终浓度)、培养12h的条件下，对SVA VP2阳性重组表达菌进行诱导，诱导的重组表达菌株约在37kD处观察到特异性蛋白条带，但多集中于沉淀中，主要为包涵体表达(图2中泳道6所示)。

3.重组SVAVP2蛋白的表达与纯化

(1)分子伴侣共表达菌株的制备

按质粒转化步骤将合成的分子伴侣pTF16(Cm

(2)重组SVA VP2蛋白的表达与纯化

将上述菌液100倍扩大培养于Kan

(3)Western blotting

将纯化的重组SVA VP2蛋白经SDS-PAGE电泳，将蛋白转移至NC膜，5％的脱脂奶室温封闭2h，PBST洗脱5次；分别以抗His单抗(1：5000稀释)和猪抗SVA的阳性血清(1：5000稀释)作为一抗，室温孵育1h，PBST洗脱5次，然后用山羊抗鼠IgG-HRP抗体(1：10000稀释)和山羊抗猪IgG-HRP抗体(1：10000稀释)为二抗，室温孵育1h，PBST洗脱5次，ECL显色。

利用分子伴侣共表达菌株在16℃、2g/L L-阿拉伯糖(终浓度)、1mmol/L IPTG(终浓度)、培养12h的条件下，诱导的重组表达菌株约在50kD(TF16)和37kD可见2条清晰的蛋白条带，分别为TF16和VP2蛋白的目的条带。且VP2蛋白在上清中明显表达(参见图2中泳道9)。

在非变性条件下，利用镍离子亲和层析填料Ni Sepharose HP对菌体裂解产物上清中的重组VP2蛋白进行纯化。SDS-PAGE鉴定结果如图3所示，纯化后的VP2抗原蛋白纯度约为80％。Western-blot结果显示，His Tag单克隆抗体和SVA阳性血清均可以检测到纯化的重组SVA VP2蛋白，表明本发明制备的重组SVA VP2蛋白具有良好的免疫反应性。

实施例2重组SVA VP2蛋白的免疫原性分析

1.小鼠免疫

选取6～8周龄的雌性健康BALB/c小鼠，分为2组，每组5只；PBS对照组、VP2免疫组(采用实施例1所述方法制备的重组SVA VP2蛋白)，采用背部皮下多点注射方式，各免疫2次，间隔时间为14d。首免重组SVAVP2蛋白剂量为50μg(弗氏不完全佐剂乳化)，注射剂量为100μL，PBS与之相同。二免重组SVA VP2蛋白剂量为50μg(弗氏完全佐剂乳化)，注射剂量为100μL，PBS与之相同。分别于0、7、14、21、28d采血分离血清。

2.间接ELISA检测

利用间接ELISA测定免疫小鼠血清中的特异性IgG抗体水平。以实施例1制备的重组SVA VP2蛋白为包被抗原，用50mmol/L碳酸盐缓冲液将抗原稀释，100μL/孔包被于ELISA酶标板中(100ng/孔)，4℃静置12h，弃液，PBST洗脱3次。5％脱脂奶粉200μL/孔，37℃封闭2h，弃液，PBST洗脱3次。将待检小鼠血清1：1 000稀释，100μL/孔，37℃孵育1h，弃液，PBST洗脱3次。山羊抗小鼠IgG-HRP抗抗体1：10000稀释，100μL/孔，37℃孵育1h，弃液，PBST洗脱3次。TMB底物显色液50μL/孔显色，终止液50μL/孔终止。酶标仪上测定OD

通过间接ELISA对小鼠0、7、14、21和28d血清进行检测，结果如图4所示，小鼠在免疫的第14d就可以产生高滴度特异性IgG抗体水平(P＜0.001)，抗体水平维持至免疫后28d(图4中A所示)。参照P/N计算公式，计算血清最高效价。结果表明，小鼠免疫血清效价最高可达1∶32 000(图4中B所示)。

3.中和抗体检测

将待检血清在56℃灭活30min，96孔板中50μL/孔加入不含FBS的DMEM培养基，在第一行按50μL/孔加入灭活血清，将血清从1：4开始连续倍比稀释至1：512，至最后一行混匀后弃去50μL，每个稀释度做3次重复。然后加入200TCID

中和试验结果如图5所示，在一免14d即可检测到重组SVA VP2蛋白免疫血清的中和抗体，至二免28d可达1：128，显著高于PBS对照组(<1∶4)。

4.CD4

按照小鼠淋巴细胞分离液操作说明分离脾脏淋巴细胞，取(细胞数量)细胞于1.5mL的EP管中1500r/min离心3min，弃上清，PBS重悬细胞沉淀。随后向各细胞悬液中加入6μL抗体(2μL CD3e-FITC、2μL CD4-APC、2μL CD8a-PE)，混匀，避光冰浴30min，1 500r/min离心5min，弃上清，PBS清洗三次，最后加入200μL的PBS重悬细胞，设置空白组调试流式细胞仪的电压，上流式细胞仪进行检测。

利用流式细胞仪检测CD4

5.淋巴细胞增殖试验

取小鼠淋巴细胞悬液接种至96孔细胞培养板中，100μL/孔(2.5×10

采用CCK-8法测定免疫后小鼠的淋巴细胞增殖能力，结果如图7所示，Con A蛋白刺激试验组和对照组淋巴细胞均增殖SI为3.63和3.81(P>0.05)，重组SVA VP2蛋白的刺激下，免疫组淋巴细胞的SI显著高于对照组(P＜0.01)，表明本发明制备的重组SVA VP2蛋白可有效刺激脾淋巴细胞增殖。

6.细胞因子水平检测

取小鼠淋巴细胞悬液接种到24孔板中，0.5mL/孔(1×10

通过ELISA检测试剂盒分别检测各组小鼠淋巴细胞分泌的IFN-γ、IL-2和IL-4、IL-10的水平，结果如图8所示，重组SVA VP2蛋白免疫组中IFN-γ的表达水平显著高于PBS组(P<0.001)；IL-2的表达水平显著高于PBS组(P<0.001)；IL-4的表达水平显著高于PBS组(P<0.001)；IL-10的表达水平显著高于PBS组(P<0.001)。这说明本发明制备的重组SVA VP2蛋白能不仅诱导Th1型细胞因子IFN-γ和IL-2的表达与分泌，还可诱导Th2型细胞因子IL-4和IL-10的表达与分泌。

上述结果表明本发明制备的重组SVA VP2蛋白可诱导机体产生强烈的体液免疫应答和细胞免疫应答，在动物体内具有良好的免疫原性。

综上，本发明利用分子伴侣TF16成功制备了可溶性的重组SVA VP2蛋白，动物免疫试验证明，该重组蛋白具有良好的免疫原性；可诱导机体产生强烈的体液免疫应答和细胞免疫应答，为进一步开发SVA新型亚单位疫苗及诊断制剂提供了重要的试验材料和理论依据。

上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。