用于制造植物信使包的方法
文献发布时间:2024-04-18 20:00:50
序列表
本申请包含序列表,该序列表已以ASCII格式电子提交,并通过引用以其全文特此并入。所述ASCII副本创建于2019年8月22日,名称为51296-007Wo3_Sequence_Listing_8.22.19_ST25,并且大小是5,825字节。
背景技术
在本领域中对制造用于在各种农业、治疗、或商业应用中使用的植物信使包的方法存在需求。
发明内容
本文披露了制造植物信使包(PMP)的方法和相关物品(例如,PMP生物反应器)。使用本文的方法和物品制造的PMP在各种农业和治疗组合物及方法中是有用的。
在第一方面,本文提供了用于产生植物信使包(PMP)的方法,该方法包括(a)在水培系统的培养基中培养植物或植物部分;(b)收获该培养基;以及(c)从该培养基中纯化PMP。
在一些实施例中,该植物或植物部分是番茄植物或番茄植物部分;幼苗或根。
在一些实施例中,该培养基是液体培养基或凝胶培养基。在一些实施例中,该培养基包含常量营养素、微量营养素、盐、酶、抗生素、抗真菌剂、或植物生长因子中的一种或多种。
在一些实施例中,该水培系统具有至少1L、至少100L、或至少500L的容量。
在一些实施例中,该收获包括从该植物或植物部分分离该培养基。在一些实施例中,该收获不包括破坏该植物或植物部分。
在一些实施例中,将该培养进行至少1周。
在另一个方面,本发明的特征在于一种用于产生植物信使包(PMP)的方法,该方法包括:(a)获得其中已培养植物、植物部分、或植物细胞的培养基;以及(b)从该培养基中纯化PMP。
在又另一个方面,本发明的特征在于一种用于产生植物PMP的方法,该方法包括:(a)在培养基中培养植物、植物部分、或植物细胞;(b)收获该培养基或其部分;以及(c)从该培养基中纯化PMP。
在一些实施例中,该培养基是液体培养基。在一些实施例中,该液体培养基在水培系统中。
在一些实施例中,该培养基是凝胶培养基,例如,琼脂或琼脂糖。
在一些实施例中,该培养基是半固体或固体培养基,例如,无菌的天然土壤或无菌的合成土壤。
在一些实施例中,该培养基包括常量营养素、微量营养素、盐、酶、抗生素、抗真菌剂、或植物生长因子中的一种或多种。
在一些实施例中,该培养在生物反应器中进行。在一些实施例中,该生物反应器是具有至少1L、10L、50L、100L、或500L的容量的容器。
在一些实施例中,该收获包括例如,使用重力沉降、离心、旋转过滤器、和膜系统中的一种或多种将该植物、植物部分、或植物细胞与植物培养基分离。在一些实施例中,该收获不包括破坏该植物、植物部分、或植物细胞。
在一些实施例中,该收获包括将该植物、植物部分、或植物细胞和培养基离心;将该培养基榨汁;或洗涤该培养基。
在一些实施例中,定期收获并更换培养基。
在一些实施例中,以至少1L的体积提供培养基。
在一些实施例中,该植物是幼苗。在一些实施例中,该幼苗在培养基中萌发。
在一些实施例中,该植物部分是胚根或根。在一些实施例中,该根不与植物地上部分连接。
在一些实施例中,该植物部分是花粉粒或愈伤组织。
在一些实施例中,该植物是双子叶植物或单子叶植物,或该植物部分是双子叶植物或单子叶植物的一部分。
在一些实施例中,该植物或植物部分是大豆植物或其一部分、蚕豆植物或其一部分、拟南芥属(Arabidopsis)植物或其一部分、番茄植物或其一部分、大麦植物或其一部分、或燕麦植物或其一部分。
在一些实施例中,该植物细胞是烟草BY-2细胞。
在一些实施例中,该植物、植物部分、或植物细胞已经生长了至少24小时或至少一周。
在一些实施例中,该植物、植物部分、或植物细胞是基因修饰的,例如,含有相对于未修饰的植物、植物部分、或植物细胞可有效增加来自该植物、植物部分、或植物细胞的PMP的产生的基因修饰,例如,相对于未修饰的植物、植物部分、或植物细胞可有效增加该植物、植物部分、或植物细胞中EXO70a1或EXO84的表达的基因修饰。在一些实施例中,该基因修饰是EXO70a1或EXO84转基因的稳定整合。
在一些实施例中,该方法进一步包括将植物、植物部分、或植物细胞暴露于有效量的刺激剂中以增加PMP的产生。
在一些实施例中,该刺激剂是生物刺激剂,例如,微生物刺激剂(例如,细菌多肽、细菌糖、细菌核酸、或细菌小分子)。在一些实施例中,该细菌多肽是延伸因子Tu 18(EFT18)。
在一些实施例中,该微生物刺激剂是真菌多肽(例如,鞭毛蛋白2)、真菌糖、真菌核酸、或真菌小分子。
在一些实施例中,该微生物刺激剂是微生物,例如,细菌、病毒或原生动物、或真菌。
在一些实施例中,植物刺激剂是非生物刺激剂,例如,渗透胁迫、干旱、水分剥夺、洪涝、高光强度、非常高的光强度、高温、低温、盐度、重金属毒害作用、厌氧生活、养分缺乏、养分过量、UV照射、大气污染、或诱导活性氧(ROS)的产生的化学物质。
在一些实施例中,该植物刺激剂是化学激发剂,例如,水杨酸、苯并噻二唑、或2,6-二氯异烟酸。
在一些实施例中,该刺激剂是增加EXO70a1或EXO84的基因表达的异源核酸。
在一些实施例中,在收获培养基前至少24小时添加该刺激剂。
在以上方法中的一些实施例中,纯化步骤包括分离出粗PMP级分,其中相对于在初始样品中的水平,该粗PMP级分具有降低水平的来自该植物或其一部分的至少一种污染物或不希望的组分。
在一些实施例中,纯化步骤进一步包括纯化该粗PMP级分,从而产生多个纯PMP,其中相对于在该粗PMP级分中的水平,该多个纯PMP具有降低水平的来自该植物或其一部分的至少一种污染物或不希望的组分。
在一些实施例中,该方法进一步包括确定这些PMP的纯度并且收集鉴定为纯的PMP。
在一些实施例中,该方法进一步包括将这些PMP用载体配制,从而产生PMP组合物。在一些实施例中,该载体是农业上可接受的载体。在一些实施例中,该PMP组合物被配制用于递送至植物。在一些实施例中,该载体是药学上可接受的载体。在一些实施例中,该组合物被配制用于向人施用。在一些实施例中,组合物被配制为液体、固体、气雾剂、糊剂、凝胶或气体组合物。
在一些实施例中,该PMP组合物稳定至少24小时、48小时、七天、或30天。在一些实施例中,该PMP组合物在至少4℃、20℃、24℃、或37℃的温度下稳定。
在一些实施例中,该方法进一步包括向PMP负载异源功能剂,例如,异源农业药剂。在一些实施例中,该异源农业药剂是杀有害生物剂、肥料剂、除草剂、植物修饰剂、或异源治疗剂。在一些实施例中,异源治疗剂包括抗真菌剂、抗细菌剂、杀病毒剂、抗病毒剂、杀昆虫剂、杀线虫剂、抗寄生生物剂、或昆虫驱避剂。
在另一个方面,本发明的特征在于一种用于产生PMP的方法,该方法包括:(a)在生物反应器中培养植物、植物部分、或植物细胞;(b)将该植物、植物部分、或植物细胞暴露于有效量的刺激剂中以增加PMP的产生;(c)收获培养基;以及(d)从该培养基中纯化PMP。
在另一个方面,本发明的特征在于一种PMP组合物,该组合物包括多个PMP,其中通过包括以下步骤的方法产生这些PMP:(a)获得其中已培养植物、植物部分、或植物细胞的培养基;以及(b)从该培养基中纯化PMP。
在另一个方面,本发明的特征在于一种PMP组合物,该组合物包括多个PMP,其中通过包括以下步骤的方法产生这些PMP:(a)在培养基中培养植物、植物部分、或植物细胞;(b)收获该培养基;以及(c)从该培养基中纯化PMP。
在一些实施例中,该PMP组合物进一步包括将植物、植物部分、或植物细胞暴露于有效量的刺激剂中以增加PMP的产生。在一些实施例中,该刺激剂是生物刺激剂、非生物刺激剂、或化学激发剂。
在一些实施例中,纯化步骤包括分离出粗PMP级分,其中相对于在初始样品中的水平,该粗PMP级分具有降低水平的来自该植物或其一部分的至少一种污染物或不希望的组分。在一些实施例中,纯化步骤进一步包括纯化该粗PMP级分,从而产生多个纯PMP,其中相对于在该粗PMP级分中的水平,该多个纯PMP具有降低水平的来自该植物或其一部分的至少一种污染物或不希望的组分。
在一些实施例中,该PMP组合物进一步包括将这些PMP用载体配制。在一些实施例中,该载体是农业上可接受的载体。在一些实施例中,该载体是药学上可接受的载体。
在一些实施例中,该PMP组合物被配制用于递送至植物。在一些实施例中,该PMP组合物被配制用于向人施用。
在一些实施例中,该PMP组合物被配制为液体、固体、气雾剂、糊剂、凝胶或气体组合物。
在一些实施例中,该PMP组合物稳定至少24小时、48小时、七天、或30天。在一些实施例中,该PMP组合物在至少4℃、20℃、24℃、或37℃的温度下稳定。
在另一个方面,本发明的特征在于一种PMP生物反应器,该PMP生物反应器包括含有植物培养物并且任选地含有有效量的刺激剂以增加PMP产生的生物反应器。
在一些实施例中,该植物培养物是包括整个植物、植物部分、或植物细胞的培养物。在一些实施例中,该植物是幼苗。在一些实施例中,该植物部分是胚根、根、花粉粒、或愈伤组织。在一些实施例中,该根不与植物地上部分连接。在一些实施例中,该植物是双子叶植物或单子叶植物,或该植物部分是双子叶植物或单子叶植物的一部分。在一些实施例中,该植物或植物部分是大豆植物或其一部分、蚕豆植物或其一部分、拟南芥属植物或其一部分、番茄植物或其一部分、大麦植物或其一部分、或燕麦植物或其一部分。在一些实施例中,该植物细胞是烟草BY-2细胞。
在一些实施例中,该植物、植物部分、或植物细胞已经生长了至少24小时或至少1周。
在一些实施例中,该植物、植物部分、或植物细胞是基因修饰的。
在一些实施例中,该基因修饰的植物、植物部分、或植物细胞含有相对于未修饰的植物、植物部分、或植物细胞可有效增加来自该植物、植物部分、或植物细胞的PMP的产生的基因修饰或相对于未修饰的植物、植物部分、或植物细胞可有效增加该植物、植物部分、或植物细胞中EXO70a1或EXO84的表达的基因修饰。在一些实施例中,该基因修饰是EXO70a1或EXO84转基因的稳定整合。
在一些实施例中,该刺激剂是生物刺激剂。在一些实施例中,该生物刺激剂是微生物刺激剂或植物刺激剂。在一些实施例中,该微生物刺激剂是细菌多肽、细菌糖、细菌核酸、细菌小分子、真菌多肽、真菌糖、真菌核酸、真菌小分子、微生物、细菌、病毒、原生动物、或真菌。在一些实施例中,该细菌多肽是延伸因子Tu 18(EFT18)。在一些实施例中,该真菌多肽是鞭毛蛋白2。
在一些实施例中,该植物刺激剂是非生物刺激剂或化学激发剂。在一些实施例中,该非生物刺激剂是渗透胁迫、干旱、水分剥夺、洪涝、高光强度、非常高的光强度、高温、低温、盐度、重金属毒害作用、厌氧生活、养分缺乏、养分过量、UV照射、大气污染、或诱导活性氧(ROS)的产生的化学物质。在一些实施例中,该化学激发剂是水杨酸、苯并噻二唑、或2,6-二氯异烟酸。
在一些实施例中,该刺激剂是增加EXO70a1或EXO84的基因表达的异源核酸。
在一些实施例中,在收获培养基前至少24小时添加该刺激剂。
在另一个方面,本发明的特征在于一种增加植物的适应度的方法,该方法包括向该植物递送有效量的前述实施例的PMP组合物,其中相对于未处理的植物,该方法增加该植物的适应度。
在另一个方面,本发明的特征在于一种降低植物有害生物的适应度的方法,该方法包括向该植物有害生物递送有效量的前述实施例的PMP组合物,其中相对于未处理的植物有害生物,该方法降低该植物有害生物的适应度。
在另一个方面,本发明的特征在于一种处理有需要的动物的感染的方法,该方法包括向该动物施用有效量的前述实施例的PMP组合物。
在另一个方面,本发明的特征在于一种降低病原体的适应度的方法,该方法包括向该病原体递送有效量的前述实施例的PMP组合物,其中相对于未处理的病原体,该方法有效降低该病原体的适应度。
在另一个方面,本发明的特征在于一种降低动物病原体媒介的适应度的方法,该方法包括向该媒介递送有效量的前述实施例的PMP组合物,其中相对于未处理的媒介,该方法降低该媒介的适应度。
从以下详细说明以及权利要求中,本发明的其他特征和优点将会是显而易见的。
定义
如本文所用,术语“植物”是指整株植物(例如,整株幼苗或整株成年植物)、植物器官、植物部分、植物组织、种子、植物细胞、种子、以及它们的子代。植物细胞包括但不限于来自种子、悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、形成层组织、下胚轴、叶、根、胚根、芽、配子体、孢子体、花粉、和小孢子的细胞。植物细胞还包括单细胞植物,例如,含有单细胞质体的生物体(如藻类)。植物部分包括分化的和未分化的组织,包括但不限于以下:根、胚根、花、雌蕊、雄蕊、茎、下胚轴、形成层组织、芽、叶、花粉、种子、果实、收获的产品、肿瘤组织、汁液(例如,木质部汁液和韧皮部汁液)、以及各种形式的细胞和培养物(例如,单细胞、原生质体、胚、和愈伤组织)。
如本文所用,术语“植物培养物”是指在培养基(例如,液体、气体、凝胶、半固体、或固体培养基)中或其上繁殖的一个植物或多个植物、植物部分、植物细胞、或植物组织。植物培养物包括但不限于天然存在的植物、植物部分、植物细胞、或植物组织或基因修饰的植物、植物部分、植物细胞、或植物组织的培养物。根据组织来源和培养的植物材料的分化水平,可以将植物培养物分为例如,无组织的培养物(例如,植物细胞培养物,如愈伤组织、悬浮液、或原生质体培养物)或有组织的培养物(如根、幼苗、胚、或整个植物培养物)。该植物培养物可以是水培培养物。如本文所用,术语“水培的”是指植物或植物部分(例如,植物根)的不包括天然土壤的含水生长系统。此类水培生长系统包括例如包含液体或半液体(例如,水性)、凝胶、半固体、或含水固体培养基的植物生长系统。水培培养物(hydroponicculture)可以包括复合养殖(aquaponic)、水培(hydroculture)、或水产养殖(aquaculture)生长系统。
如本文所用,术语“未处理的植物培养物”是指未接触或递送本文的刺激剂的植物培养物(例如,包含植物、植物细胞、或植物部分的培养物),例如,未递送刺激剂的单独的植物培养物或在递送该刺激剂之前的时间点评价的相同植物培养物。
如本文所用,术语“生物反应器”是指容量为至少1L(例如,至少5L、至少10L、至少50L、至少100L、至少500L、或至少1000L)的培养容器,该培养容器允许在受控条件下(例如,受控的无菌、混合速率、温度、光、供氧、和/或营养培养基中的一种或多种)培养(culturing)、繁殖、栽培(cultivating)、维持、或储存植物、植物部分(例如,植物组织)、或植物细胞。生物反应器可以含有整个植物或植物部分(例如,可以包含水培系统)或植物细胞(例如,可以含有植物细胞培养物)。生物反应器可以含有用于植物、植物部分、或植物细胞生长的任何合适的基质,液体、固体、半固体、或凝胶基质。
如本文所用,术语“刺激剂”是指一种药剂(例如,非生物刺激剂、生物刺激剂、化学激发剂、核酸刺激剂、或多肽刺激剂),该药剂在与植物、植物部分、或植物细胞(例如,植物培养物)接触时(例如,以有效量和有效持续时间),相对于未处理的植物培养物,增加该植物培养物细胞外囊泡的生物发生(例如,细胞内产生或分泌,例如,分泌到培养基中),和/或相对于未处理的培养物,增加可源自该植物培养物的PMP的量。
如本文所用,术语“非生物刺激剂”是指无生命的化学和/或物理因子,该无生命的化学和/或物理因子通过例如,通过渗透胁迫、干旱、水分剥夺、洪涝、高光强度、非常高的光强度、高温、低温、盐度、重金属毒害作用、厌氧生活、养分缺乏(例如,氮或磷缺乏)、养分过量、UV照射、大气污染(例如,臭氧)、或暴露于诱导活性氧(ROS)的产生的化学物质(例如,百草枯)刺激细胞外囊泡(EV)的产生和/或增加可源自植物、植物部分、或植物细胞(例如,植物培养物,例如,植物细胞培养物或组织培养物或包含植物部分或整个植物的培养物(例如,水培培养物))的PMP的量。
如本文所用,术语“生物刺激剂”是指一种生物剂(例如,植物有害生物,例如,真菌、细菌、病毒、原生动物、线虫、或食草昆虫)或其组分(例如,蛋白质或多肽、核酸、糖、或小分子),该生物剂或其组分刺激细胞外囊泡的产生和/或增加可源自植物、植物部分、或植物细胞(例如,植物培养物,例如,植物细胞培养物或组织培养物、包含植物部分的培养物、或包含整个植物的培养物)的PMP的量。术语“微生物刺激剂”是指包括微生物(例如,真菌、细菌、或病毒)或其组分(例如,能够由该微生物产生的蛋白质或多肽、核酸、糖、或小分子)的生物刺激剂。示例性微生物刺激剂包括但不限于细菌多肽延伸因子Tu 18(EFT18)和真菌多肽鞭毛蛋白2。
如本文所用,术语“化学激发剂”是指天然或合成的化合物,该天然或合成的化合物刺激细胞外囊泡的产生和/或增加可源自植物、植物部分、或植物细胞(例如,植物培养物,例如,植物细胞培养物或组织培养物、包含植物部分的培养物、或包含整个植物的培养物)的PMP的量。示例性化学激发剂包括但不限于水杨酸、苯并噻二唑和2,6-二氯异烟酸。在一些实例中,该化学激发剂在植物中诱导与植物病原体(例如,细菌病原体或真菌病原体)诱导的应答或在植物病原体诱导时从植物释放的化合物(例如,内源性激发剂)诱导的应答相似的防御应答。该防御应答可以包括例如,增加EV的产生。
如本文所用,术语“被配制用于递送至植物或植物有害生物”是指包括农业上可接受的载体的植物信使包(PMP)组合物。如本文所用,“农业上可接受的”载体或赋形剂是适用于在农业中使用(例如,用于植物)的载体或赋形剂。在某些实施例中,农业上可接受的载体或赋形剂与合理的益处/风险比相称,不会对植物、环境或食用由其衍生所得的农产品的人或动物具有过度的不利副作用。
如本文所用,“降低植物有害生物的适应度”是指作为施用本文描述的PMP组合物的结果而产生的对有害生物生理学或由所述有害生物进行的任何活动的任何破坏,包括但不限于以下任何一种或多种希望的作用:(1)使有害生物的群体降低约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、100%或更多;(2)使有害生物(例如,昆虫)的繁殖能力或速率降低约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、100%或更多;(3)使有害生物的移动性降低约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、100%或更多;(4)使有害生物的体重降低约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、100%或更多;(5)使有害生物的代谢速率或活性降低约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、100%或更多;或(6)使有害生物的植物侵染降低约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、100%或更多。与未被施用该有害生物防治(例如,生物型杀有害生物剂或生物驱避剂)组合物的有害生物相比,可以确定有害生物适应度的降低。
如本文所用,“降低病原体的适应度”是指作为施用本文描述的PMP组合物的结果,对病原体生理学的任何破坏,包括但不限于以下任何一种或多种希望的作用:(1)使病原体的群体降低约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、100%或更多;(2)使病原体的繁殖能力或速率降低约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、100%或更多;(3)使病原体的移动性降低约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、100%或更多;(4)使病原体的体重或质量降低约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、100%或更多;(5)使病原体的代谢速率或活性降低约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、100%或更多;或(6)使病原体的病原体传播(例如,病原体从一只昆虫到另一只昆虫的垂直或水平传播)降低约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、100%或更多。可以例如与未处理的病原体相比确定病原体适应度的降低。
如本文所用,“降低媒介的适应度”是指作为施用本文描述的PMP组合物的结果而产生的对媒介生理学或由所述媒介进行的任何活动的任何破坏,包括但不限于以下任何一种或多种希望的作用:(1)使媒介群体降低约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、100%或更多;(2)使媒介(例如,昆虫(例如蚊子、蜱、螨、虱子))的繁殖能力或速率降低约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、100%或更多;(3)使媒介(例如,昆虫,例如蚊子、蜱、螨、虱子)的移动性降低约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、100%或更多;(4)使媒介(例如,昆虫,例如蚊子、蜱、螨、虱子)的体重降低约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、100%或更多;(5)使媒介(例如,昆虫,例如蚊子、蜱、螨、虱子)的代谢速率或活性增加约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、100%或更多;(6)使由媒介(例如,昆虫,例如蚊子、蜱、螨、虱子)导致的媒介-媒介病原体传播(例如,媒介从一只昆虫到另一只昆虫的垂直或水平传播)降低约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、100%或更多;(7)使媒介-动物病原体传播降低约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、100%或更多;(8)使媒介(例如,昆虫,例如蚊子、蜱、螨、虱子)寿限降低约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、100%或更多;(9)使媒介(例如,昆虫,例如蚊子、蜱、螨、虱子)对杀有害生物剂(例如,杀昆虫剂)的易感性增加约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、100%或更多;或(10)使媒介(例如,昆虫,如蚊子、蜱、螨、虱子)的媒介效能降低约10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、100%或更多。可以例如与未处理的媒介相比确定媒介适应度的降低。
如本文所用,“增加植物的适应度”是指与本文描述的PMP组合物接触而直接导致的植物的适应度增加,并且包括例如,改善的产率、改善的植物活力、或从植物收获的产品的改善的品质或数量、对于农业或园艺被认为令人满意的收获前或收获后的性状(例如,味道、外观、保质期)的改善、或其他有益于人的性状的改善(例如,减少过敏原产生)。改善的植物产率涉及相对于在相同条件下但不应用本发明组合物而生产的植物的相同产品的产率或与应用常规植物修饰剂(例如,未递送PMP的植物修饰剂)相比,按可测量量计植物的产品的产率的增加(例如,如通过植物生物质、谷粒、种子或果实产率、蛋白质含量、碳水化合物或油含量或叶面积测量的)。例如,产率可以增加至少约0.5%、约1%、约2%、约3%、约4%、约5%、约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约100%、或大于100%。产率可以以在某种基础上植物或植物的产品的按重量或体积计量来表示。基础可以以时间、生长面积、生产的植物的重量、或所用原料的量来表示。植物适应度的增加也可以以其他方式来测量,如相对于在相同条件下但不施用本发明组合物或施用常规农业药剂而生产的植物的相同因素,以活力等级的增加或改善、植株密度(stand)(植物数量/单位面积)增加、植物高度增加、秆围增加、植物冠层增加、外观(如视觉测量的更绿的叶颜色)改善、根等级改善、出苗增加、蛋白质含量、叶尺寸增大、叶数量增加、更少的死的基生叶、分蘖强度增加、营养或所需肥料减少、种子萌发增加、分蘖生产率增加、开花增加、种子或谷粒成熟或种子成熟度增加、更少的植物倒伏、芽生长增加、或这些因素的任何组合,按可测量或可察觉的量来测量。
如本文所用,术语“有效量”、“有效浓度”或“有效于……的浓度”是指PMP或其组合物的量,该量足以在靶生物体中或靶生物体上影响所述结果或达到目标水平(例如,预定或阈值水平)。
如本文所用,术语“异源的”是指(1)对植物是外源的(例如,来源于不是产生PMP的植物或植物部分的源)(例如,使用本文描述的负载方法添加PMP)或(2)对产生PMP的植物细胞或组织是内源的,但以高于在自然界中发现的浓度(例如,高于在天然存在的植物细胞外囊泡中发现的浓度)的浓度存在于PMP中(例如,使用本文描述的负载方法、遗传工程、体外或体内方法添加PMP)的药剂。
如本文所用,术语“功能剂”是指使用体内或体外方法与PMP或可以与PMP缔合(例如,负载到PMP中或负载到PMP上(例如,被PMP包封、包埋在PMP中或与其缀合),并且能够根据本发明的组合物或方法影响所述的结果(例如,增加或降低植物、植物有害生物、植物共生体、动物(例如,人)病原体或动物病原体媒介的适应度)的药剂(例如,农业药剂(例如,杀有害生物剂、肥料剂、除草剂、植物修饰剂)或治疗剂(例如,抗真菌剂、抗细菌剂、杀病毒剂、抗病毒剂、杀昆虫剂、杀线虫剂、抗寄生生物剂或昆虫驱避剂))。
如本文所用,术语“农业药剂”是指可以作用于植物、植物有害生物或植物共生体的药剂,例如杀有害生物剂、有害生物驱避剂、肥料剂、除草剂、植物修饰剂或植物共生体修饰剂。
如本文所用,术语“肥料剂”是指能够增加植物(例如,植物营养素或植物生长调节剂)或植物共生体(例如,核酸或肽)的适应度的药剂。
如本文所用,术语“杀有害生物剂”是指防治或降低农业、环境、或家内/家庭(domestic/household)害虫(诸如昆虫、软体动物、线虫、真菌、细菌、杂草、或病毒)的适应度(例如,杀死或抑制生长、增殖、分裂、繁殖或扩散)的药剂、组合物或其中的物质。杀有害生物剂应理解为包括天然存在的或合成的杀昆虫剂(杀幼虫剂或杀成虫剂)、昆虫生长调节剂、杀蜱螨亚纲动物剂(杀螨剂)、杀软体动物剂、杀线虫剂、杀外寄生物剂、杀细菌剂、杀真菌剂、或除草剂。术语“杀有害生物剂”可以进一步涵盖其他生物活性分子,诸如抗生素、抗病毒剂、杀有害生物剂、抗真菌剂、抗蠕虫剂、营养物、和/或使昆虫运动停止或减缓的药剂。
如本文所用,术语“植物修饰剂”是指可以以导致植物适应度增加的方式改变植物的遗传特性(例如,增加基因表达、减少基因表达或改变DNA或RNA的核苷酸序列)或生化特性的药剂。
如本文所用,术语“治疗剂”是指可作用于动物(例如,人)、动物病原体、或病原体媒介的药剂,如抗真菌剂、抗细菌剂、杀病毒剂、抗病毒剂、杀昆虫剂、杀线虫剂、抗寄生生物剂、或昆虫驱避剂。
如本文所用,术语“基因修饰的”、“基因修饰的植物”、“基因修饰的植物部分”、或“基因修饰的植物细胞”是指已使用本领域已知的任何方法(例如,递送核酸或(例如,异源DNA或RNA)或基因编辑蛋白系统(例如,CRISPR-Cas系统、TALEN、或锌指))而遗传改变(例如,以增加或降低内源性核酸的表达、以修饰内源性核酸的核苷酸序列、或以表达外源基因)的植物、植物部分、或植物细胞(例如,植物培养物)。在某些情况下,基因修饰的植物、植物部分、或植物细胞含有相对于未修饰的植物培养物可有效增加植物培养物中植物EV的产生和/或相对于未修饰的植物培养物增加可源自该植物培养物的PMP的量的基因修饰。
如本文所用,术语“核酸”和“多核苷酸”是可互换的并且是指线性或支链的、单链或双链的RNA或DNA,或其杂交体,无论长度(例如,至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、100个、150个、200个、250个、500个、1000个、或更多个核酸)。该术语还涵盖RNA/DNA杂交体。核苷酸典型地通过磷酸二酯键连接在核酸中,尽管该术语“核酸”还涵盖具有其他类型的连接或主链的核酸类似物(例如,磷酰胺、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、O-甲基氨基磷酸酯、吗啉代、锁核酸(LNA)、甘油核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、和肽核酸(PNA)连接或主链,等)。核酸可以是单链、双链的,或含有单链和双链序列二者的部分。核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的任何组合,以及碱基(包括,例如,腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶、和修饰的或非典型碱基(包括,例如,次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、和5羟基甲基胞嘧啶))的任何组合。
如本文所用的,术语“肽”、“蛋白质”或“多肽”涵盖天然或非天然存在的氨基酸(D-或L-氨基酸)的任何链,无论长度(例如,至少2、3、4、5、6、7、10、12、14、16、18、20、25、30、40、50、100或更多个氨基酸)、存在或不存在翻译后修饰(例如,糖基化或磷酸化)、或存在例如与肽共价连接的一个或多个非氨基酰基基团(例如,糖、脂质等),并且包括例如天然蛋白、合成的或重组的多肽和肽、杂交分子、类肽或模拟肽。
如本文所用,术语“有害生物”是指对植物或其他生物体造成损害,存在于不希望它们的地方,或在其他方面例如通过影响人类农业方法或产品而对人不利的生物体。有害生物可以包括例如无脊椎动物(例如,昆虫、线虫、或软体动物);微生物(例如,植物病原体、内生植物、专性寄生生物、兼性寄生生物、或兼性腐生植物),诸如细菌、真菌、或病毒;或杂草。
如本文所用,术语“被配制用于递送至动物”是指包含药学上可接受的载体的PMP组合物。如本文所用,“药学上可接受的”载体或赋形剂是适用于施用至动物(例如,人)的载体或赋形剂并且例如对动物(例如,人)无过度的不利副作用的载体或赋形剂。
如本文所用,术语“驱避剂”是指阻止有害生物接近或保留在植物上或阻止病原体媒介(例如,昆虫,例如,蚊子、蜱、螨、或虱子)接近或保留在动物上的药剂、组合物或其中的物质。驱避剂可以例如降低植物上或附近的有害生物的数量,但不一定杀死或降低该有害生物的适应度。
如本文所用,术语“植物细胞外囊泡”、“植物EV”、或“EV”是指植物中天然存在的封闭的脂质双层结构。任选地,植物EV包含一种或多种植物EV标记物。如本文所用,术语“植物EV标记物”是指与植物EV天然缔合的组分,诸如植物蛋白、植物核酸、植物小分子、植物脂质、或其组合,包括但不限于附录中列出的任何植物EV标记物。在一些情况下,植物EV标记物是植物EV的鉴定标记物,但不是杀有害生物剂。在一些情况下,植物EV标记物是植物EV的鉴定标记物,而且还是杀有害生物剂(例如,与多个PMP缔合或被其包封的、或不直接与多个PMP缔合或被其包封的)。
如本文所用,术语“植物信使包”或“PMP”是指直径为约5-2000nm(例如,至少5-1000nm、至少5-500nm、至少400-500nm、至少25-250nm、至少50-150nm、或至少70-120nm)的脂质结构(例如,脂质双层,单层、多层结构;例如,囊泡状脂质结构),该脂质结构源自(例如,富集、分离或纯化自)植物源或其节段、部分或提取物,包括与其缔合的脂质或非脂质组分(例如,肽、核酸、或小分子),并且已从植物、植物部分或植物细胞或从植物、植物部分、或植物细胞在其中培养的培养基(例如,植物细胞培养物或水培培养物的培养基,例如,分泌PMP)中富集、分离或纯化,该富集或分离除去来源于源植物、植物部分、或植物细胞或来源于培养基中的一种或多种污染物或不希望的组分。在一些实例中,该分离包括从培养基(例如,水培系统的培养基)中除去完整的植物或植物部分,例如,在不破坏(例如,物理损害)该植物或植物部分的情况下除去该植物或植物部分。PMP可以是天然存在的EV的高度纯化制剂。优选地,除去来自源植物的一种或多种污染物或不希望的组分的至少1%的来自源植物的污染物或不希望的组分(例如,至少2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、45%、50%、55%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、98%、99%、或100%),例如植物细胞壁组分;果胶;植物细胞器(例如,线粒体;质体,诸如叶绿体、白色体或淀粉质体;和核);植物染色质(例如,植物染色体);或植物分子聚集体(例如,蛋白质聚集体、核酸、蛋白质、蛋白质-核酸聚集体、脂蛋白聚集体、脂质-蛋白质结构、或糖类)。优选地,PMP是相对于来自源植物的该一种或多种污染物或不希望的组分至少30%纯的(例如,至少40%纯的、至少50%纯的、至少60%纯的、至少70%纯的、至少80%纯的、至少90%纯的、至少99%纯的、或100%纯的),如通过重量(w/w)、光谱成像(透射率%)、或电导率(S/m)测量。
PMP可以任选地包含另外的药剂,诸如异源功能剂,例如杀有害生物剂、肥料剂、植物修饰剂、治疗剂、多核苷酸、多肽、或小分子。PMP可以以多种方式携带另外的药剂(例如,异源功能剂)或与其缔合,以使该药剂能够递送至靶植物,例如通过包封该药剂、将该药剂结合在脂质双层结构中、或将该药剂(例如,通过缀合)与脂质双层结构的表面缔合。异源功能剂可以体内(例如,在植物体内)或体外(例如,在组织培养物中、在细胞培养物中、或合成地结合)掺入PMP中。
如本文所用,术语“稳定的PMP组合物”(例如,包含负载或未负载的PMP的组合物)是指在一定时间段(例如,至少24小时、至少48小时、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少30天、至少60天、或至少90天)内任选地在限定的温度范围下(例如,至少24℃(例如,至少24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、或30℃)、至少20℃(例如,至少20℃、21℃、22℃、或23℃)、至少4℃(例如,至少5℃、10℃、或15℃)、至少-20℃(例如,至少-20℃、-15℃、-10℃、-5℃、或0℃)、或-80℃(例如,至少-80℃、-70℃、-60℃、-50℃、-40℃、或-30℃)的温度)相对于PMP组合物中PMP的数量(例如,在生产或配制时)保留初始PMP数量(例如,PMP/mL溶液)的至少5%(例如,至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%)的PMP组合物;或任选地在限定的温度范围下(例如,至少24℃(例如,至少24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、或30℃)、至少20℃(例如,至少20℃、21℃、22℃、或23℃)、至少4℃(例如,至少5℃、10℃、或15℃)、至少-20℃(例如,至少-20℃、-15℃、-10℃、-5℃、或0℃)、或-80℃(例如,至少-80℃、-70℃、-60℃、-50℃、-40℃、或-30℃)的温度)相对于PMP的初始活性(例如,在生产或配制时)保留其活性(例如,杀有害生物和/或驱避剂活性)的至少5%(例如,至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%)。
如本文所用,术语“共生体”或“植物共生体”是指赋予植物益处(例如,增加植物的适应度(例如,增加生物质产生(即,产率))、增加植物营养、增加授粉、或增加对胁迫(例如,干旱和/或有害生物)的耐受性)的生物体(例如,昆虫)或微生物(例如,细菌或真菌)。
附图说明
图1A是如下图,其示出了如通过纳米流式细胞术(NanoFCM)测量的洗脱的BMS植物细胞培养物SEC级分中的颗粒浓度(颗粒/ml)。PMP洗脱在SEC级分4-6中。
图1B是如下图,其示出了在
图1C是如下图,其示出了如通过BCA分析确定的洗脱的BMS SEC级分中的蛋白质浓度(μg/ml)。PMP洗脱在级分4-6中;级分9-13含有污染物。
图1D是散点图,其示出了如通过纳米流式细胞术(NanoFCM)测量的合并的含有BMSPMP的SEC级分中的颗粒。根据NanoFCM的说明,使用珠标准品确定PMP浓度(颗粒/ml)。
图1E是如下图,其示出了图1D的门控颗粒的BMS PMP的尺寸分布(nm)(减去背景)。根据NanoFCM的说明,使用Exo珠标准品确定中值PMP尺寸(nm)。
图2是一对图示和一组显微照片,其示出了拟南芥幼苗(上分图)和苜蓿芽(下分图)对标记有DL800的拟南芥(Arabidopsis thaliana)(At)幼苗培养物PMP的摄取。显示了DL800染料的荧光强度。对于拟南芥幼苗在22hpi(处理后小时)并且对于苜蓿芽在24hpi测量荧光强度。不与染料(“阴性对照”)以及与游离DL800染料(“仅DL800染料”)一起孵育的幼苗显示为对照。
图3A是如下图,其示出了如通过纳米流式细胞术(NanoFCM)测量的洗脱的拟南芥幼苗(Ats)水培培养物SEC级分中的颗粒浓度(颗粒/ml)。PMP洗脱在SEC级分4-6中。
图3B是如下图,其示出了在
图3C是如下图,其示出了如通过BCA分析确定的洗脱的Ats SEC级分中的蛋白质浓度(μg/ml)。PMP洗脱在级分4-6中;级分9-13含有污染物。
图3D是散点图,其示出了如通过纳米流式细胞术(NanoFCM)测量的合并的含有AtsPMP的SEC级分中的颗粒。根据NanoFCM的说明,使用珠标准品确定PMP浓度(颗粒/ml)。
图3E是如下图,其示出了图3D的门控颗粒的Ats PMP的尺寸分布(nm)(减去背景)。根据NanoFCM的说明,使用Exo珠标准品确定中值PMP尺寸(nm)。
图4是如下图,其示出了如在仪器的尺寸范围上(50-200nm),使用NanoFCM测量的拟南芥根培养物PMP中给定尺寸(nm)的颗粒的相对频率。数据表示为平均值±SD。
图5A是如下图,其示出了在对照黑色墨西哥甜玉米(Zea mays Black MexicanSweet)(BMS)细胞培养物和用1μM鞭毛蛋白肽flg22处理的BMS细胞培养物中的血细胞压积(PCV;以百分比表示)。
图5B是如下图,其示出了如使用NanoFCM测量的在对照BMS细胞培养物和用1μMflg22处理的BMS细胞培养物中的PMP的浓度。
图5C是如下图,其示出了如使用BCA测定测量的在对照BMS细胞培养物和用1μMflg22处理的BMS细胞培养物中的蛋白质浓度。
图6A是如下图,其示出了在对照黑色墨西哥甜玉米(BMS)细胞培养物和用100μM水杨酸(SA)处理的BMS细胞培养物中的血细胞压积(PCV;以百分比表示)。
图6B是如下图,其示出了如使用NanoFCM测量的在对照BMS细胞培养物和用100μMSA处理的BMS细胞培养物中的PMP的浓度。
图6C是如下图,其示出了如使用BCA测定测量的在对照BMS细胞培养物和用100μMSA处理的BMS细胞培养物中的蛋白质浓度。
图7A是散点图,其示出了如通过NanoFCM测量的、从4L培养物中纯化的含有BMS细胞培养物PMP的SEC级分中的颗粒。左分图示出了BMS PMP,并且右分图示出了BMS缓冲液背景。根据NanoFCM的说明,使用珠标准品确定PMP浓度(颗粒/mL)。
图7B是如下图,其示出了洗脱的BMS细胞培养物SEC级分中的PMP浓度蛋白质浓度(颗粒/mL,如使用NanoFCM测量的)和蛋白质浓度(μg/mL,如通过BCA分析确定的)。PMP洗脱在级分3-8中。
图7C是如下图,其示出了图7A的门控颗粒的BMS细胞培养物PMP的尺寸分布(nm)(减去背景)。根据NanoFCM的说明,使用Exo珠标准品确定中值PMP尺寸(nm)。
图8A是示意图,其示出了无菌的水培植物生长室。
图8B是如下图,其示出了从生长在水培培养物中的番茄植物的根中分离出的PMP的PMP浓度(PMP/mL,如使用NanoFCM测量的)。图示出了平均值±SEM,n=2。
具体实施方式
本文的特征是用于制造植物信使包(PMP)(全部或部分地由植物细胞外囊泡(EV)或其节段、部分或提取物产生的脂质组件)的方法和相关生物反应器。本文的制造方法和生物反应器允许工业化和/或大规模生产PMP。PMP可以任选地包含另外的药剂(例如,异源农业药剂(例如,杀有害生物剂、肥料剂、除草剂、植物修饰剂)或异源治疗剂(例如,抗真菌剂、抗细菌剂、杀病毒剂、抗病毒剂、杀昆虫剂、杀线虫剂、抗寄生生物剂或昆虫驱避剂))。因此,本文描述的PMP组合物和配制品可以配制成用于在一些农业方法或治疗方法中使用的组合物。
I.植物信使包制造
本标题下的以下部分描述了用于生产、制造、以及获得PMP的示例性方法。
PMP是包含植物EV或其节段、部分或提取物(例如,脂质提取物)的脂质(例如,脂质双层,单层或多层结构)结构。植物EV是指一种封闭的脂质双层结构,其天然存在于植物中,并且直径为约5-2000nm。植物EV可以来源于多种植物生物合成途径。在自然界中,植物EV可以发现于植物的细胞内隔室和细胞外隔室,诸如植物质外体(位于质膜外部并且由连续的细胞壁和细胞外空间形成的隔室)。可替代地,在由植物、植物部分、或植物细胞分泌后,可以从植物培养基(例如,细胞培养基或水培系统中的培养基)中富集PMP。可以通过本文进一步描述的各种方法从植物、植物部分、或植物培养物(例如,植物细胞培养物)中分离出植物EV,从而产生PMP。此外,PMP可以任选地包括可体内或体外引入的异源功能剂(例如,异源农业药剂(例如,杀有害生物剂、肥料剂、除草剂、植物修饰剂)或异源治疗剂(例如,抗真菌剂、抗细菌剂、杀病毒剂、抗病毒剂、杀昆虫剂、杀线虫剂、抗寄生生物剂或昆虫驱避剂))。
PMP可以包括植物EV或其节段、部分或提取物。任选地,除源自植物EV的脂质外,PMP还可以包括外源脂质。在一些实施例中,植物EV的直径为约5-2000nm。例如,PMP可以包含平均直径为约5-50nm、约50-100nm、约100-150nm、约150-200nm、约200-250nm、约250-300nm、约300-350nm、约350-400nm、约400-450nm、约450-500nm、约500-550nm、约550-600nm、约600-650nm、约650-700nm、约700-750nm、约750-800nm、约800-850nm、约850-900nm、约900-950nm、约950-1000nm、约1000-1250nm、约1250-1500nm、约1500-1750nm、或约1750-2000nm的植物EV或其节段、部分或提取物。在一些情况下,PMP包含平均直径为约5-950nm、约5-900nm、约5-850nm、约5-800nm、约5-750nm、约5-700nm、约5-650nm、约5-600nm、约5-550nm、约5-500nm、约5-450nm、约5-400nm、约5-350nm、约5-300nm、约5-250nm、约5-200nm、约5-150nm、约5-100nm、约5-50nm、或约5-25nm的植物EV或其节段、部分或提取物。在某些情况下,植物EV或其节段、部分或提取物的平均直径为约50-200nm。在某些情况下,植物EV或其节段、部分或提取物的平均直径为约50-300nm。在某些情况下,植物EV或其节段、部分或提取物的平均直径为约200-500nm。在某些情况下,植物EV或其节段、部分或提取物的平均直径为约30-150nm。
在一些情况下,PMP可以包含平均直径为至少5nm、至少50nm、至少100nm、至少150nm、至少200nm、至少250nm、至少300nm、至少350nm、至少400nm、至少450nm、至少500nm、至少550nm、至少600nm、至少650nm、至少700nm、至少750nm、至少800nm、至少850nm、至少900nm、至少950nm、或至少1000nm的植物EV或其节段、部分或提取物。在一些情况下,PMP包含平均直径小于1000nm、小于950nm、小于900nm、小于850nm、小于800nm、小于750nm、小于700nm、小于650nm、小于600nm、小于550nm、小于500nm、小于450nm、小于400nm、小于350nm、小于300nm、小于250nm、小于200nm、小于150nm、小于100nm、或小于50nm的植物EV或其节段、部分或提取物。可以使用本领域中多种标准方法(例如,动态光散射方法)来测量该植物EV或其节段、部分或提取物的粒径。
在一些情况下,PMP可以包含平均表面积为77nm
在一些情况下,PMP的尺寸可以与植物EV或其节段、提取物或部分相同。可替代地,PMP的尺寸可以与产生PMP的初始植物EV不同。例如,PMP可以具有约5-2000nm的直径。例如,PMP的平均直径可以是约5-50nm、约50-100nm、约100-150nm、约150-200nm、约200-250nm、约250-300nm、约300-350nm、约350-400nm、约400-450nm、约450-500nm、约500-550nm、约550-600nm、约600-650nm、约650-700nm、约700-750nm、约750-800nm、约800-850nm、约850-900nm、约900-950nm、约950-1000nm,约1000-1200nm、约1200-1400nm、约1400-1600nm、约1600-1800nm、或约1800-2000nm。在一些情况下,PMP的平均直径可以是至少5nm、至少50nm、至少100nm、至少150nm、至少200nm、至少250nm、至少300nm、至少350nm、至少400nm、至少450nm、至少500nm、至少550nm、至少600nm、至少650nm、至少700nm、至少750nm、至少800nm、至少850nm、至少900nm、至少950nm、至少1000nm、至少1200nm、至少1400nm、至少1600nm、至少1800nm、或约2000nm。可以使用本领域中多种标准方法(例如,动态光散射方法)来测量PMP的粒径。在一些情况下,在负载异源功能剂之后或在PMP的其他修饰之后确定PMP的尺寸。
在一些情况下,PMP的平均表面积可以是77nm
在一些情况下,PMP可以包含完整的植物EV。可替代地,PMP可以包括植物EV的囊泡的整个表面积的节段、部分或提取物(例如,包括囊泡的整个表面积的小于100%(例如,小于90%、小于80%、小于70%、小于60%、小于50%、小于40%、小于30%、小于20%、小于10%、小于10%、小于5%、或小于1%)的节段、部分或提取物)。节段、部分或提取物可以是任何形状,诸如圆周节段、球形节段(例如,半球)、曲线节段、线性节段、或平坦节段。在节段是囊泡的球形节段的情况下,球形节段可以表示通过将球形囊泡沿一对平行线分裂而产生的球形节段或者通过将球形囊泡沿一对非平行线分裂而产生的球形节段。因此,多个PMP可以包括多个完整的植物EV,多个植物EV节段、部分或提取物,或完整的植物EV和植物EV节段的混合物。本领域技术人员应当理解,完整的植物EV与节段的植物EV的比率将取决于所使用的特定分离方法。例如,与诸如真空渗透的非破坏性提取方法相比,将植物或其一部分研磨或共混可以产生含有更高百分比的植物EV节段、部分或提取物的PMP。
在其中PMP包含植物EV的节段、部分或提取物的情况下,EV节段、部分或提取物可以具有小于完整的囊泡的平均表面积的平均表面积,例如小于77nm
在其中PMP包含植物EV的提取物的情况下,例如在PMP包含从植物EV中提取(例如,用氯仿)的脂质的情况下,PMP可以包含至少1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%或更多的从植物EV提取(例如,用氯仿)的脂质。多个中的PMP可以包含植物EV节段和/或植物EV提取的脂质或其混合物。
本文进一步概述了关于制造PMP、PMP生物反应器、可与PMP缔合的植物EV标记物、和用于包含PMP的组合物的配制品的方法的细节。
A.生产方法
本文描述的生产方法和生物反应器允许工业化和/或大规模生产PMP。可以使用从植物、植物部分、植物组织、或植物细胞的培养物(例如,生物反应器中的植物细胞培养物或水培培养物)中释放的植物EV、或其节段、部分或提取物(例如,脂质提取物)来制造PMP。例如,可以通过涉及以下的方法来制造PMP:(a)获得其中已培养植物、植物部分、或植物细胞的培养基;以及(b)从该培养基中纯化PMP。在另一个实例中,可以通过涉及以下的方法来制造PMP:(a)在培养基中培养植物、植物部分、或植物细胞;(b)收获该培养基;以及(c)从该培养基中纯化PMP。
每个制造步骤将在下面进一步详细讨论。
可以使用各种方法从植物、植物部分、或植物细胞或组织中产生PMP。允许从植物细胞的胞内区、从植物(例如,植物组织或植物部分)的含有EV的质外体级分、或含有分泌的EV的其他细胞外级分(例如,培养基)中释放EV的任何方法适用于本发明的方法。Ev可以通过破坏性(例如,研磨或共混植物或任何植物部分(例如,细胞或组织))或非破坏性(洗涤或真空渗透植物或任何植物部分(例如,细胞或组织))方法来释放。例如,可以将该植物或其部分(例如,细胞或组织)真空渗透、研磨、共混或其组合,以从该植物或植物部分(例如,细胞或组织)中释放EV。例如,释放步骤可以涉及(b)提供植物或其一部分(例如,细胞或组织),其中该释放步骤涉及将植物真空渗透(例如,用囊泡分离缓冲剂)以释放和收集质外体级分。可替代地,释放步骤可以涉及(b)提供植物或其一部分(例如,细胞或组织),其中该释放步骤涉及将植物研磨或共混以释放EV。
关于PMP的分离和纯化的示例性方法例如在以下中找到:Rutter和Innes,PlantPhysiol.[植物生理学]173(1):728-741,2017;Rutter等人,Bio.Protoc.[生物方案]7(17):e2533,2017;Regente等人,J of Exp.Biol.[实验生物学杂志]68(20):5485-5496,2017;Mu等人,Mol.Nutr.Food Res.[分子营养与食品研究],58,1561-1573,2014,和Regente等人,FEBS Letters.[欧洲生化学会联合会快报]583:3363-3366,2009,将其中每个通过引用并入本文。
可以通过另外的纯化方法进一步纯化该粗PMP级分,以产生PMP组合物。例如,可以通过超速离心,例如使用密度梯度(碘克沙醇或蔗糖)和/或使用除去聚集的组分的其他方法(例如,沉淀或尺寸排阻色谱法),将粗PMP级分与其他植物组分分离。相对于在较早分离步骤中产生的一个或多个级分、或相对于预先确定的阈值水平(例如,商业释放规格),所得的纯植物PMP级分可以具有降低水平的污染物(例如,一种或多种非PMP组分,如蛋白质聚集体、核酸聚集体、蛋白质-核酸聚集体、游离脂蛋白、脂质-蛋白质结构)、核、细胞壁组分、细胞的细胞器、或其组合)。例如,相对于在初始样品中的水平,纯PMP可以具有降低水平(例如,降低约5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、或大于100%;或降低约2倍、4倍、5倍、10倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、或大于100倍)的植物细胞器或细胞壁组分。在一些情况下,纯PMP级分基本上不含(例如,具有不可检测水平的)一种或多种非PMP组分,如蛋白质聚集体、核酸聚集体、蛋白质-核酸聚集体、游离脂蛋白、脂质-蛋白质结构、核、细胞壁组分、细胞的细胞器、或其组合。释放和分离步骤的进一步实例可以在实例1中发现。PMP的浓度可以是例如1x10
也可从PMP中除去蛋白质聚集体。例如,可以使PMP经受一定范围的pH(例如,如使用pH探针测量),以沉淀出溶液中的蛋白质聚集体。可以通过添加例如氢氧化钠或盐酸将pH调节至例如pH 3、pH 5、pH 7、pH 9或pH 11。一旦溶液处在指定的pH,就可以将其过滤以除去微粒。可替代地,可以使用诸如Polymin-P或Praestol2640的带电聚合物的添加将PMP絮凝。简而言之,将Polymin-P或Praestol 2640添加到溶液中并且与叶轮混合。然后可以将溶液过滤以除去微粒。可替代地,可以通过增加盐浓度来增溶聚集体。例如,可以将NaCl添加到PMP中,直到其处于例如1mol/L。然后可以将溶液过滤以分离PMP。可替代地,通过增加温度来增溶聚集体。例如,可以将PMP在混合下加热直到溶液达到例如50℃的均匀温度持续5分钟。然后可以将PMP混合物过滤以分离PMP。可替代地,可溶性污染物可以通过尺寸排阻色谱柱根据标准程序从PMP溶液中分离,其中PMP洗脱在第一级分中,而蛋白质和核糖核蛋白以及一些脂蛋白则随后洗脱。蛋白质聚集体去除的效率可以通过在去除蛋白质聚集体之前和之后例如经由BCA/Bradford蛋白质定量测量和比较蛋白质浓度来确定。
本文描述的任何生产方法可以补充有本领域已知的任何定量或定性方法,以在生产过程的任何步骤中表征或鉴定PMP。可以通过估计PMP产率、PMP浓度、PMP纯度、PMP组成、或PMP尺寸的多种分析方法来表征PMP。可以通过本领域中已知的能够进行PMP的可视化、定量、或定性表征(例如,组成鉴定)的许多方法,诸如显微术(例如,透射电子显微术)、动态光散射、纳米颗粒跟踪、光谱法(例如,傅立叶变换红外分析)、或质谱法(蛋白质和脂质分析),来评估PMP。在某些情况下,可以使用方法(例如,质谱法)来鉴定PMP上存在的植物EV标记物,诸如附录中披露的标记物。为了帮助分析和表征PMP级分,可以另外对PMP进行标记或染色。例如,可以将EV用3,3’-二己基氧杂羰花青碘化物(DIOC
在生产过程中,可以任选地制备PMP,使得相对于对照或初始样品中的PMP水平,PMP具有增加的浓度(例如,增加约5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、或大于100%;或增加约2倍、4倍、5倍、10倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、或大于100倍)。PMP可以占PMP组合物的约0.1%至约100%,如约0.01%至约100%、约1%至约99.9%、约0.1%至约10%、约1%至约25%、约10%至约50%、或约50%至约99%中的任一者。在一些情况下,组合物包含至少0.1%、0.5%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、或更多中的任一者的PMP,例如,如通过wt/vol百分比PMP蛋白组成和/或百分比脂质组成(例如,通过测量荧光标记的脂质)测量;参见例如实例3)。在一些情况下,浓缩的药剂用作商业产品,例如最终使用者可以使用稀释的药剂,该稀释的药剂具有显著较低浓度的活性成分。在一些实施例中,将组合物配制成农业浓缩物配制品,例如超低体积浓缩物配制品。
如实例1所展示,使用各种植物细胞培养物可以产生PMP。
如实例2所展示,可以通过多种方法(例如通过使用密度梯度(碘克沙醇或蔗糖)结合超速离心和/或除去聚集的污染物的方法(例如,沉淀或尺寸排阻色谱法))纯化PMP。例如,实例2展示了通过实例1中概述的分离步骤纯化的PMP的纯化。此外,PMP可以根据实例3中展示的方法来表征。
如本文进一步概述,可以在使用之前,将PMP用异源剂修饰或使其负载有异源剂。
B.植物培养物
PMP可获得自各种植物培养物,例如,植物细胞培养物或组织培养物或包含整个植物或植物部分的培养物(例如,水培培养物)。
如本文所用,术语“植物培养物”是指在液体、凝胶、半固体、或固体培养基中或其上繁殖的多个植物细胞、植物部分、植物(例如,整个植物)、或植物组织。植物培养物包括但不限于天然存在的植物、植物部分、植物细胞、或植物组织或基因修饰的植物、植物部分、植物细胞、或植物组织的培养物。
i.植物培养物的来源
植物培养物可获得自许多植物物种,例如,烟草、玉米、小麦、大豆、作物野生近缘种(例如,大刍草(teosinte))、热带种、番茄、水稻、葡萄柚、人参、胡萝卜、向日葵、姜、马铃薯、苔藓、草类、绿藻类、箭舌豌豆(common vetch)、药用植物和极端微生物(extremophile)。例如,可以从获得自任何属植物(维管或非维管)的植物培养物中产生PMP,该任何属植物包括但不限于被子植物(单子叶和双子叶植物)、裸子植物、蕨类、卷柏、木贼类植物、裸蕨植物、石松类植物、藻类(例如,单细胞或多细胞的,例如原始色素体生物、葡萄藻属(Botryococcus)、或小球藻属(Chlorella))或苔藓植物。在某些情况下,使用获得自维管植物的植物培养物可以产生PMP,该维管植物例如单子叶植物或双子叶植物或裸子植物。例如,PMP可以产生自植物细胞培养物、组织培养物、或培养的植物或植物部分,这些植物细胞培养物、组织培养物、或培养的植物或植物部分可获得自苜蓿、苹果、拟南芥属、香蕉、大麦、卡诺拉油菜(canola)、蓖麻籽、菊苣、菊花、三叶草、可可、咖啡、棉花、棉籽、玉米、海甘蓝、蔓越莓、黄瓜、石斛兰属(dendrobium)、薯蓣、桉树、羊茅草、亚麻、唐菖蒲属(gladiolus)、百合科、亚麻籽、粟、甜瓜、芥菜、燕麦、油棕、油菜、番木瓜、花生、菠萝、观赏植物、菜豆属(Phaseolus)、马铃薯、油菜籽、水稻、黑麦、黑麦草、红花、芝麻、高粱、大豆、甜菜、甘蔗、向日葵、草莓、烟草、番茄、草皮草、小麦或蔬菜作物(诸如莴苣、芹菜、西兰花、花椰菜、葫芦);水果树和坚果树,诸如苹果、梨、桃、橙子、葡萄柚、柠檬、酸橙、扁桃、山核桃、胡桃、榛子;藤本植物,诸如葡萄、猕猴桃、蛇麻子;水果灌木和悬钩子,诸如覆盆子、黑莓、醋栗;林木,诸如水曲柳、松树、冷杉、枫树、橡树、栗树、杨树(popular);与苜蓿、卡诺拉油菜、蓖麻籽、玉米、棉花、海甘蓝、亚麻、亚麻籽、芥菜、油棕、油菜、花生、马铃薯、水稻、红花、芝麻、大豆、甜菜、向日葵、烟草、番茄、或小麦。在一些实例中,PMP产生自植物培养物(例如,培养的植物、植物部分、或植物细胞),该植物培养物获得自十字花科(Brassicaceae)(如拟南芥属或欧洲油菜(Brassica napus))的成员、番茄、烟草(例如,烟草BY-2细胞)、水稻、狗尾草(Setaria viridis)(印度牛筋草(Indian goosegrass))、大豆、蚕豆、大麦、或燕麦。
可以使用植物培养物产生PMP,该植物培养物由整个植物或一种或多种植物部分(例如,叶、种子、根、胚根、根毛、芽、茎、下胚轴、花、果实、营养部分(vegetable)、花粉)组成或获得自其中,这些整个植物或一种或多种植物部分包括芽营养器官/结构(例如,叶、茎、下胚轴、根茎、或块茎)、根(例如,初生根、次生根、胚根、根毛、或根瘤)、花和花器官/结构(例如,花粉、苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药、或胚珠)、种子(包括胚、胚乳、或种皮)、孢子、果实(包括成熟子房和相关的组织,例如,花托、隐头花序、或花被)、汁液(例如,韧皮部或木质部汁液)、维管组织、基本组织、肿瘤组织、单细胞、原生质体、胚、愈伤组织、保卫细胞、卵细胞、或其子代。
在培养物中容易生长的植物(例如,如整个植物、植物部分、或植物细胞系)的另外的实例包括拟南芥(水芹)、大蒜(Allium sativum,garlic)、红豆杉(Taxus chinensis)、东北红豆杉(T.cuspidata)、欧洲红豆杉(T.baccata)、短叶红豆杉(T.brevifolia)、南方红豆杉(T.mairei)(紫衫)、长春花(Catharanthus roseus)(蔓长春花)、本氏烟(Nicotianabenthamiana)(茄科(Solanaceae))、包括烟草细胞系(如NT-I或BY-2(NT-I细胞可获得自ATCC,No.74840,还参见美国专利号6,140,075))的烟草(N.Tabacum,tobacco)、水稻(Oryzasativa,rice)、番茄(Lycopersicon esculentum,tomato)、紫花苜蓿(Medicago sativa)(苜蓿)、大豆(Glycine max,soybean)、蒺藜状苜蓿(Medicago truncatula)和紫花苜蓿(M.sativa)(三叶草)、菜豆(Phaseolus vulgaris)(豆)、马铃薯(Solanum tuberosum,potato)、甜菜(Beta vulgaris,beet)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)(甘蔗)、柚木(Tectona grandis,teak)、芭蕉属物种(Musa spp.)(香蕉)、紫竹(Phyllostachys nigra)(竹)、葡萄(Vitis vinifera或V.gamay,grape)、银白杨(Populus alba)(白杨)、油棕(Elaeis guineensis,oil palm)、榆属物种(Ulmus spp.)(榆树)、唐松草(Thalictrumminus,meadow rue)、心叶青牛胆(Tinospora cordifolia)、长春花(Vinca rosea,vinca)、高粱属物种(Sorghum spp.)、多年生黑麦草(Lolium perenne)(黑麦草)、黄瓜(Cucumissativus,cucumber)、石刁柏(Asparagus officinalis)、鸦胆子(Brucea javanica,Yadanxi)、朵丽蝶兰(Doritaenopsis)或蝴蝶兰属(Phalaenopsis)(兰花)、兴安悬钩子(Rubus chamaemorus)(云莓)、小果咖啡(Cojfea arabica)、提莫菲维小麦(Triticumtimopheevii)(小麦)、美味猕猴桃(Actinidia deliciosa)(猕猴桃)、宽叶香蒲(Typhalatifolia)(香蒲)、印度楝(Azadirachta indica,neem)、绒毛钩藤(Uncaria tomentosa)或圭亚那钩藤(U.guianensis)(猫爪藤(cat's claw))、桔梗(Platycodon grandiflorum)(桔梗花)、牛角瓜(Calotropis gigantea)(马利筋)、海滨锦葵(Kosteletzkya virginica)(锦葵)、苹果(Pyrus malus,apple)、罂粟(Papaver somniferum,opium poppy)、柑橘属物种(Citrus ssp.)、墨西哥橘(Choisya ternata)(山梅花)、软猪殃殃(Galium mollugo)(茜草)、狭叶洋地黄(Digitalis lanata)或紫花毛地黄(D.purpurea)(毛地黄)、甜叶菊(Stevia rebaudiana)(甜叶)、黎豆(Stizolobium hassjoo)(马齿苋(purselane))、柳枝稷(Panicum virgatum,switchgrass)、Rudgea jasminoides、西洋参(Panax quinquefolius,American ginseng)、大果柏(Cupressus macrocarpa)或绿干柏(C.arizonica)(柏树(cypress))、香根草(Vetiveria zizanioides,vetiver grass)、催眠睡茄(Withaniasomnifera)(印度人参(Indian ginseng))、豇豆(Vigna unguiculata,cowpea)、珠子草(Phyllanthus niruri)(大戟草(spurge))、块茎状葛(Pueraria tuberosa)或葛根(P.lobata)(葛(kudzu))、棘刺甘草(Glycyrrhiza echinata)(甘草(liquorice)、鹰嘴豆(Cicer arietinum,chick pea)、水飞蓟(Silybum marianum,milk thistle)、红千层(Callistemon citrinus)(瓶刷子树(bottle brush tree))、金黄色黄芪(Astragaluschrysochlorus)(布谷鸟剪秋罗(cuckoo flower))、Coronilla vaginalis(如细胞系39RAR(多变小冠花(crown vetch)))、丹参(Salvia miltiorrhiza,red sage)、绿豆(Vignaradiata,mung bean)、针晶粟草(Gisekia pharnaceoides)、紫花曼陀罗(Datura tatula)或曼陀罗(D.stramonium)(曼陀罗花(devil's trumpet))、和玉蜀黍物种(Zea mays spp.)(玉米(maize/corn))。
这些植物、植物部分、植物细胞、或植物组织可以是基因修饰的。如本文所用,术语“基因修饰的植物培养物”是指其中植物、植物部分、植物细胞、或植物组织已使用本领域已知的任何方法(例如,递送核酸或(例如,异源DNA或RNA)或基因编辑蛋白系统(例如,CRISPR-Cas系统、TALEN、或锌指))而遗传改变(例如,以增加或降低内源性核酸的表达、以修饰内源性核酸的核苷酸序列、或以表达外源基因)的植物培养物。在某些情况下,基因修饰的植物、植物部分、植物细胞、或植物组织含有相对于未修饰的植物、植物部分、植物细胞、或植物组织可有效增加植物、植物部分、植物细胞、或植物组织中植物EV产生的基因修饰。向植物或植物细胞中引入核酸的技术是本领域技术人员众所周知的,并且包括农杆菌介导的技术以及涉及通过植物摄取外源遗传物质的其他技术,如PEG或电穿孔介导的摄取、颗粒轰击介导的递送、和/或显微注射。
ii.包含植物的培养物
植物培养物包括包含整个植物(例如,本文描述的任何植物物种的整个胚、幼苗、幼年植物、或成年植物)的培养物。含有整个植物的培养物可以在任何合适的培养基(例如,液体、气体、凝胶、半固体、或固体培养基)中或其上生长。在一些实例中,在如本文所述的水培系统中培养幼苗、幼年植物、或成年植物(例如,番茄植物、拟南芥植物、水稻植物、或狗尾草植物)。包含整个植物的培养物可以在生物反应器中生长。这些植物可以在水培系统中萌发,或者可以在任何生长阶段被引入到水培系统中。可以将整个植物或仅该植物的一部分(例如,该植物的根系统)暴露于培养基。
iii.包含植物部分的培养物
植物培养物包括包含植物部分的培养物。植物部分包括但不限于叶(例如,叶片、小叶、叶状柄、或叶柄)、种子(包括胚、胚乳、或种皮)、根(例如,初生根、次生根、胚根、根毛、或根瘤)、芽营养器官/结构(例如,叶、茎、下胚轴、根茎、或块茎)、花和花器官/结构(例如,花粉、苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药、或胚珠)、果实(包括成熟子房和相关的组织,例如,花托、隐头花序、或花被)、营养部分、花粉、种子、孢子、汁液(例如,韧皮部或木质部汁液)、或植物组织(例如,维管组织、基本组织、薄壁组织、厚壁组织、厚角组织、或肿瘤组织)。含有植物部分的培养物可以在任何合适的培养基(例如,液体、气体、凝胶、半固体、或固体培养基)中或其上生长。在一些实例中,植物部分在如本文所述的水培系统中培养。包含植物部分的培养物可以在生物反应器中生长。在一些实例中,在液体培养基(例如,根培养物)中培养根(例如,拟南芥根)。在一些实例中,这些根不与植物的芽部分缔合。该根培养物可以是发根培养物,例如,已经通过与发根根瘤菌(Rhizobium rhizogenes)的根诱导(Ri)质粒接触而诱导出无限生长的根培养物。
iv.植物细胞培养物
植物细胞培养物包括无组织的细胞培养物,其中多个培养的细胞未组织成多细胞植物的组织或器官,如多细胞植物的叶、根、芽、或繁殖结构。示例性无组织的细胞培养物包括愈伤组织培养物、细胞悬浮培养物和原生质体培养物。植物细胞培养物还包括单细胞植物,例如,含有单细胞质体的生物体(如藻类)。在一些实例中,该植物细胞培养物是烟草BY-2细胞培养物,例如,液体培养基中的烟草BY-2细胞培养物。在一些情况下,植物细胞培养物源自愈伤组织。愈伤组织是指含有多个未分化的细胞(例如,薄壁组织细胞)的无组织的细胞团或由其衍生的细胞。存在几类愈伤组织。表现出一定程度的器官再生的愈伤组织根据再生的器官而称为胚性愈伤组织、根状愈伤组织、或芽状愈伤组织。未表现出器官再生的愈伤组织可以是致密愈伤组织(细胞紧密聚集)或松散愈伤组织(细胞容易彼此分离)。
在一些情况下,愈伤组织源自植物组织外植体(例如,切除的植物部分)。外植体可以是整个或部分的植物部分,这些整个或部分的植物部分包括胚、体细胞胚、分生组织区、根尖、腋芽、愈伤组织、单细胞、花丝、叶、茎、花、柱头、根、根茎、块茎、芽、配子体、孢子体、花粉、种子、小孢子、大孢子、果实和肿瘤组织。可以使用药剂(如次氯酸钠、氯化汞和乙醇)对外植体进行表面灭菌(例如,通过冲洗、擦拭、或浸没)。无菌生长的幼苗(例如,在无菌条件下由表面无菌的种子生长的幼苗)也可用作用于产生愈伤组织的外植体。
在植物细胞培养物源自外植体的情况下,诱导所述外植体以形成愈伤组织。本领域技术人员将认识到,有利于愈伤组织形成的条件在物种、基因型、或植物组织之间是不同的。诱导愈伤组织的方法包括应用植物激素。通常,生长素(例如,2,4-D、IAA、NAA、IBA)和细胞分裂素(例如,激动素、BA、玉米素、2iP)组合使用。还可以使用油菜素类固醇和脱落酸。诱导愈伤组织的植物激素通常通过包含在愈伤组织诱导培养基(CIM)中来递送至植物。此培养基通常含有无机盐和维生素(例如,Millipore Sigma Murashige和Skoog基础盐混合物)、碳水化合物源(例如,蔗糖、葡萄糖、果糖、山梨糖醇、甘露醇)、和支持基质(例如,琼脂、滤纸、棉花、蛭石)。该培养基中还可包括抗生素,如杀真菌剂和杀细菌剂。可以影响愈伤组织形成的其他条件包括温度、光条件、和外植体的方向。可替代地,可以通过创伤和或病原体感染(例如,由细菌根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)诱导的冠瘿肿瘤)来诱导愈伤组织。可以将已从外植体诱导的愈伤组织与该外植体分离,例如,通过切除外植体组织或通过将该愈伤组织的全部或亚群(一个或多个细胞)移植到单独的基质中,以提供用于在植物细胞培养物中使用的愈伤组织。在松散愈伤组织细胞生长在液态培养基中的情况下,可以将这些细胞在所述液态培养基中振荡或搅拌以将愈伤组织结构分散成单细胞或小细胞聚集体(均质化)。可以使用筛来除去大的细胞聚集体。
C.植物细胞培养的方法
i.生长基质
在一些情况下,植物培养物(例如,植物细胞培养物、包含植物部分的培养物、或包含整个植物的培养物)可以在固体、半固体、或凝胶基质上生长。用于植物培养物的固体基质可以包括琼脂、琼脂糖、滤纸、棉花、蛭石、无菌的天然土壤、或无菌的合成土壤。通过包括浸泡、喷洒、或将培养基直接掺入基质(例如,琼脂)中的方法,可以将固体基质上的植物培养物暴露于培养基中。通常将植物培养物保持在无菌(sterile/aseptic)条件下。本领域技术人员将熟悉保持无菌的技术,该技术包括使用层流柜以及设备的灭菌(例如,高压灭菌法、火焰灭菌法)。
在一些情况下,植物培养物(例如,植物细胞培养物、包含植物部分的培养物、或包含整个植物的培养物)可以在如本文所述的液体培养基上生长。液体培养基中的植物培养物可以包含在各种容器(包括烧瓶、试管和瓶)中。植物培养物可以包含在如本文所述的生物反应器中。
ii.生物反应器容器
如本文所用,术语“生物反应器”是指容量为至少1L(例如,至少2L、3L、4L、5L、至少10L、至少20L、30L、50L、至少100L、至少200L、250L、500L、750L、或至少1000L)的培养容器,该培养容器允许在受控条件下(例如,受控的无菌、混合速率、温度、光、供氧、和/或营养培养基中的一种或多种)培养(culturing)、繁殖、栽培(cultivating)、维持、或储存植物(例如,整个植物)、植物部分、植物细胞、或植物组织。本文所述的植物、植物部分或植物细胞培养方法中的任何一种都可在生物反应器中进行。通常,生物反应器可用于培养植物细胞或愈伤组织。
可以使用各种生物反应器制造PMP。这样的生物反应器可以包括可以是具有几种可能的形状的封闭或开放系统的容器,如大桶、罐、烧瓶、试管、广口瓶、或袋。该容器可以由合适的材料(例如,玻璃、塑料、或金属)构成。在一些情况下,该容器可以是可重复使用的,例如,Eppendorf
具有各种体积容量的生物反应器可用于培养植物培养物以制造PMP。例如,该生物反应器可以具有至少1L(例如,至少1L、至少2L、至少5L、至少10L、至少50L、至少100L、至少200L、至少300L、至少400L、至少500L、至少600L、至少700L、至少800L、至少900L、至少1000L、至少2000L、至少3000L、至少4000L、至少5000L、至少6000L、至少7000L、至少8000L、至少9000L、至少10,000L、或大于10,000L)的容量。在一些情况下,该生物反应器具有约1L至约10L、约10L至约50L、约50L至约100L、约100L至约500L、约500L至约1000L、约1000L至约5000L、约5000L至约10,000L的容量。
生物反应器容器可以包括用于添加和/或除去培养基和/或培养的植物、植物部分、或植物细胞的无菌组件,如无菌连接至生物反应器容器的无菌进料容器、无菌过滤器采样探针(例如,
iii.水培系统
在一些情况下,植物培养物(例如,包含植物部分的植物培养物或包含整个植物的培养物)在水培系统中生长。对于一些应用,该水培系统可以是生物反应器。水培系统通过除天然土壤之外的培养基为植物提供营养素。示例性水培系统将植物的根暴露于包含营养素(例如,确定的营养素)的培养基(例如,液体培养基)中。可以悬浮或支撑植物或植物部分,使得仅植物或植物部分的一部分(例如,根或胚根)与培养基接触。该水培系统可以是例如静态溶液培养、连续流动溶液培养、使用营养膜技术的培养、气培培养、雾培(fogponic)培养、被动式地下灌溉培养、消长(ebb and flow)地下灌溉培养、深水培养、或旋转培养。水培系统包括水培(hydroculture)系统(例如,根据标准方法工程化的被动式水培(即,灯芯(wick))系统)。该水培系统可以包含惰性生长培养基,例如,黏土、轻质膨胀黏土聚集体(LECA)、蛭石、碎石、珍珠岩、或岩棉。
该水培系统可以具有至少1L(例如,至少1L、至少2L、至少5L、至少10L、至少50L、至少100L、至少200L、至少300L、至少400L、至少500L、至少600L、至少700L、至少800L、至少900L、至少1000L、至少2000L、至少3000L、至少4000L、至少5000L、至少6000L、至少7000L、至少8000L、至少9000L、至少10,000L、或大于10,000L)的容量。在一些情况下,该水培系统具有约1L至约10L、约10L至约50L、约50L至约100L、约100L至约500L、约500L至约1000L、约1000L至约5000L、约5000L至约10,000L的容量。
在一个方面,本文包括用于产生植物信使包的方法,该方法包括(a)在水培系统中培养植物或植物部分;(b)收获培养基,以及(c)从该培养基中纯化PMP。
在另一个方面,本文包括用于产生植物信使包的方法,该方法包括(a)在水培系统中培养植物或植物部分;(b)将该植物或植物部分暴露于有效量的刺激剂中以增加PMP的产生;(c)收获培养基,以及(d)从该培养基中纯化PMP。
iv.培养基
生物反应器容器(例如,含有植物细胞培养物或水培培养物的容器)可进一步含有培养基。该培养基可以是含有涉及植物细胞生长的因子的液体、凝胶、半固体、固体、或雾化溶液。该培养基可以含有支持基质,例如,琼脂、琼脂糖、或结冷胶。该培养基可以含有一种或多种碳源,例如,蔗糖、葡萄糖、果糖、山梨糖醇、或甘露醇。碳源的浓度可以在0与大于50克/升之间(例如,大于0克/升、10克/升、20克/升、30克/升、40克/升、或50克/升)变化。该培养基可以含有一种或多种常量营养素,例如,碳(C)、氢(H)、氧(O)、氮(N)、磷(P)、钾(K)、钙(Ca)、镁(Mg)、或硫(S)。该培养基可以含有一种或多种微量营养素,如铁(Fe)、锰(Mn)、锌(Zn)、铜(Cu)、钼(Mo)、碘(I)、硼(B)、钴(Co)、铝(Al)、镍(Ni)、钠(S)、硅(Si)、或氯(Cl)。该培养基可以含有一种或多种有机补充剂,这些有机补充剂可能包括氨基酸(例如,Ala、Arg、Asn、Cys、His、Ile、Leu、或Met)、维生素、和其他辅因子(例如,肌醇、硫胺素、吡哆醇、叶酸、抗坏血酸、生育酚、酵母提取物、或蛋白胨)。该培养基可以含有一种或多种盐。示例性培养基使Millipore Sigma Murashige和Skoog基础盐混合物。在一些情况下,该培养基可以含有一种或多种植物生长因子,例如,植物激素和/或人造生长调节剂(例如,IAA、2,4-D、NAA、IBA、2,4,5-T、激动素、BAP、玉米素、嘌呤、腺嘌呤、GA
此外,该培养基可以包括一种或多种刺激剂,如本文ID部分所概述的那些。另外或可替代地,该培养基可以含有掺入PMP中的一种或多种异源功能剂,如本文III部分描述的那些。在一些情况下,该培养基包括一种或多种植物EV刺激剂和一种或多种异源功能剂,其中将该异源功能剂掺入PMP中。
v.培养条件和培养模式
可以将植物、植物细胞、或植物部分在生物反应器(例如,在植物细胞培养物或在水培系统中)中培养任何合适的时间段,例如,少于一天、至少一天、两天、三天、四天、五天、六天、七天、一周、两周、三周、一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、一年、或多于一年。在一些实例中,将植物在生物反应器(例如,水培系统)中培养其全部或部分生命周期(例如,萌发、幼苗期、幼年期、相变、成年期、开花、结果、或衰老中的一个、多于一个或全部)。
在一些情况下,可以将植物、植物部分、或植物细胞连续地浸入培养基(例如,液相生物反应器或淹没式生物反应器)中。在其他情况下,植物、植物部分、或植物细胞浸入培养基可以是间歇性的(例如,间歇浸没式(ebb and flood)生物反应器、消长生物反应器(例如,消长水培系统))。在此类生物反应器中,可替代地将植物、植物部分、或植物细胞浸入培养基中并暴露于气体组合物中。浸入的持续时间和频率可以变化。在其他情况下,细胞可以暴露于雾、薄雾(mist)、喷雾或气雾形式的培养基中(例如,营养喷雾生物反应器、薄雾生物反应器)。
在生物反应器中可以使用几种培养模式。例如,生物反应器可用于发展分批培养、补料分批培养、连续培养、或半连续培养(例如,定期收获和更换培养基的培养)。在分批培养中,允许植物、植物部分、或植物细胞在固定体积的培养基中生长整个生长期。在补料分批培养中,在给定体积的培养基中开始植物、植物部分、或植物细胞培养,并且随时间推移添加更多的培养基(连续地或逐步增加)。在连续培养中,培养体积保持恒定,这是由于添加了新鲜的生长培养基并且以相称的体积弃去了植物培养物和/或培养基。
在半连续培养期间,将植物、植物部分、或植物细胞保留在生物反应器中,同时移除(例如,收获)或更换全部或部分培养基。可以以任何合适的时间间隔(例如,每天一次、每两天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次、每周一次、每两周一次、每个月一次、或以大于一个月一次的时间间隔)移除(例如,收获)或更换培养基。可替代地,当培养物处于特定条件下时(例如,当培养物的密度达到阈值水平时),可以收获并更换该培养基。在设计用于植物培养的培养基交换装置时,应考虑以重复循环长期(3-4个月)运行。
在一些情况下,可以给培养物进行通气。通气中使用的气体组合物可以包括O
在一些情况下,可以将培养物混合。混合方法可以包括机械搅拌(例如,船用叶轮、螺旋带叶轮、锚式叶轮、斜叶叶轮、Rushton叶轮、螺旋搅拌器、磁力搅拌器、振动多孔板)、使用鼓泡塔(即,柱形容器的气体鼓泡)、使用气升式反应器(即,气体在具有物理分隔的通道的容器中鼓泡,例如通过挡板、同心圆柱、或外部回路而产生向上和向下的气体和液体流)、外部搅拌(例如,置于振荡或摇动的板上)及其组合。混合可以是间歇或连续的。
在一些情况下,包含在生物反应器容器中的培养物可以定期地或连续地暴露于光下。光强度可以介于0与20千勒克斯(Klux)之间,例如,大于0Klux、5Klux、10Klux、15Klux、或20Klux。光的波长可包括100nm-100μm(紫外光、可见光和红外光)。光源可以是反应器外部的(例如,荧光灯、卤素灯泡、金属卤化物灯泡、发光二极管、固态灯、或阳光)或内部的(例如,包封的灯、或光纤电缆)。光周期(每24小时一天的照明持续时间)可以在0小时(无曝光)和24小时(连续曝光)之间,例如0小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时或24小时。
可以将生物反应器设置为各种温度。在一些情况下,可以控制温度,使得该培养基和/或环境温度对于特定的植物、植物部分、或植物细胞的生长或活力是最佳的温度。例如,在一些情况下,生物反应器容器中的培养物的温度为21℃-30℃,例如,21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃。本领域技术人员应理解,生长的最佳温度将取决于植物或植物部分的类型、植物细胞的类型、或植物组织的类型。在其他情况下,如在标题为“刺激剂”的部分中所述,可以将温度设置为用于刺激从植物组织和细胞中产生或分泌EV的最佳温度或用于最大化可源自植物培养物的PMP的量的最佳温度。可以以各种方式调节生物反应器中的温度,如通过包含在容器中的温度控制元件、围绕容器的流体循环夹套、或容器下方的加热垫。
此外,生物反应器中培养基的pH可以设置为任何期望的pH。在一些情况下,可以控制pH,使得该培养基对于特定的植物、植物部分、或植物细胞的生长或活力是最佳的pH。例如,在一些情况下,培养物的pH的范围可以为pH 3.5至pH 7.5,例如,pH大于3.5、4.5、5.5、6.5、或7.5。在其他情况下,如在标题为“刺激剂”的部分中所述,可以将pH设置为用于刺激从植物组织和细胞中产生或分泌EV的最佳pH或用于最大化可源自植物培养物的PMP的量的最佳pH。pH可以随培养物的阶段和营养摄入而变化。可以通过添加改变pH的试剂(例如,酸、碱)来手动调节pH。
可以存在用于测量培养条件的组件,并且这些组件可以包括温度计、pH传感器、溶解氧传感器和溶解CO
在一些情况下,植物培养物(例如,植物细胞培养物)的生长可以描述为S形生长曲线。此生长曲线由以下组成:植物、植物部分、或植物细胞增殖缓慢的停滞期,植物、植物部分、或植物细胞增殖较快的对数生长期,营养素有效性限制生长率的稳定期或平台期,以及细胞死亡占主导地位的衰退期。植物培养物(例如,植物细胞培养物)的生长可以被测量为例如,沉降体积(例如,沉降细胞体积)、压紧体积(例如,血细胞压积)、鲜重(例如,鲜细胞重量)、干重(例如,干细胞重量)、培养基电导率、或光密度。
生物反应器中植物、植物部分、或植物细胞的生长可以通过许多不同的方式来确定。例如,可以通过测量沉降植物、植物部分、或植物细胞的体积分数(例如,沉降细胞体积分数(FSCV)),植物、植物部分、或植物细胞的压紧体积分数(例如,血细胞压积分数(FPCV)),或生物质浓度来确定在培养物中的植物、植物部分、或植物细胞的生长。可以通过例如从生物反应器容器中除去包含植物、植物部分或植物细胞的培养基的样品,允许这些植物、植物部分或植物细胞在容器中沉降(例如,约十分钟),并记录沉降的植物、植物部分或植物细胞相的体积来确定沉降体积分数(例如,FSCV)。可替代地,例如,在生物反应器中一旦关闭搅拌和通气,并且植物、植物部分、或植物细胞有时间通过重力沉降,如果澄清的液体与沉降的植物、植物部分、或植物相之间的界面可以可视化或测量,那么可以直接测量沉降体积分数(例如,FSCV)。可以通过例如从生物反应器容器中除去包含植物、植物部分或植物细胞的培养基的样品,将该样品离心,并记录压紧的植物、植物部分或植物细胞的体积来测量压紧体积分数(例如,FPCV)。生物质浓度可以例如通过每升培养物的植物、植物部分、或植物细胞的干重克数来确定。植物、植物部分、或植物细胞的干重可以例如通过将来自生物反应器容器的含有植物、植物部分、或植物细胞的样品放在预先称重的滤纸上,通过抽吸除去培养基,用水洗涤这些植物、植物部分、或植物细胞,将这些植物、植物部分、或植物干燥,并且将它们进行称重来确定。另外,技术人员可以使用各种方法来确定植物、植物部分、或植物细胞活力,例如,通过使用氧摄取测量或染料排斥测定。例如,本领域技术人员可以使用合适的染料和血细胞计数仪对植物细胞培养物中的活细胞进行计数。
可以将如本文ID部分所述的那些刺激剂引入生物反应器中(例如,在植物培养物的任何阶段,例如,在停滞期、对数生长期、或稳定期或平台期)。例如,可以在植物细胞或组织生长期间的任何时候将非生物或生物EV刺激剂引入植物培养基中。另外或可替代地,可以改变生物反应器中的条件(例如温度、CO
vi.放大培养
在一些情况下,可以将植物培养物按体积扩大:在这些情况下,将在液体、凝胶、或固体培养基中生长的植物培养物(“预培养物”)的初始体积(例如,0.25L预培养物、0.5L预培养物、1L预培养物、2L预培养物、3L预培养物、4L预培养物、5L预培养物、6L预培养物、7L预培养物、8L预培养物、9L预培养物、10L预培养物)以给定密度(例如,植物或植物部分的细胞密度或密度)(例如,10g fw/L、50g fw/L、100g fw/L、200g fw/L、400g fw/L、600g fw/L)添加至更大体积(例如,5L、10L、20L、50L、100L、1000L、2000L)的生长培养基中,并且允许生长至给定密度(例如,10g fw/L、50g fw/L、100g fw/L、200g fw/L、400g fw/L、600g fw/L)。在一些情况下,该放大步骤可以进行一次。可替代地,可以将培养物分几个步骤扩大,例如,逐渐扩大至培养基的更大体积。
在生物反应器中含有植物培养物的情况下,可以使用如下所述的几种培养模式。在分批培养中,允许植物、植物部分、或植物细胞在固定体积的培养基中生长整个生长期。在补料分批培养中,在给定体积的培养基中开始植物、植物部分、或植物细胞培养,并且随时间推移添加更多的培养基(连续地或逐步增加)。在连续培养中,培养体积保持恒定,这是由于添加了新鲜的生长培养基并且以相称的体积弃去了生长培养基和/或植物培养物。
vii.交换和收获培养基
可以出于各种原因而交换培养基或从生物反应器容器中移除培养基,这些原因包括诱导EV产生或分泌(例如,通过掺入含有刺激剂的培养基),收获培养基或其一部分,或营养素耗尽后植物、植物部分、或植物细胞重新开始生长。本领域技术人员将理解,可以以各种方式进行培养基交换。例如,可以通过无菌过滤器过滤来添加无菌培养基。例如,可以通过无菌管焊接机通过使用蠕动泵将培养基从生物反应器中抽入柔性管中,从而从生物反应器容器中除去培养基。
从生物反应器中除去培养基(例如,收获培养基)可以包括将培养基与植物、植物部分、或植物细胞分离。在一些实例中,该收获不包括破坏(例如,机械破坏、裂解、或损害)植物、植物部分、或植物细胞。分离可以发生在生物反应器中,或可以发生在包含植物、植物部分、或植物细胞的培养基已从生物反应器中除去后。从植物、植物部分、或植物细胞中分离培养基的方法包括重力沉降、离心、旋转过滤器和膜系统。可替代地,可以从培养基中手动除去植物、植物部分、或植物细胞。
由于培养基中的植物细胞通常以聚集体而不是单个细胞的形式生长,并且与微生物或哺乳动物细胞相比具有相对较低的代谢率,因此重力沉降是用于细胞保留的有用的选择(例如,从培养基中分离细胞)。重力沉降是使污染可能性最小的简单且可靠的细胞保留技术,这是因为它可以完全在生物反应器内进行。当搅拌和通气停止时,随着细胞聚集体沉降,澄清区域将从液体表面向下扩展,在沉降细胞相的顶部留下澄清的液相。然后可以抽出此澄清液相并用不同的培养基替换。重力沉降也可用于将整个植物或植物部分从培养基中分离。
在一些实例中,收获培养基涉及将该培养基榨汁,例如,将该培养基(例如,凝胶、半固体、或固体培养基)按压(例如,冷压)或离心。在其他实例中,收获培养基涉及洗涤该培养基(例如,凝胶、半固体、或固体培养基),例如,用溶液或缓冲液洗涤该培养基以从该培养基中释放PMP。可以在收获之前从培养基中除去植物、植物部分、或植物细胞,例如,使用本文所述的任何方法除去。
在一些实例中,在整个培养过程中连续或定期性地收获培养基。在其他实例中,在培养过程中的一个或多个特定阶段收获培养基。例如,当植物细胞培养物处于指数生长期或非指数生长期,例如停滞期、稳定期、或死亡期时,可以收获植物细胞培养物的培养基。在另一个实例中,当植物或植物部分正经历萌发、处于幼苗期、幼年期、相变、或成年期、正在开花、正在结果、正在衰老或已经衰老时,可以收获水培系统的培养基(例如,包含植物或植物部分的培养基)。
D.刺激剂
在一些实例中,本文描述的PMP制造方法涉及使用刺激剂。刺激剂是一种药剂(例如,非生物刺激剂、生物刺激剂、化学激发剂、核酸刺激剂、或多肽刺激剂),该药剂在与植物培养物接触时(例如,以有效量和有效持续时间),相对于未处理的植物细胞培养物,增加植物细胞培养物中细胞外囊泡的生物发生(例如,细胞内产生或分泌,例如,分泌到培养基中),和/或相对于未处理的培养物,增加可源自该植物培养物的PMP的量。例如,相对于未处理的植物培养物,该刺激剂可以增加生物发生(例如,细胞外囊泡的细胞内产生或分泌)约1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、或大于100%;或增加植物培养物约2倍、4倍、5倍、10倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、或大于100倍。在另一个实例中,相对于未处理的植物培养物,刺激剂可以增加可源自植物培养物的PMP(例如,源自本文描述的PMP纯化方法)的量约1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、或大于100%;或增加植物培养物约2倍、4倍、5倍、10倍、20倍、25倍、50倍、75倍、100倍、或大于100倍。
可以将植物培养物暴露于刺激剂中任何一段时间(例如,至少1min、5min、15min、30min、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、10小时、12小时、24小时、2天、3天、4天、6天、1周、2周、3周、1个月、或多于一个月),以及暴露于如下量的刺激剂中,该量足以促进EV生物发生(例如,细胞外囊泡的细胞内产生或分泌)和/或增加可源自植物培养物的PMP的量。本领域的技术人员将理解,植物培养物接触或暴露的刺激剂的量将取决于所使用的具体刺激剂。植物培养物可暴露于任何数量的不同刺激剂(例如,至少2、3、4、5、6、7、8、9或至少10种刺激剂)。
该刺激剂可以是非生物刺激剂、生物刺激剂、和/或化学激发剂,如本文进一步描述的那些。
i.非生物刺激剂
在一些情况下,该刺激剂是非生物刺激剂。非生物刺激剂是指无生命的化学和/或物理因子,该无生命的化学和/或物理因子通过例如,渗透胁迫、干旱、水分剥夺、洪涝、高光强度、非常高的光强度、高温、低温、盐度、重金属毒害作用、厌氧生活、养分(例如,氮或磷)缺乏、养分过量、UV照射、大气污染(例如,臭氧)、或暴露于诱导活性氧(ROS)的产生的化学物质(例如,百草枯)刺激植物或其部分(例如,植物培养物,例如,植物细胞培养物或组织培养物、包含植物部分的培养物、或包含整个植物的培养物)中细胞外囊泡的产生。在一些情况下,该非生物刺激剂可以被认为是可对植物培养物、植物细胞、植物组织、植物种子、植物器官、或整个植物的代谢、生长或活力产生不利影响的环境条件或胁迫原。因此,在一些情况下,非生物刺激剂可以是对植物培养物施加非生物胁迫的条件或试剂。
在一个方面,本文包括用于产生植物信使包的方法,该方法包括(a)在生物反应器中培养植物、植物部分、或植物细胞;(b)将该植物、植物部分、或植物细胞暴露于有效量的刺激剂中以增加PMP的产生;(c)收获培养基,以及(d)从该培养基中纯化PMP。
因此,在另一个方面,本文提供了一种PMP生物反应器,该PMP生物反应器包括含有植物培养物和有效量的刺激剂以增加PMP产生的生物反应器。
在一些情况下,非生物刺激剂是高培养温度(即,热胁迫)或低培养温度(例如,冷胁迫)。例如,植物培养物可暴露于(例如,可将包括植物培养物的生物反应器设置为)如下温度,该温度在足够的持续时间后可引起由植物细胞培养物进行的植物EV生物发生或释放增加,例如可增加可源自植物培养物的PMP的量。例如,当植物培养物经受比正常植物培养物生长温度(例如,本领域已知的对于大多数物种建议用于最佳生长和产率的温度范围)高至少约5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、或40℃的温度时,可发生热胁迫。相反,当植物培养物经受比正常植物培养物生长温度(例如,本领域已知的对于大多数物种建议用于最佳生长和产率的温度范围)低至少约5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、或40℃的温度时,可发生冷胁迫。在某些情况下,非生物刺激剂的温度等于或小于20℃、15℃、10℃、5℃、或0℃。在其他情况下,非生物刺激剂的温度等于或大于20℃、25℃、30℃、或35℃。在一些情况下,可以将植物培养物暴露于高温或低温至少1min、5min、15min、30min、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、10小时、12小时、或24小时。
在一些情况下,非生物刺激剂是低pH或高pH。高pH或低pH是相对术语,其根据植物物种和正常植物土壤条件(例如,本领域已知的对于大多数物种建议用于最佳生长和产率的土壤条件)而变化。例如,低pH值可以是比正常植物培养生长pH值(例如,本领域已知的对于大多数物种建议用于最佳生长和产率的pH值)低约0.1、0.2、0.5、1、2、3、4或5个单位的pH值。相反,高pH值可以是比正常植物培养生长pH值(例如,本领域已知的对于大多数物种建议用于最佳生长和产率的pH值)高约0.1、0.2、0.5、1、2、3、4或5个单位的pH值。在某些情况下,非生物刺激剂处于等于或大于pH 7、7.5、8、8.5、9、9.5、或10的高pH。在其他情况下,非生物刺激剂处于低pH,例如,pH小于或等于pH 7、6.5、6、5.5、5、4.5、或4。在一些情况下,可以将植物培养物暴露于高或低pH至少1min、5min、15min、30min、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、10小时、12小时、或24小时。
在一些情况下,非生物刺激剂是高光强度、高辐照度、或光胁迫(例如,可引起由植物细胞培养物进行的植物EV生物发生或释放增加的光强度,例如,当递送足够的强度和持续时间时,可以增加可源自植物培养物的PMP的量的光强度)。在某些情况下,高光强度也可能足够对植物、植物部分、或植物细胞造成光抑制损害。在一些情况下,该高光强度可以是至少250μE、300μE、350μE、400μE、450μE、500μE、550μE、或600μE。在一些情况下,高光强度胁迫的持续时间可以是至少1min、5min、15min、30min、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、10小时、12小时、或24小时。
在一些情况下,非生物刺激剂是渗透胁迫。渗透胁迫可与渗透物的浓度升高相关或由其诱导,渗透物的浓度升高可导致植物、植物部分或植物细胞的细胞内或细胞外环境的渗透势发生扰动。例如,一种或多种溶质或渗透物可以与一定量的植物培养物接触并持续一段时间以引起渗透胁迫,从而增加植物EV生物发生或释放,例如,增加可源自植物培养物的PMP的量。术语“溶质”和“渗透物”可互换使用并且是指降低水势的物质。此类物质的实例包括但不限于,可以包含在培养基中的离子渗透物和非离子渗透物。
离子溶质可以是水溶性无机溶质,如氯化钠(NaCl)。水溶性无机溶质的实例包括但不限于NaCl、KCl(氯化钾)、LiCl(氯化锂)、CsCl(氯化铯)、RbCl(氯化铷)和CaCl2(氯化钙)、硫酸钠、硫酸镁、硫酸钙、氯化钠、氯化镁、氯化钙、氯化钾等、农业肥料的盐以及与碱性或酸性土壤条件有关的盐(Werner J.E.等人(1995)Physiologia Plantarum[植物生理学]93:659-666;美国专利号7,253,338)。通常,细胞培养基可以包含可增加培养基中钠、镁、钙、氯化物、硫酸盐、碳酸盐、或碳酸氢盐的任何水溶性无机盐,如硫酸钠、硫酸镁、硫酸钙、氯化钠、氯化镁、氯化钙、氯化钾、农业肥料的盐、或与碱性或酸性土壤条件有关的盐。例如,该培养基可以具有高盐度(例如,具有至少2ds/m、4ds/m、5ds/m、6ds/m、7ds/m、8ds/m、9ds/m、10ds/m、12ds/m、14ds/m、16ds/m、18ds/m、20ds/m、22ds/m、24ds/m、26ds/m、28ds/m或大于28ds/m的电导率的培养基)。
非离子渗透物的实例包括但不限于糖类、糖醇、以及高分子量的聚合物渗透物。主要为代谢惰性的任何糖醇都可以用作渗透物,这些糖醇包括但不限于甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、乳糖醇、或麦芽糖醇。也可以使用两种或更多种糖醇的组合。可以用作渗透物的其他糖类的实例包括但不限于蜜二糖和蔗糖。
渗透物也可以是高分子量的聚合物溶质,是指一类基本上不渗透到植物细胞中的聚合物溶质。可用于降低水势的高分子量的聚合物溶质的实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇和右旋糖酐。聚乙二醇(PEG)是以一定分子量范围产生的聚合物。分子量为6000或以上的PEG基本上不能进入植物细胞的孔中。因此,较高分子量(例如,大于或等于3000的分子量)的PEG可用于本文所述的方法。在一些情况下,本文可以使用分子量在3000与35000之间(例如3000、5000、10000、15000、20000、25000、30000或35000)的PEG。
此外,可通过引起渗透势增加的其他条件来诱导培养基的渗透压升高,从而诱导渗透胁迫。诱导渗透胁迫的条件的实例包括但不限于盐度、干旱、高温、寒冷、和/或冷冻。例如,植物培养基的渗透压可以为0.4-1.23MPa。在其他情况下,培养基的渗透压为至少0.4MPa、0.5MPa、0.6MPa、0.7MPa、0.8MPa、0.9MPa、1MPa、1.1MPa、1.2MPa、1.23Mpa、或大于1.23MPa。
在一些情况下,非生物刺激剂是干旱、干旱胁迫或低水有效性,低水有效性是指降低的水有效性,该降低的水有效性足够低以进行足够的时间以导致由植物细胞培养物进行的植物EV释放增加,例如,可源自植物培养物的PMP的量增加。在某些情况下,干旱胁迫可足以引起植物、植物部分、或植物细胞的生长或活力降低。在一些情况下,可以将植物培养物暴露于干旱胁迫至少1min、5min、15min、30min、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、10小时、12小时、或24小时。
在一些情况下,非生物刺激剂是在植物、植物部分、或植物细胞中引起氧化胁迫的试剂或条件。不利环境条件(如干旱、盐胁迫、以及除草剂的使用)促进植物、植物部分和植物细胞中活性氧(ROS)的过量产生。例如,在一些情况下,非生物刺激剂是百草枯。百草枯是对植物施加氧化胁迫的除草剂(例如,浓度为0.03至0.3μM)。百草枯(联吡啶鎓(bipyridylium)除草剂)通过在PSI处拦截电子传输链中的电子而起作用。这个反应导致联吡啶自由基的产生,这些联吡啶自由基很容易与双氧反应,从而产生超氧化物。
在一些情况下,非生物刺激剂是在植物、植物部分、或植物细胞中引起营养缺乏的条件或试剂。例如,可向植物培养物提供作为氮限制培养基的培养基(例如,其中总可用氮(例如来自硝酸盐、氨或其他已知氮源)的量不足以维持最佳植物生长和发育的培养基)。本领域技术人员将认识到总可用氮是足以维持最佳植物生长和发育(例如,最佳植物、植物部分或植物细胞生长和发育)的条件。本领域技术人员将认识到什么构成了足够量的总可用氮,以及什么构成了用于向植物提供氮的土壤、培养基和肥料输入。氮限制条件将取决于许多因素而变化,这些因素包括但不限于特定的植物培养和环境条件。
ii.化学激发剂
刺激剂可以是化学激发剂。如本文所用,术语“化学激发剂”是指在植物中诱导与植物病原体(例如,细菌病原体或真菌病原体)诱导的应答或在植物病原体诱导时从植物释放的化合物(例如,内源性激发剂)诱导的应答相似的防御应答的天然或合成的化合物。
在一个方面,本文包括用于产生PMP的方法,该方法包括(a)在生物反应器中培养植物、植物部分、或植物细胞;(b)将该植物、植物部分、或植物细胞暴露于有效增加PMP产生的化学激发剂的量;(c)收获培养基,以及(d)从该培养基中纯化PMP。
因此,在另一个方面,本文提供了一种PMP生物反应器,该PMP生物反应器包含含有植物培养物和化学激发剂的生物反应器(例如,植物细胞培养系统或水培系统),该化学激发剂的量足以有效地增加由植物培养物产生的PMP。
可用作刺激剂的化学激发剂的实例包括水杨酸、苯并噻二唑、2,6-二氯异烟酸、茉莉酸、茉莉酮酸甲酯、一氧化氮、苯甲酸、β-氨基丁酸、甲硫氨酸、色氨酸、腐殖酸、重金属(例如,铁、铜、铬、钴、镉、镍、锰、锌、汞、砷、或铅)、乙酸、或纳米氧化物。在某些情况下,该化学激发剂是水杨酸。在其他情况下,该化学激发剂是苯并噻二唑。在又其他情况下,该化学激发剂是2,6-二氯异烟酸。
增加由植物培养物进行的EV产生或释放(例如,增加可源自植物培养物的PMP的量)所需的化学激发剂的量和暴露于植物培养物中的持续时间将取决于植物、植物部分、或植物细胞的类型、植物培养物的密度以及生长条件而变化,但可以使用本领域中的标准技术来确定。
iii.生物刺激剂
在一些情况下,刺激剂是生物刺激剂。如本文所用,术语“生物刺激剂”是指生物剂(例如,植物有害生物,例如,真菌、细菌、病毒、原生动物、线虫、或食草昆虫)或其组分(例如,蛋白质、多肽、核酸、或小分子),该生物剂或其组分刺激植物或其部分(例如,细胞培养物或组织培养物)中细胞外囊泡的产生,例如,增加可源自植物培养物的PMP的量。
在一个方面,本文包括用于产生PMP的方法,该方法包括(a)在生物反应器中培养植物、植物部分、或植物细胞;(b)将该植物、植物部分、或植物细胞暴露于有效增加PMP产生的生物刺激剂的量;(c)收获培养基,以及(d)从该培养基中纯化PMP。
因此,在另一个方面,本文提供了一种PMP生物反应器,该PMP生物反应器包含含有植物培养物和生物刺激剂的生物反应器(例如,植物细胞培养系统或水培系统),该生物刺激剂的量足以有效地增加由植物培养物产生的PMP。
该生物刺激剂可以是例如,真菌、细菌、病毒、原生动物、线虫、或食草昆虫。在一些情况下,该生物刺激剂是微生物刺激剂,该微生物刺激剂是指包括微生物(例如,细菌、病毒、或真菌)或其分离的组分的组合物。微生物剂可以包括活细胞、死细胞、细胞裂解物、或其分离的组分(例如,多肽、核酸、小分子、糖)。在一些情况下,该微生物刺激剂是微生物(例如,活或死细胞),如细菌、病毒、原生动物、或真菌。
在一些情况下,该微生物刺激剂是细菌多肽、细菌糖(例如,多糖或寡糖)、细菌核酸、或细菌核酸。在一些情况下,该微生物刺激剂是细菌多肽。在某些情况下,该细菌多肽是延伸因子Tu 18(EFT18)。在一些情况下,该细菌多肽包括与EFT18具有至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、或100%序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下,细菌肽是谷胱甘肽。在一些实施例中,该微生物刺激剂是细菌细胞壁组分或脂多糖。
在其他情况下,该微生物刺激剂可以是真菌多肽、真菌糖(例如,多糖或寡糖)、真菌核酸、或真菌核酸。在某些情况下,该真菌多肽是鞭毛蛋白2。在一些情况下,微生物刺激剂是酵母细胞壁、菌丝细胞壁、或真菌孢子。
在一些情况下,微生物刺激剂是病毒多肽、病毒糖(例如,多糖或寡糖)、病毒核酸、或病毒核酸。在一些情况下,该病毒多肽是病毒包被蛋白发夹(例如,来自烟草花叶病毒)。
在一些情况下,微生物刺激剂是原生动物多肽、原生动物糖(例如,多糖或寡糖)、原生动物核酸、或原生动物核酸。
在一些情况下,该生物刺激剂是多糖(例如,藻酸盐、几丁质、右旋糖酐、果胶、或壳聚糖)。在一些情况下,该生物刺激剂是寡糖(例如,甘露糖醛酸酯、古罗糖醛酸酯、甘露聚糖和半乳糖醛酸苷)。在一些情况下,该生物刺激剂是多肽(例如,纤维素酶或寡雄蛋白)。在一些情况下,该生物刺激剂是糖蛋白。在一些情况下,该生物刺激剂是脂质(例如,脂多糖)。在一些情况下,该生物刺激剂是寡半乳糖醛酸苷。
在某些情况下,微生物刺激剂是植物病原体或植物有害生物、或其组分(例如,核酸、小分子、或多肽)。可以用作生物刺激剂的植物病原体或植物有害生物的实例包括在本文标题为“递送至植物有害生物”的部分中描述或如以下进一步描述的那些。
细菌刺激剂
在一些情况下,生物刺激剂是细菌或其组分(例如,核酸、小分子、或多肽),例如,在植物中引起疾病的细菌,该细菌包括但不限于本文所述的任何细菌。例如,细菌可以是属于放线菌门(Actinobacteria)或变形菌门(Proteobacteria)的细菌,诸如伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、微杆菌科(Microbacteriaceae)、和根瘤菌科(Rhizobiaceae)中的细菌。
在一些情况下,细菌是燕麦食酸菌亚种(Acidovorax avenae subsp.),包括例如燕麦食酸菌燕麦亚种(Acidovorax avenae subsp.avenae)(=燕麦假单胞菌燕麦亚种(Pseudomonas avenae subsp.avenae))、燕麦食酸菌卡特来兰亚种(Acidovorax avenaesubsp.cattleyae)(=卡特来兰假单胞菌(Pseudomonas cattleyae))、或燕麦食酸菌瓜类亚种(Acidovorax avenae subsp.citrulli)(=假产碱假单胞菌瓜类亚种(Pseudomonaspseudoalcaligenes subsp.citrulli))、(Pseudomonas avenae subsp.citrulli))。
在一些情况下,细菌是伯克霍尔德氏菌属物种(Burkholderia spp.),包括例如须芒草伯克霍尔德氏菌(Burkholderia andropogonis)(=须芒草假单胞菌(Pseudomonasandropogonis)、伍氏假单胞菌(Pseudomonas woodsii))、石竹伯克霍尔德氏菌(Burkholderia caryophylli)(=石竹假单胞菌(Pseudomonas caryophylli))、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)(=洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia))、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)(=唐菖蒲假单胞菌(Pseudomonasgladioli))、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌栖伞菌致病变种(Burkholderia gladiolipv.agaricicola)(=唐菖蒲假单胞菌栖伞菌致病变种(Pseudomnas gladiolipv.agaricicola))、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌葱生致病变种(Burkholderia gladiolipv.alliicola)(即,唐菖蒲假单胞菌葱生致病变种(Pseusomonas gladiolipv.alliicola))、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌唐菖蒲致病变种(Burkholderia gladiolipv.gladioli)(即,唐菖蒲假单胞菌(Pseudomonas gladioli)、唐菖蒲假单胞菌唐菖蒲致病变种(Pseudomonas gladioli pv.gladioli))、荚壳伯克霍尔德氏菌(Burkholderiaglumae)(即,荚壳假单胞菌(Pseudomonas glumae))、植物伯克霍尔德氏菌(Burkholderiaplantarii)(即,植物假单胞菌(Pseudomonas plantarii))、茄伯克霍尔德氏菌(Burkholderia solanacearum)(即,茄科青枯菌(Ralstonia solanacearum))、或青枯菌属物种(Ralstonia spp.)。
在一些情况下,细菌是韧皮部杆菌属物种(Liberibacter spp.),包括暂定韧皮部杆菌属物种(Candidatus Liberibacter spec.),包括例如暂定亚洲韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter asiaticus)、非洲韧皮部杆菌(Liberibacter africanus)(Laf)、美洲韧皮部杆菌(Liberibacter americanus)(Lam)、亚洲韧皮部杆菌(Liberibacter asiaticus)(Las)、欧洲韧皮部杆菌(Liberibacter europaeus)(Leu)、Liberibacter psyllaurous、或茄韧皮部杆菌(Liberibacter solanacearum)(Lso)。
在一些情况下,细菌是棒杆菌属物种(Corynebacterium spp.),包括例如带状棒杆菌(Corynebacterium fascians)、萎蔫棒杆菌萎蔫致病变种(Corynebacteriumflaccumfaciens pv.flaccumfaciens)、密执安棒杆菌(Corynebacteriummichiganensis)、密执安棒杆菌小麦致病变种(Corynebacterium michiganensepv.tritici)、密执安棒杆菌尼布拉斯加致病变种(Corynebacterium michiganensepv.nebraskense)、或腐败棒杆菌(Corynebacterium sepedonicum)。
在一些情况下,细菌是欧文氏菌属物种(Erwinia spp.),包括例如解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)、菠萝欧文氏菌(Erwinia ananas)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovora)(即,胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum))、胡萝卜软腐欧文氏菌黑腐亚种(Erwinia carotovora subsp.atroseptica)、胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种(Erwinia carotovora subsp.carotovora)、菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)、菊欧文氏菌玉米致病变种(Erwinia chrysanthemi pv.zeae)、溶解欧文氏菌(Erwiniadissolvens)、草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontic)、斯氏欧文氏菌(Erwinia stewartiii)、嗜管欧文嗜菌(Erwinia tracheiphila)、或噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)。
在一些情况下,细菌是丁香假单胞菌亚种(Pseudomonas syringae subsp.),包括例如丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae)(Psa)、丁香假单胞菌致黑致病变种(Pseudomonas syringae pv.atrofaciens)、丁香假单胞菌晕斑致病变种(Pseudomonas syringae pv.coronafaciens)、丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)、丁香假单胞菌黄瓜致病变种(Pseudomonassyringae pv.lachrymans)、丁香假单胞菌斑生致病变种(Pseudomonas syringaepv.maculicola)、丁香假单胞菌疱疹致病变种(Pseudomonas syringae pv.papulans)、丁香假单胞菌条纹致病变种(Pseudomonas syringae pv.striafaciens)、丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonas syringae pv.syringae)、丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)、或丁香假单胞菌烟草致病变种(Pseudomonassyringae pv.tabaci)。
在一些情况下,细菌是链霉菌属物种(Streptomyces ssp.),包括例如酸疮痂链霉菌(Streptomyces acidiscabies)、微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)、纯白链霉菌(Streptomyces candidus)(即,闪白放线菌(Actinomyces candidus))、晶体链霉菌(Streptomyces caviscabies)、山丘链霉菌(Streptomyces collinus)、Streptomyceseuropaeiscabiei、中间型链霉菌(Streptomyces intermedius)、番薯链霉菌(Streptomyces ipomoeae)、Streptomyces luridiscabiei、Streptomyces niveiscabiei、Streptomyces puniciscabiei、Streptomyces retuculiscabiei、Streptomyces scabiei、疮痂病链霉菌(Streptomyces scabies)、西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)、Streptomyces steliiscabiei、Streptomyces turgidiscabies、或Streptomyceswedmorensis。
在一些情况下,细菌是地毯草黄单胞菌亚种(Xanthomonas axonopodis subsp.),包括例如地毯草黄单胞菌苜蓿致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.alfalfae)(=苜蓿黄单胞菌(Xanthomonas alfalfae))、地毯草黄单胞菌莱檬致病变种(Xanthomonasaxonopodis pv.aurantifolii)(=褐色黄单胞菌莱檬亚种(Xanthomonas fuscanssubsp.aurantifolii))、Xanthomonas axonopodis pv.allii(=Xanthomonas campestrispv.allii)、地毯草黄单胞菌地毯草致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.axonopodis)、地毯草黄单胞菌羊蹄甲致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.bauhiniae)(=野油菜黄单胞菌羊蹄甲致病变种(Xanthomonas campestris pv.bauhiniae))、地毯草黄单胞菌秋海棠致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.begoniae)(=野油菜黄单胞菌秋海棠致病变种(Xanthomonas campestris pv.begoniae))、地毯草黄单胞菌萎叶致病变种(Xanthomonasaxonopodis pv.betlicola)(=野油菜黄单胞菌萎叶致病变种(Xanthomonas campestrispv.betlicola))、地毯草黄单胞菌感应草致病变种(Xanthomonas axonopodispv.biophyti)(=野油菜黄单胞菌感应草致病变种(Xanthomonas campestrispv.biophyti))、地毯草黄单胞菌木豆致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.cajani)(=野油菜黄单胞菌木豆致病变种(Xanthomonas campestris pv.cajani))、地毯草黄单胞菌木薯致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.cassavae)(=木薯黄单胞菌(Xanthomonascassavae)、野油菜黄单胞菌木薯致病变种(Xanthomonas campestris pv.cassavae))、地毯草黄单胞菌山扁豆致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.cassiae)(=野油菜黄单胞菌山扁豆致病变种(Xanthomonas campestris pv.cassiae))、地毯草黄单胞菌柑橘致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.citri)(=柑橘黄单胞菌(Xanthomonas citri))、地毯草黄单胞菌柑蜜致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.citrumelo)(=苜蓿黄单胞菌柑蜜亚种(Xanthomonas alfalfae subsp.citrumelonis))、地毯草黄单胞菌蝶豆致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.clitoriae)(=野油菜黄单胞菌蝶豆致病变种(Xanthomonas campestris pv.clitoriae))、地毯草黄单胞菌糁子致病变种(Xanthomonasaxonopodis pv.coracanae)(=野油菜黄单胞菌糁子致病变种((Xanthomonas campestrispv.coracanae)))、地毯草黄单胞菌瓜尔豆致病变种(Xanthomonas axonopodispv.cyamopsidis)(=野油菜黄单胞菌瓜尔豆致病变种(Xanthomonas campestrispv.cyamopsidis))、地毯草黄单胞菌山马蝗致病变种(Xanthomonas axonopodispv.desmodii)(=野油菜黄单胞菌山马蝗致病变种(Xanthomonas campestrispv.desmodii))、地毯草黄单胞菌恒河山马蝗致病变种(Xanthomonas axonopodispv.desmodiigangetici)(=野油菜黄单胞菌恒河山马蝗致病变种(Xanthomonascampestris pv.desmodiigangetici))、地毯草黄单胞菌疏花山马蝗致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.desmodiilaxiflori)(=野油菜黄单胞菌疏花山马蝗致病变种(Xanthomonas campestris pv.desmodiilaxiflori))、地毯草黄单胞菌园叶山马蝗致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.desmodiirotundifolii)(=野油菜黄单胞菌园叶山马蝗致病变种(Xanthomonas campestris pv.desmodiirotundifolii))、地毯草黄单胞菌花叶万年青致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.dieffenbachiae)(=野油菜黄单胞菌花叶万年青致病变种(Xanthomonas campestris pv.dieffenbachiae))、地毯草黄单胞菌印度刺桐致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.erythrinae)(=野油菜黄单胞菌印度刺桐致病变种(Xanthomonas campestris pv.erythrinae))、地毯草黄单胞菌簇生致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.fascicularis)(=野油菜黄单胞菌簇生致病变种(Xanthomonas campestris pv.fasciculari))、地毯草黄单胞菌大豆致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.glycines)(=野油菜黄单胞菌大豆致病变种(Xanthomonascampestris pv.glycines))、地毯草黄单胞菌红木致病变种(Xanthomonas axonopodispv.khayae)(=野油菜黄单胞菌红木致病变种(Xanthomonas campestris pv.khayae))、地毯草黄单胞菌胡枝子致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.lespedezae)(=野油菜黄单胞菌胡枝子致病变种(Xanthomonas campestris pv.lespedezae))、地毯草黄单胞菌栀子致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.maculifoliigardeniae)(=野油菜黄单胞菌栀子致病变种(Xanthomonas campestris pv.maculifoliigardeniae))、地毯草黄单胞菌锦葵致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.malvacearum)(=柑橘黄单胞菌锦葵亚种(Xanthomonas citri subsp.malvacearum))、地毯草黄单胞菌木薯致病变种(Xanthomonasaxonopodis pv.manihotis)(=野油菜黄单胞菌木薯致病变种(Xanthomonas campestrispv.manihotis))、地毯草黄单胞菌栖角胡麻致病变种(Xanthomonas axonopodispv.martyniicola)(=野油菜黄单胞菌栖角胡麻致病变种(Xanthomonas campestrispv.martyniicola))、地毯草黄单胞菌梅氏致病变种(Xanthomonas axonopodispv.melhusii)(=野油菜黄单胞菌梅氏致病变种(Xanthomonas campestrispv.melhusii))、地毯草黄单胞菌中田氏黄麻致病变种(Xanthomonas axonopodispv.nakataecorchori)(=野油菜黄单胞菌中田氏黄麻致病变种(Xanthomonas campestrispv.nakataecorchori))、地毯草黄单胞菌西番莲致病变种(Xanthomonas axonopodispv.passiflorae)(=野油菜黄单胞菌西番莲致病变种(Xanthomonas campestrispv.passiflorae))、地毯草黄单胞菌印度麻致病变种(Xanthomonas axonopodispv.patelii)(=野油菜黄单胞菌印度麻致病变种(Xanthomonas campestrispv.patelii))、Xanthomonas axonopodis pv.pedalii(=Xanthomonas campestrispv.pedalii)、地毯草黄单胞菌菜豆致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.phaseoli)(=野油菜黄单胞菌菜豆致病变种(Xanthomonas campestris pv.phaseoli)、菜豆黄单胞菌(Xanthomonas phaseoli))、地毯草黄单胞菌菜豆致病变种褐色变种(Xanthomonasaxonopodis pv.phaseoli var.fuscans)(=褐色黄单胞菌(Xanthomonas fuscans))、地毯草黄单胞菌叶下珠致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.phyllanthi)(=野油菜黄单胞菌叶下珠致病变种(Xanthomonas campestris pv.phyllanthi))、地毯草黄单胞菌栖酸浆致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.physalidicola)(=野油菜黄单胞菌栖酸浆致病变种(Xanthomonas campestris pv.physalidicola))、地毯草黄单胞菌栖猩猩木致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.poinsettiicola)(=野油菜黄单胞菌栖猩猩木致病变种(Xanthomonas campestris pv.poinsettiicola))、地毯草黄单胞菌安石榴致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.punicae)(=野油菜黄单胞菌安石榴致病变种(Xanthomonas campestris pv.punicae))、地毯草黄单胞菌鹿藿致病变种(Xanthomonasaxonopodis pv.rhynchosiae)(=野油菜黄单胞菌鹿藿致病变种(Xanthomonascampestris pv.rhynchosiae))、地毯草黄单胞菌蓖麻致病变种(Xanthomonas axonopodispv.ricini)(=野油菜黄单胞菌蓖麻致病变种(Xanthomonas campestris pv.ricini))、地毯草黄单胞菌田菁致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.sesbaniae)(=野油菜黄单胞菌田菁致病变种(Xanthomonas campestris pv.sesbaniae))、地毯草黄单胞菌罗望子致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.tamarindi)(=野油菜黄单胞菌罗望子致病变种(Xanthomonas campestris pv.tamarindi))、地毯草黄单胞菌维管束致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.vasculorum)(=野油菜黄单胞菌维管束致病变种(Xanthomonas campestris pv.vasculorum)、地毯草黄单胞菌辣椒斑点病致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.vesicatoria)(=野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种(Xanthomonas campestris pv.vesicatoria)、辣椒斑点病黄单胞菌(Xanthomonasvesicatoria))、地毯草黄单胞菌绿豆致病变种(Xanthomonas axonopodispv.vignaeradiatae)(=野油菜黄单胞菌绿豆致病变种(Xanthomonas campestrispv.vignaeradiatae))、地毯草黄单胞菌栖豇豆致病变种(Xanthomonas axonopodispv.vignicola)(=野油菜黄单胞菌栖豇豆致病变种(Xanthomonas campestrispv.vignicola))、或地毯草黄单胞菌葡萄蔓致病变种(Xanthomonas axonopodispv.vitians)(=野油菜黄单胞菌葡萄蔓致病变种(Xanthomonas campestrispv.vitians))。
在一些情况下,细菌是野油菜黄单胞菌香蕉致病变种(Xanthomonas campestrispv.musacearum)、野油菜黄单胞菌桃李致病变种(Xanthomonas campestris pv.pruni)(=树生黄单胞菌桃李致病变种(Xanthomonas arboricola pv.pruni))、或草莓黄单胞菌(Xanthomonas fragariae)。
在一些情况下,细菌是半透明黄单胞菌(Xanthomonas translucens supsp.)(=野油菜黄单胞菌大麦致病变种(Xanthomonas campestris pv.hordei)),包括例如半透明黄单胞菌燕麦草致病变种(Xanthomonas translucens pv.arrhenatheri)(=野油菜黄单胞菌燕麦草致病变种(Xanthomonas campestris pv.arrhenatheri))、半透明黄单胞菌谷物致病变种(Xanthomonas translucens pv.cerealis)(=野油菜黄单胞菌谷物致病变种(Xanthomonas campestris pv.cerealis))、半透明黄单胞菌禾谷致病变种(Xanthomonastranslucens pv.graminis)(=野油菜黄单胞菌禾谷致病变种(Xanthomonas campestrispv.graminis))、半透明黄单胞菌梯牧草属致病变种(Xanthomonas translucenspv.phlei)(=野油菜黄单胞菌梯牧草属致病变种(Xanthomonas campestris pv.phlei))、半透明黄单胞菌梯牧草致病变种(Xanthomonas translucens pv.phleipratensis)(=野油菜黄单胞菌梯牧草致病变种(Xanthomonas campestris pv.phleipratensis))、半透明黄单胞菌早熟禾致病变种(Xanthomonas translucens pv.poae)(=野油菜黄单胞菌早熟禾致病变种(Xanthomonas campestris pv.poae))、半透明黄单胞菌黑麦致病变种(Xanthomonas translucens pv.secalis)(=野油菜黄单胞菌黑麦致病变种(Xanthomonascampestris pv.secalis))、半透明黄单胞菌小麦致病变种(Xanthomonas translucenspv.translucens)(=野油菜黄单胞菌小麦致病变种(Xanthomonas campestrispv.translucens))、或半透明黄单胞菌波形致病变种(Xanthomonas translucenspv.undulosa)(=野油菜黄单胞菌波形致病变种(Xanthomonas campestrispv.undulosa))。
在一些情况下,细菌是稻黄单胞菌亚种(Xanthomonas oryzae supsp.)、稻黄单胞菌稻亚种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)(=野油菜黄单胞菌稻致病变种(Xanthomonascampestris pv.oryzae))、或野油菜黄单胞菌oryzicola致病变种(Xanthomonas oryzaepv.oryzicola)(=野油菜黄单胞菌oryzicola致病变种(Xanthomonas campestrispv.oryzicola))。
在一些情况下,细菌是来自黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)的苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)。
表7示出了在本文所述的生产方法和生物反应器中可用作生物刺激剂的细菌有害生物的另外的实例。
真菌刺激剂
在一些情况下,生物刺激剂是真菌或其组分(例如,核酸、小分子、或多肽),例如,在植物中引起疾病的真菌,该真菌包括本文所述的任何真菌。例如,该生物刺激剂可以是在植物中引起疾病的真菌,如白粉病病原体,例如白粉菌属(Blumeria)物种,例如小麦白粉菌(Blumeria graminis);叉丝单囊壳属(Podosphaera)物种,例如白叉丝单囊壳(Podosphaera leucotricha);单丝壳属(Sphaerotheca)物种,例如单丝壳菌(Sphaerotheca fuliginea);钩丝壳属(Uncinula)物种,例如葡萄钩丝壳(Uncinulanecator);由以下引起的疾病:锈病病原体,例如胶锈菌属(Gymnosporangium)物种,例如褐色胶锈菌(Gymnosporangium sabinae);驼孢锈菌属(Hemileia)物种,例如咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix);层锈菌属(Phakopsora)物种,例如豆薯层锈菌(Phakopsorapachyrhizi)和山马蝗层锈菌(Phakopsora meibomiae);柄锈菌属(Puccinia)物种,例如隐匿柄锈菌(Puccinia recondite)、小麦叶锈菌(P.triticina)、禾柄锈菌(P.graminis)或条形柄锈菌(P.striiformis)或大麦柄锈菌(P.hordei);单胞锈菌属(Uromyces)物种,例如疣顶单胞锈菌(Uromyces appendiculatus);由来自以下各项的组的病原体引起的疾病:卵菌纲(Oomycetes),例如白锈菌属(Albugo)物种,例如白锈菌(Algubo candida);盘梗霉属(Bremia)物种,例如莴苣盘梗霉(Bremia lactucae);霜霉属(Peronospora)物种,例如豌豆霜霉(Peronospora pisi)、寄生霜霉(P.parasitica)或芸苔霜霉(P.brassicae);疫霉属(Phytophthora)物种,例如致病疫霉(Phytophthora infestans);单轴霉属(Plasmopara)物种,例如葡萄单轴霉(Plasmopara viticola);假霜霉属(Pseudoperonospora)物种,例如葎草假霜霉(Pseudoperonospora humuli)或古巴假霜霉菌(Pseudoperonosporacubensis);腐霉属(Pythium)物种,例如极腐霉(Pythium ultimum);例如由以下引起的叶疱病和叶萎蔫病:链格孢属(Alternaria)物种,例如茄链格孢(Alternaria solani);尾孢属(Cercospora)物种,例如甜菜生尾孢(Cercospora beticola);枝孢属(Cladiosporium)物种,例如黄瓜枝孢(Cladiosporium cucumerinum);旋孢腔菌属(Cochliobolus)物种,例如禾旋孢腔菌(Cochliobolus sativus)(分生孢子形式:内脐蠕孢属(Drechslera),同义:长蠕孢属(Helminthosporium)、宫部旋孢腔菌(Cochliobolus miyabeanus);炭疽菌属(Colletotrichum)物种,例如莱豆炭疽菌(Colletotrichum lindemuthanium);锈斑病菌属(Cycloconium)物种,例如油橄榄孔雀斑病菌(Cycloconium oleaginum);间座壳属(Diaporthe)物种,例如柑桔间座壳(Diaporthe citri);痂囊腔菌属(Elsinoe)物种,例如柑橘痂囊腔菌(Elsinoe fawcettii);盘长孢属(Gloeosporium)物种,例如悦色盘长孢(Gloeosporium laeticolor);小丛壳属(Glomerella)物种,例如于围小丛壳(Glomerellacingulata);球座菌属(Guignardia)物种,例如葡萄球座菌(Guignardia bidwelli);小球腔菌属(Leptosphaeria)物种,例如斑点小球腔菌(Leptosphaeria maculans)、颖枯壳小球腔菌(Leptosphaeria nodorum);稻瘟菌属(Magnaporthe)物种,例如稻瘟病菌(Magnaporthe grisea);微座孢属(Microdochium)物种,例如雪霉微座孢(Microdochiumnivale);球腔菌属(Mycosphaerella)物种,例如禾生球腔菌(Mycosphaerellagraminicola)、落花生球腔菌(M.arachidicola)和香蕉叶斑病(M.fifiensis);暗球腔菌属(Phaeosphaeria)物种,例如颖枯壳针孢(Phaeosphaeria nodorum);核腔菌属(Pyrenophora)物种,例如圆核腔菌(Pyrenophora teres)、偃麦草核腔菌(Pyrenophoratritici repentis);柱隔孢属(Ramularia)物种,例如柱隔孢叶斑病菌(Ramularia collo-cygni)、白斑柱隔孢(Ramularia areola);喙孢属(Rhynchosporium)物种,例如大麦云纹病菌(Rhynchosporium secalis);壳针孢属(Septoria)物种,例如芹菜壳针孢菌(Septoriaapii)、茄壳针孢菌(Septoria lycopersii);核瑚菌属(Typhula)物种,例如肉孢核瑚菌(Typhula incarnata);黑星菌属(Venturia)物种,例如苹果黑星病菌(Venturiainaequalis);例如由以下引起的根病和茎病:伏革菌属(Corticium)物种,例如禾伏革菌(Corticium graminearum);镰孢属(Fusarium)物种,例如尖孢镰孢(Fusariumoxysporum);顶囊壳属(Gaeumannomyces)物种,例如禾顶囊壳(Gaeumannomycesgraminis);丝核菌属(Rhizoctonia)物种,例如像立枯丝核菌(Rhizoctonia solani);例如由稻帚枝霉(Sarocladium oryzae)引起的帚枝霉(Sarocladium)病;例如由以下引起的小核菌(Sclerotium)病:小球菌核菌(Sclerotium oryzae);Tapesia属物种,例如Tapesiaacuformis;根串珠霉属(Thielaviopsis)物种,例如烟草根黑腐病菌(Thielaviopsisbasicola);例如由以下引起的穗和圆锥花序疾病(包括玉米穗轴):链格孢属(Alternaria)物种,例如链格孢属物种(Alternaria spp.);曲霉属(Aspergillus)物种,例如黄曲霉菌(Aspergillus flavus);枝孢属(Cladosporium)物种,例如芽枝状枝孢(Cladosporiumcladosporioides);麦角菌属(Claviceps)物种,例如黑麦麦角菌(Claviceps purpurea);镰孢属物种,例如黄色镰孢(Fusarium culmorum);赤霉属(Gibberella)物种,例如玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae);明梭孢属(Monographella)物种,例如雪腐明梭孢(Monographella nivalis);壳针孢属物种,例如颖枯壳针孢(Septoria nodorum);由以下引起的疾病:黑穗病真菌,例如轴黑粉菌属(Sphacelotheca)物种,例如丝黑穗病菌(Sphacelotheca reiliana);腥黑粉菌属(Tilletia)物种,例如小麦网腥黑粉菌(Tilletiacaries)、小麦矮腥黑穗病菌(T.controversa);条黑粉菌属(Urocystis)物种,例如隐条黑粉菌(Urocystis occulta);黑粉菌属(Ustilago)物种,例如裸黑粉菌(Ustilago nuda)、U.nuda tritici;例如由以下引起的果腐病:曲霉属物种,例如黄曲霉菌;葡萄孢属(Botrytis)物种,例如灰葡萄孢菌;青霉属(Penicillium)物种,例如扩展青霉(Penicillium expansum)和产紫青霉(P.purpurogenum);核盘霉属物种,例如核盘菌;轮枝孢属(Verticilium)物种,例如黑白轮枝孢(Verticilium alboatrum);种子和土壤传播的腐烂、霉、萎蔫、腐烂和猝倒病,这些疾病例如是由以下引起的:链格孢属(Alternaria)物种,例如由甘蓝链格孢菌(Alternaria brassicicola)引起;丝囊霉属(Aphanomyces)物种,例如由根腐丝囊霉(Aphanomyces euteiches)引起;壳二孢属(Ascochyta)物种,例如由兵豆壳二孢(Ascochyta lentis)引起;曲霉属物种,例如由黄曲霉菌引起;枝孢属(Cladosporium)物种,例如由多主枝孢(Cladosporium herbarum)引起;旋孢腔菌属(Cochliobolus)物种,例如由禾旋孢腔菌(Cochliobolus sativus);(分生孢子形式:内脐蠕孢属(Drechslera)、平脐蠕孢属(Bipolaris),同义:长蠕孢属(Helminthosporium)引起;炭疽菌属(Colletotrichum)物种,例如由球状炭疽菌(Colletotrichum coccodes)引起;镰孢物种,例如由黄色镰孢引起;赤霉属物种,例如由玉蜀黍赤霉引起;壳球孢属(Macrophomina)物种,例如由菜豆壳球孢菌(Macrophomina phaseolina)引起;明梭孢属物种,例如由雪腐明梭孢引起;青霉属物种,例如由扩展青霉引起;茎点霉属(Phoma)物种,例如由黑胫茎点霉(Phoma lingam)引起;拟茎点霉属(Phomopsis)物种,例如由大豆拟茎点菌(Phomopsis sojae)引起;疫霉属(Phytophthora)物种,例如由恶疫霉菌(Phytophthoracactorum)引起;核腔菌属(Pyrenophora)物种,例如由麦类核腔菌(Pyrenophoragraminea)引起;梨孢属(Pyricularia)物种,例如由稻梨孢菌(Pyricularia oryzae)引起;腐霉属物种,例如由极腐霉引起;丝核菌属(Rhizoctonia)物种,例如由立枯丝核菌引起;根霉属(Rhizopus)物种,例如由稻根霉菌(Rhizopus oryzae)引起;小菌核属(Sclerotium)物种,例如由齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)引起;壳针孢属物种,例如由颖枯壳针孢引起;核瑚菌属物种,例如由肉孢核瑚菌引起;轮枝孢属(Verticillium)物种,例如由大丽花轮枝孢引起;例如由以下引起的癌、瘿瘤和鬼帚病(witches’broom):丛赤壳属(Nectria)物种,例如仁果干癌丛赤壳菌(Nectria galligena);例如由以下引起的萎蔫病:链核盘菌属(Monilinia)物种,例如核果链核盘菌(Monilinia laxa);例如由以下引起的叶疱病或叶卷缩病:外担菌属(Exobasidium)物种,例如坏损外担菌(Exobasidium vexans);外囊菌属(Taphrina)物种,例如畸形外囊菌(Taphrina deformans);木质植物的衰退病,其例如由以下引起:埃斯卡病(Esca disease),例如由根霉格孢菌(Phaemoniella clamydospora)、Phaeoacremonium aleophilum和地中海嗜蓝孢孔菌(Fomitiporia mediterranea);葡萄顶枯病(Eutypa dyeback),例如由葡萄弯孢壳(Eutypa lata)引起;例如由岛灵芝(Ganodermaboninense)引起的灵芝(Ganoderma)病;例如由木硬孔菌(Rigidoporus lignosus)引起的硬孔菌(Rigidoporus)病;例如由以下引起的花和种子的疾病:葡萄孢属(Botrytis)物种,例如灰葡萄孢菌;例如由以下引起的植物块茎的疾病:丝核菌属物种,例如立枯丝核菌;长蠕孢属(Helminthosporium)物种,例如茄长蠕孢(Helminthosporium solani);例如由以下引起的根肿病:根肿菌属(Plasmodiophora)物种,例如芸苔根肿菌(Plamodiophorabrassicae);由以下引起的疾病:细菌病原体,例如黄单胞菌属(Xanthomonas)物种,例如野油菜黄单胞菌稻致病变体(Xanthomonas campestris pv.oryzae);假单胞菌属(Pseudomonas)物种,例如丁香假单胞菌黄瓜致病变种(Pseudomonas syringaepv.lachrymans);欧文氏菌属(Erwinia)物种,例如解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)。
表6提供了在本文所述的生产方法和生物反应器中可用作生物刺激剂的真菌植物有害生物的另外的实例。
病毒刺激剂
在一些情况下,生物刺激剂是病毒或其组分(例如,核酸、小分子、或多肽),例如,在植物中引起疾病的病毒,该病毒包括但不限于本文所述的任何病毒。
表10提供了在本文所述的生产方法和生物反应器中可用作生物刺激剂的病毒植物有害生物的另外的实例。
昆虫刺激剂
在一些情况下,生物刺激剂是昆虫或其组分(例如,核酸、小分子、或多肽),例如,作为植物有害生物的昆虫,该昆虫包括但不限于本文所述的任何昆虫。例如,该生物刺激剂可以是以下目的昆虫或其组分,如蜱螨目(Acari)、蜘蛛目(Araneae)、虱目(Anoplura)、鞘翅目(Coleoptera)、弹尾目(Collembola)、革翅目(Dermaptera)、网翅目(Dictyoptera)、双尾目(Diplura)、双翅目(Diptera)(例如,斑翅果蝇(spotted-wing Drosophila))、纺足目(Embioptera)、蜉蝣目(Ephemeroptera)、蛩蠊目(Grylloblatodea)、半翅目(Hemiptera)(例如,蚜虫、温室白粉虱)、同翅目(Homoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、等翅目(Isoptera)、鳞翅目、食毛目(Mallophaga)、长翅目(Mecoptera)、脉翅目(Neuroptera)、蜻蜓目(Odonata)、直翅目(Orthoptera)、竹节虫目(Phasmida)、襀翅目(Plecoptera)、原尾目(Protura)、啮虫目(Psocoptera)、蚤目(Siphonaptera)、虱目(Siphunculata)、缨尾目(Thysanura)、捻翅目(Strepsiptera)、缨翅目(Thysanoptera)、毛翅目(Trichoptera)、或缺翅目(Zoraptera)。
表8提供了在本文所述的制造方法和生物反应器中可用作生物刺激剂的昆虫植物有害生物的另外的实例。
软体动物刺激剂
在一些情况下,生物刺激剂是软体动物或其组分(例如,核酸、小分子、或多肽),例如,在植物中引起疾病的软体动物,该软体动物包括但不限于本文所述的任何软体动物,例如,主要作为杂食性有害生物出现在农业和园艺作物上的陆生蛞蝓和蜗牛。例如,软体动物可以属于以下科:玛瑙螺科(Achatinidae)、野蛞蝓科(Agriolimacidae)、瓶螺科(Ampullariidae)、阿勇蛞蝓科(Arionidae)、巴蜗牛科(Bradybaenidae)、大蜗牛科(Helicidae)、Hydromiidae、椎实螺科(Lymnaeidae)、小蛞蝓科(Milacidae)、尾环蜗牛科(Urocyclidae)、或蛞蝓科(Veronicellidae)。
例如,在一些情况下,软体动物是玛瑙螺属物种(Achatina spp.)、Archachatina属物种(例如,Archachatina marginata)、野蛞蝓属物种(Agriolimax spp.)、Arion属物种(例如,A.ater、A.circumscriptus、A.distinctus、A.fasciatus、A.hortensis、A.intermedius、红色蛞蝓(A.rufus)、A.subfuscus、A.silvaticus、A.lusitanicus)、Arliomax属物种(例如,Ariolimax columbianus)、双脐螺属物种(Biomphalaria spp)、缓行螺属物种(Bradybaena spp.)(例如,B.fruticum)、小泡螺属物种(Bulinus spp.)、蜗牛属物种(Cantareus spp.)(例如,棕色庭园蜗牛(C.asperses))、葱蜗牛属物种(Cepaeaspp.)(例如,花园葱蜗牛(C.hortensis)、森林蜗牛(C.nemoralis)、花园葱蜗牛(C.hortensis))、白蜗牛属物种(Cernuella spp.)、螺蜗牛属物种(Cochlicella spp.)、Cochlodina属物种(例如,C.laminata)、颈蛞蝓属物种(Deroceras spp.)(例如,田地颈蛞蝓(D.agrestis)、D.empiricorum、光滑颈蛞蝓(D.laeve)、D.panornimatum、网纹颈蛞蝓(D.reticulatum))、圆盘蜗牛属物种(Discus spp.)(例如,圆形圆盘蜗牛(D.rotundatus))、Euomphalia属物种、土蜗属物种(Galba spp.)(例如,截形土蜗(G.trunculata))、大蜗牛属物种(Helicella spp.)(例如,H.itala、H.obvia)、Helicigona属物种(例如,H.arbustorum)、Helicodiscus属物种、Helix属物种(例如,H.aperta、H.aspersa、H.pomatia)、Limax属物种(例如,L.cinereoniger、L.flavus、L.marginatus、L.maximus、L.tenellus)、Limicolaria属物种(例如,Limicolaria aurora)、椎实螺属物种(Lymnaea spp.)(例如,静水椎实螺(L.stagnalis))、Mesodon属物种(例如,Mesonthyroidus)、蒙纳螺属物种(Monadenia spp.)(例如,信念蒙纳螺(Monadenia fidelis))、Milax属物种(例如,M.gagates、M.marginatus、M.sowerbyi、M.budapestensis)、钉螺属物种(Oncomelania spp.)、Neohelix属物种(例如,Neohelix albolabris)、钻螺属物种(Opeas spp.)、Otala属物种(例如,Otala lacteal)、Oxyloma属物种(例如,O.pfeifferi)、福寿螺属物种(Pomacea spp.)(例如,小管福寿螺(P.canaliculata))、琥珀螺属物种(Succinea spp.)、Tandonia属物种(例如,T.budapestensis、T.sowerbyi)、Theba属物种、瓦娄蜗牛属物种(Vallonia spp.)、或琥珀蜗牛属物种(Zonitoides spp.)(例如,光洁琥珀蜗牛(Z.nitidus))。
线虫刺激剂
在一些情况下,生物刺激剂是线虫或其组分(例如,核酸、小分子、或多肽),例如,在植物中引起疾病的线虫,该线虫包括但不限于本文所述的任何线虫,例如,根结线虫属物种(Meloidogyne spp.)(根结)、异皮线虫属物种(Heterodera spp.)、球异皮线虫属物种(Globodera spp.)、短体线虫属物种(Pratylenchus spp.)、螺旋线虫属物种(Helicotylenchus spp.)、相似穿孔线虫(Radopholus similis)、鳞球茎茎线虫(Ditylenchus dipsaci)、肾形肾状线虫(Rotylenchulus reniformis)、剑线虫属物种(Xiphinema spp.)、滑刃线虫属物种(Aphelenchoides spp.)和芹刺线虫(Belonolaimuslongicaudatus)。在一些情况下,线虫是植物寄生线虫或生活在土壤中的线虫。植物寄生线虫包括但不限于,体外寄生物,诸如剑线虫属物种(Xiphinema spp.)、长针线虫属物种(Longidorus spp.)、和毛刺线虫属物种(Trichodorus spp.);半寄生物,诸如垫刃线虫属物种(Tylenchulus spp.);移栖体内寄生物,如短体线虫属物种(Pratylenchus spp.)、穿孔线虫属物种(Radopholus spp.)、和盾线虫属物种(Scutellonema spp.);定栖寄生物,诸如异皮线虫属物种(Heterodera spp.)、球异皮线虫属物种(Globodera spp.)、和根结线虫属物种(Meloidogyne spp.);以及茎叶体内寄生物,诸如茎线虫属物种(Ditylenchusspp.)、滑刃线虫属物种(Aphelenchoides spp.)、和潜根线虫属物种(Hirschmaniellaspp.)。特别有害的根寄生土壤线虫是诸如异皮线虫属(Heterodera)或球异皮线虫属(Globodera)的囊肿形成线虫、和/或根结线虫属(Meloidogyne)的根结线虫。这些属的有害物种是例如,南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、大豆孢囊线虫(Heteroderaglycines,soybean cyst nematode)、马铃薯白线虫(Globodera pallida)和马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis),用本文描述的PMP组合物有效地控制这些物种。然而,本文描述的PMP组合物的使用决不限于这些属或物种,而且也以相同的方式延伸至其他线虫。
可以用作生物刺激剂的线虫的其他实例包括但不限于例如居农粗纹膜垫刃线虫(Aglenchus agricola)、小麦粒线虫(Anguina tritici)、花生滑刃线虫(Aphelenchoidesarachidis)、草莓滑刃线虫(Aphelenchoides fragaria)以及一般的滑刃线虫属物种(Aphelenchoides spp.)类茎和叶体内寄生虫、细小刺线虫(Belonolaimus gracilis)、长尾剌线虫(Belonolaimus longicaudatus)、诺顿刺线虫(Belonolaimus nortoni)、椰子伞滑刃线虫(Bursaphelenchus cocophilus)、Bursaphelenchus eremus、松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)、拟松材线虫(Bursaphelenchus mucronatus)以及一般的伞滑刃属物种(Bursaphelenchus spp.)、胡桃线虫(Cacopaurus pestis)、弯曲小环线虫(Criconemella curvata)、刻线小环线虫(Criconemella onoensis)、装饰小环线虫(Criconemella ornata)、Criconemella rusium、薄叶小环线虫(Criconemella xenoplax)(=Mesocriconema xenoplax)和一般的小环线虫属物种(Criconemella spp.)、Criconemoides femiae、Criconemoides onoense、Criconemoides ornatum和一般的轮线虫属物种(Criconemoides spp.)、腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)、鳞球茎茎线虫(Ditylenchus dipsaci)、食菌茎线虫(Ditylenchus myceliophagus)和一般的茎线虫属物种(Ditylenchus spp.)类茎和叶体内寄生虫、Dolichodorus heterocephalus、马铃薯白线虫(Globodera pallida)(=Heterodera pallida)、马铃薯金线虫(Globoderarostochiensis)(马铃薯胞囊线虫(potato cyst nematode))、茄球异皮线虫(Globoderasolanacearum)、烟草球异皮线虫(Globodera tabacum)、弗吉尼亚球异皮线虫(Globoderavirginia)和一般的球异皮线虫属物种(Globodera spp.)类固着性胞囊形成寄生虫、双角螺旋线虫(Helicotylenchus digonicus)、双宫双角螺旋线虫(Helicotylenchusdihystera)、刺桐双角螺旋线虫(Helicotylenchus erythrine)、多带双角螺旋线虫(Helicotylenchus multicinctus)、短小双角螺旋线虫(Helicotylenchus nannus)、假强壮双角螺旋线虫(Helicotylenchus pseudorobustus)和一般的螺旋线虫属物种(Helicotylenchus spp.)、半轮线虫(Hemicriconemoides)、蚤缀鞘线虫(Hemicycliophoraarenaria)、Hemicycliophora nudata、微细鞘线虫(Hemicycliophora parvana)、Heterodera avenae、十字花科异皮线虫(Heterodera cruciferae)、大豆异皮线虫(Heterodera glycines)(大豆胞囊线虫)、水稻异皮线虫(Heterodera oryzae)、甜菜异皮线虫(Heterodera schachtii)、玉米异皮线虫(Heterodera zeae)和一般的异皮线虫属物种(Heterodera spp.)类固着性囊孢形成寄生虫、纤细潜根线虫(Hirschmaniellagracilis)、水稻潜根线虫(Hirschmaniella oryzae)、刺尾潜根线虫(Hirschmaniellaspinicaudata)和一般的潜根线虫属物种(Hirschmaniella spp.)类茎和叶的内寄生虫、埃及纽带线虫(Hoplolaimus aegyptii)、加州纽带线虫(Hoplolaimus califomicus)、哥伦比亚纽带线虫(Hoplolaimus columbus)、帽状纽带线虫(Hoplolaimus galeatus)、印度纽带线虫(Hoplolaimus indicus)、大针纽带线虫(Hoplolaimus magnistylus)、不强纽带线虫(Hoplolaimus pararobustus)、非洲长针线虫(Longidorus africanus)、短环长针线虫(Longidorus breviannulatus)、逸去长针线虫(Longidorus elongatus)、光头长针线虫(Longidorus laevicapitatus)、藤蔓长针线虫(Longidorus vineacola)和一般的长针线虫属物种(Longidorus spp.)类外寄生虫、高粱根结线虫(Meloidogyne acronea)、非洲根结线虫(Meloidogyne africana)、花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)、泰晤士花生根结线虫(Meloidogyne arenaria thamesi)、Meloidogyne artiella、哥伦比亚根结线虫(Meloidogyne chitwoodi)、咖啡根结线虫(Meloidogyne coffeicola)、埃塞俄比亚根结线虫(Meloidogyne ethiopica)、短小根结线虫(Meloidogyne exigua)、伪哥伦比亚根结线虫(Meloidogyne fallax)、禾草根结线虫(Meloidogyne graminicola)、禾本科根结线虫(Meloidogyne graminis)、北方根结线虫(Meloidogyne hapla)、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、Meloidogyne incognita acrita、爪哇根结线虫(Meloidogynejavanica)、吉库尤根结线虫(Meloidogyne kikuyensis)、微小根结线虫(Meloidogyneminor)、纳西根结线虫(Meloidogyne naasi)、巴拉那根结线虫(Meloidogyneparanaensis)、泰晤士根结线虫(Meloidogyne thamesi)和一般的根结线虫属物种(Meloidogyne spp.)类固着性囊孢形成寄生虫、瓢线虫属物种(Meloinema spp.)、异常珍珠线虫(Nacobbus aberrans)、Neotylenchus vigissi、Paraphelenchuspseudoparietinus、葱副毛刺线虫(Paratrichodorus allius)、裂片副毛刺线虫(Paratrichodorus lobatus)、微小拟毛刺线虫(Paratrichodorus minor)、矮小拟毛刺(Paratrichodorus nanus)、胼胝副毛刺线虫(Paratrichodorus porosus)、光滑副毛刺线虫(Paratrichodorus teres)和一般的副毛刺线虫属物种(Paratrichodorus spp.)、弯钩针线虫(Paratylenchus hamatus)、微小针线虫(Paratylenchus minutus)、突出针线虫(Paratylenchus projectus)和一般的针线虫属物种(Paratylenchus spp.)、敏捷短体线虫(Pratylenchus agilis)、艾氏短体线虫(Pratylenchus alleni)、安第斯短体线虫(Pratylenchus andinus)、最短尾短体线虫(Pratylenchus brachyurus)、谷类短体线虫(Pratylenchus cerealis)、咖啡短体线虫(Pratylenchus coffeae)、刻痕短体线虫(Pratylenchus crenatus)、德式短体线虫(Pratylenchus delattrei)、圆尾短体线虫(Pratylenchus giibbicaudatus)、古氏短体线虫(Pratylenchus goodeyi)、钩状短体线虫(Pratylenchus hamatus)、六纹短体线虫(Pratylenchus hexincisus)、卢斯短体线虫(Pratylenchus loosi)、落选短体线虫(Pratylenchus neglectus)、穿刺短体线虫(Pratylenchus penetrans)、草地短体线虫(Pratylenchus pratensis)、Pratylenchusscribneri、精美短体线虫(Pratylenchus teres)、索氏短体线虫(Pratylenchusthornei)、伤残短体线虫(Pratylenchus vulnus)、玉米短体线虫(Pratylenchus zeae)和一般的短体线虫属物种(Pratylenchus spp.)类迁移性内寄生虫、Pseudohalenchusminutus、大齿平滑垫刃线虫(Psilenchus magnidens)、肿大平滑垫刃线虫(Psilenchustumidus)、查尔斑皮线虫(Punctodera chalcoensis)、锐利五沟线虫(Quinisulciusacutus)、柑橘穿孔线虫(Radopholus citrophilus)、相似穿孔线虫(Radopholussimilis)、一般的穿孔线虫属物种(Radopholus spp.)类迁移性内寄生虫、北方小盘旋线虫(Rotylenchulus borealis)、小肾状线虫(Rotylenchulus parvus)、肾形小盘旋线虫(Rotylenchulus reniformis)和一般的小盘旋线虫属物种(Rotylenchulus spp.)、直沟盘旋线虫(Rotylenchus laurentinus)、Rotylenchus macrodoratus、强壮盘旋线虫(Rotylenchus robustus)、单型盘旋线虫(Rotylenchus uniformis)和一般的盘旋线虫属物种(Rotylenchus spp.)、小班盾线虫(Scutellonema brachyurum)、缓慢盾线虫(Scutellonema bradys)、格尾盾线虫(Scutellonema clathricaudatum)和一般的盾线虫属物种(Scutellonema spp.)类迁移性内寄生虫、根瘿亚蟃线虫(Subanguina radiciola)、烟草头线虫(Tetylenchus nicotianae)、圆筒毛刺线虫(Trichodorus cylindricus)、微小毛刺线虫(Trichodorus minor)、原始毛刺线虫(Trichodorus primitivus)、最近毛刺线虫(Trichodorus proximus)、相似毛刺线虫(Trichodorus similis)、少见毛刺线虫(Trichodorus sparsus)和一般的毛刺线虫属物种(Trichodorus spp.)类体外寄生虫、农田矮化线虫(Tylenchorhynchus agri)、甘蓝矮化线虫(Tylenchorhynchus brassicae)、清亮矮化线虫(Tylenchorhynchus clarus)、克莱顿矮化线虫(Tylenchorhynchusclaytoni)、指状矮化线虫(Tylenchorhynchus digitatus)、伊布里矮化线虫(Tylenchorhynchus ebriensis)、最大矮化线虫(Tylenchorhynchus maximus)、裸矮化线虫(Tylenchorhynchus nudus)、普通矮化线虫(Tylenchorhynchus vulgaris)和一般的矮化线虫属物种(Tylenchorhynchus spp.)、半穿刺线虫(Tylenchulus semipenetrans)和一般的小垫刃属物种(Tylenchulus spp.)类半寄生虫、美洲剑线虫(Xiphinemaamericanum)、短颈剑线虫(Xiphinema brevicolle)、裂尾剑线虫(Xiphinemadimorphicaudatum)、标准剑线虫(Xiphinema index)和一般的剑线虫属物种(Xiphinema)类外寄生物。
线虫有害生物的其他实例包括属于以下科的物种:环线虫科(Criconematidae)、刺线虫科(Belonolaimidae)、枪形科(Hoploaimidae)、异皮线虫科(Heteroderidae)、长针线虫科(Longidoridae)、短体线虫科(Pratylenchidae)、毛刺线虫科(Trichodoridae)、或粒线虫科(Anguinidae)。
表9提供了在本文所述的生产方法和生物反应器中可用作生物刺激剂的线虫植物有害生物的另外的实例。
iv.核酸或多肽刺激剂
在一些情况下,刺激剂是异源多肽、异源核酸或异源小分子。
例如,该异源核酸可以是DNA、RNA、PNA、或杂交DNA-RNA分子。在一些情况下,RNA是信使RNA(mRNA)、指导RNA(gRNA)、或抑制性RNA。在一些情况下,该抑制性RNA是RNAi、shRNA、或miRNA。在一些情况下,该抑制性RNA抑制植物、植物部分、或植物细胞中的基因表达。在一些情况下,该核酸是mRNA、修饰的mRNA或DNA分子,其增加植物、植物部分、或植物细胞中以下的表达:酶、成孔蛋白、信号传导配体、细胞渗透肽、转录因子、受体、抗体、纳米抗体、基因编辑蛋白(例如,CRISPR-Cas系统、TALEN、或锌指)、核糖蛋白、蛋白适配体或伴侣蛋白。在某些情况下,该异源核酸改变了涉及细胞中EV生物发生或分泌的途径中的基因表达。例如,该异源核酸可以增加植物细胞中EXO70a1和/或EXO84的基因表达,从而刺激植物细胞分泌EV,并且增加可源自植物培养物的PMP的量。
可用于本文的多肽的实例可以包括基因编辑蛋白(例如,CRISPR-Cas系统、TALEN、或锌指)。在某些情况下,异源多肽改变了基因表达或以其他方式编辑涉及细胞中EV生物发生或分泌的基因的序列。例如,该异源多肽可以增加植物细胞中EXO70a1和/或EXO84的基因表达,从而刺激植物细胞分泌EV,和/或增加可源自植物培养物的PMP的量。
E.植物EV标记物
根据本文的方法或生物反应器制造的PMP可以具有一系列标记物,这些标记物将PMP鉴定为是使用植物EV产生的和/或包括其节段、部分或提取物。如本文所用,术语“植物EV标记物”是指与植物天然缔合并且在植物体内掺入植物EV中或上的组分,诸如植物蛋白、植物核酸、植物小分子、植物脂质、或其组合。植物EV标记物的实例可以在例如以下中发现:Rutter和Innes,Plant Physiol.[植物生理学]173(1):728-741,2017;Raimondo等人,Oncotarget.[肿瘤靶标]6(23):19514,2015;Ju等人,Mol.Therapy[分子疗法]21(7):1345-1357,2013;Wang等人,Molecular Therapy[分子疗法]22(3):522-534,2014;和Regente等人,J of Exp.Biol.[实验生物学杂志]68(20):5485-5496,2017;将其中每个通过引用并入本文。植物EV标记物的另外实例在附录中列出并且在本文中进一步概述。
在一些情况下,植物EV标记物可以包括植物脂质。可以在PMP中发现的植物脂质标记物的实例包括植物固醇、菜油固醇、β-谷固醇、豆固醇、燕麦固醇(avenasterol)、糖基肌醇磷酰基神经酰胺(GIPC)、糖脂(例如,单半乳糖基二酰基甘油(MGDG)或二半乳糖基二酰基甘油(DGDG))、或其组合。例如,PMP可以包括GIPC,GIPC表示植物中的主要鞘脂并且是植物中最丰富的膜脂质之一。其他植物EV标记物可以包括响应于非生物胁迫原或生物胁迫原(例如,细菌感染或真菌感染)而在植物中积累的脂质,诸如磷脂酸(PA)或磷脂酰肌醇-4-磷酸酯(PI4P)。
可替代地,植物EV标记物可以包括植物蛋白。在一些情况下,蛋白质植物EV标记物可以是植物天然产生的抗微生物蛋白,包括植物响应于非生物胁迫原或生物胁迫原(例如,细菌感染或真菌感染)而分泌的防御蛋白。植物病原体防御蛋白包括可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感性因子缔合蛋白受体蛋白(SNARE)的蛋白质(例如,突触融合蛋白-121(SYP121;GenBank登录号:NP_187788.1或NP_974288.1)、渗透(Penetration)1(PEN1;GenBank登录号:NP_567462.1))或ABC转运蛋白渗透3(PEN3;GenBank登录号:NP_191283.2)。植物EV标记物的其他实例包括促进在植物中长距离转运RNA的蛋白质,包括韧皮部蛋白(例如,韧皮部蛋白2-A1(PP2-A1),GenBank登录号:NP_193719.1)、钙依赖性脂质结合蛋白、或凝集素(例如,木菠萝相关凝集素,例如向日葵(Helianthus annuus)木菠萝(Helja;GenBank:AHZ86978.1)。例如,RNA结合蛋白可以是富含甘氨酸的RNA结合蛋白-7(GRP7;GenBank登录号:NP_179760.1)。另外,在一些情况下,调节胞间连丝功能的蛋白质可以在植物EV(包括蛋白质,诸如Synap-Totgamin A(GenBank登录号:NP_565495.1))中发现。在一些情况下,植物EV标记物可以包括参与脂质代谢的蛋白质,诸如磷脂酶C或磷脂酶D。在一些情况下,植物蛋白EV标记物是植物中的细胞运输蛋白。在植物EV标记物是蛋白质的某些情况下,蛋白质标记物可以缺少典型地与分泌的蛋白质相关的信号肽。非常规的分泌蛋白似乎共有若干个共同特征,如(i)缺少前导序列,(ii)缺少对ER或高尔基体具有特异性的翻译后修饰(PTM),和/或(iii)不受布雷菲德菌素A影响的分泌,布雷菲德菌素A阻断经典的ER/高尔基体依赖性分泌途径。本领域技术人员可以使用公众可免费获取的多种工具(例如,SecretomeP数据库;SUBA3(拟南芥属蛋白的亚细胞定位数据库(SUBcellular localization database forArabidopsis proteins)))来评估信号序列的蛋白质或其缺少。
在植物EV标记物是蛋白质的某些情况下,蛋白质可以具有与植物EV标记物(诸如附录中列出的植物EV标记物)具有至少35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、或100%序列同一性的氨基酸序列。例如,蛋白质可以具有与来自拟南芥的PEN1(GenBank登录号:NP_567462.1)具有至少35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、或100%序列同一性的氨基酸序列。
在一些情况下,植物EV标记物包括在植物中编码的核酸,例如植物RNA、植物DNA、或植物PNA。例如,PMP可以包括由植物编码的dsRNA、mRNA、病毒RNA、微小RNA(miRNA)、或小干扰RNA(siRNA)。在一些情况下,核酸可以是与促进在植物中长距离转运RNA的蛋白质相关的核酸,如本文所讨论。在一些情况下,核酸植物EV标记物可以是参与宿主诱导的基因沉默(HIGS)的核酸植物EV标记物,HIGS是植物沉默植物有害生物(例如,病原体,诸如真菌)的外来转录物的过程。例如,核酸可以是使细菌基因或真菌基因沉默的核酸。在一些情况下,核酸可以是微小RNA,诸如miR159或miR166,该微小RNA靶向真菌病原体(例如,大丽花轮枝孢(Verticillium dahliae))中的基因。在一些情况下,蛋白质可以是参与携带植物防御化合物的蛋白质,诸如参与芥子油苷(GSL)转运和代谢的蛋白质,包括芥子油苷转运蛋白-1 -1(GTR1;GenBank登录号:NP_566896.2)、芥子油苷转运蛋白-2(GTR2;NP_201074.1)、或环硫特异性(Epithiospecific)修饰子1(ESM1;NP_188037.1)。
在植物EV标记物是核酸的情况下,核酸可以具有与植物EV标记物具有至少35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、或100%序列同一性的核苷酸序列,例如诸如编码附录中列出的植物EV标记物的那些。例如,核酸可以具有与miR159或miR166具有至少35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、或100%序列同一性的多核苷酸序列。
在一些情况下,植物EV标记物包括由植物产生的化合物。例如,化合物可以是响应于非生物胁迫原或生物胁迫原而产生的防御化合物,诸如次生代谢物。在PMP中发现的一种此类次生代谢物是芥子油苷(GSL),GSL是主要在十字花科(Brassicaceae)植物中发现的含有氮和硫的次生代谢物。其他次生代谢物可以包括化感物质。
在一些情况下,基于典型地不是由植物产生的但通常与其他生物体相关的(例如,动物EV、细菌EV、或真菌EV的标记物)某些标记物(例如,脂质、多肽、或多核苷酸)的缺少,PMP也可以被鉴定为是使用植物EV产生的。例如,在一些情况下,PMP缺少典型地在动物EV、细菌EV或真菌EV中发现的脂质。在一些情况下,PMP缺少作为动物EV的典型特征的脂质(例如,鞘磷脂)。在一些情况下,PMP不含作为细菌EV或细菌膜的典型特征的脂质(例如,LPS)。在一些情况下,PMP缺少作为真菌膜的典型特征的脂质(例如,麦角固醇)。
可以使用本领域已知的能够鉴定小分子(例如,质谱法、质谱分析法)、脂质(例如,质谱法、质谱分析法)、蛋白质(例如,质谱法、免疫印迹法)、或核酸(例如,PCR分析)的任何方法来鉴定植物EV标记物。在一些情况下,本文描述的PMP组合物包含可检测量(例如,预定阈值量)的本文描述的植物EV标记物。
F.修饰的PMP
根据本文的方法或生物反应器产生的PMP可以是修饰的。在一个方面,可以使PMP负载有异源剂(例如,植物细胞壁渗透剂),相对于未修饰的PMP,该异源剂能够增加植物细胞摄取。例如,修饰的PMP可以包括植物细胞壁渗透剂,如酶、洗涤剂、或脂质。可在制造过程中的任何步骤添加此试剂,以有效地将该试剂引入制造的PMP中。
在一些情况下,该细胞壁渗透剂是酶。例如,该酶可以是细菌酶、真菌酶、原生动物酶、哺乳动物酶、或能够降解植物细胞壁的植物酶。在一些情况下,酶是能够降解植物细胞壁的细菌酶。在一些情况下,酶与能够降解植物细胞壁的细菌酶的全部或部分序列具有至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或100%的同一性。在一些情况下,酶是能够降解植物细胞壁的真菌酶。在一些情况下,酶与能够降解植物细胞壁的真菌酶的全部或部分序列具有至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或100%的同一性。在一些情况下,酶是能够降解植物细胞壁的植物酶。在一些情况下,细胞壁降解酶与能够降解植物细胞壁的植物酶的全部或部分序列具有至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或100%的同一性。在一些情况下,酶是能够降解植物细胞壁的原生动物酶。在一些情况下,细胞壁降解酶与能够降解植物细胞壁的原生动物酶的全部或部分序列具有至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或100%的同一性。
在一些情况下,酶是纤维素酶。例如,纤维素酶可以与细菌纤维素酶的全部或部分序列具有至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或100%的同一性。在一些情况下,纤维素酶与真菌纤维素酶的全部或部分序列具有至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或100%的同一性。在一些情况下,纤维素酶与原生动物纤维素酶的全部或部分具有至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或100%的同一性。
在一些情况下,细胞壁渗透剂是洗涤剂。在一些实施例中,洗涤剂是皂苷。
在一些情况下,细胞壁渗透剂包括阳离子脂质。在一些实施例中,阳离子脂质是1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DOPC)。在一些实施例中,阳离子脂质是1,2-二芥酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DEPC)。
药剂可以增加PMP的整体摄取或可以增加PMP的部分或组分(诸如由PMP携带的异源功能剂(例如,异源农业药剂(例如,杀有害生物剂、肥料剂、除草剂、植物修饰剂)或异源治疗剂(例如,抗真菌剂、抗细菌剂、杀病毒剂、抗病毒剂、杀昆虫剂、杀线虫剂、抗寄生生物剂或昆虫驱避剂))的摄取。植物细胞摄取程度的增加可以取决于将组合物递送到的植物或植物部分、PMP配制品、和对PMP进行的其他修饰。例如,相对于未修饰的PMP,修饰的PMP可以具有至少1%、2%、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%增加的植物细胞摄取。在一些情况下,该增加的植物细胞摄取是相对于未修饰的PMP增加至少2倍、4倍、5倍、10倍、100倍、或1000倍的植物细胞摄取。
在另一个方面,可以将这些PMP用其他组分(例如脂质,例如固醇,例如胆固醇;或小分子)修饰,以改变PMP的功能和结构特征。例如,可以将PMP用稳定分子修饰,这些稳定分子增加PMP的稳定性(例如,在室温下持续至少一天和/或在4℃下稳定至少一周)。
可以通过本领域已知的多种方法来测量修饰的PMP的植物细胞摄取。例如,可以用能在分离的植物细胞中检测到的标记物(例如,荧光标记物)对PMP或其组分进行标记,以确认摄取。可替代地,可以基于植物适应度的测量来检测植物细胞摄取。例如,本发明组合物和方法的功效可以通过比较用本发明修饰的PMP进行治疗相对于用缺少修饰的PMP的组合物进行治疗的植物适应度变化来确定。
G.药剂的负载
可以对根据本文的方法或生物反应器产生的PMP进行修饰以包括如本文所述的那些异源功能剂(例如,异源农业药剂(例如,杀有害生物剂、肥料剂、除草剂、植物修饰剂)或异源治疗剂(例如,抗真菌剂、抗细菌剂、杀病毒剂、抗病毒剂、杀昆虫剂、杀线虫剂、抗寄生生物剂、或昆虫驱避剂))。PMP可以以多种方式携带此类药剂或与其缔合,以使该药剂能够递送至靶植物,例如通过包封该药剂、将组分结合在脂质双层结构中、或将组分(例如,通过缀合)与PMP的脂质双层结构的表面缔合。
可以通过本领域已知的允许直接或间接在PMP与药剂之间缔合的任何方法将异源功能剂结合或负载到PMP中或上。可以通过体内方法(例如,在植物体内,例如通过从包含异源剂的转基因植物中生产PMP)、或体外(例如,在组织培养物中或在细胞培养物中)、或体内和体外方法两者,将异源功能剂掺入PMP中。
在PMP负载有体内异源功能剂的情况下,可以使用EV或其节段或部分、或已经在植物中负载的含有EV的提取物来产生PMP。植物体内方法包括在已基因修饰为表达用于负载到EV中的异源功能剂的植物、植物细胞培养物、或植物组织中表达该异源功能剂。在一些情况下,异源功能剂对植物是外源的。可替代地,异源功能剂可以天然发现于植物中,但被工程化为以相对于在非遗传修饰的植物中发现的其水平升高的水平表达。
在一些情况下,PMP可以体外负载。物质可以使用但不限于物理、化学和/或生物学方法(例如,在组织培养物中或在细胞培养物中)负载到PMP上或中(例如,可以被PMP包封)。例如,可以通过电穿孔、超声处理、被动扩散、搅拌、脂质提取、或挤出中的一种或多种将异源功能剂引入到PMP中。可以使用多种方法来评价负载的PMP,以确认负载的药剂的存在或水平,这些方法如HPLC(例如,用于评价小分子);免疫印迹法(例如,用于评价蛋白质);和定量PCR(例如,用于评价核苷酸)。然而,本领域技术人员应当认识到,将感兴趣的物质负载到PMP中不限于以上展示的方法。
在一些情况下,可以将异源功能剂与PMP缀合,其中异源功能剂间接或直接地连接或接连至PMP。例如,可以将一种或多种异源功能剂化学连接至PMP,使得该一种或多种异源功能剂直接接连(例如,通过共价键或离子键)至PMP的脂质双层。在一些情况下,各种异源功能剂与PMP的缀合可以通过首先将一种或多种异源功能剂与适当的交联剂(例如,N-乙基碳二亚胺(“EDC”),其通常用作与伯胺进行酰胺键合的羧基活化剂并且还与磷酸酯基团反应)在合适的溶剂中混合来实现。在足以允许异源功能剂附接至交联剂的孵育时间段后,然后可以将交联剂/异源功能剂混合物与PMP键合,并且在另一个孵育时间段后,经受蔗糖梯度(例如,和8%、30%、45%、和60%蔗糖梯度)以将游离的异源功能剂和游离的PMP与缀合至PMP的异源功能剂分离。作为将混合物与蔗糖梯度混合以及伴随的离心步骤的一部分,与异源功能剂缀合的PMP然后在蔗糖梯度中作为条带被看见,使得然后可以将缀合的PMP收集、洗涤并且溶解于如本文描述使用的合适溶液中。
在一些情况下,在将PMP递送至例如植物之前和之后,PMP与异源功能剂稳定缔合。在其他情况下,PMP与异源功能剂缔合,使得在将PMP递送至例如植物之后,该异源功能剂变成与PMP解离的。
PMP可以负载有各种浓度的异源功能剂,取决于特定的药剂或用途。例如,在一些情况下,负载PMP,使得本文披露的PMP组合物包含约0.001、0.01、0.1、1.0、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、或95(或在约0.001与95之间的任何范围)或更大wt%的异源功能剂。在一些情况下,负载PMP,使得PMP组合物包含约95、90、80、70、60、50、40、30、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1.0、0.1、0.01、0.001(或在约95与0.001之间的任何范围)或更小wt%的异源功能剂。例如,PMP组合物可以包含约0.001至约0.01wt%、约0.01至约0.1wt%、约0.1至约1wt%、约1至约5wt%、或约5至约10wt%、约10至约20wt%的异源功能剂。在一些情况下,PMP可以负载有约1、5、10、50、100、200、或500、1,000、2,000(或在约1与2,000之间的任何范围)或更大μg/ml的异源功能剂。本发明的PMP可以负载有约2,000、1,000、500、200、100、50、10、5、1(或在约2,000与1之间的任何范围)或更小μg/ml的异源功能剂。
在一些情况下,负载PMP,使得本文披露的PMP组合物包含至少0.001wt%、至少0.01wt%、至少0.1wt%、至少1.0wt%、至少2wt%、至少3wt%、至少4wt%、至少5wt%、至少6wt%、至少7wt%、至少8wt%、至少9wt%、至少10wt%、至少15wt%、至少20wt%、至少30wt%、至少40wt%、至少50wt%、至少60wt%、至少70wt%、至少80wt%、至少90wt%、或至少95wt%的异源功能剂。在一些情况下,PMP可以负载有至少1μg/ml、至少5μg/ml、至少10μg/ml、至少50μg/ml、至少100μg/ml、至少200μg/ml、至少500μg/ml、至少1,000μg/ml、至少2,000μg/ml的异源功能剂。
可以负载到PMP中的特定异源功能剂的实例在标题为“异源功能剂”的部分中进一步概述。
II.PMP配制品
A.农业配制品
为了实现易于应用、处理、转运、储存和有效活性,可以将PMP(例如,根据本文的方法或生物反应器产生的)与用于在农业中使用的其他物质一起配制,例如,配制用于向植物、植物有害生物、植物共生体进行递送。可以将PMP配制成例如诱饵、浓缩乳液、粉剂、可乳化浓缩物、熏剂、凝胶、颗粒剂、微胶囊、种子处理剂、悬浮液浓缩物、悬乳剂、片剂、水溶性液体、水可分散颗粒剂或干燥可流动剂、可湿性粉剂、和超低容量溶液。关于配制品类型的进一步信息,参见“Catalogue of Pesticide Formulation Types and InternationalCoding System[杀有害生物剂配制品类型目录和国际编码系统]”Technical Monograph[技术专论]n°2,第5版,CropLife International[国际作物生命协会](2002)。
PMP组合物可以以从此类药剂的浓缩制配制品制备的水性悬浮液或乳液的形式应用。此类水溶性、水可悬浮性、或可乳化配制品是固体,通常称为可湿性粉剂或水可分散颗粒剂;或液体,通常称为可乳化浓缩物或水性悬浮液。可压实形成水可分散颗粒剂的可湿性粉剂包含PMP组合物、载体和表面活性剂的紧密混合物。载体通常选自绿坡缕石(attapulgite)粘土、蒙脱石(montmorillonite)粘土、硅藻土、或纯化硅酸盐。占可湿性粉剂的约0.5%至约10%的有效表面活性剂经发现于磺化木质素、缩合萘磺酸盐、萘磺酸盐、烷基苯磺酸盐、烷基硫酸盐、和诸如烷基苯酚的环氧乙烷加合物的非离子表面活性剂。
可乳化浓缩物可以包含合适浓度的溶解于载体中的PMP(诸如从约50至约500克/升液体),该载剂是水混溶性溶剂或水不可混溶性有机溶剂和乳化剂的混合物。可用的有机溶剂包括芳族化合物(尤其是二甲苯)和石油馏分(尤其是石油的高沸点萘和烯部分,诸如重芳族石脑油)。也可以使用其他有机溶剂,诸如包括松香衍生物的萜烯溶剂、诸如环己酮的脂族酮、和诸如2-乙氧基乙醇的复杂醇。用于可乳化浓缩物的合适乳化剂选自常规的阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂。
水性悬浮液包括水不溶性PMP组合物以按重量计从约5%至约50%的浓度分散在水性载体中的悬浮液。悬浮液通过以下方式制备:精细研磨组合物并且将其剧烈混合到由水和表面活性剂构成的载体中。还可以添加诸如无机盐和合成胶或天然胶的成分以增加水性载体的密度和粘度。
PMP组合物也可以以颗粒组合物的形式应用,这些颗粒组合物特别可用于应用于土壤。颗粒组合物通常含有按重量计从约0.5%至约10%的PMP组合物,该PMP组合物分散于包含粘土或类似物质的载体中。通常通过将配制品溶解于合适的溶剂中并且将其应用到已预先形成为在从约0.5mm至约3mm的适当粒度的颗粒载体中来制备此类组合物。也可以通过制造载体和化合物的粘团或糊剂并且挤压和干燥以获得所希望的颗粒粒度来配制此类组合物。
通过将呈粉末形式的PMP与合适的粉尘状农业载体(诸如高岭土、研磨的火山岩等)紧密混合来制备含有本发明的PMP配制品的粉剂。粉剂可以适当地含有从约1%至约10%的小包。它们可以以拌种的形式或以用喷粉机的叶面应用的形式来应用。
同样实用的是以在适当的有机溶剂(通常为石油,诸如广泛用于农业化学的喷淋油)中的溶液的形式应用本发明的配制品。
PMP也可以以气雾剂组合物的形式应用。在此类组合物中,小包溶解或分散于作为产生压力的推进剂混合物的载体中。将气雾剂组合物包装在通过雾化阀分配混合物的容器中。
另一个实施例是水包油乳液,其中该乳液包含各自具备层状液晶包衣并且分散在水相中的油性小珠,其中每个油性小珠包含至少一种具有农业活性的化合物并且单独地被单层状层或寡层状层包覆,该单层状层或寡层状层包含:(1)至少一种非离子亲脂性表面活性剂,(2)至少一种非离子亲水性表面活性剂,和(3)至少一种离子表面活性剂,其中这些小珠具有小于800纳米的平均粒径。在2007年2月1日披露的美国专利公开20070027034中披露了有关该实施例的更多信息。为了易于使用,此实施例将被称为“OIWE”。
另外,通常,当以上披露的分子用于配制品时,此类配制品还可以含有其他组分。这些组分包括但不限于(这是非详尽且非互相排他性列表)润湿剂、铺展剂、粘着剂、渗透剂、缓冲剂、螯合剂、减漂剂、相容剂、消泡剂、清洁剂、和乳化剂。接着描述数种组分。
润湿剂是当被添加到液体中时通过减小液体与它在上面铺展的表面之间的界面张力而增加液体的铺展或渗透能力的物质。润湿剂因两个主要功能而用于农业化学配制品:在加工和制造期间,增加粉末在水中润湿的速率以制造可溶性液体的浓缩物或悬浮液浓缩物;以及在将产品与水在喷洒罐中混合期间,减少可湿性粉剂的润湿时间并且改善水到水可分散颗粒剂中的渗透。用于可湿性粉剂、悬浮液浓缩物和水可分散颗粒剂配制品的润湿剂的实例是:月桂基硫酸钠;磺基琥珀酸二辛酯钠;烷基酚乙氧基化物;和脂族醇乙氧基化物。
分散剂是吸附于颗粒表面上并且有助于保持颗粒的分散状态并且防止其再聚集的物质。将分散剂添加到农业化学配制品中以促进在制造期间的分散和悬浮并且确保颗粒再分散于喷洒罐中的水中。它们广泛用于可湿性粉剂、悬浮液浓缩物、和水可分散颗粒剂。用作分散剂的表面活性剂具有强烈吸附于颗粒表面上并且对颗粒再聚集提供带电荷的壁垒或空间壁垒的能力。最常用的表面活性剂是阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、或两种类型的混合物。对于可湿性粉剂配制品,最常见的分散剂是木质素磺酸钠。对于悬浮液浓缩物,使用聚电解质(诸如萘磺酸钠甲醛缩合物)获得非常好的吸附和稳定。也使用三苯乙烯基酚乙氧基化物磷酸酯。诸如烷基芳基环氧乙烷缩合物和EO-PO嵌段共聚物的非离子表面活性剂有时与作为分散剂的阴离子表面活性剂组合用于悬浮液浓缩物。近年来,已开发出新型的非常高分子量的聚合物表面活性剂作为分散剂。它们具有非常长的疏水性“主链”和大量环氧乙烷链,这些环氧乙烷链形成“梳型”表面活性剂的“齿”。这些高分子量聚合物可以赋予悬浮液浓缩物非常好的长期稳定性,因为疏水性主链具有到颗粒表面上的许多锚点。用于农业化学配制品的分散剂的实例是:木质素磺酸钠;萘磺酸钠甲醛缩合物;三苯乙烯基酚乙氧基化物磷酸酯;脂族醇乙氧基化物;烷基乙氧基化物;EO-PO(环氧乙烷-环氧丙烷)嵌段共聚物;和接枝共聚物。
乳化剂是使一种液相的液滴在另一个液相中的悬浮液稳定的物质。在无乳化剂的情况下,可以将两种液体分成两种不可混溶性液相。最常用的乳化剂共混物含有具有十二个或更多个环氧乙烷单元的烷基酚或脂族醇和油溶性的十二烷基苯磺酸钙盐。从8至18的亲水亲油平衡(“HLB”)值将通常提供良好的稳定乳液。乳液稳定性有时可以通过添加少量EO-PO嵌段共聚物表面活性剂来改善。
增溶剂是将以高于临界胶束浓度的浓度在水中形成胶束的表面活性剂。这些胶束然后能够溶解或增溶胶束的疏水性部分内的水不溶性材料。通常用于增溶的表面活性剂的类型是非离子表面活性剂、脱水山梨糖醇单油酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯乙氧基化物、和油酸甲酯。
表面活性剂有时单独使用或与作为用于喷洒罐混合料的佐剂的其他添加剂(诸如矿物油或植物油)一起使用,以改善PMP组合物对于靶标的生物性能。用于生物增强的表面活性剂的类型通常取决于PMP组合物的性质和作用方式。然而,它们通常是非离子表面活性剂,诸如:烷基乙氧基化物;线性脂族醇乙氧基化物;脂族胺乙氧基化物。
农业配制品中的载体或稀释剂是添加到PMP组合物中以给出所希望的强度的产品的材料。载体通常是具有高吸收能力的材料,而稀释剂通常是具有低吸收能力的材料。载体和稀释剂用于粉剂、可湿性粉剂、颗粒剂、和水可分散颗粒剂的配制。
有机溶剂主要用于配制可乳化浓缩物、水包油乳液、悬乳剂、和超低容量配制品,并且在较小程度上用于配制颗粒配制品。有时使用溶剂混合物。第一主组的溶剂是脂族石蜡油,诸如煤油或精制石蜡。第二主组(并且最常用的)包括芳族溶剂,诸如二甲苯和较高分子量的C9和C10芳族溶剂馏分。氯化烃可用作助溶剂以便当配制品乳化在水中时防止PMP组合物结晶。醇有时用作助溶剂以增加溶解能力。其他溶剂可以包括植物油、种子油、和植物油和种子油的酯。
增稠剂或胶凝剂主要用于配制悬浮液浓缩物、乳液和悬乳剂,以改变液体的流变学或流动特性以及防止分散的颗粒或液滴的分离和沉降。增稠剂、胶凝剂和防沉剂通常分成两个类别,即水不溶性微粒和水溶性聚合物。可以使用粘土和二氧化硅来生产悬浮液浓缩物配制品。这些类型的材料的实例包括但不限于蒙脱石、膨润土、硅酸镁铝、和绿坡缕石。水溶性多糖已被用作增稠胶凝剂多年。最常用的多醣类型是种子和海草的天然提取物或是纤维素的合成衍生物。这些类型的材料的实例包括但不限于瓜尔胶;刺槐豆胶;卡拉胶;藻酸酯;甲基纤维素;羧甲基纤维素钠(SCMC);羟乙基纤维素(HEC)。其他类型的防沉剂基于改性淀粉、聚丙烯酸酯、聚乙烯醇、和聚环氧乙烷。另一种良好的防沉剂是黄原胶。
微生物可以导致配制产品的腐败。因此,使用防腐剂来消除或减小其作用。此类药剂的实例包括但不限于:丙酸及其钠盐;山梨酸及其钠盐或钾盐;苯甲酸及其钠盐;对羟基苯甲酸钠盐;对羟基苯甲酸甲酯;和1,2-苯并噻唑啉-3-酮(BIT)。
表面活性剂的存在通常在生产中和在通过喷洒罐进行的应用中的混合操作期间导致基于水的配制品起泡。为了减少起泡的倾向,通常在生产阶段期间或在填充至瓶中之前添加消泡剂。通常,存在两种类型的消泡剂,即硅酮和非硅酮。硅酮通常是二甲基聚硅氧烷的水性乳液,而非硅酮消泡剂是水不溶性油(诸如辛醇和壬醇)或二氧化硅。在两种情况下,消泡剂的功能是使表面活性剂从空气-水界面移位。
“绿色”剂(例如,佐剂、表面活性剂、溶剂)可以减少作物保护配制品的整体环境足迹。绿色剂是可生物降解的并且通常源自天然和/或可持续源,例如植物源和动物源。具体实例是:植物油、种子油、及其酯,以及烷氧基化烷基聚葡萄糖苷。
在一些情况下,可以将PMP冷冻干燥或冻干。参见美国专利号4,311,712。PMP可以随后在与水或另一种液体接触后重构。可以将其他组分添加到冻干或重构的PMP中,例如其他异源功能剂、农业上可接受的载体、或根据本文描述的配制品的其他材料。
组合物的其他任选特征包括保护PMP组合物免受UV和/或酸性条件的载体或递送媒介物。在一些情况下,递送媒介物含有pH缓冲剂。在一些情况下,将组合物配制为具有在约4.5至约9.0的范围内的pH,包括例如范围在5.0至约8.0、约6.5至约7.5、或约6.5至约7.0中的任一者的pH。
关于农业配制品的进一步信息,参见D.A.Knowles编辑的“Chemistry andTechnology of Agrochemical Formulations[农业化学配制品的化学和技术]”,版权1998归属于Kluwer Academic Publishers[克鲁维尔学术出版社]。还参见A.S.Perry,I.Yamamoto,I.Ishaaya,和R.Perry的“Insecticides in Agriculture and Environment-Retrospects and Prospects[农业杀昆虫剂与环境-回顾与展望]”,版权1998归属于Springer-Verlag[施普林格出版社]。
B.药物配制品
可以将本文产生的PMP配制成药物组合物,例如用于施用至动物(例如,人)。可以用药学上可接受的稀释剂、载体和/或赋形剂将药物组合物施用于动物(例如,人)。根据施用方式和剂量,将本文描述的方法的药物组合物配制成合适的药物组合物以允许容易的递送。根据需要,单剂量可以是单位剂量形式。
病原体防治组合物可以被配制用于例如口服施用、静脉内施用(例如,注射或输注)、或皮下施用于动物。对于可注射配制品,本领域已知各种有效的药物载体(参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy[雷明顿:药学科学与实践],第22版,(2012)和ASHP Handbook on Injectable Drugs[可注射药物的ASHP手册],第18版,(2014))。
本发明组合物中的药学上可接受的载体和赋形剂在使用的剂量和浓度下对受体无毒。可接受的载体和赋形剂可以包括缓冲剂,诸如磷酸盐、柠檬酸盐、HEPES、和TAE;抗氧化剂,诸如抗坏血酸和甲硫氨酸;防腐剂,诸如氯化六甲双铵、十八烷基二甲基苄基氯化铵、间苯二酚、和氯化苯甲烃铵;蛋白质,诸如人血清白蛋白、明胶、葡聚糖、和免疫球蛋白;亲水聚合物,诸如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸,诸如甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、和赖氨酸;以及碳水化合物,诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖、和山梨糖醇。可以根据常规药学实践来配制组合物。配制品中化合物的浓度将取决于许多因素而变化,这些因素包括待施用的活性剂(例如,PMP)的剂量以及施用途径。
为了口服施用于动物,病原体防治组合物可以以口服配制品的形式制备。口服使用的配制品可以包括片剂、囊片、胶囊、糖浆、或口服液体剂型,其含有与无毒的药学上可接受的赋形剂混合的一种或多种活性成分。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂或填充剂(例如,蔗糖、山梨糖醇、糖、甘露醇、微晶纤维素、淀粉(包括马铃薯淀粉)、碳酸钙、氯化钠、乳糖、磷酸钙、硫酸钙、或磷酸钠);制粒剂和崩解剂(例如,包括微晶纤维素的纤维素衍生物、包括马铃薯淀粉的淀粉、交联羧甲基纤维素钠、藻酸盐、或藻酸);粘合剂(例如,蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、阿拉伯胶、海藻酸、海藻酸钠、明胶、淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、硅酸铝镁、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、或聚乙二醇);以及润滑剂、助流剂和抗粘剂(例如,硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、二氧化硅、氢化植物油、或滑石)。其他药学上可接受的赋形剂可以是着色剂、调味剂、增塑剂、保湿剂、缓冲剂等。口服使用的配制品也可以提供在单位剂型中,作为可咀嚼片剂、非咀嚼片剂、囊片、胶囊(例如,作为硬明胶胶囊,其中活性成分与惰性固体稀释剂混合;或作为软明胶胶囊,其中活性成分与水或油介质混合)。本文披露的组合物还可以进一步包含立即释放配制品、延长释放配制品、或延迟释放配制品。
对于肠胃外施用于动物,病原体防治组合物可以以液体溶液或悬浮液的形式配制,并且通过肠胃外途径(例如,皮下、静脉内、或肌内)施用。药物组合物可以配制用于注射或输注。用于肠胃外施用的药物组合物可以使用无菌溶液或任何药学上可接受的液体作为媒介物来配制。药学上可接受的媒介物包括但不限于无菌水、生理盐水、或细胞培养基(例如,杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)(DMEM)、α-改良的伊格尔培养基(α-MEM)、F-12培养基)。配制方法是本领域已知的,参见例如Gibson(编辑)Pharmaceutical Preformulation and Formulation[药物预配制和配制](第2版)Taylor&Francis Group[泰勒弗朗西斯集团],CRC Press[CRC出版社](2009)。
III.异源功能剂
本文产生的PMP可以进一步包括异源功能剂,如异源农业药剂(例如,杀有害生物剂、肥料剂、除草剂、植物修饰剂)或异源治疗剂(例如,抗真菌剂、抗细菌剂、杀病毒剂、抗病毒剂、杀昆虫剂、杀线虫剂、抗寄生生物剂、或昆虫驱避剂)。例如,PMP可以包封异源功能剂。可替代地,异源功能剂可以包埋在PMP的表面上或与其缀合。在一些情况下,PMP包含两种或更多种(例如,2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10种)不同的异源功能剂。可在制造期间的任何步骤添加异源功能剂,以有效地将药剂引入制造的PMP中。
在某些情况下,可以修饰异源功能剂(例如,异源农业药剂(例如,杀有害生物剂、肥料剂、除草剂、植物修饰剂、异源核酸、异源多肽或异源小分子)或异源治疗剂(例如,抗真菌剂、抗细菌剂、杀病毒剂、抗病毒剂、杀线虫剂、抗寄生生物剂或昆虫驱避剂))。例如,修饰可以是化学修饰,例如缀合至标记,例如荧光标记物或放射性标记物。在其他实例中,修饰可以包括与如下部分缀合或操作性连接,该部分增强药剂(例如脂质、聚糖、聚合物(例如PEG)、或阳离子部分)的稳定性、递送、靶向、生物利用度、或半衰期。
可负载到本文制造的PMP中的异源功能剂的实例概述在以下。
A.异源农业药剂
本文产生的PMP可包含异源农业药剂(例如,影响植物或与植物缔合的生物体并可负载到PMP中的药剂),例如,杀有害生物剂、除草剂、肥料剂、或植物修饰剂。
例如,在一些情况下,PMP可包含杀有害生物剂。杀有害生物剂可以是抗真菌剂、抗细菌剂、杀昆虫剂、杀软体动物剂、杀线虫剂、杀病毒剂、或其组合。杀有害生物剂可以是化学剂,诸如本领域中熟知的那些。可替代地或另外地,杀有害生物剂可以是肽、多肽、核酸、多核苷酸、或小分子。杀有害生物剂可以是可以降低各种植物有害生物的适应度的药剂,或者可以是一种或多种特定靶植物有害生物(例如,特定物种或属的植物有害生物)的药剂。
在一些情况下,PMP可包含一种或多种异源肥料剂。异源肥料剂的实例包括植物营养素或植物生长调节剂,诸如本领域中熟知的那些。可替代地或另外地,肥料剂可以是可增加植物共生体适应度的肽、多肽、核酸或多核苷酸。肥料剂可以是可以增加各种植物或植物共生体的适应度的药剂,或者可以是一种或多种特定靶植物或植物共生体(例如,特定物种或属的植物或植物共生体)的药剂。
在其他情况下,PMP可包含一种或多种异源植物修饰剂。在一些情况下,植物修饰剂可包含肽或核酸。
i.抗细菌剂
本文描述的PMP组合物可以进一步包含抗细菌剂。在一些情况下,PMP组合物包含两种或更多种(例如,2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10种)不同的抗细菌剂。例如,抗细菌剂可以降低(例如,降低生长或杀死)细菌植物有害生物(例如,细菌植物病原体)的适应度。可以使包含如本文描述的抗生素的PMP组合物以一定量和一定时间与靶有害生物或其侵染的植物接触,该量和时间足以:(a)达到靶有害生物内或上抗生素浓度的目标水平(例如,预定或阈值水平);和(b)降低靶有害生物的适应度。本文描述的抗细菌剂可以配制在用于本文描述的任何方法的PMP组合物中,并且在某些情况下,可以与其PMP缔合。
如本文所用,术语“抗细菌剂”是指杀死或抑制细菌(诸如植物病原体细菌)的生长、增殖、分裂、繁殖或扩散的材料,并且包括杀细菌剂(例如,消毒化合物、抗菌化合物、或抗生素)或抑细菌剂(例如,化合物或抗生素)。杀细菌抗生素杀死细菌,而抑细菌抗生素仅减缓其生长或繁殖。
杀细菌剂可以包括消毒剂、抗菌剂、或抗生素。最多使用的消毒剂可以包括:活性氯(即,次氯酸盐(例如,次氯酸钠)、氯胺、二氯异氰脲酸酯和三氯异氰脲酸酯、湿氯、二氧化氯等);活性氧(过氧化物,诸如乙酸、过硫酸钾、过硼酸钠、过碳酸钠和尿素过水合物);碘(碘聚维酮(聚维酮-碘、必妥碘(Betadine));鲁哥氏溶液(Lugol’s solution)、碘酊、碘化非离子型表面活性剂);浓缩醇(主要是乙醇、1-丙醇(也称为正丙醇)和2-丙醇(称为异丙醇)及其混合物;此外,使用2-苯氧基乙醇以及1-和2-苯氧基丙醇);酚类物质(诸如苯酚(也称为石炭酸),甲酚(与液体钾皂组合称为Lysole),卤化(氯化、溴化)苯酚,诸如六氯酚、三氯生、三氯苯酚、三溴苯酚、五氯苯酚、Dibromol及其盐);阳离子表面活性剂,诸如一些季铵阳离子(诸如氯化苯甲烃铵、十六烷基三甲基溴化铵或十六烷基三甲基氯化铵、二癸基二甲基氯化铵、十六烷基吡啶鎓氯化物、苯乙铵氯化物)以及其他;非季铵盐化合物,诸如双氯苯双胍己烷(chlorhexidine)、glucoprotamine、奥替尼啶二盐酸盐等);强氧化剂,诸如臭氧和高锰酸盐溶液;重金属及其盐,诸如胶质银、硝酸银、氯化汞、苯基汞盐、硫酸铜、氧化-氯化铜、氢氧化铜、辛酸铜、硫酸氯氧化铜、硫酸铜、五水硫酸铜等。重金属及其盐是最大毒性的且对环境有害的杀细菌剂,并且因此,其使用被强烈压制或取消;此外,还有适当浓缩的强酸(磷酸、硝酸、硫酸、氨基磺酸、甲苯磺酸)和碱(氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙)。
作为抗菌剂(即,可以在人体或动物体、皮肤、粘膜、伤口等上使用的杀菌剂),可以在适当的条件(主要是浓度、pH、温度和对人/动物的毒性)下使用上述几种消毒剂。其中重要的是:适当稀释的氯制剂(即,达康氏溶液(Daquin’s solution)、0.5%次氯酸钠或次氯酸钾溶液(pH调节至pH 7-8)、或0.5%-1%苯磺酰氯胺钠盐溶液(氯胺B));一些碘制剂,诸如呈各种盖仑制剂(软膏、溶液、伤口膏药)的碘聚维酮、在过去还有鲁哥氏溶液;作为尿素过水合物溶液和pH缓冲的0.1%-0.25%过乙酸溶液的过氧化物;主要用于皮肤抗菌的具有或不具有抗菌添加剂的醇;弱有机酸,诸如山梨酸、苯甲酸、乳酸和水杨酸;一些酚类化合物,诸如六氯酚、三氯生和Dibromol;以及阳离子活性化合物,诸如0.05%-0.5%苯甲烃铵、0.5%-4%双氯苯双胍己烷、0.1%-2%奥替尼啶溶液。
本文描述的PMP组合物可以包含抗生素。可以使用本领域已知的任何抗生素。抗生素通常根据其作用机制、化学结构或活性谱进行分类。
本文描述的抗生素可以靶向任何细菌的功能或生长过程,并且可以是抑细菌的(例如,减缓或阻止细菌生长)或杀细菌的(例如,杀死细菌)。在一些情况下,抗生素是杀细菌抗生素。在一些情况下,杀细菌抗生素是靶向细菌细胞壁的杀细菌抗生素(例如,青霉素和头孢菌素);靶向细胞膜的杀细菌抗生素(例如,多粘菌素);或者抑制必需细菌酶的杀细菌抗生素(例如,利福霉素、闰年霉素(lipiarmycins)、喹诺酮类和磺胺类)。在一些情况下,杀细菌抗生素是氨基糖苷类(例如,春雷霉素)。在一些情况下,抗生素是抑细菌抗生素。在一些情况下,抑细菌抗生素靶向蛋白质合成(例如,大环内酯类、林可胺类和四环素类)。本文可以使用的另外类的抗生素包括环脂肽(诸如达托霉素)、甘氨酰环素(如替加环素)、噁唑烷酮类(如利奈唑胺)、或闰年霉素(lipiarmycins)(如非达霉素)。抗生素的实例包括利福平、环丙沙星、强力霉素、氨比西林、和多粘菌素B。本文描述的抗生素可以具有任何水平的靶特异性(例如,窄谱或广谱)。在一些情况下,抗生素是窄谱抗生素,并且因此靶向特异性类型的细菌,诸如革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌。可替代地,抗生素可以是靶向宽范围的细菌的广谱抗生素。
抗生素的其他非限制性实例发现于表1中。本领域技术人员应当认识到,组合物中每种抗生素的合适的浓度取决于诸如功效、抗生素的稳定性、不同抗生素的数量、配制品、和组合物的应用方法的因素。
表1.抗生素的实例
ii.抗真菌剂
本文描述的PMP组合物可以进一步包含抗真菌剂。在一些情况下,PMP组合物包含两种或更多种(例如,2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10种)不同的抗真菌剂。例如,抗真菌剂可以降低(例如,降低生长或杀死)真菌植物有害生物的适应度。可以使包含如本文描述的抗真菌剂的PMP组合物以一定量和一定时间与靶真菌有害生物或被其侵染的植物接触,该量和时间足以:(a)达到靶真菌内或上抗生素浓度的目标水平(例如,预定或阈值水平);和(b)降低靶真菌的适应度。本文描述的抗真菌剂可以配制在用于本文描述的任何方法的PMP组合物中,并且在某些情况下,可以与其PMP缔合。
如本文所用,术语“杀真菌剂(fungicide)”或“抗真菌剂(antifungal agent)”是指杀死或抑制真菌(诸如植物病原体真菌)的生长、增殖、分裂、繁殖或扩散的物质。商业上已生产了许多不同类型的抗真菌剂。抗真菌剂的非限制性实例包括:嘧菌酯、代森锰、丙硫菌唑、灭菌丹、戊唑醇、苯醚甲环唑、克菌丹、乙嘧酚磺酸酯、或乙膦酸-Al。其他示例性杀真菌剂包括但不限于嗜球果伞素、嘧菌酯、甲氧菌平、烯肟菌酯、氟嘧菌酯、醚菌酯-甲基、苯氧菌胺、啶氧菌酯、唑菌胺酯、三氟敏、肟醚菌胺、甲酰胺、甲酰苯胺、苯霜灵、精苯霜灵、麦锈灵、萎锈灵、灭锈胺、灭普宁、甲呋酰胺、环酰菌胺、福多宁、呋霜灵(furalaxyl)、二甲呋酰胺、呋吡菌胺、甲霜灵、精甲霜灵(metalaxyl-M)(mefenoxam)、呋菌胺、噻菌胺、呋酰胺(ofurace)、恶霜灵、氧化萎锈灵、吡噻菌胺、吡喃灵(pyracarbolid)、水杨酰苯胺、叶枯酞、噻呋酰胺、噻酰菌胺、N-联苯基酰胺、联苯吡菌胺、啶酰菌胺、N-酰基吗啉(carboxylic acidmorpholide)、烯酰吗啉、氟吗啉、苯甲酰胺、氟联苯菌(flumetover)、氟啶酰菌胺(fluopicolid)(氟吡菌胺(picobenzamid))、苯酰菌胺、甲酰胺、环丙酰菌胺、双氯氰菌胺、双炔酰菌胺、硫硅菌胺、唑类、三唑、双苯三唑醇、溴菌唑、环丙唑醇、苯醚甲环唑、达克利、恩康唑、氟环唑、芬克座、氟硅唑、氟喹唑、粉唑醇、己唑醇、亚胺唑、环戊唑醇、叶菌唑、腈菌唑、戊菌唑、丙环唑、丙硫菌唑、硅氟唑、戊唑醇、四氟醚唑、唑菌醇、三唑酮、灭菌唑、咪唑、氰霜唑、抑霉唑、净种灵(pefurazoate)、咪鲜胺、氟菌唑、苯并咪唑、苯菌灵、多菌灵、呋喃基苯并咪唑(fuberidazole)、噻苯咪唑、噻唑菌胺、土菌灵(etridiazole)、恶霉灵、含氮杂环基化合物、吡啶、氟啶胺(fuazinam)、比芬诺、嘧啶、乙嘧酚磺酸酯、环丙嘧啶、嘧菌腙(ferimzone)、氯苯嘧啶醇、嘧菌胺(mepanipyrim)、氟苯嘧啶醇、嘧霉胺、哌嗪、嗪胺灵、吡咯、咯菌腈、拌种咯(fenpiclonil)、吗啉、aldimorph、吗菌灵(dodemorph)、丁苯吗啉、十三吗啉、二甲酰亚胺、异菌脲、速克灵、乙烯菌核利、活化酯-S-甲基、敌菌灵、克菌丹、敌菌丹、棉隆、哒菌清、稻瘟酰胺、灭菌丹、苯锈啶、噁唑酮菌、咪唑菌酮(fenamidon)、辛基异噻唑酮(octhilinone)、噻菌灵、丙氧喹啉、咯喹酮(pyroquilon)、喹氧灵、三环唑、氨基甲酸酯、二硫代氨基甲酸酯、福美铁、代森锰、代森锰、代森联、威百亩、甲基代森锌、福美双、代森锌、福美锌、乙霉威、苯噻菌胺(flubenthiavalicarb)、丙森锌(iprovalicarb)、霜霉威、胍、多果定、双胍辛胺、双胍盐、春雷霉素、多氧霉素、链霉素、有效霉素A、有机金属化合物、三苯锡盐、含硫杂环基化合物、稻瘟灵、二噻农、有机磷化合物、克瘟散、乙膦酸、乙膦酸铝、异稻瘟净、吡嘧磷、甲基立枯磷、有机氯化合物、甲基托布津、百菌清、抑菌灵、对甲抑菌灵、氟硫灭、四氯苯酞、六氯苯、戊菌隆、五氯硝基苯、硝基苯基衍生物、乐杀螨、敌螨普、消螨通、螺环菌胺、环氟菌胺、霜脲氰、苯菌酮(metrafenon)、N-2-氰基苯基-3,4-二氯异噻唑-5-甲酰胺(异噻菌胺(isotianil))、N-(3',4',5'-三氟联苯-2-基)-3-二氟甲基-1-甲基吡唑-4-甲酰胺、3-[5-(4-氯苯基)-2,3-二甲基异噁唑烷-3-基]-吡啶、N-(3',4'-二氯-4-氟联苯-2-基)-3-二氟甲基-1-甲基吡唑-4-甲酰胺、5-氯-7-(4-甲基哌啶-1-基)-6-(2,4,6-三氟苯基)-[1,2,4]三-唑并[1,5-a]嘧啶、2-丁氧基-6-碘-3-丙基色烯-4-酮、N,N-二甲基-3-(3-溴-6-氟-2-甲基吲哚-1-磺酰基)-[1,2,4]三唑-1-磺胺、甲基-(2-氯-5-[1-(3-甲基苄氧基亚氨基)-乙基]苄基)氨基甲酸酯、甲基-(2-氯-5-[1-(6-甲基吡啶-2-基甲氧基-亚氨基)乙基]苄基)氨基甲酸酯、3-(4-氯苯基)-3-(2-异丙氧基羰基氨基-3-甲基丁酰基-氨基)丙酸甲酯、N-(1-(1-(4-氰基苯基)乙磺酰基)丁-2-基)氨基甲酸4-氟苯酯、N-(2-(4-[3-(4-氯苯基)丙-2-炔基氧基]-3-甲氧基苯基)乙基)-2-甲磺酰基氨基-3-甲基丁酰胺、N-(2-(4-[3-(4-氯苯基)丙-2-炔基氧基]-3-甲氧基苯基)乙基)-2-乙磺酰基氨基-3-甲基丁酰胺、N-(4'-溴联苯-2-基)-4-二氟甲基-2-甲基噻唑-5-甲酰胺、N-(4'-三氟甲基联苯-2-基)-4-二氟甲基-2-甲基噻唑-5-甲酰胺、N-(4'-氯-3'-氟联苯-2-基)-4-二氟甲基-2-甲基噻唑-5-甲酰胺、或2-(邻-((2,5-二甲基苯氧基-亚甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸甲脂。本领域技术人员应当认识到,组合物中每种抗真菌剂的合适的浓度取决于诸如功效、抗真菌剂的稳定性、不同抗真菌剂的数量、配制品、和组合物的应用方法的因素。
iii.杀昆虫剂
本文描述的PMP组合物可以进一步包含杀昆虫剂。在一些情况下,PMP组合物包含两种或更多种(例如,2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10种)不同的杀昆虫剂。例如,杀昆虫剂可以降低(例如,降低生长或杀死)昆虫植物有害生物的适应度。可以使包含如本文描述的杀昆虫剂的PMP组合物以一定量和一定时间与靶昆虫有害生物或被其侵染的植物接触,该量和时间足以:(a)达到靶昆虫内或上杀昆虫剂浓度的目标水平(例如,预定或阈值水平);和(b)降低靶昆虫的适应度。本文描述的杀昆虫剂可以配制在用于本文描述的任何方法的PMP组合物中,并且在某些情况下,可以与其PMP缔合。
如本文所用,术语“杀昆虫剂(insecticide或insecticidal agent)”是指杀死或抑制昆虫(诸如农业昆虫有害生物)的生长、增殖、繁殖、或扩散的物质。杀昆虫剂的非限制性实例在表2中示出。合适的杀昆虫剂的另外的非限制性实例包括生物制剂、激素或信息素(诸如印楝素)、芽孢杆菌属(Bacillus)物种、白僵菌属(Beauveria)物种、可得蒙(codlemone)、绿僵菌属(Metarrhizium)物种、拟青霉属(Paecilomyces)物种、thuringiensis、和轮枝孢属(Verticillium)物种;以及具有未知或非特定的作用机理的活性化合物,诸如熏剂(诸如磷化铝、甲基溴和硫酰氟),和选择性进食抑制剂(诸如冰晶石、氟啶虫酰胺和吡蚜酮)。本领域技术人员应当认识到,组合物中每种杀昆虫剂的合适的浓度取决于诸如功效、杀昆虫剂的稳定性、不同杀昆虫剂的数量、配制品、和组合物的应用方法的因素。
表2.杀昆虫剂的实例
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iv.杀线虫剂
本文描述的PMP组合物可以进一步包含杀线虫剂。在一些情况下,PMP组合物包含两种或更多种(例如,2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10种)不同的杀线虫剂。例如,杀线虫剂可以降低(例如,降低生长或杀死)线虫植物有害生物的适应度。可以使包含如本文描述的杀线虫剂的PMP组合物以一定量和一定时间与靶线虫有害生物或被其侵染的植物接触,该量和时间足以:(a)达到靶线虫内或上杀线虫剂浓度的目标水平(例如,预定或阈值水平);和(b)降低靶线虫的适应度。本文描述的杀线虫剂可以配制在用于本文描述的任何方法的PMP组合物中,并且在某些情况下,可以与其PMP缔合。
如本文所用,术语“杀线虫剂(nematicide或nematicidal agent)”是指杀死或抑制线虫(诸如农业线虫有害生物)的生长、增殖、繁殖、或扩散的物质。杀线虫剂的非限制性实例在表3中示出。本领域技术人员应当认识到,组合物中每种杀线虫剂的合适的浓度取决于诸如功效、杀线虫剂的稳定性、不同杀线虫剂的数量、配制品、和组合物的应用方法的因素。
表3.杀线虫剂的实例
v.杀软体动物剂
本文描述的PMP组合物可以进一步包含杀软体动物剂。在一些情况下,PMP组合物包含两种或更多种(例如,2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10种)不同的杀软体动物剂。例如,杀软体动物剂可以降低(例如,降低生长或杀死)软体动物植物有害生物的适应度。可以使包含如本文描述的杀软体动物剂的PMP组合物以一定量和一定时间与靶软体动物有害生物或被其侵染的植物接触,该量和时间足以:(a)达到靶软体动物内或上杀软体动物剂浓度的目标水平(例如,预定或阈值水平);和(b)降低靶软体动物的适应度。本文描述的杀软体动物剂可以配制在用于本文描述的任何方法的PMP组合物中,并且在某些情况下,可以与其PMP缔合。
如本文所用,术语“杀软体动物剂”或“杀软体动物剂”是指杀死或抑制软体动物(诸如农业软体动物有害生物)的生长、增殖、繁殖、或扩散的物质。许多化学物可以用作杀软体动物剂,包括金属盐,诸如磷酸铁(III)、硫酸铝、和EDTA铁钠、[3][4]、聚乙醛、甲硫威、或乙酰胆碱酯酶抑制剂。本领域技术人员应当认识到,组合物中每种杀软体动物剂的合适的浓度取决于诸如功效、杀软体动物剂的稳定性、不同杀软体动物剂的数量、配制品、和组合物的应用方法的因素。
vi.杀病毒剂
本文描述的PMP组合物可以进一步包含杀病毒剂。在一些情况下,PMP组合物包含两种或更多种(例如,2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10种)不同的杀病毒剂。例如,杀病毒剂可以降低(例如,降低或消除)病毒植物病原体的适应度。可以使包含如本文描述的杀病毒剂的PMP组合物以一定量和一定时间与靶病毒或被其侵染的植物接触,该量和时间足以:(a)达到杀病毒剂浓度的目标水平(例如,预定或阈值水平);和(b)降低或消除靶病毒。本文描述的杀病毒剂可以配制在用于本文描述的任何方法的PMP组合物中,并且在某些情况下,可以与其PMP缔合。
如本文所用,术语“杀病毒剂”或“抗病毒剂”是指杀死或抑制病毒(诸如农业病毒病原体)的生长、增殖、繁殖、发育、或扩散的物质。需要药剂可以用作杀病毒剂,包括化学物或生物药剂(例如核酸,例如dsRNA)。本领域技术人员应当认识到,组合物中每种杀病毒剂的合适的浓度取决于诸如功效、杀病毒剂的稳定性、不同杀病毒剂的数量、配制品、和组合物的应用方法的因素。
vii.除草剂
本文描述的PMP组合物可以进一步包含一种或多种(例如,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10种)除草剂。例如,除草剂可以降低(例如,降低或消除)杂草的适应度。可以使包含如本文描述的除草剂的PMP组合物以一定量和一定时间与靶杂草接触,该量和时间足以:(a)达到植物上除草剂浓度的目标水平(例如,预定或阈值水平),和(b)降低杂草的适应度。本文描述的除草剂可以配制在用于本文描述的任何方法的PMP组合物中,并且在某些情况下,可以与其PMP缔合。
如本文所用,术语“除草剂”是指杀死或抑制杂草的生长、增殖、繁殖、或扩散的物质。许多化学物可以用作除草剂,包括草铵膦、喔草酯、苯嗪草酮、吡草胺、二甲戊乐灵、氟噻草胺、吡氟酰草胺、异噁草酮、烟嘧磺隆、硝磺草酮、唑啉草酯、磺草酮、苄草丹、甲磺草胺、治草醚、喹草酸、野麦畏、特丁津、莠去津、乙氧氟草醚、敌草隆、氟乐灵、或绿麦隆。除草剂的进一步实例包括但不限于苯甲酸除草剂,诸如麦草畏酯;苯氧基烷酸除草剂,诸如2,4-D、MCPA和2,4-DB酯;芳氧基苯氧基丙酸除草剂,诸如炔草酯(clodinafop)、氰氟草酯(cyhalofop)、噁唑禾草灵(fenoxaprop)、吡氟禾草灵、吡氟氯禾灵、和喹禾灵酯;吡啶羧酸除草剂,诸如氯氨吡啶酸、毒莠定、和二氯吡啶酸酯;嘧啶羧酸除草剂,诸如环丙嘧啶酸酯;吡啶基氧基烷酸除草剂,诸如氯氟吡氧乙酸(fluoroxypyr)和绿草定(triclopyr)酯;以及羟基苄腈除草剂,诸如溴草腈和碘苯腈(ioxynil)酯;芳基吡啶羧酸的酯;以及美国专利号7,314,849、美国专利号7,300,907和美国专利号7,642,220中披露的通用结构的芳基嘧啶羧酸,将各专利通过引用以其全文并入本文。在某些实施例中,除草剂可以选自由以下组成的组:2,4-D、2,4-DB、乙草胺、氟锁草醚、甲草胺、莠灭净、杀草强、黄草灵、莠去津、唑啶草酮、氟草氨、苄嘧磺隆、地散灵、苯达松、除草定、溴草腈、丁草敌、唑草酮、草灭畏、氯嘧磺隆、chlorproham、氯磺隆、烯草酮、异噁草酮、二氯吡啶酸、氯酯磺草胺酸(cloransulam)、草净津、环草敌、DCPA、甜菜安、敌草腈、禾草灵、双氯磺草胺、乙酰甲草胺、燕麦枯、二氟吡隆、精二甲吩草胺、敌草快、敌草隆、DSMA、草多索、EPTC、丁氟消草、胺苯磺隆、乙氧呋草黄、噁唑禾草灵、精吡氟禾草灵(fluazifop-P)、氟酮磺隆、氟噻草胺、唑嘧磺草胺、氟烯草酸、丙炔氟草胺、伏草隆、氟草烟、嗪草酸(fluthiacet)、氟磺胺草醚、甲酰胺磺隆、草铵膦、草甘膦、氯吡嘧磺隆、吡氟氯禾灵(haloxyfop)、环嗪酮、咪草酯(imazamethabenz)、甲氧咪草烟、甲基咪草烟、咪唑喹啉酸、咪唑乙烟酸、异噁酰草胺、异噁唑草酮、乳氟禾草灵、利谷隆、MCPA、MCPB、硝磺草酮、灭草唑、异丙甲草胺-s、赛克津、甲磺隆、草达灭、MSMA、敌草胺、抑草生、烟嘧磺隆、达草灭、黄草消、恶草灵、环氧嘧磺隆、乙氧氟草醚、百草枯、克草猛(pebulate)、壬酸、二甲戊乐灵、苯敌草、毒莠定、氟嘧磺隆、氨氟乐灵、扑草净、拿草特、毒草安、敌稗、氟磺隆、杀草敏(pyrazon)、哒草特、嘧硫草醚、快杀稗(quinclorac)、喹禾灵、砜嘧磺隆(rimsulfuron)、稀禾定、环草隆、西玛津、甲磺草胺、甲嘧磺隆、磺酰磺隆、特丁噻草隆、特草定、噻草啶、噻吩磺隆、禾草丹、肟草酮(tralkoxydim)、野麦畏、醚苯磺隆、苯磺隆、绿草定、氟乐灵、氟胺磺隆、灭草猛。本领域技术人员应当认识到,组合物中每种除草剂的合适的浓度取决于诸如功效、除草剂的稳定性、不同除草剂的数量、配制品、和组合物的应用方法的因素。
viii.驱避剂
本文描述的PMP组合物可以进一步包含驱避剂。在一些情况下,PMP组合物包含两种或更多种(例如,2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10种)不同的驱避剂。例如,驱避剂可以趋避本文描述的任何有害生物(例如,昆虫、线虫、或软体动物);微生物(例如,植物病原体或内生植物,诸如细菌、真菌、或病毒);或杂草。可以使包含如本文描述的驱避剂的PMP组合物以一定量和一定时间与靶植物或被其侵染的植物接触,该量和时间足以:(a)达到驱避剂浓度的目标水平(例如,预定或阈值水平);和(b)相对于未处理的植物降低植物上有害生物的水平。本文描述的驱避剂可以配制在用于本文描述的任何方法的PMP组合物中,并且在某些情况下,可以与其PMP缔合。
在一些情况下,驱避剂是昆虫驱避剂。熟知的昆虫驱避剂的一些实例包括:苯偶酰;苯甲酸苄酯;2,3,4,5-双(丁-2-烯)四氢糠醛(MGK驱避剂11);丁氧基聚丙二醇;N-丁基乙酰苯胺;正丁基-6,6-二甲基-5,6-二氢-1,4-吡喃酮-2-甲酸酯(避虫酮);己二酸二丁酯;邻苯二甲酸二丁酯;琥珀酸二正丁酯(驱虫特);N,N-二乙基-间甲苯酰胺(DEET);驱蚊灵(内型,内型)-二甲基二环[2.2.1]庚-5-烯-2,3-二甲酸酯);邻苯二甲酸二甲酯;2-乙基-2-丁基-1,3-丙二醇;2-乙基-1,3-己二醇(Rutgers 612);异辛可部酸二正丙酯(MGK驱避剂326);2-苯基环己醇;对甲烷-3,8-二醇,和N,N-二乙基琥珀酰胺酸正丙酯。其他驱避剂包括香茅油、邻苯二甲酸二甲酯、正丁基均三甲苯基氧化物草酸酯和2-乙基己二醇-1,3(参见Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology[柯克-奥瑟默化学技术百科全书],第2版,第11卷:724-728;和The Condensed Chemical Dictionary[简明化学词典],第8版,第756页)。
昆虫驱避剂可以是合成或非合成昆虫驱避剂。合成昆虫驱避剂的实例包括邻氨基苯甲酸甲酯以及其他基于邻氨基苯甲酸酯的昆虫驱避剂、苯甲醛、DEET(N,N-二乙基-间甲苯酰胺)、驱蚊灵、邻苯二甲酸二甲酯、埃卡瑞丁(icaridin)(即,派卡瑞丁(picaridin)、羟哌酯(Bayrepel)、和KBR 3023)、避虫酮(例如,如用于“6-2-2”混合物(60%邻苯二甲酸二甲酯、20%避虫酮、20%乙基己二醇)、IR3535(3-[N-丁基-N-乙酰基]-氨基丙酸,乙酯)、甲氧苄氟菊酯、扑灭司林、SS220、或三环癸烯基烯丙基醚。天然昆虫驱避剂的实例包括紫珠(紫珠属(Callicarpa))叶、桦树树皮、香杨梅(bog myrtle)(Myrica Gale)、猫薄荷油(例如,荆芥内酯)、香茅油、柠檬桉(Corymbia citriodora;例如p-薄荷烷-3,8-二醇(PMD))的精油、苦楝油、柠檬草、来自互生叶白千层(Melaleuca alternifolia)叶的茶树油、烟草、或其提取物。
ix.肥料剂
本文描述的PMP组合物可以进一步包含异源肥料剂。在一些情况下,异源肥料剂与PMP缔合。例如,PMP可以包封异源肥料剂。另外地,或可替代地,异源肥料剂可以包埋在PMP的表面上或与其缀合。
异源肥料剂的实例包括植物营养素或植物生长调节剂,诸如本领域中熟知的那些。可替代地或另外地,肥料剂可以是可增加植物共生体适应度的肽、多肽、核酸或多核苷酸。肥料剂可以是可以增加各种植物或植物共生体的适应度的药剂,或者可以是一种或多种特定靶植物或植物共生体(例如,特定物种或属的植物或植物共生体)的药剂。
在一些情况下,可以修饰异源肥料剂。例如,修饰可以是化学修饰,例如缀合至标记,例如荧光标记物或放射性标记物。在其他实例中,修饰可以包括与如下部分缀合或操作性连接,该部分增强药剂(例如脂质、聚糖、聚合物(例如PEG)、或阳离子部分)的稳定性、递送、靶向、生物利用度、或半衰期。
可以用于本发明披露的PMP组合物和方法的异源肥料剂的实例概述在以下。
在一些情况下,异源肥料剂包括天然或合成来源的任何材料,其被应用于土壤或植物组织上以提供一种或多种植物生长所必需的植物营养素。植物营养素可以包含常量营养素、微量营养素或其组合。植物常量营养素包括氮、磷、钾、钙、镁和/或硫。植物微量营养素包括铜、铁、锰、钼、锌、硼、硅、钴和/或钒。植物营养素肥料的实例包括氮肥,包括但不限于尿素、硝酸铵、硫酸铵、常压氮溶液、氨水、无水氨、硫代硫酸铵、涂硫尿素、脲醛、IBDU、聚合物涂覆的尿素、硝酸钙、脲甲醛或亚甲脲、磷肥(例如磷酸二铵、磷酸一铵、聚磷酸铵、重过磷酸钙和三过磷酸钙)、或钾肥(例如氯化钾、硫酸钾、硫酸钾镁、硝酸钾)。此类组合物可以在组合物中以游离盐或离子的形式存在。肥料可以通过其一种或多种组分(诸如氮、磷或钾)的含量来指定。肥料中这些元素的含量可以由N-P-K值指示(其中N=按重量百分比计的氮含量,P=按重量百分比计的磷含量,以及K=按重量百分比计的钾含量)。
另一方面,无机肥料由非活体材料制成,并且包括例如硝酸铵、硫酸铵、尿素、氯化钾、钾碱、磷酸铵、无水氨和其他磷酸盐。无机肥料可很容易的商购,并且含有可溶形式的可立即用于植物的营养素。无机肥料通常价格便宜,所希望元素的单位成本低。本领域技术人员将理解,肥料剂中给定元素的精确量可以计算出,并施用于植物或土壤。
肥料可进一步分类为有机肥料或无机肥料。有机肥料包括具有含碳主链的分子主链的肥料,诸如在源自生活物质的组合物中。有机肥料是由源自生物的材料制成的。动物性杂肥、堆肥、骨粉、羽毛粉和血粉是常见的有机肥料的实例。另一方面,有机肥料典型地不可立即用于植物,并且在被植物使用之前需要土壤微生物将肥料组分分解为更简单的结构。此外,有机肥料不仅可以如普通无机肥料所观察到的引起植物的生长反应,而且天然有机肥料还可以刺激土壤微生物群体的生长和活性。土壤微生物群体(例如,植物共生体)的增加可能对土壤的物理和化学特性具有显著的有益作用,以及增加了对病害和有害生物的抗性。
在一个方面,可以使包含如本文描述的植物营养素的PMP组合物以一定量和一定时间与植物接触,该量和时间足以:(a)达到植物内或上植物营养素浓度的目标水平(例如,预定或阈值水平),和(b)相对于未处理的植物增加植物的适应度。
在另一个方面,可以使包含如本文描述的植物营养素的PMP组合物以一定量和一定时间与植物共生体接触,该量和时间足以:(a)达到植物共生体(例如,细菌或真菌内共生体)内或上植物营养素浓度的目标水平(例如,预定或阈值水平),和(b)相对于未处理的植物共生体增加植物共生体的适应度。
异源肥料剂可以包括植物生长调节剂。示例性植物生长调节剂包括植物生长素、细胞分裂素、赤霉素和脱落酸。在一些情况下,植物生长调节剂是脱落酸、乙酰胺、嘧啶醇、6-苄基氨基嘌呤、油菜素内酯、仲丁灵、矮壮素(chlormequat)(氯化氯代胆碱(chlormequatchloride))、氯化胆碱、环丙酰草胺、丁酰肼、调呋酸、噻节因、2,6-二甲基吡啶、乙烯磷、氟节胺、呋嘧醇、嗪草酸、氯吡脲、赤霉酸、抗倒胺、吲哚-3-乙酸、马来酰肼、氟磺酰草胺、甲哌鎓(mepiquat)(氯化二甲基哌啶嗡(mepiquat chloride))、萘乙酸、N-6-苄基腺嘌呤、多效唑、调环酸(prohexadione)(调环酸-钙(prohexadione-calcium))、茉莉酸诱导体(prohydrojasmon)、噻苯隆、抑芽唑、三丁基三硫磷酸酯、2,3,5-三-碘苯甲酸、抗倒酯(trinexapac-ethyl)和烯效唑。可掺入种子包衣组合物的其他植物生长调节剂描述于US2012/0108431中,其通过引用以其全文并入本文。
x.植物修饰剂
本文描述的PMP组合物包含一种或多种异源植物修饰剂。例如,PMP可以包封异源植物修饰剂。可替代地或另外地,异源植物修饰剂可以包埋在PMP的表面上或与其缀合。
在一些情况下,植物修饰剂可包含肽或核酸。植物修饰剂可以是增加各种植物的适应度的药剂,或者可以是靶向一种或多种特定植物(例如,特定物种或属的植物)的药剂。另外地,在一些情况下,PMP组合物包含两种或更多种(例如,2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10种)不同的植物修饰剂。
此外,在一些情况下,可以修饰异源植物修饰剂(例如,包含核酸分子或肽的药剂)。例如,修饰可以是化学修饰,例如缀合至标记,例如荧光标记物或放射性标记物。在其他实例中,修饰可以包括与如下部分缀合或操作性连接,该部分增强药剂(例如脂质、聚糖、聚合物(例如PEG)、或阳离子部分)的稳定性、递送、靶向、生物利用度、或半衰期。
可以用于本发明披露的PMP组合物和方法的异源植物修饰剂(例如,肽或核酸)的实例概述在以下。
A.多肽
本文描述的PMP组合物(例如,PMP)可以包含异源多肽。在一些情况下,本文描述的PMP组合物包含修饰植物(例如,例如增加植物的适应度)的多肽或其功能片段或衍生物。例如,多肽可以增加植物的适应度。可以使包含如本文描述的多肽的PMP组合物以一定量和一定时间与植物接触,该量和时间足以:(a)达到多肽浓度的目标水平(例如,预定或阈值水平);和(b)修饰植物(例如,增加植物的适应度)。
本文可用的多肽的实例可以包括酶(例如,代谢重组酶、解旋酶、整合酶、RNA酶、DNA酶、或泛素化蛋白)、成孔蛋白、信号传导配体、细胞渗透肽、转录因子、受体、抗体、纳米抗体、基因编辑蛋白(例如,CRISPR-Cas系统、TALEN、或锌指)、核糖蛋白、蛋白适配体、或伴侣蛋白。
本文包括的多肽可以包括天然存在的多肽或重组产生的变体。在一些情况下,多肽可以是其功能片段或变体(例如,其酶活性片段或变体)。例如,多肽可以是本文描述的任何多肽的功能活性变体,例如在指定区域或整个序列上与本文描述的多肽或天然存在的多肽的序列具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性。在一些情况下,多肽可以与感兴趣的蛋白质具有至少50%(例如,至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、99%、或更大)同一性。
可以在用于本文描述的任何用途的组合物中配制本文描述的多肽。本文披露的组合物可以包含任何数量或类型(例如,类别)的多肽,诸如至少约1种多肽、2、3、4、5、10、15、20、或更多种多肽中的任一者。组合物中每种多肽的合适的浓度取决于诸如功效、多肽的稳定性、组合物中不同多肽的数量、配制品、和组合物的应用方法的因素。在一些情况下,液体组合物中每种多肽是从约0.1ng/mL至约100mg/mL。在一些情况下,固体组合物中每种多肽是从约0.1ng/g至约100mg/g。
制造多肽的方法在本领域是常规的。通常,参见Smales和James(编辑),Therapeutic Proteins:Methods and Protocols[治疗性蛋白:方法和方案](Methods inMolecular Biology[分子生物学方法]),Humana Press[胡玛纳出版社](2005);以及Crommelin,Sindelar和Meibohm(编辑),Pharmaceutical Biotechnology:Fundamentalsand Applications[药物生物技术:基础与应用],Springer[斯普林格出版社](2013)。
用于产生多肽的方法涉及在植物细胞中表达,尽管也可以使用昆虫细胞、酵母、细菌、哺乳动物细胞、或其他细胞,在适当的启动子控制下,产生重组蛋白。哺乳动物表达载体可以包含非转录元件,诸如复制起点、合适的启动子和增强子、以及其他5'或3’侧翼非转录序列;以及5'或3'非翻译序列,诸如必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和接受位点;以及终止序列。源自SV40病毒基因组的DNA序列,例如SV40起点、早期启动子、增强子、剪接和聚腺苷酸化位点可以用于提供异源DNA序列表达所需的其他遗传元件。在以下文献中描述了用于与细菌、真菌、酵母、和哺乳动物细胞宿主一起使用的适当的克隆和表达载体:Green&Sambrook,Molecular Cloning:ALaboratory Manual[分子克隆-实验室手册](第四版),Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社](2012)。
不同哺乳动物细胞培养系统可以用于表达和制造重组多肽药剂。哺乳动物表达系统的实例包括但不限于CHO细胞、COS细胞、HeLA和BHK细胞系。在以下文献中描述了用于生产蛋白治疗剂的宿主细胞培养的过程:例如,Zhou和Kantardjieff(编辑),Mammalian CellCultures for Biologics Manufacturing[用于生物制品制造的哺乳动物细胞培养](Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology[生物化学工程/生物科技的进展]),Springer[斯普林格出版社](2014)。在以下文献中描述了蛋白质的纯化:Franks,Protein Biotechnology:Isolation,Characterization,and Stabilization[蛋白生物技术:分离、表征、和稳定化],Humana Press[胡玛纳出版社](2013);以及Cutler,ProteinPurification Protocols[蛋白纯化方案](Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]),Humana Press[胡玛纳出版社](2010)。以下文献中描述了蛋白治疗剂的配制品:Meyer(编辑),Therapeutic Protein Drug Products:Practical Approaches toformulation in the Laboratory,Manufacturing,and the Clinic[治疗性蛋白药物产品:实验室、制造和临床中配制品的实践方法],Woodhead Publishing Series[伍德海德出版系列](2012)。
在一些情况下,PMP组合物包含抗体或其抗原结合片段。例如,本文描述的药剂可以是阻断或增强植物的组分的活性和/或功能的抗体。抗体可以充当植物中多肽(例如,酶或细胞受体)的拮抗剂或激动剂。针对靶抗原的抗体的制造和使用是本领域已知的。参见例如Zhiqiang An(编辑),Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic[治疗性单克隆抗体,从实验室到临床],第1版,Wiley[威利出版社],2009,以及还有Greenfield(编辑),Antibodies:ALaboratory Manual[抗体:实验室手册],第2版,ColdSpring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],2013获得制造重组抗体的方法,包括抗体工程、简并寡核苷酸的使用、5'-RACE、噬菌体展示、以及诱变;抗体测试和表征;抗体药代动力学和药效动力学;抗体纯化和储存;以及筛选和标记技术。
B.核酸
许多核酸在本文描述的PMP组合物和方法中是有用的。本文披露的PMP组合物可以包括任何数量或类型(例如,类别)的异源核酸(例如,DNA分子或RNA分子,例如,mRNA、指导RNA(gRNA)、或抑制性RNA分子(例如,siRNA、shRNA、或miRNA),或杂交DNA-RNA分子),诸如至少约1个核酸类别或变体,2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个或更多个核酸类别或变体。组合物中每种核酸的合适浓度取决于多种因素,诸如功效、核酸的稳定性、不同核酸的数量、配制品、以及该组合物的施用方法。可用于本文的核酸的实例包括反义RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹(shRNA)、微小RNA(miRNA)、(不对称干扰RNA)aiRNA、肽核酸(PNA)、吗啉代、锁核酸(LNA)、piwi相互作用RNA(piRNA)、核糖酶、脱氧核酶(DNAzyme)、适配体(DNA、RNA)、环状RNA(circRNA)、指导RNA(gRNA)、或DNA分子。
可以使包含如本文描述的核酸的PMP组合物以一定量和一定时间与植物接触,该量和时间足以:(a)达到核酸浓度的目标水平(例如,预定或阈值水平);和(b)修饰植物(例如,增加植物的适应度)。
(a)编码肽的核酸
在一些情况下,PMP组合物包括编码多肽的异源核酸。编码多肽的核酸可以具有以下长度:从约10至约50,000个核苷酸(nts)、约25至约100nts、约50至约150nts、约100至约200nts、约150至约250nts、约200至约300nts、约250至约350nts、约300至约500nts、约10至约1000nts、约50至约1000nts、约100至约1000nts、约1000至约2000nts、约2000至约3000nts、约3000至约4000nts、约4000至约5000nts、约5000至约6000nts、约6000至约7000nts、约7000至约8000nts、约8000至约9000nts、约9000至约10,000nts、约10,000至约15,000nts、约10,000至约20,000nts、约10,000至约25,000nts、约10,000至约30,000nts、约10,000至约40,000nts、约10,000至约45,000nts、约10,000至约50,000nts、或介于其间的任何范围。
PMP组合物还可以包含感兴趣的核酸序列的功能活性变体。在一些情况下,核酸的变体与感兴趣的核酸的序列,例如在指定区域上或在整个序列上,具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性。在一些情况下,本发明包括由如本文描述的核酸变体编码的功能活性多肽。在一些情况下,由核酸变体编码的功能活性多肽与感兴趣的多肽的序列或天然来源的多肽序列,例如在指定区域上或在整个氨基酸序列上,具有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性。
某些用于表达编码蛋白的核酸的方法可以涉及在适当的启动子控制下,在细胞中表达,这些细胞包括昆虫、酵母细胞、植物细胞、细菌细胞、或其他细胞。表达载体可以包括非转录元件,诸如复制起点、合适的启动子和增强子、以及其他5'或3’侧翼非转录序列;以及5'或3'非翻译序列,诸如必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点;以及终止序列。源自SV40病毒基因组的DNA序列,例如SV40起点、早期启动子、增强子、剪接和聚腺苷酸化位点可以用于提供异源DNA序列表达所需的其他遗传元件。在以下文献中描述了用于与细菌、真菌、酵母、和哺乳动物细胞宿主一起使用的适当的克隆和表达载体:Green等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆-实验室手册],第四版,Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],2012。
使用重组方法的遗传修饰通常是本领域已知的。可以使用本领域已知的重组方法获得编码希望的基因的核酸序列,例如像使用标准技术,通过从表达该基因的细胞中筛选文库、通过从已知包括该基因的载体获得该基因、或通过从包含该基因的细胞和组织直接分离。可替代地,感兴趣的基因可以是以合成方式产生的,而不是克隆的。
天然的或合成的核酸的表达典型地通过以下实现:将编码感兴趣的基因的核酸可操作地连接至启动子,并且将构建体并入表达载体。表达载体可以适用于在细菌中复制和表达。表达载体还可以适用于在真核生物中复制和整合。典型的克隆载体含有转录和翻译终止子、起始序列、和启动子,可用于希望的核酸序列的表达。
另外的启动子元件,例如,增强子,调节转录起始的频率。典型地,这些元件位于起始位点上游30-110个碱基对(bp)的区域中,尽管最近已经显示许多启动子也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔通常是灵活的,使得当反转元件或使元件相对彼此移动时能够保留启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中,在活性开始下降之前,启动子元件之间的间隔可以增加至50bp。取决于启动子,似乎单个元件可以共同地或独立地发挥功能,以激活转录。
合适的启动子的一个实例是即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。这一启动子序列是能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个实例是延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而,还可以使用其他组成型启动子序列,包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、艾普斯登-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)即时早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、连同人类基因启动子(诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子、以及肌酸激酶启动子)。
可替代地,启动子可以是诱导型启动子。诱导型启动子的使用提供了分子开关,当希望这种表达时,该分子开关能够开启与该启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达,或当不希望表达时,则能够关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子、和四环素启动子。
待引入的表达载体还可以含有选择性标记基因或报告基因或二者,从而便于从寻求通过病毒载体转染或感染的细胞的群体中,鉴定和选择表达性细胞。在其他方面,选择性标记物可以在一段单独的DNA上进行,并且用于共转染程序。选择性标记物和报告基因二者侧翼可以是适当的调节序列,以使得能够在宿主细胞中表达。有用的选择性标记物包括例如抗生素抗性基因,诸如neo等。
报告基因可以用于鉴定潜在转化的细胞并且用于评估调节序列的功能性。通常,报告基因是不存在于受体来源或不由受者来源表达,并且编码其表达由一些易于检测特性(例如酶活性)所证明的多肽的基因。在将DNA引入受体细胞后,在适当的时间测定报告基因的表达。合适的报告基因可以包括编码萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因,或绿色荧光蛋白基因(例如,Ui-Tei等人,FEBS Letters[欧洲生化学会联合会快报]479:79-82,2000)。合适的表达系统是熟知的,可以使用已知技术制备或商业获得。通常,具有显示报告基因最高表达水平的最小5'侧翼区的构建体被鉴定为启动子。此类启动子区可以连接至报告基因,并且用于评估药剂调节启动子驱动的转录的能力。
在一些情况下,生物体可以被遗传修饰从而改变一种或多种蛋白的表达。一种或多种蛋白的表达可以被修饰用于具体时间,例如生物体的发育或分化状态。在一种情况下,本发明包括用来改变一种或多种蛋白(例如影响活性、结构、或功能的蛋白)的表达的组合物。一种或多种蛋白的表达可以限制在一个或多个具体位置,或遍布整个生物体中。
(b)合成mRNA
PMP组合物可以包含合成mRNA分子,例如编码多肽的合成mRNA分子。合成mRNA分子可以被修饰,例如被化学修饰。mRNA分子可以是化学合成的,或在体外转录。mRNA分子可以设置在质粒上,例如,病毒载体、细菌载体、或真核表达载体。在一些实例中,可以通过转染、电穿孔、或转导(例如,腺病毒或慢病毒转导),将mRNA分子递送至细胞。
在一些情况下,本文描述的修饰的感兴趣的RNA药剂具有修饰的核苷或核苷酸。此类修饰是已知的,并且描述于以下文献中:例如WO 2012/019168。在以下文献中描述了另外的修饰:例如WO 2015/038892;WO 2015/038892;WO 2015/089511;WO 2015/196130;WO2015/196118和WO 2015/196128 A2。
在一些情况下,编码感兴趣的多肽的修饰的RNA具有一个或多个末端修饰,例如5'帽结构和/或多聚A尾(例如,长度在100-200个核苷酸之间)。5'帽结构可以选自由以下组成的组:CapO、Capl、ARCA、肌苷、Nl-甲基-鸟苷、2'氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷、和2-叠氮-鸟苷。在一些情况下,修饰的RNA还含有5’UTR(其包括至少一个Kozak序列)和3'UTR。此类修饰是已知的,并且描述于以下文献中:例如,WO 2012/135805和WO 2013/052523。以下文献中描述了另外的末端修饰,例如,WO 2014/164253和WO 2016/011306、WO 2012/045075、以及WO 2014/093924。用于合成加帽RNA分子(例如,修饰的mRNA)(其可以包括至少一个化学修饰)的嵌合酶描述于WO 2014/028429中。
在一些情况下,修饰的mRNA可以环化或串联,从而产生具有翻译能力的分子,进而辅助多聚A结合蛋白和5’-端结合蛋白之间的相互作用。可以通过至少3种不同途径发生环化或串联机制:1)化学途径,2)酶途径,以及3)核酶催化途径。新形成的5'-/3'-键可以是分子内或分子间的。描述了此类修饰,例如在WO 2013/151736中。
制造和纯化修饰的RNA的方法是本领域已知的,并且已在本领域披露。例如,仅使用体外转录(IVT)酶合成制造修饰的RNA。制造IVT多核苷酸的方法是本领域已知的,并且描述于以下文献中:WO 2013/151666、WO 2013/151668、WO 2013/151663、WO 2013/151669、WO2013/151670、WO 2013/151664、WO 2013/151665、WO 2013/151671、WO 2013/151672、WO2013/151667和WO 2013/151736。纯化方法包括通过以下纯化RNA转录物(包括多聚A尾):在使得RNA转录物结合至与多个胸苷或其衍生物和/或多个尿嘧啶或其衍生物(多聚T/U)连接的表面的条件下使样品与该表面接触,并且从该表面洗脱纯化的RNA转录物(WO 2014/152031);经由可扩展的方法,使用允许长度高达10,000个核苷酸的较长RNA分离的离子(例如阴离子)交换色谱法(WO 2014/144767);并且使修饰的mRNA样品经受DNA酶处理(WO2014/152030)。
修饰的RNA的配制品是已知的并且描述于例如,WO 2013/090648中。例如,配制品可以是但不限于纳米颗粒、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)微球、类脂质、脂复合物、脂质体、聚合物、碳水化合物(包括简单糖)、阳离子脂质、纤维蛋白凝胶、纤维蛋白水凝胶、纤维蛋白胶、纤维蛋白封闭剂、纤维蛋白原、凝血酶、快速消除的脂质纳米颗粒(reLNP)及其组合。
在人类疾病、抗体、病毒和多种体内环境的领域中,编码多肽的修饰的RNA是已知的,并且披露于例如国际公开号WO 2013/151666、WO 2013/151668、WO 2013/151663、WO2013/151669、WO 2013/151670、WO 2013/151664、WO 2013/151665、WO 2013/151736的表6中;国际公开号WO 2013/151672的表6和表7中;国际公开号WO 2013/151671的表6、表178和表179中;国际公开号WO 2013/151667的表6、185和186中。可以将以上项中的任一种合成为IVT多核苷酸、嵌合多核苷酸或环状多核苷酸,并且各自可以包括一种或多种修饰的核苷酸或末端修饰。
(c)抑制性RNA
在一些情况下,PMP组合物包含抑制性RNA分子,例如,抑制性RNA分子经由RNA干扰(RNAi)途径发挥作用。在一些情况下,抑制性RNA分子降低植物中的基因表达水平和/或降低植物中的蛋白质水平。在一些情况下,抑制性RNA分子抑制植物基因的表达。例如,抑制性RNA分子可以包括短干扰RNA、短发夹RNA、和/或微小RNA,其靶向植物中的基因。某些RNA分子可以通过RNA干扰(RNAi)的生物过程抑制基因表达。RNAi分子包括RNA或RNA样结构,这些结构典型地含有15-50个碱基对(如约18-25个碱基对),并且具有与细胞内的表达的靶基因中的编码序列同一的(互补的)或接近同一的(基本上互补的)核碱基序列。RNAi分子包括但不限于:短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、短发夹RNA(shRNA)、部分双链体(meroduplex)、dicer酶底物、和多价RNA干扰(美国专利号8,084,599、8,349,809、8,513,207和9,200,276)。shRNA是包含经由RNAi降低靶基因表达的发夹弯(发夹弯)的RNA分子。可以按质粒的形式,例如,病毒或细菌载体,例如通过转染、电穿孔、或转导,将shRNA递送至细胞。微小RNA是典型地具有约22个核苷酸的长度的非编码RNA分子。MiRNA结合mRNA分子上的靶位点,并且使该mRNA沉默,例如,通过引起该mRNA的切割,使该mRNA去稳定,或抑制该mRNA的翻译。在一些情况下,抑制性RNA分子降低负功能调节因子的水平和/或活性。在其他情况下,抑制性RNA分子降低正功能调节因子的抑制剂的水平和/或活性。抑制性RNA分子可以是化学合成的或在体外转录。
在一些情况下,核酸是DNA、RNA、或PNA。在一些情况下,RNA是抑制性RNA。在一些情况下,抑制性RNA抑制植物中的基因表达。在一些情况下,核酸是mRNA、修饰的mRNA、或DNA分子,其增加植物中以下的表达:酶(例如,代谢重组酶、解旋酶、整合酶、RNA酶、DNA酶、或泛素化蛋白)、成孔蛋白、信号传导配体、细胞渗透肽、转录因子、受体、抗体、纳米抗体、基因编辑蛋白(例如,CRISPR-Cas系统、TALEN、或锌指)、核糖蛋白、蛋白适配体、或伴侣蛋白。在一些情况下,核酸是mRNA、修饰的mRNA、或DNA分子,其增加以下的表达:酶(例如,代谢酶、重组酶、解旋酶、整合酶、RNA酶、DNA酶、或泛素化蛋白)、成孔蛋白、信号传导配体、细胞渗透肽、转录因子、受体、抗体、纳米抗体、基因编辑蛋白(例如,CRISPR-Cas系统、TALEN、或锌指)、核糖蛋白、蛋白适配体、或伴侣蛋白。在一些情况下,植物中表达的增加是相对于参考水平(例如,未处理的植物中的表达)约5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、或大于100%的表达增加。在一些情况下,植物中表达的增加是相对于参考水平(例如,未处理的植物中的表达)约2x倍、约4x倍、约5x倍、约10x倍、约20x倍、约25x倍、约50x倍、约75x倍、或约100x倍或更大的表达增加。
在一些情况下,核酸是反义RNA、siRNA、shRNA、miRNA、aiRNA、PNA、吗啉代、LNA、piRNA、核糖酶、DNAzyme、适体(DNA、RNA)、circRNA、gRNA、或DNA分子(例如,反义多核苷酸),其减少植物中以下的表达:例如酶(代谢酶、重组酶、解旋酶、整合酶、RNA酶、DNA酶、聚合酶、泛素化蛋白、超氧化物管理酶、或能量生产酶)、转录因子、分泌蛋白、结构因子(肌动蛋白、驱动蛋白、或微管蛋白)、核糖蛋白、蛋白适配体、伴侣蛋白、受体、信号传导配体、或转运蛋白。在一些情况下,植物中表达的降低是相对于参考水平(例如,未处理的植物中的表达)约5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、或大于100%的表达降低。在一些情况下,植物中表达的降低是相对于参考水平(例如,未处理的植物中的表达)约2x倍、约4x倍、约5x倍、约10x倍、约20x倍、约25x倍、约50x倍、约75x倍、或约100x倍或更大的表达降低。
RNAi分子包括与靶基因的全部或片段基本上互补、或完全互补的序列。RNAi分子可以与内含子和外显子之间的边界处的序列互补,从而防止特异性基因的新产生的核RNA转录物成熟为用于转录的mRNA。与特异性基因互补的RNAi分子可以与靶基因的mRNA杂交,并且防止其翻译。反义分子可以是DNA、RNA、或其衍生物或杂交体。此类衍生物分子的实例包括但不限于,肽核酸(PNA)和硫代磷酸酯基分子,诸如脱氧核糖核酸胍(DNG)或核糖核酸胍(RNG)。
RNAi分子可以作为体外合成的“即用型”RNA提供,或作为转染到细胞中的反义基因提供,当转录时,这些细胞将产生RNAi分子。与mRNA杂交导致杂交的分子被RNA酶H降解,和/或翻译复合物的形成的抑制。二者都导致不能产生原始基因的产物。
与感兴趣的转录物杂交的RNAi分子的长度可以是约10个核苷酸,约15或30个核苷酸之间,或约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个核苷酸。反义序列与靶向的转录物的同一性程度可以是至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、或至少95%。
RNAi分子还可以包括突出端,即典型地不成对的、悬突核苷酸,其不直接参与正常情况下由本文限定的正义链和反义链对的核心序列形成的双螺旋结构。RNAi分子可以含有独立地位于每条正义链和反义链上的约1-5个碱基的3'和/或5'突出端。在一些情况下,正义链和反义链二者都含有3'和5'突出端。在一些情况下,一条链的一个或多个3'突出端核苷酸与另一条链的一个或多个5'突出端核苷酸碱基配对。在其他情况下,一条链的一个或多个3'突出端核苷酸不与另一条链的一个或多个5'突出端核苷酸碱基配对。RNAi分子的正义和反义链可以含有或可以不含有相同数量的核苷酸碱基。反义和正义链可以形成双链体,其中仅5'端具有钝端,仅3’端具有钝端,5'和3'端都是钝端,或5'端和3’端都不是钝端。在另一个情况下,突出端中的一个或多个核苷酸含有硫代磷酸、硫代磷酸酯、反转的脱氧核苷酸(3'至3’连接的)核苷酸,或是修饰的核糖核苷酸或脱氧核苷酸。
小干扰RNA(siRNA)分子包括与靶mRNA的约15至约25个连续核苷酸同一的核苷酸序列。在一些情况下,siRNA序列以二核苷酸AA开始,包括含量为30%-70%(约30%-60%、约40%-60%、或约45%-55%)的GC,并且与除了待引入其中的基因组中的靶标之外的任何核苷酸序列不具有高同一性百分比,例如,如通过标准BLAST检索确定的。
siRNA和shRNA类似于内源性微小RNA(miRNA)基因的加工途径中的中间体(Bartel,Cell[细胞]116:281-297,2004)。在一些情况下,siRNA可以用作miRNA,反之亦然(Zeng等人,Mol.Cell[分子细胞学]9:1327-1333,2002;Doench等人,Genes Dev.[基因与发育]17:438-442,2003)。外源性siRNA下调与siRNA具有种子互补性的mRNA(Birmingham等人,Nat.Methods[自然方法]3:199-204,2006)。3'UTR内的多个靶位点给出了更强的下调(Doench等人,Genes Dev.[基因和发育]17:438-442,2003)。
已知的有效的siRNA序列和同源结合位点也很好地呈现在相关文献中。通过本领域已知的技术,RNAi分子易于设计和生产的。此外,存在增加发现有效且特异性的序列基序的机会的计算工具(Pei等人,Nat.Methods[自然方法]3(9):670-676,2006;Reynolds等人,Nat.Biotechnol.[自然生物技术]22(3):326-330,2004;Khvorova等人,Nat.Struct.Biol.[自然结构生物学]10(9):708-712,2003;Schwarz等人,Cell[细胞]115(2):199-208,2003;Ui-Tei等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究]32(3):936-948,2004;Heale等人,NucleicAcids Res.[核酸研究]33(3):e30,2005;Chalk等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.[生化及生物物理研究通讯]319(1):264-274,2004;以及Amarzguioui等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.[生化及生物物理研究通讯]316(4):1050-1058,2004)。
RNAi分子调节由基因编码的RNA的表达。因为多个基因可能彼此共享一定程度的序列同源性,所以在一些情况下,可以设计RNAi分子以靶向具有充分序列同源性的一类基因。在一些情况下,RNAi分子可以含有与在不同基因靶标中共享的序列或对于特异性基因靶标而言是独特的序列具有互补性的序列。在一些情况下,可以设计RNAi分子以靶向在若干基因之间具有同源性的RNA序列的保守区,由此靶向一个基因家族中的若干基因(例如,不同基因同种型、剪接变体、突变基因等)。在一些情况下,可以设计RNAi分子以靶向对于单个基因的特异性RNA序列而言是独特的序列。
抑制性RNA分子可以被修饰,例如,从而含有修饰的核苷酸,例如,2’-氟、2’-邻甲基、2’-脱氧、解锁核酸、2’-羟基、硫代磷酸酯、2’-硫尿核苷、4’-硫尿核苷、2’-脱氧尿苷。不希望受理论约束,据信此类修饰可以增加核酸酶抗性和/或血清稳定性,或降低免疫原性。
在一些情况下,经由生理上不稳定的键或接头将RNAi分子连接至递送聚合物。选择生理上不稳定的接头,使得存在于某些生理条件下时,经历化学转化(例如,切割)(例如,在细胞质的还原性环境下,经二硫键切割)。通过切割生理上不稳定的连接,从聚合物释放分子,促进了分子与对于活性而言适当的细胞组分的相互作用。
可以通过将分子与聚合物共价连接,形成RNAi分子-聚合物缀合物。聚合物是聚合的或修饰的,使得它含有反应性基团A。RNAi分子也是聚合的或修饰的,使得它含有反应性基团B。选择反应性基团A和B,使得可以使用本领域已知的方法,经由可逆的共价键,连接它们。
在过量的聚合物存在下,可以进行RNAi分子与聚合物的缀合。因为在缀合期间,RNAi分子和聚合物可以具有相反的电荷,所以过量聚合物的存在可以减少或消除缀合物的聚集。可替代地,可以使用过量的载体聚合物,诸如聚阳离子。可以在施用缀合物之前,从缀合的聚合物去除过量聚合物。可替代地,可以与缀合物一起共施用过量聚合物。
基于非编码RNA,诸如核酶、RNA酶P、siRNA、和miRNA的抑制剂的制备和使用也是本领域已知的,例如,如在以下文献中描述的:Sioud,RNA Therapeutics:Function,Design,and Delivery[RNA治疗剂:功能、涉及、和递送](Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]).Humana Press[胡玛纳出版社](2010)。
(d)基因编辑
本文描述的PMP组合物可以包含基因编辑系统的组分。例如,药剂可以在植物中的基因中引入改变(例如,插入、缺失(例如,敲除)、易位、倒位、单点突变或其他突变)。示例性基因编辑系统包括锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活因子效应因子基核酸酶(TALEN)、和规律成簇间隔短回文重复(CRISPR)系统。以下文献中描述了基于ZFN、TALEN、和CRISPR的方法:例如Gaj等人,Trends Biotechnol.[生物技术趋势]31(7):397-405,2013。
在典型的CRISPR/Cas系统中,通过靶向单链或双链DNA序列的序列特异性的、非编码“指导RNA”,将内切核酸酶导向靶核苷酸序列(例如,待进行序列编辑的基因组中的位点)。已经鉴定了三类(I-III)CRISPR系统。II类CRISPR系统使用单个Cas内切核酸酶(而不是多个Cas蛋白)。一种II类CRISPR系统包括II类Cas内切核酸酶,诸如Cas9、CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)。crRNA含有指导RNA,即典型地,对应于靶DNA序列的一个约20个核苷酸的RNA序列。crRNA还包含与tracrRNA结合的区域,以形成被RNA酶III切割的部分双链结构,产生crRNA/tracrRNA杂交体。RNA作为指导物以指导Cas蛋白使特异性DNA/RNA序列沉默,这取决于间隔子序列。参见例如,Horvath等人,Science[科学]327:167-170,2010;Makarova等人,Biology Direct[生物学指导]1:7,2006;Pennisi,Science[科学]341:833-836,2013。靶DNA序列必须总体上邻近针对给定Cas内切核酸酶来说是特异性的原间隔子邻近基序(PAM);然而,PAM序列似乎遍布整个给定基因组。从不同原核物种鉴定的CRISPR内切核酸酶具有独特的PAM序列要求;PAM序列的实例包括5’-NGG(酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes))、5’-NNAGAA(嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)CRISPR1)、5’-NGGNG(嗜热链球菌CRISPR3)、和5’-NNNGATT(奈瑟氏脑膜炎双球菌(Neisseria meningiditis))。一些内切核酸酶,例如,Cas9内切核酸酶,与富含G的PAM位点(例如,5’-NGG)相关,并且在距离PAM位点上游(距离PAM位点的5’)3个核苷酸的位置处,进行靶DNA的钝端切割。另一个II类CRISPR系统包括小于Cas9的V型内切核酸酶Cpf1;实例包括AsCpf1(来自氨基酸球菌属物种(Acidaminococcus sp.))和LbCpf1(来自毛螺旋菌属物种(Lachnospiraceae sp.))。Cpf1相关CRISPR阵列被加工成成熟crRNA,而不需要tracrRNA;换言之,Cpf1系统仅需要Cpf1核酸酶和crRNA来切割靶DNA序列。Cpf1内切核酸酶与富含T的PAM位点,例如,5’-TTN相关。Cpf1也可以识别5'-CTA PAM基序。Cpf1通过引入具有4或5个核苷酸的5'突出端的错位或交错的双链断裂来切割靶DNA,例如切割如下靶DNA,该靶DNA中的5个核苷酸的错位或交错的切割位于距离编码链上的PAM位点下游(3’)18个核苷酸的位置处和距离互补链上的PAM位点下游23个核苷酸的位置处;由这种错位切割产生的5个核苷酸突出端使得通过同源重组的DNA插入比在平末端切割的DNA的插入更精确地进行基因组编辑。参见例如,Zetsche等人,Cell[细胞]163:759-771,2015。
出于基因编辑的目的,可以设计CRISPR阵列以含有对应于希望的靶DNA序列的一个或多个指导RNA序列;参加例如,Cong等人,Science[科学]339:819-823,2013;Ran等人,Nature Protocols[自然实验手册]8:2281-2308,2013。用于进行DNA切割,Cas9需要gRNA序列的至少约16或17个核苷酸;对于Cpf1,需要gRNA序列的至少约16个核苷酸,从而实现可检测的DNA切割。在实践中,指导RNA序列通常被设计为具有17-24个核苷酸之间(例如,19、20、或21个核苷酸)的长度,并且与靶向的基因或核酸序列互补性。定制的gRNA生成器和算法可从商业上获得,用于设计有效的指导RNA。还使用嵌合的单指导RNA(sgRNA),一种模拟天然存在的crRNA-tracrRNA复合物并包含tracrRNA(用于结合核酸酶)和至少一个crRNA(以将核酸酶指导至编辑目标序列)的工程化(合成)单RNA分子,实现了基因编辑。也已经证明,在基因组编辑中,化学修饰的sgRNA是有效的;参见例如,Hendel等人,Nature Biotechnol.[自然生物技术]985-991,2015。
而在由gRNA靶向的特异性DNA序列上,野生型Cas9产生双链断裂(DSB),具有修饰的功能性的许多CRISPR内切核酸酶是可得的,例如:Cas9的切口酶形式仅产生单链断裂;无催化活性的Cas9(dCas9)不切割靶DNA,但是通过位阻干扰转录。dCas9可以进一步与效应因子融合,从而阻遏(CRISPRi)或激活(CRISPRa)靶基因的表达。例如,Cas9可以与转录阻遏因子(例如,KRAB结构域)或转录激活因子融合(例如,dCas9-VP64融合物)。融合至FokI核酸酶(dCas9-FokI)的无催化活性的Cas9(dCas9)可以用于在与两个gRNA同源的靶序列上产生DSB。参见例如,许多CRISPR/Cas9质粒披露于并且可公开获得自阿德基因质粒库(Addgenerepository)(阿德基因公司(Addgene),西德尼大街75号(Sidney St.),550A单元,剑桥郡,马萨诸塞州02139;addgene.org/crispr/)。引入两个单独的双链断裂(各自由单独的指导RNA指导)的双切口酶Cas9被以下文献描述为实现了更精确的基因组编辑:Ran等人,Cell[细胞]154:1380-1389,2013。
用于编辑真核生物的基因的CRISPR技术披露于以下文献中:美国专利申请公开US2016/0138008A1和US2015/0344912A1,以及美国专利8,697,359、8,771,945、8,945,839、8,999,641、8,993,233、8,895,308、8,865,406、8,889,418、8,871,445、8,889,356、8,932,814、8,795,965、和8,906,616。Cpf1内切核酸酶和相应的指导RNA和PAM位点在美国专利申请公开2016/0208243A1中披露。
在一些情况下,希望的基因组修饰涉及同源重组,其中由RNA指导的核酸酶和一种或多种指导RNA产生靶核苷酸序列中的一个或多个双链DNA断裂,随后使用同源重组机制(同源定向修复),修复该一个或多个断裂。在这样的情况下,将编码待在双链断裂处插入或敲入的希望的核苷酸序列的供体模板提供至细胞或受试者;合适的模板的实例包括单链DNA模板和双链DNA模板(例如,与本文描述的多肽连接)。通常,以单链DNA的形式,提供编码小于约50个核苷酸的区域内的核苷酸变化的供体模板;更大的供体模板(例如,多于100个核苷酸)通常作为双链DNA质粒提供。在一些情况下,以足以实现希望的同源定向修复,但是在给定时间段后(例如在一个或多个细胞分裂周期后)不存留于细胞或受试者中的量,将供体模板提供至细胞或受试者。在一些情况下,供体模板具有与靶核苷酸序列(例如同源内源基因组区)相差至少1、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、或更多个核苷酸的核心核苷酸序列。此核心序列侧翼是同源性臂或与靶向的核苷酸序列具有高度序列同一性的区域;在一些情况下,具有高度同一性的区域包括在核心序列的每一侧上的至少10、至少50、至少100、至少150、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少750、或至少1000个核苷酸。在一些情况下,其中供体模板处于单链DNA的形式,核心序列侧翼是同源性臂,该同源性臂包括在核心序列的每一侧上的至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、或至少100个核苷酸。在多种情况下,其中供体模板处于双链DNA的形式,核心序列侧翼是同源性臂,该同源性臂包括在核心序列的每一侧上的至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、或至少1000个核苷酸。在一种情况下,用双切口酶Cas9,将两个单独的双链断裂引入细胞或受试者的靶核苷酸序列(参见Ran等人,Cell[细胞]154:1380-1389,2013),随后是供体模板的递送。
在一些情况下,组合物包括gRNA和靶向的核酸酶,例如,Cas9,例如,野生型Cas9、切口酶Cas9(例如,Cas9 D10A)、失活Cas9(dCas9)、eSpCas9、Cpf1、C2C1、或C2C3,或编码这样的核酸酶的核酸。通过靶向的突变是否是核苷酸的缺失、取代、或添加,例如靶向的序列的核苷酸缺失、取代、或添加,确定核酸酶和一种或多种gRNA的选择。无催化活性的内切核酸酶,例如,失活Cas9(dCas9,例如,D10A、H840A)与(一个或多个)效应因子结构域的全部或一部分(例如生物活性部分)链连的融合物产生可以与多肽连接的嵌合蛋白,从而通过一个或多个RNA序列(sgRNA)指导该组合物至特定的DNA位点,进而调节一个或多个靶核酸序列的活性和/或表达。
在多种情况下,药剂包括指导RNA(gRNA),用于进行基因编辑的CRISPR系统。在一些情况下,药剂包括锌指核酸酶(ZFN)或编码ZFN的mRNA,其靶向(例如,切割)植物中基因的核酸序列(例如,DNA序列)。在一些情况下,药剂包括TALEN或编码TALEN的mRNA,其靶向(例如,切割)植物的基因的核酸序列(例如,DNA序列)。
例如,gRNA可以用于CRISPR系统以工程化植物中的基因的改变。在其他实例中,ZFN和/或TALEN可以用于工程化植物中的基因的改变。示例性改变包括插入、缺失(例如,敲除)、易位、反转、单点突变、或其他突变。可以将改变引入细胞中的基因中,例如体外、离体、或体内进行。在一些实例中,改变增加植物中的基因的水平和/或活性。在其他实例中,改变降低植物中的基因的水平和/或活性(例如,敲低或敲除)。在又另一个实例中,改变纠正植物中的基因中的缺陷(例如,引起缺陷的突变)。
在一些情况下,CRISPR系统用于编辑(例如,添加或缺失碱基对)植物中的靶基因。在其他情况下,将CRISPR系统用于引入提前终止密码子,例如由此降低靶基因的表达。仍在其他情况下,将CRISPR系统用于以可逆的方式,例如类似于RNA干扰,关闭靶基因。在一些情况下,将CRISPR系统用于将Cas指导至基因的启动子,由此以位阻方式阻断RNA聚合酶。
在一些情况下,可以生成CRISPR系统以使用以下中描述的技术编辑植物中的基因:例如美国公开号20140068797,Cong,Science[科学]339:819-823,2013;Tsai,NatureBiotechnol.[自然生物技术]32:6 569-576,2014;美国专利号:8,871,445;8,865,406;8,795,965;8,771,945;和8,697,359。
在一些情况下,CRISPR干扰(CRISPRi)技术可以用于转录阻遏植物中的特定基因。在CRISPRi中,工程化的Cas9蛋白(例如,无核酸酶的dCas9、或dCas9融合蛋白,例如,dCas9-KRAB或dCas9-SID4X融合物)可以与序列特异性指导RNA(sgRNA)配对。Cas9-gRNA复合物可以阻断RNA聚合酶,由此干扰转录延伸。复合物还可以通过干扰转录因子结合,阻断转录起始。CRISPRi方法是特异性的,具有最小的脱靶效应并且是可多路共用的,例如可以同时阻遏多于一个基因(例如,使用多个gRNAs)。而且,CRISPRi方法允许可逆的基因抑制。
在一些情况下,CRISPR介导的基因激活(CRISPRa)可以用于植物中的基因的转录激活。在CRISPRa技术中,dCas9融合蛋白募集了转录激活因子。例如,dCas9可以与多肽(例如,激活结构域)(诸如VP64或p65激活结构域(p65D))融合,并且与sgRNA(例如,单个sgRNA或多个sgRNA)一起使用,以激活植物中的一个或多个基因。可以使用多种sgRNA募集多种激活剂-这可以增加激活功效。可以使用多种激活结构域和单个或多个激活结构域。除了将dCas9工程化来募集激活剂,还可以将sgRNA工程化来募集激活剂。例如,可以将RNA适配体并入sgRNA来募集蛋白(例如,激活结构域),诸如VP64。在一些实例中,协同激活介导因(SAM)系统可以用于转录激活。在SAM中,将MS2适配体添加至sgRNA。MS2募集融合至p65AD和热休克因子1(HSF1)的MS2包被蛋白(MCP)。
以下文献更详细地描述了CRISPRi和CRISPRa技术,例如,Dominguez等人,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.[自然综述分子细胞生物学]17:5-15,2016,将其通过引用并入本文。另外,dCas9介导的表观遗传修饰以及使用CRISPR系统的同时激活和阻遏(如Dominguez等人所描述)可以用于调节植物中的基因。
B.异源治疗剂
本文制造的PMP可包括异源治疗剂(例如,影响动物(例如,人)、动物病原体、或其病原体媒介,并且可负载到PMP中的药剂),如病原体防治剂(例如,抗真菌剂、抗细菌剂、杀病毒剂、抗病毒剂、杀昆虫剂、杀线虫剂、抗寄生生物剂、或昆虫驱避剂)。负载此类药剂的PMP可与药学上可接受的载体一起配制,以递送至动物、动物病原体或其病原体媒介中。
i.抗细菌剂
本文描述的PMP组合物可以进一步包含抗细菌剂。例如,可以将包含如本文描述的抗生素的PMP组合物以一定量和一定时间施用于动物,该量和时间足以:达到动物内或上抗生素浓度的目标水平(例如,预定或阈值水平);和/或处理或预防动物的细菌感染。本文描述的抗细菌剂可以配制在用于本文描述的任何方法的PMP组合物中,并且在某些情况下,可以与其PMP缔合。在一些情况下,PMP组合物包含两种或更多种(例如,2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10种)不同的抗细菌剂。
如本文所用,术语“抗细菌剂”是指杀死或抑制细菌(诸如植物病原体细菌)的生长、增殖、分裂、繁殖或扩散的材料,并且包括杀细菌剂(例如,消毒化合物、抗菌化合物、或抗生素)或抑细菌剂(例如,化合物或抗生素)。杀细菌抗生素杀死细菌,而抑细菌抗生素仅减缓其生长或繁殖。
杀细菌剂可以包括消毒剂、抗菌剂、或抗生素。最多使用的消毒剂可以包括:活性氯(即,次氯酸盐(例如,次氯酸钠)、氯胺、二氯异氰脲酸酯和三氯异氰脲酸酯、湿氯、二氧化氯等);活性氧(过氧化物,诸如乙酸、过硫酸钾、过硼酸钠、过碳酸钠和尿素过水合物);碘(碘聚维酮(聚维酮-碘、必妥碘(Betadine));鲁哥氏溶液(Lugol’s solution)、碘酊、碘化非离子型表面活性剂);浓缩醇(主要是乙醇、1-丙醇(也称为正丙醇)和2-丙醇(称为异丙醇)及其混合物;此外,使用2-苯氧基乙醇以及1-和2-苯氧基丙醇);酚类物质(诸如苯酚(也称为石炭酸),甲酚(与液体钾皂组合称为Lysole),卤化(氯化、溴化)苯酚,诸如六氯酚、三氯生、三氯苯酚、三溴苯酚、五氯苯酚、Dibromol及其盐);阳离子表面活性剂,诸如一些季铵阳离子(诸如氯化苯甲烃铵、十六烷基三甲基溴化铵或十六烷基三甲基氯化铵、二癸基二甲基氯化铵、十六烷基吡啶鎓氯化物、苯乙铵氯化物)以及其他;非季铵盐化合物,诸如双氯苯双胍己烷(chlorhexidine)、glucoprotamine、奥替尼啶二盐酸盐等);强氧化剂,诸如臭氧和高锰酸盐溶液;重金属及其盐,诸如胶质银、硝酸银、氯化汞、苯基汞盐、硫酸铜、氧化-氯化铜、氢氧化铜、辛酸铜、硫酸氯氧化铜、硫酸铜、五水硫酸铜等。重金属及其盐是最大毒性的且对环境有害的杀细菌剂,并且因此,其使用被强烈压制或取消;此外,还有适当浓缩的强酸(磷酸、硝酸、硫酸、氨基磺酸、甲苯磺酸)和碱(氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙)。
作为抗菌剂(即,可以在人体或动物体、皮肤、粘膜、伤口等上使用的杀菌剂),可以在适当的条件(主要是浓度、pH、温度和对人/动物的毒性)下使用上述几种消毒剂。其中重要的是:适当稀释的氯制剂(即,达康氏溶液(Daquin’s solution)、0.5%次氯酸钠或次氯酸钾溶液(pH调节至pH 7-8)、或0.5%-1%苯磺酰氯胺钠盐溶液(氯胺B));一些碘制剂,诸如呈各种盖仑制剂(软膏、溶液、伤口膏药)的碘聚维酮、在过去还有鲁哥氏溶液;作为尿素过水合物溶液和pH缓冲的0.1%-0.25%过乙酸溶液的过氧化物;主要用于皮肤抗菌的具有或不具有抗菌添加剂的醇;弱有机酸,诸如山梨酸、苯甲酸、乳酸和水杨酸;一些酚类化合物,诸如六氯酚、三氯生和Dibromol;以及阳离子活性化合物,诸如0.05%-0.5%苯甲烃铵、0.5%-4%双氯苯双胍己烷、0.1%-2%奥替尼啶溶液。
本文描述的PMP组合物可以包含抗生素。可以使用本领域已知的任何抗生素。抗生素通常根据其作用机制、化学结构或活性谱进行分类。
本文描述的抗生素可以靶向任何细菌的功能或生长过程,并且可以是抑细菌的(例如,减缓或阻止细菌生长)或杀细菌的(例如,杀死细菌)。在一些情况下,抗生素是杀细菌抗生素。在一些情况下,杀细菌抗生素是靶向细菌细胞壁的杀细菌抗生素(例如,青霉素和头孢菌素);靶向细胞膜的杀细菌抗生素(例如,多粘菌素);或者抑制必需细菌酶的杀细菌抗生素(例如,利福霉素、闰年霉素(lipiarmycins)、喹诺酮类和磺胺类)。在一些情况下,杀细菌抗生素是氨基糖苷类(例如,春雷霉素)。在一些情况下,抗生素是抑细菌抗生素。在一些情况下,抑细菌抗生素靶向蛋白质合成(例如,大环内酯类、林可胺类和四环素类)。本文可以使用的另外类的抗生素包括环脂肽(诸如达托霉素)、甘氨酰环素(如替加环素)、噁唑烷酮类(如利奈唑胺)、或闰年霉素(lipiarmycins)(如非达霉素)。抗生素的实例包括利福平、环丙沙星、强力霉素、氨比西林、和多粘菌素B。本文描述的抗生素可以具有任何水平的靶特异性(例如,窄谱或广谱)。在一些情况下,抗生素是窄谱抗生素,并且因此靶向特异性类型的细菌,诸如革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌。可替代地,抗生素可以是靶向宽范围的细菌的广谱抗生素。
适用于处理动物的抗细菌剂的实例包括青霉素(阿莫西林、氨比西林、巴氨西林、羧苄西林、邻氯青霉素、双氯西林、氟氯西林、美洛西林、萘夫西林、苯唑西林、青霉素G、普鲁卡因青霉素300A.S.、青霉素G钾制剂(Pentids)、Permapen、Pfizerpen、Pfizerpen-AS、威西林(Wycillin)、青霉素V、哌拉西林、匹氨西林、匹美西林、替卡西林)、头孢菌素(头孢乙腈(Cefacetrile)(头孢乙腈(cephacetrile)))、头孢羟氨苄(Cefadroxil)(头孢羟氨苄(cefadroxyl))、头孢氨苄(Cefalexin)(头孢氨苄(cephalexin))、头孢来星(Cefaloglycin)(头孢来星(cephaloglycin))、头孢洛宁(Cefalonium)(头孢洛宁(cephalonium))、头孢噻啶(Cefaloridine)(头孢噻啶(cephaloradine))、头孢噻吩(Cefalotin)(头孢噻吩(cephalothin))、头孢匹林(Cefapirin)(头孢匹林(cephapirin))、头孢曲嗪、头孢氮氟、头孢西酮、头孢唑啉(Cefazolin)(头孢唑啉(cephazolin))、头孢拉定(Cefradine)(头孢拉定(cephradine))、头孢沙定、头孢替唑、头孢克洛、头孢羟唑、头孢美唑、头孢尼西、头孢替坦、头孢西丁、头孢罗齐(Cefprozil)(头孢罗齐(cefproxil))、头孢呋辛、头孢唑南、头孢卡品、头孢达肟、头孢地尼、头孢托仑、头孢他美、头孢克肟、头孢甲肟、头孢地嗪、头孢噻肟、头孢咪唑、头孢泊肟、头孢特仑、头孢布坦、头孢噻呋、头孢噻林、头孢唑肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、头孢克定、头孢吡肟、头孢瑞南、头孢噻利、头孢唑兰、头孢匹罗、头孢喹肟、头孢吡普、头孢洛林、头孢氯嗪、头孢罗兰、头孢帕罗、头孢卡奈、头孢屈洛、头孢吡酮、头孢三唑、头孢维曲、头孢马替林(Cefmatilen)、Cefmepidium、头孢维星、头孢噁唑、头孢罗替、头孢舒米、头孢呋汀、头孢噻氧、组合(头孢他啶/阿维巴坦、Ceftolozane/他唑巴坦))、单菌霉素(氨曲南)、碳青霉烯(亚胺培南、亚胺培南/西司他丁、多利培南、厄他培南、美洛培南、美洛培南/法硼巴坦)、大环内酯(阿奇霉素、红霉素、克拉霉素、地红霉素、罗红霉素、泰利霉素)、林可酰胺(克林霉素、林可霉素)、链阳菌素(原始霉素、奎奴普丁/达福普丁)、氨基糖苷(阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、巴龙霉素、链霉素、妥布霉素)、喹诺酮(氟甲喹、萘啶酸、噁喹酸、吡咯米酸、吡哌酸、罗索沙星(第二代)、环丙沙星、依诺沙星、洛美沙星、那氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、芦氟沙星、巴洛沙星、加替沙星、格雷沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、帕珠沙星、司帕沙星、替马沙星、妥舒沙星、贝西沙星、德拉沙星、克林沙星、吉米沙星、普卢利沙星、西他沙星、曲伐沙星)、磺酰胺(磺胺甲二唑、磺胺甲噁唑、磺胺异噁唑、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑)、四环素(地美环素、强力霉素、米诺环素、氧四环素、四环素、替加环素)、其他(脂肽、氟喹诺酮、脂糖肽、头孢菌素、大环物、氯霉素、甲硝唑、磺甲硝咪唑、呋喃妥因、糖肽、万古霉素、替考拉宁、脂糖肽、替拉万星、噁唑烷酮、利奈唑胺、环丝氨酸2、利福霉素、利福平、利福布丁、利福喷丁、利福拉齐、多肽、杆菌肽、多粘菌素B、结核放线菌素、紫霉素、卷曲霉素)。
本领域技术人员应当认识到,组合物中每种抗生素的合适的浓度取决于诸如功效、抗生素的稳定性、不同抗生素的数量、配制品、和组合物的应用方法的因素。
ii.抗真菌剂
本文描述的PMP组合物可以进一步包含抗真菌剂。例如,包含如本文描述的抗真菌剂的PMP组合物可以以一定量和一定时间施用于动物,该量和时间足以在动物内或上达到抗真菌剂浓度的目标水平(例如,预定或阈值水平);和/或处理或预防动物的真菌感染。本文描述的抗真菌剂可以配制在用于本文描述的任何方法的PMP组合物中,并且在某些情况下,可以与其PMP缔合。在一些情况下,PMP组合物包含两种或更多种(例如,2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10种)不同的抗真菌剂。
如本文所用,术语“杀真菌剂”或“抗真菌剂”是指杀死或抑制真菌(诸如作为针对动物的病原体的真菌)的生长、增殖、分裂、繁殖或扩散的物质。商业上已生产了许多不同类型的抗真菌剂。抗真菌剂的非限制性实例包括:烯丙胺(阿莫罗芬(Amorolfin)、布替萘芬、萘替芳、特比萘芬)、咪唑((联苯苄唑、布康唑、克霉唑、益康唑、芬替康唑、酮康唑、异康唑、卢立康唑、咪康唑、奥莫康唑、奥昔康唑、舍他康唑、硫益康唑、噻康唑、特康唑);三唑(阿巴康唑、艾氟康唑、氟康唑、艾沙康唑、依曲康唑、泊沙康唑、雷夫康唑(Ravuconazole)、特康唑、伏立康唑)、噻唑(阿巴芬净)、多烯(两性霉素B、制霉菌素、纳他霉素、曲古霉素)、棘白菌素(阿尼芬净、卡泊芬净、米卡芬净)、其他(托萘酯、氟胞嘧啶、布替萘芬、灰黄霉素、环匹罗司、硫化硒、他伐硼罗(Tavaborole))。本领域技术人员应当认识到,组合物中每种抗真菌剂的合适的浓度取决于诸如功效、抗真菌剂的稳定性、不同抗真菌剂的数量、配制品、和组合物的应用方法的因素。
iii.杀昆虫剂
本文描述的PMP组合物可以进一步包含杀昆虫剂。例如,杀昆虫剂可以降低(例如,降低生长或杀死)动物病原体的昆虫媒介的适应度。可以使包含如本文描述的杀昆虫剂的PMP组合物以一定量和一定时间与昆虫接触,该量和时间足以:(a)达到昆虫内或上杀昆虫剂浓度的目标水平(例如,预定或阈值水平);和(b)降低昆虫的适应度。在一些情况下,杀昆虫剂可以降低(例如,降低生长或杀死)寄生昆虫的适应度。可以使包含如本文描述的杀昆虫剂的PMP组合物以一定量和一定时间与寄生昆虫或被其感染的动物接触,该量和时间足以:(a)达到寄生昆虫内或上杀昆虫剂浓度的目标水平(例如,预定或阈值水平);和(b)降低寄生昆虫的适应度。本文描述的杀昆虫剂可以配制在用于本文描述的任何方法的PMP组合物中,并且在某些情况下,可以与其PMP缔合。在一些情况下,PMP组合物包含两种或更多种(例如,2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10种)不同的杀昆虫剂。
如本文所用,术语“杀昆虫剂(insecticide或insecticidal agent)”是指杀死或抑制昆虫(诸如动物病原体或寄生昆虫的昆虫媒介)的生长、增殖、繁殖、或扩散的物质。杀昆虫剂的非限制性实例在表4中示出。合适的杀昆虫剂的另外的非限制性实例包括生物制剂、激素或信息素(诸如印楝素)、芽孢杆菌属(Bacillus)物种、白僵菌属(Beauveria)物种、可得蒙(codlemone)、绿僵菌属(Metarrhizium)物种、拟青霉属(Paecilomyces)物种、thuringiensis、和轮枝孢属(Verticillium)物种;以及具有未知或非特定的作用机理的活性化合物,诸如熏剂(诸如磷化铝、甲基溴和硫酰氟),和选择性进食抑制剂(诸如冰晶石、氟啶虫酰胺和吡蚜酮)。本领域技术人员应当认识到,组合物中每种杀昆虫剂的合适的浓度取决于诸如功效、杀昆虫剂的稳定性、不同杀昆虫剂的数量、配制品、和组合物的应用方法的因素。
表4.杀昆虫剂的实例
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iv.杀线虫剂
本文描述的PMP组合物可以进一步包含杀线虫剂。在一些情况下,PMP组合物包含两种或更多种(例如,2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10种)不同的杀线虫剂。例如,杀线虫剂可以降低(例如,降低生长或杀死)寄生线虫的适应度。可以使包含如本文描述的杀线虫剂的PMP组合物以一定量和一定时间与寄生线虫或被其感染的动物接触,该量和时间足以:(a)达到靶线虫内或上杀线虫剂浓度的目标水平(例如,预定或阈值水平);和(b)降低寄生线虫的适应度。本文描述的杀线虫剂可以配制在用于本文描述的任何方法的PMP组合物中,并且在某些情况下,可以与其PMP缔合。
如本文所用,术语“杀线虫剂(nematicide或nematicidal agent)”是指杀死或抑制线虫(诸如寄生线虫)的生长、增殖、繁殖、或扩散的物质。杀线虫剂的非限制性实例在表5中示出。本领域技术人员应当认识到,组合物中每种杀线虫剂的合适的浓度取决于诸如功效、杀线虫剂的稳定性、不同杀线虫剂的数量、配制品、和组合物的应用方法的因素。
表5.杀线虫剂的实例
v.抗寄生生物剂
本文描述的PMP组合物可以进一步包含抗寄生生物剂。例如,抗寄生生物剂可以降低(例如,降低生长或杀死)寄生原生动物的适应度。可以使包含如本文描述的抗寄生生物剂的PMP组合物以一定量和一定时间与原生动物接触,该量和时间足以:(a)达到原生动物或被其感染的动物内或上抗寄生生物剂浓度的目标水平(例如,预定或阈值水平);和(b)降低原生动物的适应度。这可以用于处理或预防动物的寄生生物。例如,可以将包含如本文描述的抗寄生生物剂的PMP组合物以一定量和一定时间施用于动物,该量和时间足以:达到动物内或上抗寄生生物剂浓度的目标水平(例如,预定或阈值水平);和/或处理或预防动物的寄生生物(例如,寄生线虫、寄生昆虫、或原生动物)感染。本文描述的抗寄生生物剂可以配制在用于本文描述的任何方法的PMP组合物中,并且在某些情况下,可以与其PMP缔合。在一些情况下,PMP组合物包含两种或更多种(例如,2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10种)不同的抗寄生生物剂。
如本文所用,术语“抗寄生生物剂(antiparasitic或antiparasitic agent)”是指杀死或抑制寄生生物(诸如寄生原生动物、寄生线虫、或寄生昆虫)的生长、增殖、繁殖、或扩散的物质。抗寄生生物剂的实例包括抗蠕虫剂(苄酚宁、乙胺嗪、伊维菌素、氯硝柳胺、哌嗪、吡喹酮、噻嘧啶、扑蛲灵(Pyrvinium)、苯并咪唑、阿苯达唑、氟苯达唑、甲苯咪唑、噻苯咪唑、左旋咪唑、硝唑尼特、蒙内庞特(Monopantel)、艾莫德斯(Emodepside)、螺吲哚(Spiroindole))、杀疥螨剂(苯甲酸苄酯、苯甲酸苄酯/双硫仑、林丹、马拉松、扑灭司林)、杀虱剂(胡椒基丁醚/除虫菊精、多杀菌素、莫昔克丁)、杀疥螨剂(克罗米通)、抗绦虫剂(氯硝柳胺、Pranziquantel、阿苯达唑)、抗阿米巴剂(利福平、两性霉素B);或抗原生动物剂(美拉胂醇、依洛尼塞、甲硝唑、磺甲硝咪唑、米替福新、青蒿素)。在某些情况下,抗寄生生物剂可以用于处理或预防牲畜动物的感染,例如左旋咪唑、芬苯达唑、奥芬达唑、阿苯达唑、莫昔克丁、依立诺克丁、多拉菌素、依维菌素、或氯舒隆。本领域技术人员应当认识到,组合物中每种抗寄生生物剂的合适的浓度取决于诸如功效、抗寄生生物剂的稳定性、不同抗寄生生物剂的数量、配制品、和组合物的应用方法的因素。
vi.抗病毒剂
本文描述的PMP组合物可以进一步包含抗病毒剂。包含如本文描述的抗病毒剂的PMP组合物可以以一定量和一定时间施用于动物,该量和时间足以达到动物内或上抗病毒浓度的目标水平(例如,预定或阈值水平);和/或处理或预防动物的病毒感染。本文描述的抗病毒剂可以配制在用于本文描述的任何方法的PMP组合物中,并且在某些情况下,可以与其PMP缔合。在一些情况下,PMP组合物包含两种或更多种(例如,2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10种)不同的抗病毒剂。
如本文所用,术语“抗病毒剂”或“杀病毒剂”是指杀死或抑制病毒(诸如感染动物的病毒病原体)的生长、增殖、繁殖、发育、或扩散的物质。许多药剂可以用作抗病毒剂,包括化学物或生物药剂(例如核酸,例如dsRNA)。可用于本文的抗病毒剂的实例包括阿巴卡韦、阿昔洛韦(Acyclovir)(阿昔洛韦(Aciclovir))、阿德福韦、金刚烷胺、安普那韦(Amprenavir)(安普那韦(Agenerase))、安普利近、阿比多尔、阿扎那韦、立普妥、巴拉维尔(Balavir)、西多福韦、可比韦、度鲁特韦、地瑞那韦、地拉夫定、地达诺新、二十二醇、依度尿苷、依法韦仑、恩曲他滨、恩夫韦地、恩替卡韦、艾柯立韦(Ecoliever)、泛昔洛韦、福米韦生、膦沙那韦、膦甲酸、膦乙醇(Fosfonet)、融合抑制剂、更昔洛韦、伊巴他滨、Imunovir、疱疹净、咪喹莫特、茚地那韦、肌苷、整合酶抑制剂、III型干扰素、II型干扰素、I型干扰素、干扰素、拉米夫定、洛匹那韦、洛韦胺、马拉韦罗(Maraviroc)、吗啉胍、甲吲噻腙、奈非那韦、奈韦拉平、索拉非尼(Nexavir)、硝唑尼特、核苷类似物、诺韦、奥司他韦(特敏福)、聚乙二醇化干扰素α-2a、喷昔洛韦、帕拉米韦、普可那利、足叶草毒素、雷特格韦、利巴韦林、金刚烷乙胺、利托那韦、Pyramidine、沙奎那韦、索非布韦、司他夫定、协同增强剂(抗逆转录病毒剂)、特拉匹韦、替诺福韦、替诺福韦酯(Tenofovir disoproxil)、替拉那韦、三氟尿苷、三协维(Trizivir)、曲金刚胺、特鲁瓦达、伐昔洛韦(维德思(Valtrex))、缬更昔洛韦、维克韦罗(Vicriviroc)、阿糖腺苷、Viramidine、扎西他滨、扎那米韦(瑞乐沙(Relenza))、或齐多夫定。本领域技术人员应当认识到,组合物中每种抗病毒剂的合适的浓度取决于诸如功效、抗病毒剂的稳定性、不同抗病毒剂的数量、配制品、和组合物的应用方法的因素。
vii.驱避剂
本文描述的PMP组合物可以进一步包含驱避剂。例如,驱避剂可以驱避动物病原体的媒介,诸如昆虫。本文描述的驱避剂可以配制在用于本文描述的任何方法的PMP组合物中,并且在某些情况下,可以与其PMP缔合。在一些情况下,PMP组合物包含两种或更多种(例如,2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多于10种)不同的驱避剂。
例如,可以使包含如本文描述的驱避剂的PMP组合物以一定量和一定时间与昆虫媒介或媒介的生境接触,该量和时间足以:(a)达到驱避剂浓度的目标水平(例如,预定或阈值水平);和/或(b)相对于对照,降低动物附近或近旁的昆虫的水平。可替代地,可以使包含如本文描述的驱避剂的PMP组合物以一定量和一定时间与动物接触,该量和时间足以:(a)达到驱避剂浓度的目标水平(例如,预定或阈值水平);和/或(b)相对于未处理的动物,降低动物附近或上的昆虫的水平。
熟知的昆虫驱避剂的一些实例包括:苯偶酰;苯甲酸苄酯;2,3,4,5-双(丁-2-烯)四氢糠醛(MGK驱避剂11);丁氧基聚丙二醇;N-丁基乙酰苯胺;正丁基-6,6-二甲基-5,6-二氢-1,4-吡喃酮-2-甲酸酯(避虫酮);己二酸二丁酯;邻苯二甲酸二丁酯;琥珀酸二正丁酯(驱虫特);N,N-二乙基-间甲苯酰胺(DEET);驱蚊灵(内型,内型)-二甲基二环[2.2.1]庚-5-烯-2,3-二甲酸酯);邻苯二甲酸二甲酯;2-乙基-2-丁基-1,3-丙二醇;2-乙基-1,3-己二醇(Rutgers 612);异辛可部酸二正丙酯(MGK驱避剂326);2-苯基环己醇;对甲烷-3,8-二醇,和N,N-二乙基琥珀酰胺酸正丙酯。其他驱避剂包括香茅油、邻苯二甲酸二甲酯、正丁基均三甲苯基氧化物草酸酯和2-乙基己二醇-1,3(参见Kirk-Othmer Encyclopedia of ChemicalTechnology[柯克-奥瑟默化学技术百科全书],第2版,第11卷:724-728;和The CondensedChemical Dictionary[简明化学词典],第8版,第756页)。
在一些情况下,驱避剂是昆虫驱避剂,包括合成或非合成昆虫驱避剂。合成昆虫驱避剂的实例包括邻氨基苯甲酸甲酯以及其他基于邻氨基苯甲酸酯的昆虫驱避剂、苯甲醛、DEET(N,N-二乙基-间甲苯酰胺)、驱蚊灵、邻苯二甲酸二甲酯、埃卡瑞丁(icaridin)(即,派卡瑞丁(picaridin)、羟哌酯(Bayrepel)、和KBR 3023)、避虫酮(例如,如用于“6-2-2”混合物(60%邻苯二甲酸二甲酯、20%避虫酮、20%乙基己二醇)、IR3535(3-[N-丁基-N-乙酰基]-氨基丙酸,乙酯)、甲氧苄氟菊酯、扑灭司林、SS220、或三环癸烯基烯丙基醚。天然昆虫驱避剂的实例包括紫珠(紫珠属(Callicarpa))叶、桦树树皮、香杨梅(bog myrtle)(MyricaGale)、猫薄荷油(例如,荆芥内酯)、香茅油、柠檬桉(Corymbia citriodora;例如p-薄荷烷-3,8-二醇(PMD))的精油、苦楝油、柠檬草、来自互生叶白千层(Melaleuca alternifolia)叶的茶树油、烟草、或其提取物。
IV.使用方法
本文产生的PMP在多种农业或治疗方法中是有用的。下面进一步描述使用PMP的方法的实例。
A.向植物的递送
本文提供了将PMP组合物(例如,根据本文的方法或生物反应器制造的)递送到植物的方法,例如,通过使植物或其部分与PMP组合物接触。在一些情况下,可以用未负载的PMP处理植物。在其他情况下,PMP包括异源功能剂(例如杀有害生物剂(例如,抗细菌剂、抗真菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂、杀病毒剂、除草剂))、有害生物防治剂(例如,驱避剂)、肥料剂或植物修饰剂。
在一个方面,本文提供了一种增加植物的适应度的方法,该方法包括向该植物递送本文描述的PMP组合物(例如,以有效的量和持续时间)以相对于未处理的植物(例如,未递送该PMP组合物的植物)增加该植物的适应度。
由于递送PMP组合物而导致的植物适应度的增加可以以许多种方式表现,例如从而导致植物的生产更好,例如产率提高、植物活力改善、或从植物收获的产品的品质改善。改善的植物产率涉及相对于在相同条件下但不应用本发明组合物而生产的植物的相同产品的产率或与应用常规农业药剂相比,按可测量量计植物的产品的产率的增加(例如,如通过植物生物质、谷粒、种子或果实产率、蛋白质含量、碳水化合物或油含量或叶面积测量的)。例如,产率可以增加至少约0.5%、约1%、约2%、约3%、约4%、约5%、约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约100%、或大于100%。产率可以以在某种基础上植物或植物的产品的按重量或体积计量来表示。基础可以以时间、生长面积、生产的植物的重量、或所用原料的量来表示。例如,此类方法可以增加植物组织的产率,这些植物组织包括但不限于:种子、果实、仁、圆荚、块茎、根和叶。
由于递送PMP组合物而导致的植物适应度的增加也可以通过其他方法来测量,诸如相对于在相同条件下但不施用本发明组合物或施用常规农业药剂而生产的植物的相同因素,以活力等级的增加或改善、植株密度(stand)(植物数量/单位面积)、植物高度、秆围、秆长、叶数量、叶尺寸、植物冠层、视觉外观(诸如更绿的叶颜色)、根等级、出苗、蛋白质含量、分蘖的增加、更大的叶、更多的叶、更少的死的基生叶、分蘖更强、所需肥料更少、所需种子更少、分蘖更多产、开花更早、提早的谷粒或种子成熟度、更少的植物节(verse)(倒伏)、芽生长的增加、更早萌发、或这些因素的任何组合,按可测量或可察觉的量来测量。
本文提供了修饰或增加植物的适应度的方法,该方法包括向植物递送有效量的本文提供的PMP组合物,其中该方法修饰该植物并由此相对于未处理的植物引入或增加该植物中的有益性状(例如,增加约1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%,70%、80%、90%、100%或大于100%)。特别地,相对于未处理的植物,该方法可增加植物的适应度(例如,增加约1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或大于100%)。
在一些情况下,植物适应度的增加是抗病性、耐旱性、耐热性、耐冷性、耐盐性、金属耐性、除草剂耐性、化学耐性、水分利用效率,氮利用、氮胁迫抗性、固氮作用、有害生物抗性、食草动物抗性、病原抗性、产率、限水条件下产率、活力、生长、光合能力、营养、蛋白质含量、碳水化合物含量、含油量、生物质、芽长度、根长度、根构型、种子重量,或可收获产品的量的增加(例如,增加约1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或大于100%)。
在一些情况下,适应度的增加是发育、生长、产率、对非生物胁迫原的抗性或对生物胁迫原的抗性的增加(例如,增加约1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或大于100%)。非生物胁迫是指植物或植物部分遭受的如下环境胁迫条件,包括例如干旱胁迫、盐胁迫、热胁迫、冷胁迫和低养分胁迫。生物胁迫是指植物或植物部分遭受的如下环境胁迫条件,包括例如线虫胁迫、昆虫取食胁迫、真菌病原体胁迫、细菌病原体胁迫或病毒病原体胁迫。胁迫可能是暂时的,例如几个小时、几天、几个月,或是永久的,例如持续植物的生命。
在一些情况下,植物适应度的增加是从植物收获的产品质量的增加(例如,增加约1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或大于100%)。例如,植物适应度的增加可以是从植物收获的产品的商业上有利的特征(例如,味道或外观)的改善。在其他情况下,植物适应度的增加是从植物收获的产品的保质期的增加(例如,增加约1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或大于100%)。
可替代地,适应度的增加可能是对人或动物健康有益的性状的改变,例如过敏原产生的减少。例如,适应度的增加可能是刺激动物(例如,人)免疫应答的过敏原(例如,花粉)的产生降低(例如,降低约1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或大于100%)。
植物的修饰(例如,适应度的增加)可能产生自一个或多个植物部分的修饰。例如,可以通过接触植物的叶、种子、花粉、根、果实、芽、花、细胞、原生质体或组织(例如,分生组织)来修饰植物。因此,在另一个方面,本文提供了一种增加植物的适应度的方法,该方法包括使植物的花粉与有效量的本文的PMP组合物接触,其中相对于未处理的植物,该方法增加植物的适应度(例如,增加约1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或大于100%)。
在又另一个方面,本文提供了一种增加植物的适应度的方法,该方法包括使植物的种子与有效量的本文披露的PMP组合物接触,其中相对于未处理的植物,该方法增加植物的适应度(例如,增加约1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或大于100%)。
在另一个方面,本文提供了一种包括使植物的原生质体与有效量的本文的PMP组合物接触的方法,其中相对于未处理的植物,该方法增加植物的适应度(例如,增加约1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%,或大于100%)。
在另外的方面,本文提供了一种增加植物的适应度的方法,该方法包括使植物的植物细胞与有效量的本文的PMP组合物接触,其中相对于未处理的植物,该方法增加植物的适应度(例如,增加约1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%,或大于100%)。
在另一个方面,本文提供了一种增加植物的适应度的方法,该方法包括使植物的分生组织与有效量的本文的PMP组合物接触,其中相对于未处理的植物,该方法增加植物的适应度(例如,增加约1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%,或大于100%)。
在另一个方面,本文提供了一种增加植物的适应度的方法,该方法包括使植物的胚胎与有效量的本文的PMP组合物接触,其中相对于未处理的植物,该方法增加植物的适应度(例如,增加约1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%,或大于100%)。
在PMP或其组合物中包含除草剂的情况下,方法可以进一步用于降低杂草的适应度或杀死杂草。在此类情况下,与未处理的杂草(例如,未施用PMP组合物的杂草)相比,该方法可以有效地将杂草的适应度降低约2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、或更大。例如,方法可以有效地杀死杂草,从而与未处理的植物相比,将杂草群体降低约2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、或更大。在一些情况下,方法显著消除杂草。本文进一步描述了可以根据本发明的方法处理的杂草的实例。
i.植物
可以将多种植物递送至本文描述的PMP组合物或用其处理。可以根据本发明方法递送PMP组合物的(即,“处理的”)植物包括整株植物及其部分,包括但不限于芽营养器官/结构(例如,叶、茎和块茎)、根、花和花器官/结构(例如,苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(包括胚、胚乳、子叶、和胚胎)和果实(成熟的子房)、植物组织(例如,维管组织、基本组织等)和细胞(例如,保卫细胞、卵细胞等)及其子代。植物部分可以进一步指诸如以下的植物部分:芽、根、茎、种子、托叶、叶、花瓣、花、胚珠、苞片、枝、叶柄、节间、树皮、短柔毛、分蘖、根茎、叶状体(frond)、叶片、花粉、雄蕊等。
可以在本文披露的方法中处理的植物的类别包括高等植物和低等植物类别,包括被子植物(单子叶植物和双子叶植物)、裸子植物、蕨类、木贼类植物、裸蕨植物、石松类植物、苔藓植物、和藻类(例如,多细胞藻类或单细胞藻类)。可以根据本发明方法处理的植物进一步包括任何维管植物,例如单子叶或双子叶植物或裸子植物,包括但不限于苜蓿、苹果、拟南芥属物种、香蕉、大麦、卡诺拉油菜、蓖麻籽、菊花、十字花科植物、三叶草、可可、咖啡、棉花、棉籽、玉米、海甘蓝、蔓越莓、黄瓜、石斛兰、薯蓣、桉树、羊茅草、亚麻、唐菖蒲、百合科、亚麻籽、粟、甜瓜、芥菜、燕麦、油棕、油菜、番木瓜、花生、菠萝、观赏植物、菜豆、马铃薯、油菜籽、水稻、黑麦、黑麦草、红花、芝麻、高粱、大豆、甜菜、甘蔗、向日葵、草莓、烟草、番茄、草皮草、小麦和蔬菜作物(诸如莴苣、芹菜、西兰花、花椰菜、葫芦);水果树和坚果树,诸如苹果、梨、桃、橙子、葡萄柚、柠檬、酸橙、扁桃、山核桃、胡桃、榛子;藤本植物,诸如葡萄(例如,葡萄园)、猕猴桃、蛇麻子(hop);水果灌木和悬钩子,诸如覆盆子、黑莓、醋栗;林木,诸如水曲柳、松树、冷杉、枫树、橡树、栗树、杨树(popular);与苜蓿、卡诺拉油菜、蓖麻籽、玉米、棉花、海甘蓝、亚麻、亚麻籽、芥菜、油棕、油菜、花生、马铃薯、水稻、红花、芝麻、大豆、甜菜、向日葵、烟草、番茄、和小麦。可以根据本发明的方法处理的植物包括任何作物植物,例如,草料作物、油籽作物、谷物作物、水果作物、蔬菜作物、纤维作物、香料作物、香料作物、草皮作物、糖作物、饮料作物、和森林作物。在某些情况下,在该方法中处理的作物植物是大豆植物。在其他某些情况下,作物植物是小麦。在某些情况下,作物植物是玉米。在某些情况下,作物植物是棉花。在某些情况下,作物植物是苜蓿。在某些情况下,作物植物是甜菜。在某些情况下,作物植物是水稻。在某些情况下,作物植物是马铃薯。在某些情况下,作物植物是番茄。
在某些情况下,植物是作物。此类作物植物的实例包括但不限于单子叶植物和双子叶植物,包括但不限于饲养料或草料豆类、观赏植物、食物作物、树木、或灌木,选自枫属物种(Acer spp)、葱属物种(Allium spp.)、苋属物种(Amaranthus spp.)、凤梨(Ananascomosus)、旱芹(Apium graveolens)、花生属物种(Arachis spp)、石刁柏(Asparagusofficinalis)、甜菜(Beta vulgaris)、芸苔属物种(Brassica spp.)(例如,欧洲油菜(Brassica napus)、芜菁(Brassica rapa ssp.)(卡诺拉油菜、油菜、白菜型油菜(turniprape))、野茶树(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、大麻(Cannabis sativa)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、栗属物种(Castanea spp.)、栽培菊苣(Cichoriumendivia)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑橘属物种(Citrus spp.)、椰子属物种(Cocosspp.)、咖啡属物种(Coffea spp.)、芫荽(Coriandrum sativum)、榛属物种(Corylusspp.)、山楂属物种(Crataegus spp.)、南瓜属物种(Cucurbita spp.)、黄瓜属物种(Cucumis spp.)、胡萝卜(Daucus carota)、水青冈属物种(Fagus spp.)、无花果(Ficuscarica)、草莓属物种(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆属违章(Glycinespp.)(例如,大豆(Glycine max)、黄豆(Soja hispida)或大豆(Soja max))、陆地棉(Gossypium hirsutum)、向日葵属物种(Helianthus spp.)(例如,向日葵)、木槿属物种(Hibiscus spp.)、大麦属物种(Hordeum spp.)(例如,大麦(Hordeum vulgare))、甘薯(Ipomoea batatas)、胡桃属物种(Juglans spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、亚麻(Linumusitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、莲属物种(Lotus spp.)、棱角丝瓜(Luffaacutangula)、羽扇豆属物种(Lupinus spp.)、蕃茄属物种(Lycopersicon spp.)(例如,番茄(Lycopersicon esculenturn))、圣女果(Lycopersicon lycopersicum)、梨形番茄(Lycopersicon pyriforme)、苹果属物种(Malus spp.)、紫花苜蓿(Medicago sativa)、薄荷属物种(Mentha spp.)、芒(Miscanthus sinensis)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉属物种(Musa spp.)、烟草属物种(Nicotiana spp.)、木犀榄属物种(Olea spp.)、稻属物种(Oryzaspp.)(例如,稻(Oryza sativa))、宽叶野生稻(Oryza latifolia)、黍稷(Panicummiliaceum)、柳枝稷(Panicum virgatum)、西番莲(Passiflora edulis)、欧芹(Petroselinum crispum)、菜豆属物种(Phaseolus spp.)、松属物种(Pinus spp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆属物种(Pisum spp.)、早熟禾属物种(Poa spp.)、杨属物种(Populus spp.)、李属物种(Prunus spp.)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属物种(Quercusspp.)、萝卜(Raphanus sativus)、波叶大黄(Rheum rhabarbarum)、茶藨子属物种(Ribesspp.)、蓖麻(Ricinus communis)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、甘蔗属物种(Saccharumspp.)、柳属物种(Salix sp.)、接骨木属物种(Sambucus spp.)、黑麦(Secale cereale)、胡麻属物种(Sesamum spp.)、白芥属物种(Sinapis spp.)、茄属物种(Solanum spp.)(例如,马铃薯(Solanum tuberosum)、红茄(Solanumintegrifolium)或番茄(Solanumlycopersicum))、双色高粱(Sorghum bicolor)、石茅(Sorghum halepense)、菠菜属物种(Spinacia spp.)、罗晃子(Tamarindus indica)、可可树(Theobroma cacao)、三叶草属物种(Trifolium spp.)、小黑麦(Triticosecale rimpaui)、小麦属物种(Triticum spp.)(例如,普通小麦(Triticum aestivum))、硬粒小麦(Triticum durum)、圆锥小麦(Triticumturgidum)、Triticum hybernum、马卡小麦(Triticum macha)、Triticum sativum或Triticum vulgare)、越橘属物种(Vaccinium spp.)、蚕豆属物种(Vicia spp.)、豇豆属物种(Vigna spp.)、香堇菜(Viola odorata)、葡萄属物种(Vitis spp.)、和玉米(Zea mays)。在某些实施例中,作物植物是水稻、油菜、卡诺拉油菜、大豆、玉米(玉蜀黍(maize))、棉花、甘蔗、苜蓿、高粱、或小麦。
在某些情况下,组合物和方法可以用于处理收获后的植物或植物部分、食物或饲料产品。在一些情况下,食物或饲料产品是非植物性食物或饲料产品(例如,人、兽医动物、或牲畜可食用的产品(例如,蘑菇))。
用于本发明的植物或植物部分包括任何植物发育阶段的植物。在某些情况下,可以在萌发、幼苗生长、营养生长、和繁殖生长的阶段进行递送。在某些情况下,向植物的递送在营养生长和繁殖生长阶段期间进行。可替代地,可以进行向种子的递送。营养生长和繁殖生长阶段在本文中也称为“成株”或“成熟”植物。
ii.杂草
在PMP或其组合物中包含除草剂的情况下,方法可以进一步用于降低杂草的适应度或杀死杂草。在此类情况下,与未处理的杂草(例如,未施用PMP组合物的杂草)相比,该方法可以有效地将杂草的适应度降低约2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、或更大。例如,方法可以有效地杀死杂草,从而与未处理的植物相比,将杂草群体降低约2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、或更大。在一些情况下,方法显著消除杂草。本文进一步描述了可以根据本发明的方法处理的杂草的实例。
如本文所用,术语“杂草”是指在不希望其生长的地方生长的植物。此类植物典型地是侵入性的,并且有时是有害的或具有变得有害的风险。可以用本发明的PMP组合物处理杂草来减小或消除植物的存在、生存力、或繁殖。例如并且不限于此,这些方法可以用于靶向已知损害植物的杂草。例如并且不限于此,杂草可以是以下科的组的任何成员:禾本科(Gramineae)、伞形花科(Umbelliferae)、蝶形花科(Papilionaceae)、十宇花科(Cruciferae)、锦葵科(Malvaceae)、大戟科(Eufhorbiaceae)、菊科(Compositae)、藜科(Chenopodiaceae)、紫堇科(Fumariaceae)、Charyophyllaceae、报春花科(Primulaceae)、牻牛儿苗科(Geraniaceae)、蓼科(Polygonaceae)、灯芯草科(Juncaceae)、莎草科(Cyperaceae)、番杏科(Aizoaceae)、菊科(Asteraceae)、旋花科(Convolvulaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、蓼科(Polygonaceae)、马齿苋科(Portulaceae)、茄科(Solanaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、苦木科(Simaroubaceae)、木通科(Lardizabalaceae)、百合科(Liliaceae)、苋科(Amaranthaceae)、葡萄科(Vitaceae)、豆科(Fabaceae)、报春花科(Primulaceae)、夹竹桃科(Apocynaceae)、五加科(Araliaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、萝摩科(Asclepiadaceae)、卫矛科(Celastraceae)、罂粟科(Papaveraceae)、柳叶菜科(Onagraceae)、毛茛科(Ranunculaceae)、唇形科(Lamiaceae)、鸭跖草科(Commelinaceae)、玄参科(Scrophulariaceae)、川续断科(Dipsacaceae)、紫草科(Boraginaceae)、木賊科(Equisetaceae)、牛儿苗科(Geraniaceae)、茜草科(Rubiaceae)、大麻科(Cannabaceae)、金丝桃科(Hyperiacaceae)、凤仙花科(Balsaminaceae)、半边莲科(Lobeliaceae)、忍冬科(Caprifoliaceae)、紫茉莉科(Nyctaginaceae)、酢浆草料(Oxalidaceae)、葡萄科(Vitaceae)、荨麻科(Urticaceae)、水龙骨科(Polypodiaceae)、漆树科(Anacardiaceae)、菝葜科(Smilacaceae)、天南星科(Araceae)、桔梗科(Campanulaceae)、香蒲科(Typhaceae)、败酱科(Valerianaceae)、马鞭草科(Verbenaceae)、堇菜科(Violaceae)。例如并且不限于此,杂草可以是由以下组成的组的任何成员:硬直黑麦草(Lolium rigidum)、Amaramthus palmeri、苘麻(Abutilontheopratsi)、假高粱(Sorghum halepense)、加拿大蓬(Conyza canadensis)、倒刺狗尾草(Setaria verticillata)、荠(Capsella pastoris)、和Cyperus rotundas。另外的杂草包括例如刺轴含羞草(Mimosapigra)、槐叶苹属(salvinia)、香苦草属(hyptis)、决明属(senna)、noogoora、毛刺草(burr)、棉叶麻风树(Jatropha gossypifolia)、扁轴木(Parkinsonia aculeate)、香泽兰(Chromolaena odorata)、橡胶紫茉莉(Cryptoslegiagrandiflora)、或须芒草(Andropogon gayanus)。杂草可以包括单子叶植物(例如,剪股颖属(Agrostis)、看麦娘属(Alopecurus)、燕麦属(Avena)、雀麦属(Bromus)、莎草属(Cyperus)、马唐属(Digitaria)、稗属(Echinochloa)、黑麦草属(Lolium)、雨久花属(Monochoria)、筒轴茅属(Rottboellia)、慈姑属(Sagittaria)、藨草属(Scirpus)、狗尾草属(Setaria)、黄花稔属(Sida)或蜀黍(Sorghum))或双子叶植物(苘麻属(Abutilon))、苋属(Amaranthus)、藜属(Chenopodium)、菊属(Chrysanthemum)、假蓬属(Conyza)、猪殃殃属(Galium)、番薯属(Ipomoea)、旱金莲属(Nasturtium)、白芥属(Sinapis)、茄属(Solanum)、繁缕属(Stellaria)、婆婆纳属(Veronica)、堇菜属(Viola)或苍耳属(Xanthium))。
组合物和相关方法可以用于预防病原体或病原体媒介的侵染或减少病原体或病原体媒介在它们住居的任何生境中(例如,动物的外部,例如在植物、植物部分(例如,roots,fruits and seeds)上;在土壤、水中或上;或在另一种病原体或病原体媒介生境上的数量。因此,这些组合物和方法可以通过例如杀死、伤害或减慢媒介的活动来减少病原体媒介的损害作用,并且可以从而控制病原体向动物的扩散。本文披露的组合物可以用于防治、杀死、伤害、麻痹处于任何发育阶段(例如,它们的卵、若虫、龄虫、幼虫(larvae)、成虫、幼龄虫(juvenile)、或干燥形式)的任何病原体或病原体媒介中的任何一种或多种,或减少其活动。这些方法中的每一种的细节将在下面进一步描述。
B.向植物有害生物的递送
本文提供了将PMP组合物(例如,根据本文的方法或生物反应器制造的)递送到植物有害生物的方法,例如,通过使植物有害生物与PMP组合物接触。在一些情况下,可以用未负载的PMP处理植物有害生物。在其他情况下,PMP包括异源功能剂(例如杀有害生物剂(例如,抗细菌剂、抗真菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂、杀病毒剂、或除草剂))、有害生物防治剂(例如,驱避剂)。例如,方法可以用于降低有害生物的适应度,例如以作为递送PMP组合物的结果而预防或处理有害生物侵染。
在一个方面,本文提供了一种降低有害生物的适应度的方法,该方法包括向该有害生物递送本文描述的PMP组合物(例如,以有效量和有效持续时间)以相对于未处理的有害生物(例如,未递送该PMP组合物的有害生物)降低该有害生物的适应度。
在一个方面,本文提供了一种降低(例如,处理)具有真菌感染的植物中的真菌感染的方法,其中该方法包括向该植物有害生物递送包含多个PMP的PMP组合物(例如,本文描述的PMP组合物)。
在另一个方面,本文提供了一种降低(例如,处理)具有真菌感染的植物中的真菌感染的方法,其中该方法包括向该植物有害生物递送包含多个PMP的PMP组合物(例如,本文描述的PMP组合物),并且其中该多个PMP包含抗真菌剂。在一些情况下,抗真菌剂是核酸,该核酸抑制引起真菌感染的真菌中基因(例如,dcl1和dcl2(即,dcl1/2)的表达。在一些情况下,真菌感染是由真菌引起的,该真菌属于核盘霉属物种(Sclerotinia spp.)(例如,核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum))、葡萄孢属物种(Botrytis spp.)(例如,灰葡萄孢菌)、曲霉属物种(Aspergillus spp.)、镰孢属物种(Fusarium spp.)、或青霉属物种(Penicilliumspp.)。在一些情况下,组合物包含从拟南芥属质外体EV产生的PMP。在一些情况下,方法降低或显著消除真菌感染。
在另一个方面,本文提供了一种降低(例如,处理)具有细菌感染的植物中的细菌感染的方法,其中该方法包括向该植物有害生物递送包含多个PMP的PMP组合物(例如,本文描述的PMP组合物)。
在另一个方面,本文提供了一种降低(例如,处理)具有细菌感染的植物中的细菌感染的方法,其中该方法包括向该植物有害生物递送包含多个PMP的PMP组合物,并且其中该多个PMP包含抗细菌剂。在一些情况下,抗细菌剂是链霉素。在一些情况下,细菌感染是由细菌引起的,该细菌属于假单胞菌属物种(Pseudomonas spp)(例如,丁香假单胞菌或铜绿假单胞菌(Psuedomonas aeruginosa))。在一些情况下,组合物包含从拟南芥属质外体EV产生的PMP。在一些情况下,方法降低或显著消除细菌感染。
在另一个方面,本文提供了一种降低昆虫植物有害生物的适应度的方法,其中该方法包括向该昆虫植物有害生物递送包含多个PMP的PMP组合物(例如,本文描述的PMP组合物)。
在另一个方面,本文提供了一种降低昆虫植物有害生物的适应度的方法,其中该方法包括向该植物有害生物递送包含多个PMP的PMP组合物(例如,本文描述的PMP组合物),并且其中该多个PMP包含杀昆虫剂。在一些情况下,杀昆虫剂是肽核酸。在一些情况下,昆虫植物有害生物是蚜虫。在一些情况下,昆虫植物有害生物是鳞翅目昆虫(例如,草地贪夜蛾)。在一些情况下,相对于未处理的昆虫植物有害生物,该方法降低昆虫植物有害生物的适应度
在另一个方面,本文提供了一种降低线虫植物有害生物的适应度的方法,其中该方法包括向该线虫植物有害生物递送包含多个PMP的PMP组合物(例如,本文描述的PMP组合物)。
在另一个方面,本文提供了一种降低线虫植物有害生物的适应度的方法,其中该方法包括向该线虫植物有害生物递送包含多个PMP的PMP组合物(例如,本文描述的PMP组合物),并且其中该多个PMP包含杀线虫剂。在一些情况下,杀线虫剂是神经肽(例如,Mi-NLP-15b)。在一些情况下,线虫植物有害生物是玉米根结线虫。在一些情况下,相对于未处理的线虫植物有害生物,该方法降低该线虫植物有害生物的适应度。
在另一个方面,本文提供了一种降低杂草的适应度的方法,其中该方法包括向该杂草递送包含多个PMP的PMP组合物(例如,本文描述的PMP组合物)。
在另一个方面,本文提供了一种降低杂草的适应度的方法,其中该方法包括向该杂草递送包含多个PMP的PMP组合物(例如,本文描述的PMP组合物),并且其中该多个PMP包含除草剂(例如,草铵膦)。在一些情况下,杂草是印度牛筋草(Indian goosegrass)(蟋蟀草(Eleusine indica))。在一些情况下,相对于未处理的杂草,该方法降低杂草的适应度。
作为递送PMP组合物的结果的有害生物适应度的降低可以以许多种方式表现。在一些情况下,作为递送PMP组合物的结果,有害生物适应度的降低可表现为有害生物的生理学的劣化或下降(例如,健康或存活降低)。在一些情况下,与未施用PMP组合物的有害生物相比,生物体的适应度可以通过一种或多种参数来测量,该一种或多种参数包括但不限于繁殖速率、生育力、寿限、生存力、移动性、繁殖力、有害生物发育、体重、代谢速率或活动、或存活。例如,本文提供的方法或组合物可以有效地降低有害生物的总体健康或降低有害生物的总体存活。在一些情况下,相对于参考水平(例如,在未接受PMP组合物的有害生物中发现的水平),有害生物的存活降低大约2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、或大于100%。在一些情况下,与未施用PMP组合物的有害生物相比,这些方法和组合物有效降低有害生物繁殖(例如,繁殖速率、生育力)。在一些情况下,相对于参考水平(例如,在未接受PMP组合物的有害生物中发现的水平),这些方法和组合物有效地将其他生理参数(诸如移动性、体重、寿限、繁殖力、或代谢速率)降低约2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、或大于100%。
在一些情况下,与未施用PMP组合物的有害生物相比,有害生物适应度的降低可表现为有害生物中的一种或多种营养物(例如,维生素、碳水化合物、氨基酸、或多肽)的生产的降低。在一些情况下,相对于参考水平(例如,在未接受PMP组合物的有害生物中发现的水平),本文提供的方法或组合物可以有效地将有害生物中的营养物(例如,维生素、碳水化合物、氨基酸、或多肽)的生产降低约2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、或大于100%。
在一些情况下,与未施用PMP组合物的有害生物相比,有害生物适应度的降低可表现为有害生物对杀有害生物剂的敏感性的增加和/或有害生物对杀有害生物剂的抗性的降低。在一些情况下,相对于参考水平(例如,在未接受PMP组合物的有害生物中发现的水平),本文提供的方法或组合物可以有效地将有害生物对杀有害生物剂的敏感性增加约2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、或大于100%。杀有害生物剂可以是本领域已知的任何杀有害生物剂,包括杀昆虫剂。在一些情况下,与未施用PMP组合物的有害生物相比,本文提供的方法或组合物可以通过降低有害生物的将杀有害生物剂代谢或降解成可用底物的能力来增加有害生物对杀有害生物剂的敏感性。
在一些情况下,与未施用PMP组合物的有害生物相比,有害生物适应度的降低可表现为有害生物对化感剂的敏感性的增加和/或有害生物对化感剂的抗性的降低。在一些情况下,相对于参考水平(例如,在未接受PMP组合物的有害生物中发现的水平),本文提供的方法或组合物可以有效地将有害生物对化感剂的抗性降低约2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、或大于100%。在一些情况下,化感剂是咖啡因、大豆半胱氨酸蛋白酶抑制剂(soyacystatin)、杀螟松、单萜、二萜酸、或酚类化合物(例如,丹宁酸、类黄酮)。在一些情况下,与未施用PMP组合物的有害生物相比,本文提供的方法或组合物可以通过降低有害生物的将化感剂代谢或降解成可用底物的能力来增加有害生物对化感剂的敏感性。
在一些情况下,与未施用PMP组合物的有害生物相比,本文提供的方法或组合物可以有效地降低有害生物对寄生生物或病原体(例如,真菌的、细菌的、或病毒的病原体或寄生生物)的抗性。在一些情况下,相对于参考水平(例如,在未接受PMP组合物的有害生物中发现的水平),本文提供的方法或组合物可以有效地将有害生物对病原体或寄生生物(例如,真菌的、细菌的、或病毒的病原体;或寄生螨)的抗性降低约2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、或大于100%。
在一些情况下,与未施用PMP组合物的有害生物相比,本文提供的方法或组合物可以有效地降低有害生物的携带或传播植物病原体(例如,植物病毒(例如,TYLCV)或植物细菌(例如,农杆菌属物种(Agrobacterium spp))的能力。例如,相对于参考水平(例如,在未接受PMP组合物的有害生物中发现的水平),本文提供的方法或组合物可以有效地将有害生物的携带或传播植物病原体(例如,植物病毒(例如,TYLCV)或植物细菌(例如,农杆菌属物种))的能力降低约2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、或大于100%。
另外地或可替代地,在PMP或其组合物中包含除草剂的情况下,方法可以进一步用于降低杂草的适应度或杀死杂草。在此类情况下,与未处理的杂草(例如,未施用PMP组合物的杂草)相比,该方法可以有效地将杂草的适应度降低约2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、或更大。例如,方法可以有效地杀死杂草,从而与未处理的植物相比,将杂草群体降低约2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、或更大。在一些情况下,方法显著消除杂草。本文进一步描述了可以根据本发明的方法处理的杂草的实例。
在一些情况下,与未施用PMP组合物的有害生物相比,有害生物适应度的降低可表现为其他适应度劣势,诸如对某些环境因素的耐受性(例如,高温或低温耐受性)降低、在某些生境中存活的能力降低、或维持某种饮食的能力降低。在一些情况下,本文提供的方法或组合物可以以本文描述的任何多种方式有效地降低有害生物适应度。此外,PMP组合物可以降低任何数量的有害生物纲、目、科、属、或物种(例如,1个有害生物物种、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、200、250、500、或更多个有害生物物种)中的有害生物适应度。在一些情况下,PMP组合物作用于单一有害生物纲、目、科、属、或物种。
可以使用本领域的任何标准方法来评估有害生物适应度。在一些情况下,可以通过评价单独的有害生物来评估有害生物适应度。可替代地,可以通过评价有害生物群体来评估有害生物适应度。例如,有害生物适应度的降低可表现为与其他昆虫的成功竞争的降低,从而导致有害生物群体规模的减小。
i.真菌
PMP组合物和相关方法可以用于降低真菌的适应度,例如以预防或处理植物中的真菌感染。包括用于将通过使真菌与PMP组合物接触而将PMP组合物递送至真菌的方法。另外地或可替代地,方法包括通过使植物与PMP组合物接触而将PMP组合物递送至处于真菌感染的风险或具有真菌感染的植物。
PMP组合物和相关方法适用于递送至真菌,这些真菌引起植物中的真菌疾病,包括由以下引起的疾病:白粉病病原体,例如白粉菌属(Blumeria)物种,例如小麦白粉菌(Blumeria graminis);叉丝单囊壳属(Podosphaera)物种,例如白叉丝单囊壳(Podosphaera leucotricha);单丝壳属(Sphaerotheca)物种,例如单丝壳菌(Sphaerotheca fuliginea);钩丝壳属(Uncinula)物种,例如葡萄钩丝壳(Uncinulanecator);由以下引起的疾病:锈病病原体,例如胶锈菌属(Gymnosporangium)物种,例如褐色胶锈菌(Gymnosporangium sabinae);驼孢锈菌属(Hemileia)物种,例如咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix);层锈菌属(Phakopsora)物种,例如豆薯层锈菌(Phakopsorapachyrhizi)和山马蝗层锈菌(Phakopsora meibomiae);柄锈菌属(Puccinia)物种,例如隐匿柄锈菌(Puccinia recondite)、小麦叶锈菌(P.triticina)、禾柄锈菌(P.graminis)或条形柄锈菌(P.striiformis)或大麦柄锈菌(P.hordei);单胞锈菌属(Uromyces)物种,例如疣顶单胞锈菌(Uromyces appendiculatus);由来自以下各项的组的病原体引起的疾病:卵菌纲(Oomycetes),例如白锈菌属(Albugo)物种,例如白锈菌(Algubo candida);盘梗霉属(Bremia)物种,例如莴苣盘梗霉(Bremia lactucae);霜霉属(Peronospora)物种,例如豌豆霜霉(Peronospora pisi)、寄生霜霉(P.parasitica)或芸苔霜霉(P.brassicae);疫霉属(Phytophthora)物种,例如致病疫霉(Phytophthora infestans);单轴霉属(Plasmopara)物种,例如葡萄单轴霉(Plasmopara viticola);假霜霉属(Pseudoperonospora)物种,例如葎草假霜霉(Pseudoperonospora humuli)或古巴假霜霉菌(Pseudoperonosporacubensis);腐霉属(Pythium)物种,例如极腐霉(Pythium ultimum);例如由以下引起的叶疱病和叶萎蔫病:链格孢属(Alternaria)物种,例如茄链格孢(Alternaria solani);尾孢属(Cercospora)物种,例如甜菜生尾孢(Cercospora beticola);枝孢属(Cladiosporium)物种,例如黄瓜枝孢(Cladiosporium cucumerinum);旋孢腔菌属(Cochliobolus)物种,例如禾旋孢腔菌(Cochliobolus sativus)(分生孢子形式:内脐蠕孢属(Drechslera),同义:长蠕孢属(Helminthosporium)、宫部旋孢腔菌(Cochliobolus miyabeanus);炭疽菌属(Colletotrichum)物种,例如莱豆炭疽菌(Colletotrichum lindemuthanium);锈斑病菌属(Cycloconium)物种,例如油橄榄孔雀斑病菌(Cycloconium oleaginum);间座壳属(Diaporthe)物种,例如柑桔间座壳(Diaporthe citri);痂囊腔菌属(Elsinoe)物种,例如柑橘痂囊腔菌(Elsinoe fawcettii);盘长孢属(Gloeosporium)物种,例如悦色盘长孢(Gloeosporium laeticolor);小丛壳属(Glomerella)物种,例如于围小丛壳(Glomerellacingulata);球座菌属(Guignardia)物种,例如葡萄球座菌(Guignardia bidwelli);小球腔菌属(Leptosphaeria)物种,例如斑点小球腔菌(Leptosphaeria maculans)、颖枯壳小球腔菌(Leptosphaeria nodorum);稻瘟菌属(Magnaporthe)物种,例如稻瘟病菌(Magnaporthe grisea);微座孢属(Microdochium)物种,例如雪霉微座孢(Microdochiumnivale);球腔菌属(Mycosphaerella)物种,例如禾生球腔菌(Mycosphaerellagraminicola)、落花生球腔菌(M.arachidicola)和香蕉叶斑病(M.fifiensis);暗球腔菌属(Phaeosphaeria)物种,例如颖枯壳针孢(Phaeosphaeria nodorum);核腔菌属(Pyrenophora)物种,例如圆核腔菌(Pyrenophora teres)、偃麦草核腔菌(Pyrenophoratritici repentis);柱隔孢属(Ramularia)物种,例如柱隔孢叶斑病菌(Ramularia collo-cygni)、白斑柱隔孢(Ramularia areola);喙孢属(Rhynchosporium)物种,例如大麦云纹病菌(Rhynchosporium secalis);壳针孢属(Septoria)物种,例如芹菜壳针孢菌(Septoriaapii)、茄壳针孢菌(Septoria lycopersii);核瑚菌属(Typhula)物种,例如肉孢核瑚菌(Typhula incarnata);黑星菌属(Venturia)物种,例如苹果黑星病菌(Venturiainaequalis);例如由以下引起的根病和茎病:伏革菌属(Corticium)物种,例如禾伏革菌(Corticium graminearum);镰孢属(Fusarium)物种,例如尖孢镰孢(Fusariumoxysporum);顶囊壳属(Gaeumannomyces)物种,例如禾顶囊壳(Gaeumannomycesgraminis);丝核菌属(Rhizoctonia)物种,例如像立枯丝核菌(Rhizoctonia solani);例如由稻帚枝霉(Sarocladium oryzae)引起的帚枝霉(Sarocladium)病;例如由以下引起的小核菌(Sclerotium)病:小球菌核菌(Sclerotium oryzae);Tapesia属物种,例如Tapesiaacuformis;根串珠霉属(Thielaviopsis)物种,例如烟草根黑腐病菌(Thielaviopsisbasicola);例如由以下引起的穗和圆锥花序疾病(包括玉米穗轴):链格孢属(Alternaria)物种,例如链格孢属物种(Alternaria spp.);曲霉属(Aspergillus)物种,例如黄曲霉菌(Aspergillus flavus);枝孢属(Cladosporium)物种,例如芽枝状枝孢(Cladosporiumcladosporioides);麦角菌属(Claviceps)物种,例如黑麦麦角菌(Claviceps purpurea);镰孢属物种,例如黄色镰孢(Fusarium culmorum);赤霉属(Gibberella)物种,例如玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae);明梭孢属(Monographella)物种,例如雪腐明梭孢(Monographella nivalis);壳针孢属物种,例如颖枯壳针孢(Septoria nodorum);由以下引起的疾病:黑穗病真菌,例如轴黑粉菌属(Sphacelotheca)物种,例如丝黑穗病菌(Sphacelotheca reiliana);腥黑粉菌属(Tilletia)物种,例如小麦网腥黑粉菌(Tilletiacaries)、小麦矮腥黑穗病菌(T.controversa);条黑粉菌属(Urocystis)物种,例如隐条黑粉菌(Urocystis occulta);黑粉菌属(Ustilago)物种,例如裸黑粉菌(Ustilago nuda)、U.nuda tritici;例如由以下引起的果腐病:曲霉属物种,例如黄曲霉菌;葡萄孢属(Botrytis)物种,例如灰葡萄孢菌;青霉属(Penicillium)物种,例如扩展青霉(Penicillium expansum)和产紫青霉(P.purpurogenum);核盘霉属物种,例如核盘菌;轮枝孢属(Verticilium)物种,例如黑白轮枝孢(Verticilium alboatrum);种子和土壤传播的腐烂、霉、萎蔫、腐烂和猝倒病,这些疾病例如是由以下引起的:链格孢属(Alternaria)物种,例如由甘蓝链格孢菌(Alternaria brassicicola)引起;丝囊霉属(Aphanomyces)物种,例如由根腐丝囊霉(Aphanomyces euteiches)引起;壳二孢属(Ascochyta)物种,例如由兵豆壳二孢(Ascochyta lentis)引起;曲霉属物种,例如由黄曲霉菌引起;枝孢属(Cladosporium)物种,例如由多主枝孢(Cladosporium herbarum)引起;旋孢腔菌属(Cochliobolus)物种,例如由禾旋孢腔菌(Cochliobolus sativus);(分生孢子形式:内脐蠕孢属(Drechslera)、平脐蠕孢属(Bipolaris),同义:长蠕孢属(Helminthosporium)引起;炭疽菌属(Colletotrichum)物种,例如由球状炭疽菌(Colletotrichum coccodes)引起;镰孢物种,例如由黄色镰孢引起;赤霉属物种,例如由玉蜀黍赤霉引起;壳球孢属(Macrophomina)物种,例如由菜豆壳球孢菌(Macrophomina phaseolina)引起;明梭孢属物种,例如由雪腐明梭孢引起;青霉属物种,例如由扩展青霉引起;茎点霉属(Phoma)物种,例如由黑胫茎点霉(Phoma lingam)引起;拟茎点霉属(Phomopsis)物种,例如由大豆拟茎点菌(Phomopsis sojae)引起;疫霉属(Phytophthora)物种,例如由恶疫霉菌(Phytophthoracactorum)引起;核腔菌属(Pyrenophora)物种,例如由麦类核腔菌(Pyrenophoragraminea)引起;梨孢属(Pyricularia)物种,例如由稻梨孢菌(Pyricularia oryzae)引起;腐霉属物种,例如由极腐霉引起;丝核菌属(Rhizoctonia)物种,例如由立枯丝核菌引起;根霉属(Rhizopus)物种,例如由稻根霉菌(Rhizopus oryzae)引起;小菌核属(Sclerotium)物种,例如由齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)引起;壳针孢属物种,例如由颖枯壳针孢引起;核瑚菌属物种,例如由肉孢核瑚菌引起;轮枝孢属(Verticillium)物种,例如由大丽花轮枝孢引起;例如由以下引起的癌、瘿瘤和鬼帚病(witches’broom):丛赤壳属(Nectria)物种,例如仁果干癌丛赤壳菌(Nectria galligena);例如由以下引起的萎蔫病:链核盘菌属(Monilinia)物种,例如核果链核盘菌(Monilinia laxa);例如由以下引起的叶疱病或叶卷缩病:外担菌属(Exobasidium)物种,例如坏损外担菌(Exobasidium vexans);外囊菌属(Taphrina)物种,例如畸形外囊菌(Taphrina deformans);木质植物的衰退病,其例如由以下引起:埃斯卡病(Esca disease),例如由根霉格孢菌(Phaemoniella clamydospora)、Phaeoacremonium aleophilum和地中海嗜蓝孢孔菌(Fomitiporia mediterranea);葡萄顶枯病(Eutypa dyeback),例如由葡萄弯孢壳(Eutypa lata)引起;例如由岛灵芝(Ganodermaboninense)引起的灵芝(Ganoderma)病;例如由木硬孔菌(Rigidoporus lignosus)引起的硬孔菌(Rigidoporus)病;例如由以下引起的花和种子的疾病:葡萄孢属(Botrytis)物种,例如灰葡萄孢菌;例如由以下引起的植物块茎的疾病:丝核菌属物种,例如立枯丝核菌;长蠕孢属(Helminthosporium)物种,例如茄长蠕孢(Helminthosporium solani);例如由以下引起的根肿病:根肿菌属(Plasmodiophora)物种,例如芸苔根肿菌(Plamodiophorabrassicae);由以下引起的疾病:细菌病原体,例如黄单胞菌属(Xanthomonas)物种,例如野油菜黄单胞菌稻致病变体(Xanthomonas campestris pv.oryzae);假单胞菌属(Pseudomonas)物种,例如丁香假单胞菌黄瓜致病变种(Pseudomonas syringaepv.lachrymans);欧文氏菌属(Erwinia)物种,例如解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)。
例如由以下引起的叶、茎、荚和种子上的真菌疾病:链格孢属叶斑病(Alternarialeaf spot)(链格孢属种细极链格孢(Alternaria spec.atrans tenuissima)、炭疽病(Anthracnose)(Colletotrichum gloeosporoides dematium var.truncatum)、褐斑病(brown spot)(大豆壳针孢菌(Septoria glycines))、尾孢属(cercospora)叶斑病和枯萎病(菊池尾孢菌(Cercospora kikuchii))、笄霉属(choanephora)叶枯病(Choanephorainfundibulifera trispora(同义))、dactuliophora叶枯病(Dactuliophora glycines)、霜霉病(大豆霜霉病(Peronospora manshurica))、内脐蠕孢属枯萎病(Drechsleraglycini)、蛙眼叶斑病(frogeye leaf spot)(大豆尾孢菌(Cercospora sojina))、小光壳属(leptosphaerulina)叶斑病(三叶草小光壳(Leptosphaerulina trifolii))、叶点霉属(phyllostica)叶斑病(大豆生叶点霉(Phyllosticta sojaecola))、荚和茎枯萎病(大豆拟茎点菌(Phomopsis sojae))、白粉病(扩散叉丝壳(Microsphaera diffusa))、棘壳孢属(pyrenochaeta)叶斑病(大豆棘壳孢(Pyrenochaeta glycines))、丝核菌空气枯萎病、叶子枯萎病和网枯萎病(立枯丝核菌)、锈病(豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)、山马蝗层锈菌)、疮痂病(大豆痂圆孢(Sphaceloma glycines))、匍柄霉属(stemphylium)叶枯萎病(葱叶枯匍柄霉Stemphylium botryosum))、靶斑病(target spot)(多主棒孢霉(Corynespora cassiicola))。
例如由以下引起的根和茎基部上的真菌疾病:黑根腐病(猪屎豆丽赤壳菌(Calonectria crotalariae))、木炭腐病(charcoal rot)(菜豆壳球孢菌(Macrophominaphaseolina))、镰孢枯萎病或萎蔫病、根腐病、以及荚和颈腐病(尖孢镰孢、直啄镰孢(Fusarium orthoceras)、半裸镰孢(Fusarium semitectum)、木贼镰孢(Fusariumequiseti))、mycoleptodiscus根腐病(Mycoleptodiscus terrestris)、新赤壳属(neocosmospora)(侵管新赤壳菌(Neocosmospora vasinfecta))、荚和颈枯萎病(菜豆间座壳(Diaporthe phaseolorum))、茎溃疡病(菜豆间座壳北方大豆变种(Diaporthephaseolorum var.caulivora))、疫霉属(phytophthora)腐病(大雄疫霉(Phytophthoramegasperma))、褐茎腐病(brown stem rot)(大豆茎褐腐病菌(Phialophora gregata))、腐霉属(pythium)腐病(瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)、畸雌腐霉(Pythiumirregulare)、德巴利腐霉(Pythium debaryanum)、群结腐霉(Pythium myriotylum)、极腐霉(Pythium ultimum))、丝核菌属(rhizoctonia)根腐病、茎腐烂、和猝倒病(立枯丝核菌)、核盘菌属(sclerotinia)茎腐烂(核盘菌)、核盘菌属南方枯萎病(齐整小核菌(Sclerotiniarolfsii))、根串珠霉属(thielaviopsis)根腐病(基生根串珠霉(Thielaviopsisbasicola))。
在某些情况下,真菌是核盘霉属物种(Sclerotinia spp)(核盘菌(Scelrotiniasclerotiorum))。在某些情况下,真菌是葡萄孢属物种(例如,灰葡萄孢菌)。在某些情况下,真菌是曲霉属物种。在某些情况下,真菌是镰孢属物种。在某些情况下,真菌是青霉属物种。
本发明的组合物可用于各种真菌防治应用中。以上描述的组合物可以用于在真菌病原体收获前或收获后防治真菌植物病原体。在一个实施例中,以上描述的任何组合物用于通过将组合物应用于植物、植物周围的区域、或可食用的栽培蘑菇、蘑菇菌柱、或蘑菇堆肥来防治靶病原体,诸如镰孢属物种、葡萄孢属物种、轮枝孢属物种、丝核菌属物种、木霉属物种、或腐霉属物种。在另一个实施例中,本发明的组合物用于防治收获后病原体,诸如青霉属、地丝菌属(Geotrichum)、黑曲霉(Aspergillus niger)或炭疽菌属物种。
表6提供了可以使用本文描述的PMP组合物和相关方法处理或预防的真菌和与其相关的植物疾病的进一步实例。
表6.真菌有害生物
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ii.细菌
PMP组合物和相关方法可以用于降低细菌的适应度,例如以预防或处理植物中的细菌感染。包括用于将通过使细菌与PMP组合物接触而将PMP组合物递送至细菌的方法。另外地或可替代地,方法包括通过使植物与PMP组合物接触而将生物型杀有害生物剂(biopesticide)递送至处于细菌感染的风险或具有细菌感染的植物。
PMP组合物和相关方法适用于递送至细菌或被其感染的植物,包括以下进一步描述的任何细菌。例如,细菌可以是属于放线菌门(Actinobacteria)或变形菌门(Proteobacteria)的细菌,诸如伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、微杆菌科(Microbacteriaceae)、和根瘤菌科(Rhizobiaceae)中的细菌。
在一些情况下,细菌是燕麦食酸菌亚种(Acidovorax avenae subsp.),包括例如燕麦食酸菌燕麦亚种(Acidovorax avenae subsp.avenae)(=燕麦假单胞菌燕麦亚种(Pseudomonas avenae subsp.avenae))、燕麦食酸菌卡特来兰亚种(Acidovorax avenaesubsp.cattleyae)(=卡特来兰假单胞菌(Pseudomonas cattleyae))、或燕麦食酸菌瓜类亚种(Acidovorax avenae subsp.citrulli)(=假产碱假单胞菌瓜类亚种(Pseudomonaspseudoalcaligenes subsp.citrulli))、(Pseudomonas avenae subsp.citrulli))。
在一些情况下,细菌是伯克霍尔德氏菌属物种(Burkholderia spp.),包括例如须芒草伯克霍尔德氏菌(Burkholderia andropogonis)(=须芒草假单胞菌(Pseudomonasandropogonis)、伍氏假单胞菌(Pseudomonas woodsii))、石竹伯克霍尔德氏菌(Burkholderia caryophylli)(=石竹假单胞菌(Pseudomonas caryophylli))、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)(=洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia))、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)(=唐菖蒲假单胞菌(Pseudomonasgladioli))、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌栖伞菌致病变种(Burkholderia gladiolipv.agaricicola)(=唐菖蒲假单胞菌栖伞菌致病变种(Pseudomnas gladiolipv.agaricicola))、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌葱生致病变种(Burkholderia gladiolipv.alliicola)(即,唐菖蒲假单胞菌葱生致病变种(Pseusomonas gladiolipv.alliicola))、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌唐菖蒲致病变种(Burkholderia gladiolipv.gladioli)(即,唐菖蒲假单胞菌(Pseudomonas gladioli)、唐菖蒲假单胞菌唐菖蒲致病变种(Pseudomonas gladioli pv.gladioli))、荚壳伯克霍尔德氏菌(Burkholderiaglumae)(即,荚壳假单胞菌(Pseudomonas glumae))、植物伯克霍尔德氏菌(Burkholderiaplantarii)(即,植物假单胞菌(Pseudomonas plantarii))、茄伯克霍尔德氏菌(Burkholderia solanacearum)(即,茄科青枯菌(Ralstonia solanacearum))、或青枯菌属物种(Ralstonia spp.)。
在一些情况下,细菌是韧皮部杆菌属物种(Liberibacter spp.),包括暂定韧皮部杆菌属物种(Candidatus Liberibacter spec.),包括例如暂定亚洲韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter asiaticus)、非洲韧皮部杆菌(Liberibacter africanus)(Laf)、美洲韧皮部杆菌(Liberibacter americanus)(Lam)、亚洲韧皮部杆菌(Liberibacter asiaticus)(Las)、欧洲韧皮部杆菌(Liberibacter europaeus)(Leu)、Liberibacter psyllaurous、或茄韧皮部杆菌(Liberibacter solanacearum)(Lso)。
在一些情况下,细菌是棒杆菌属物种(Corynebacterium spp.),包括例如带状棒杆菌(Corynebacterium fascians)、萎蔫棒杆菌萎蔫致病变种(Corynebacteriumflaccumfaciens pv.flaccumfaciens)、密执安棒杆菌(Corynebacteriummichiganensis)、密执安棒杆菌小麦致病变种(Corynebacterium michiganensepv.tritici)、密执安棒杆菌尼布拉斯加致病变种(Corynebacterium michiganensepv.nebraskense)、或腐败棒杆菌(Corynebacterium sepedonicum)。
在一些情况下,细菌是欧文氏菌属物种(Erwinia spp.),包括例如解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)、菠萝欧文氏菌(Erwinia ananas)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovora)(即,胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum))、胡萝卜软腐欧文氏菌黑腐亚种(Erwinia carotovora subsp.atroseptica)、胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜软腐亚种(Erwinia carotovora subsp.carotovora)、菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)、菊欧文氏菌玉米致病变种(Erwinia chrysanthemi pv.zeae)、溶解欧文氏菌(Erwiniadissolvens)、草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、大黄欧文氏菌(Erwinia rhapontic)、斯氏欧文氏菌(Erwinia stewartiii)、嗜管欧文嗜菌(Erwinia tracheiphila)、或噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)。
在一些情况下,细菌是丁香假单胞菌亚种(Pseudomonas syringae subsp.),包括例如丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae)(Psa)、丁香假单胞菌致黑致病变种(Pseudomonas syringae pv.atrofaciens)、丁香假单胞菌晕斑致病变种(Pseudomonas syringae pv.coronafaciens)、丁香假单胞菌大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)、丁香假单胞菌黄瓜致病变种(Pseudomonassyringae pv.lachrymans)、丁香假单胞菌斑生致病变种(Pseudomonas syringaepv.maculicola)、丁香假单胞菌疱疹致病变种(Pseudomonas syringae pv.papulans)、丁香假单胞菌条纹致病变种(Pseudomonas syringae pv.striafaciens)、丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonas syringae pv.syringae)、丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato)、或丁香假单胞菌烟草致病变种(Pseudomonassyringae pv.tabaci)。
在一些情况下,细菌是链霉菌属物种(Streptomyces ssp.),包括例如酸疮痂链霉菌(Streptomyces acidiscabies)、微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)、纯白链霉菌(Streptomyces candidus)(即,闪白放线菌(Actinomyces candidus))、晶体链霉菌(Streptomyces caviscabies)、山丘链霉菌(Streptomyces collinus)、Streptomyceseuropaeiscabiei、中间型链霉菌(Streptomyces intermedius)、番薯链霉菌(Streptomyces ipomoeae)、Streptomyces luridiscabiei、Streptomyces niveiscabiei、Streptomyces puniciscabiei、Streptomyces retuculiscabiei、Streptomyces scabiei、疮痂病链霉菌(Streptomyces scabies)、西唐氏链霉菌(Streptomyces setonii)、Streptomyces steliiscabiei、Streptomyces turgidiscabies、或Streptomyceswedmorensis。
在一些情况下,细菌是地毯草黄单胞菌亚种(Xanthomonas axonopodis subsp.),包括例如地毯草黄单胞菌苜蓿致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.alfalfae)(=苜蓿黄单胞菌(Xanthomonas alfalfae))、地毯草黄单胞菌莱檬致病变种(Xanthomonasaxonopodis pv.aurantifolii)(=褐色黄单胞菌莱檬亚种(Xanthomonas fuscanssubsp.aurantifolii))、Xanthomonas axonopodis pv.allii(=Xanthomonas campestrispv.allii)、地毯草黄单胞菌地毯草致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.axonopodis)、地毯草黄单胞菌羊蹄甲致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.bauhiniae)(=野油菜黄单胞菌羊蹄甲致病变种(Xanthomonas campestris pv.bauhiniae))、地毯草黄单胞菌秋海棠致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.begoniae)(=野油菜黄单胞菌秋海棠致病变种(Xanthomonas campestris pv.begoniae))、地毯草黄单胞菌萎叶致病变种(Xanthomonasaxonopodis pv.betlicola)(=野油菜黄单胞菌萎叶致病变种(Xanthomonas campestrispv.betlicola))、地毯草黄单胞菌感应草致病变种(Xanthomonas axonopodispv.biophyti)(=野油菜黄单胞菌感应草致病变种(Xanthomonas campestrispv.biophyti))、地毯草黄单胞菌木豆致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.cajani)(=野油菜黄单胞菌木豆致病变种(Xanthomonas campestris pv.cajani))、地毯草黄单胞菌木薯致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.cassavae)(=木薯黄单胞菌(Xanthomonascassavae)、野油菜黄单胞菌木薯致病变种(Xanthomonas campestris pv.cassavae))、地毯草黄单胞菌山扁豆致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.cassiae)(=野油菜黄单胞菌山扁豆致病变种(Xanthomonas campestris pv.cassiae))、地毯草黄单胞菌柑橘致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.citri)(=柑橘黄单胞菌(Xanthomonas citri))、地毯草黄单胞菌柑蜜致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.citrumelo)(=苜蓿黄单胞菌柑蜜亚种(Xanthomonas alfalfae subsp.citrumelonis))、地毯草黄单胞菌蝶豆致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.clitoriae)(=野油菜黄单胞菌蝶豆致病变种(Xanthomonas campestris pv.clitoriae))、地毯草黄单胞菌糁子致病变种(Xanthomonasaxonopodis pv.coracanae)(=野油菜黄单胞菌糁子致病变种((Xanthomonas campestrispv.coracanae)))、地毯草黄单胞菌瓜尔豆致病变种(Xanthomonas axonopodispv.cyamopsidis)(=野油菜黄单胞菌瓜尔豆致病变种(Xanthomonas campestrispv.cyamopsidis))、地毯草黄单胞菌山马蝗致病变种(Xanthomonas axonopodispv.desmodii)(=野油菜黄单胞菌山马蝗致病变种(Xanthomonas campestrispv.desmodii))、地毯草黄单胞菌恒河山马蝗致病变种(Xanthomonas axonopodispv.desmodiigangetici)(=野油菜黄单胞菌恒河山马蝗致病变种(Xanthomonascampestris pv.desmodiigangetici))、地毯草黄单胞菌疏花山马蝗致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.desmodiilaxiflori)(=野油菜黄单胞菌疏花山马蝗致病变种(Xanthomonas campestris pv.desmodiilaxiflori))、地毯草黄单胞菌园叶山马蝗致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.desmodiirotundifolii)(=野油菜黄单胞菌园叶山马蝗致病变种(Xanthomonas campestris pv.desmodiirotundifolii))、地毯草黄单胞菌花叶万年青致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.dieffenbachiae)(=野油菜黄单胞菌花叶万年青致病变种(Xanthomonas campestris pv.dieffenbachiae))、地毯草黄单胞菌印度刺桐致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.erythrinae)(=野油菜黄单胞菌印度刺桐致病变种(Xanthomonas campestris pv.erythrinae))、地毯草黄单胞菌簇生致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.fascicularis)(=野油菜黄单胞菌簇生致病变种(Xanthomonas campestris pv.fasciculari))、地毯草黄单胞菌大豆致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.glycines)(=野油菜黄单胞菌大豆致病变种(Xanthomonascampestris pv.glycines))、地毯草黄单胞菌红木致病变种(Xanthomonas axonopodispv.khayae)(=野油菜黄单胞菌红木致病变种(Xanthomonas campestris pv.khayae))、地毯草黄单胞菌胡枝子致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.lespedezae)(=野油菜黄单胞菌胡枝子致病变种(Xanthomonas campestris pv.lespedezae))、地毯草黄单胞菌栀子致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.maculifoliigardeniae)(=野油菜黄单胞菌栀子致病变种(Xanthomonas campestris pv.maculifoliigardeniae))、地毯草黄单胞菌锦葵致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.malvacearum)(=柑橘黄单胞菌锦葵亚种(Xanthomonas citri subsp.malvacearum))、地毯草黄单胞菌木薯致病变种(Xanthomonasaxonopodis pv.manihotis)(=野油菜黄单胞菌木薯致病变种(Xanthomonas campestrispv.manihotis))、地毯草黄单胞菌栖角胡麻致病变种(Xanthomonas axonopodispv.martyniicola)(=野油菜黄单胞菌栖角胡麻致病变种(Xanthomonas campestrispv.martyniicola))、地毯草黄单胞菌梅氏致病变种(Xanthomonas axonopodispv.melhusii)(=野油菜黄单胞菌梅氏致病变种(Xanthomonas campestrispv.melhusii))、地毯草黄单胞菌中田氏黄麻致病变种(Xanthomonas axonopodispv.nakataecorchori)(=野油菜黄单胞菌中田氏黄麻致病变种(Xanthomonas campestrispv.nakataecorchori))、地毯草黄单胞菌西番莲致病变种(Xanthomonas axonopodispv.passiflorae)(=野油菜黄单胞菌西番莲致病变种(Xanthomonas campestrispv.passiflorae))、地毯草黄单胞菌印度麻致病变种(Xanthomonas axonopodispv.patelii)(=野油菜黄单胞菌印度麻致病变种(Xanthomonas campestrispv.patelii))、Xanthomonas axonopodis pv.pedalii(=Xanthomonas campestrispv.pedalii)、地毯草黄单胞菌菜豆致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.phaseoli)(=野油菜黄单胞菌菜豆致病变种(Xanthomonas campestris pv.phaseoli)、菜豆黄单胞菌(Xanthomonas phaseoli))、地毯草黄单胞菌菜豆致病变种褐色变种(Xanthomonasaxonopodis pv.phaseoli var.fuscans)(=褐色黄单胞菌(Xanthomonas fuscans))、地毯草黄单胞菌叶下珠致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.phyllanthi)(=野油菜黄单胞菌叶下珠致病变种(Xanthomonas campestris pv.phyllanthi))、地毯草黄单胞菌栖酸浆致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.physalidicola)(=野油菜黄单胞菌栖酸浆致病变种(Xanthomonas campestris pv.physalidicola))、地毯草黄单胞菌栖猩猩木致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.poinsettiicola)(=野油菜黄单胞菌栖猩猩木致病变种(Xanthomonas campestris pv.poinsettiicola))、地毯草黄单胞菌安石榴致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.punicae)(=野油菜黄单胞菌安石榴致病变种(Xanthomonas campestris pv.punicae))、地毯草黄单胞菌鹿藿致病变种(Xanthomonasaxonopodis pv.rhynchosiae)(=野油菜黄单胞菌鹿藿致病变种(Xanthomonascampestris pv.rhynchosiae))、地毯草黄单胞菌蓖麻致病变种(Xanthomonas axonopodispv.ricini)(=野油菜黄单胞菌蓖麻致病变种(Xanthomonas campestris pv.ricini))、地毯草黄单胞菌田菁致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.sesbaniae)(=野油菜黄单胞菌田菁致病变种(Xanthomonas campestris pv.sesbaniae))、地毯草黄单胞菌罗望子致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.tamarindi)(=野油菜黄单胞菌罗望子致病变种(Xanthomonas campestris pv.tamarindi))、地毯草黄单胞菌维管束致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.vasculorum)(=野油菜黄单胞菌维管束致病变种(Xanthomonas campestris pv.vasculorum)、地毯草黄单胞菌辣椒斑点病致病变种(Xanthomonas axonopodis pv.vesicatoria)(=野油菜黄单胞菌辣椒斑点病致病变种(Xanthomonas campestris pv.vesicatoria)、辣椒斑点病黄单胞菌(Xanthomonasvesicatoria))、地毯草黄单胞菌绿豆致病变种(Xanthomonas axonopodispv.vignaeradiatae)(=野油菜黄单胞菌绿豆致病变种(Xanthomonas campestrispv.vignaeradiatae))、地毯草黄单胞菌栖豇豆致病变种(Xanthomonas axonopodispv.vignicola)(=野油菜黄单胞菌栖豇豆致病变种(Xanthomonas campestrispv.vignicola))、或地毯草黄单胞菌葡萄蔓致病变种(Xanthomonas axonopodispv.vitians)(=野油菜黄单胞菌葡萄蔓致病变种(Xanthomonas campestrispv.vitians))。
在一些情况下,细菌是野油菜黄单胞菌香蕉致病变种(Xanthomonas campestrispv.musacearum)、野油菜黄单胞菌桃李致病变种(Xanthomonas campestris pv.pruni)(=树生黄单胞菌桃李致病变种(Xanthomonas arboricola pv.pruni))、或草莓黄单胞菌(Xanthomonas fragariae)。
在一些情况下,细菌是半透明黄单胞菌(Xanthomonas translucens supsp.)(=野油菜黄单胞菌大麦致病变种(Xanthomonas campestris pv.hordei)),包括例如半透明黄单胞菌燕麦草致病变种(Xanthomonas translucens pv.arrhenatheri)(=野油菜黄单胞菌燕麦草致病变种(Xanthomonas campestris pv.arrhenatheri))、半透明黄单胞菌谷物致病变种(Xanthomonas translucens pv.cerealis)(=野油菜黄单胞菌谷物致病变种(Xanthomonas campestris pv.cerealis))、半透明黄单胞菌禾谷致病变种(Xanthomonastranslucens pv.graminis)(=野油菜黄单胞菌禾谷致病变种(Xanthomonas campestrispv.graminis))、半透明黄单胞菌梯牧草属致病变种(Xanthomonas translucenspv.phlei)(=野油菜黄单胞菌梯牧草属致病变种(Xanthomonas campestris pv.phlei))、半透明黄单胞菌梯牧草致病变种(Xanthomonas translucens pv.phleipratensis)(=野油菜黄单胞菌梯牧草致病变种(Xanthomonas campestris pv.phleipratensis))、半透明黄单胞菌早熟禾致病变种(Xanthomonas translucens pv.poae)(=野油菜黄单胞菌早熟禾致病变种(Xanthomonas campestris pv.poae))、半透明黄单胞菌黑麦致病变种(Xanthomonas translucens pv.secalis)(=野油菜黄单胞菌黑麦致病变种(Xanthomonascampestris pv.secalis))、半透明黄单胞菌小麦致病变种(Xanthomonas translucenspv.translucens)(=野油菜黄单胞菌小麦致病变种(Xanthomonas campestrispv.translucens))、或半透明黄单胞菌波形致病变种(Xanthomonas translucenspv.undulosa)(=野油菜黄单胞菌波形致病变种(Xanthomonas campestrispv.undulosa))。
在一些情况下,细菌是稻黄单胞菌亚种(Xanthomonas oryzae supsp.)、稻黄单胞菌稻亚种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)(=野油菜黄单胞菌稻致病变种(Xanthomonascampestris pv.oryzae))、或野油菜黄单胞菌oryzicola致病变种(Xanthomonas oryzaepv.oryzicola)(=野油菜黄单胞菌oryzicola致病变种(Xanthomonas campestrispv.oryzicola))。
在一些情况下,细菌是来自黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)的苛养木杆菌(Xylella fastidiosa)。
表7示出了可以使用本文描述的PMP组合物和相关方法处理或预防的细菌和与其相关的疾病的进一步实例。
表7.细菌性有害生物
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iii.昆虫
PMP组合物和相关方法可以用于降低昆虫的适应度,例如以预防或处理植物中的昆虫侵染。术语“昆虫”包括在任何发育阶段(即,未成熟昆虫和成虫昆虫)的属于节肢动物门以及属于昆虫纲(Insecta)或蛛形纲(Arachnida)的任何生物体。包括用于将通过使昆虫与PMP组合物接触而将PMP组合物递送至昆虫的方法。另外地或可替代地,方法包括通过使植物与PMP组合物接触而将生物型杀有害生物剂递送至处于昆虫侵染的风险或具有昆虫侵染的植物。
PMP组合物和相关方法适用于预防或处理昆虫侵染或被其侵染的植物,包括属于以下目的昆虫:蜱螨目(Acari)、蜘蛛目(Araneae)、虱目(Anoplura)、鞘翅目(Coleoptera)、弹尾目(Collembola)、革翅目(Dermaptera)、网翅目(Dictyoptera)、双尾目(Diplura)、双翅目(Diptera)(例如,斑翅果蝇(spotted-wing Drosophila))、纺足目(Embioptera)、蜉蝣目(Ephemeroptera)、蛩蠊目(Grylloblatodea)、半翅目(Hemiptera)(例如,蚜虫、温室白粉虱)、同翅目(Homoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、等翅目(Isoptera)、鳞翅目、食毛目(Mallophaga)、长翅目(Mecoptera)、脉翅目(Neuroptera)、蜻蜓目(Odonata)、直翅目(Orthoptera)、竹节虫目(Phasmida)、襀翅目(Plecoptera)、原尾目(Protura)、啮虫目(Psocoptera)、蚤目(Siphonaptera)、虱目(Siphunculata)、缨尾目(Thysanura)、捻翅目(Strepsiptera)、缨翅目(Thysanoptera)、毛翅目(Trichoptera)、或缺翅目。
在一些情况下,昆虫来自蛛形纲(Arachnida),例如粉螨属物种(Acarus spp.)、柑橘瘤瘿螨(Aceria sheldoni)、刺皮瘿螨属物种(Aculops spp.)、刺瘿螨属物种(Aculusspp.)、花蜱属物种(Amblyomma spp.)、山楂叶螨(Amphitetranychus viennensis)、锐缘蜱属物种(Argas spp.)、牛蜱属物种(Boophilus spp.)、短须螨属物种(Brevipalpus spp.)、麦苔螨(Bryobia graminum)、苜蓿苔螨(Bryobia praetiosa)、刺尾蝎属物种(Centruroides spp.)、皮螨属物种(Chorioptes spp.)、鸡皮刺螨(Dermanyssusgallinae)、屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)、粉尘螨(Dermatophagoidesfarinae)、革蜱属物种(Dermacentor spp.)、始叶螨属物种(Eotetranychus spp.)、梨上瘿螨(Epitrimerus pyri)、真叶螨属物种(Eutetranychus spp.)、瘿螨属物种(Eriophyesspp.)、家食甜螨(Glycyphagus domesticus)、Halotydeus destructor、Hemitarsonemus属物种、璃眼蜱属物种(Hyalomma spp.)、硬蜱属物种(Ixodes spp.)、蛛属物种(Latrodectusspp.)、Loxosceles属物种、Metatetranychus属物种、Neutrombicula autumnalis、奴合撒属物种(Nuphersa spp.)、小爪螨属物种(Oligonychus spp.)、钝缘蜱属物种(Ornithodorus spp.)、禽刺螨属物种(Ornithonyssus spp.)、全爪螨属物种(Panonychusspp.)、柑桔锈螨(Phyllocoptruta oleivora)、侧多食跗线螨(Polyphagotarsonemuslatus)、痒螨(Psoroptes spp.)、扇头蜱属物种(Rhipicephalus spp.)、根螨属物种(Rhizoglyphus spp.)、疥螨属物种(Sarcoptes spp.)、中东金蝎(Scorpio maurus)、狭跗线螨属物种(Steneotarsonemus spp.)、斯氏狭跗线螨(Steneotarsonemus spinki)、跗线螨属物种(Tarsonemus spp.)、叶螨属物种(Tetranychus spp.)、阿氏真恙螨(Trombiculaalfreddugesi)、愈神蝎属物种(Vaejovis spp.)、或柑橘瘤瘿螨(Vasates lycopersici)。
在一些情况下,昆虫来自唇足纲(Chilopoda),例如地蜈蚣属物种(Geophilusspp.)或蚰蜒属物种(Scutigera spp.)。
在一些情况下,昆虫来自弹尾目(Collembola),例如武装棘跳虫(Onychiurusarmatus)。
在一些情况下,昆虫来自倍足纲(Diplopoda),例如Blaniulus guttulatus;
来自昆虫纲(Insecta),例如来自蜚蠊目(Blattodea),例如亚洲小蠊(Blattellaasahinai)、德国小蠊(Blattella germanica)、东方蜚蠊(Blatta orientalis)、马德拉蜚蠊(Leucophaea maderae)、古巴蠊属物种(Panchlora spp.)、木蠊属物种(Parcoblattaspp.)、大蠊属物种(Periplaneta spp.)、或棕带蜚蠊(Supella longipalpa)。
在一些情况下,昆虫来自鞘翅目(Coleoptera),例如Acalymma vittatum、菜豆象(Acanthoscelides obtectus)、喙丽金龟属物种(Adoretus spp.)、Agelastica alni、叩甲属物种(Agriotes spp.)、小粉虫(Alphitobius diaperinus)、粉吹金龟子(Amphimallonsolstitialis)、家具窃蠹(Anobium punctatum)、星天牛属物种(Anoplophora spp.)、花象属物种(Anthonomus spp.)、圆皮蠹属物种(Anthrenus spp.)、长喙小象属物种(Apionspp.)、甘蔗金龟属物种(Apogonia spp.)、Atomaria属物种、毛皮蠹属物种(Attagenusspp.)、Bruchidius obtectus、豆象属物种(Bruchus spp.)、龟金花虫属物种(Cassidaspp.)、Cerotoma trifurcata、象甲(Ceutorrhynchus spp.)、凹胫跳甲属物种(Chaetocnema spp.)、宽胸口口头虫属物种(Cleonus mendicus、宽胸金针虫(Conoderusspp.)、象甲属物种(Cosmopolites spp.)、褐新西兰肋翅鳃角金龟(Costelytrazealandica)、金针虫属物种(Ctenicera spp.)、象虫属物种(Curculio spp.)、锈赤扁谷盗(Cryptolestes ferrugineus)、杨干隐喙象(Cryptorhynchus lapathi)、细枝象属物种(Cylindrocopturus spp.)、皮蠹属物种(Dermestes spp.)、条叶甲属物种(Diabroticaspp.)(例如,玉米根虫)、蛀野螟属物种(Dichocrocis spp.)、铁甲虫(Dicladispaarmigera)、阿根廷小兜属物种(Diloboderus spp.)、食植瓢虫属物种(Epilachna spp.)、毛跳甲属物种(Epitrix spp.)、Faustinus属物种、裸蛛甲(Gibbium psylloides)、阔角谷盗(Gnathocerus cornutus)、菜心螟(Hellula undalis)、黑异爪庶金龟(Heteronychusarator)、寡节鲍金龟属物种(Heteronyx spp.)、Hylamorpha elegans、北美家天牛(Hylotrupes bajulus)、紫苜蓿叶象(Hypera postica)、蓝绿象(Hypomeces squamosus)、咪小蠢属物种(Hypothenemus spp.)、甘蔗大褐齿爪鳃金龟(Lachnosternaconsanguinea)、烟草甲(Lasioderma serricorne)、长头谷盗(Latheticus oryzae)、Lathridius属物种、负泥虫属物种(Lema spp.)、马铃薯甲虫(Leptinotarsadecemlineata)、银潜蛾属物种(Leucoptera spp.)、稻水象(Lissorhoptrusoryzophilus)、筒喙象属物种(Lixus spp.)、萤叶甲属物种(Luperodes spp.)、粉蠹属物种(Lyctus spp.)、美洲叶甲属物种(Megascelis spp.)、梳爪叩头虫属物种(Melanotusspp.)、油菜花露尾甲(Meligethes aeneus)、鳃金龟属物种(Melolontha spp.)、Migdolus属物种、墨天牛属物种(Monochamus spp.)、象甲(Naupactus xanthographus)、隐跗郭公虫属物种(Necrobia spp.)、褐蛛甲(Niptus hololeucus)、椰蛀犀金龟(Oryctesrhinoceros)、锯胸粉扁虫(Oryzaephilus surinamensis)、Oryzaphagus oryzae、耳喙象属物种(Otiorrhynchus spp.)、小青花金龟(Oxycetonia jucunda)、辣根猿叶虫(Phaedoncochleariae)、食叶鳃金龟属物种(Phyllophaga spp.)、Phyllophaga helleri、黄条跳甲属物种(Phyllotreta spp.)、日本弧丽金龟(Popillia japonica)、象甲属物种(Premnotrypes spp.)、大谷蠹(Prostephanus truncatus)、油菜金头跳甲属物种(Psylliodes spp.)、蛛甲属物种(Ptinus spp.)、暗色瓢虫(Rhizobius ventralis)、谷蠹(Rhizopertha dominica)、谷象属物种(Sitophilus spp.)、米象(Sitophilus oryzae)、尖隐喙象属物种(Sphenophorus spp.)、药材甲(Stegobium paniceum)、茎干象属物种(Sternechus spp.)、Symphyletes属物种、纤毛象属物种(Tanymecus spp.)、黄粉虫(Tenebrio molitor)、大谷盗(Tenebrioides mauretanicus)、拟谷盗属物种(Triboliumspp.)、斑皮蠹属物种(Trogoderma spp.)、籽象属物种(Tychius spp.)、脊虎天牛属物种(Xylotrechus spp.)、或距步甲属物种(Zabrus spp.)。
在一些情况下,昆虫来自双翅目,例如伊蚊属物种(Aedes spp.)、潜蝇属物种(Agromyza spp.)、按实蝇属物种(Anastrepha spp.)、按蚊属物种(Anopheles spp.)、瘿蚊属物种(Asphondylia spp.)、实蝇属物种(Bactrocera spp.)、花园毛蚊(Bibiohortulanus)、天青丽蝇(Calliphora erythrocephala)、红头丽蝇(Calliphora vicina)、地中海实蝇(Ceratitis capitata)、摇蚊属物种(Chironomus spp.)、金蝇属物种(Chrysomyia spp.)、斑虻属物种(Chrysops spp.)、高额麻虻(Chrysozona pluvialis)、锥蝇属物种(Cochliomyia spp.)、康瘿蚊属物种(Contarinia spp.)、人皮蝇(Cordylobiaanthropophaga)、稻环摇蚊(Cricotopus sylvestris)、库蚊属物种(Culex spp.)、库蠓属物种(Culicoides spp.)、脉毛蚊属物种(Culiseta spp.)、黄蝇属物种(Cuterebra spp.)、橄榄大实蝇(Dacus oleae)、叶瘿蚊属物种(Dasyneura spp.)、地种蝇属物种(Deliaspp.)、人肤蝇(Dermatobia hominis)、果蝇属物种(Drosophila spp.)、果蝇属物种(Echinocnemus spp.)、厕蝇属物种(Fannia spp.)、胃蝇属物种(Gasterophilus spp.)、舌蝇属物种(Glossina spp.)、麻虻属物种(Haematopota spp.)、毛眼水蝇属物种(Hydrelliaspp.)、大麦毛眼水蝇(Hydrellia griseola)、黑蝇属物种(Hylemya spp.)、虱蝇属物种(Hippobosca spp.)、皮蝇属物种(Hypoderma spp.)、斑潜蝇属物种(Liriomyza spp.)、绿蝇属物种(Lucilia spp.)、Lutzomyia属物种、曼蚊属物种(Mansonia spp.)、家蝇属物种(Musca spp.)(例如,Musca domestica)、狂蝇属物种(Oestrus spp.)、瑞典麦秆蝇(Oscinella frit)、Paratanytarsus属物种、Paralauterborniella subcincta、泉蝇属物种(Pegomyia spp.)、白蛉属物种(Phlebotomus spp.)、草种蝇属物种(Phorbia spp.)、草种蝇属物种(Phormia spp.)、酪蝇(Piophila casei)、Prodiplosis属物种、胡萝卜茎蝇(Psila rosae)、绕实蝇属物种(Rhagoletis spp.)、麻蝇属物种(Sarcophaga spp.)、蚋属物种(Simulium spp.)、螫蝇属物种(Stomoxys spp.)、虻属物种(Tabanus spp.)、根斑蝇属物种(Tetanops spp.)、或大蚊属物种(Tipula spp.)。
在一些情况下,昆虫来自异翅亚目(Heteroptera),例如,南瓜缘蝽(Anasatristis)、拟丽蝽属物种(Antestiopsis spp.)、Boisea属物种、土长蝽属物种(Blissusspp.)、俊盲蝽属物种(Calocoris spp.)、斑腿微刺盲蝽(Campylomma livida)、异背长蝽属物种(Cavelerius spp.)、臭虫属物种(Cimex spp.)、白辧麦寄蝇属物种(Collaria spp.)、Creontiades dilutus、胡椒缘蝽(Dasynus piperis)、Dichelops furcatus、厚氏长棒网蝽(Diconocoris hewetti)、棉红蝽属物种(Dysdercus spp.)、美洲蝽属物种(Euschistusspp.)、扁盾蝽属物种(Eurygaster spp.)、刺盲蝽属物种(Heliopeltis spp.)、棉红蝽(Horcias nobilellus)、稻缘蝽属物种(Leptocorisa spp.)、稻缘椿象(Leptocorisavaricornis)、北美叶足缘蝽(Leptoglossus phyllopus)、草盲蝽属物种(Lygus spp.)、蔗黑长蝽(Macropes excavatus)、盲蝽科(Miridae)、金光绿盲蝽(Monalonion atratum)、绿蝽属物种(Nezara spp.)、稻蝽属物种(Oebalus spp.)、蝽科(Pentomidae)、方背皮蝽(Piesma quadrata)、壁蝽属物种(Piezodorus spp.)、杂盲蝽属物种(Psallus spp.)、Pseudacysta persea、红猎蝽属物种(Rhodnius spp.)、可可褐盲蝽(Sahlbergellasingularis)、Scaptocoris castanea、黑蝽属物种(Scotinophora spp.)、梨冠网蝽(Stephanitis nashi)、Tibraca属物种、或锥猎蝽属物种(Triatoma spp.)。
在一些情况下,昆虫来自同翅目(Homiptera)、例如Acizzia acaciaebaileyanae、Acizzia dodonaeae、Acizzia uncatoides、长头蝗(Acrida turrita)、无网长管蚜属物种(Acyrthosipon spp.)、Acrogonia属物种、Aeneolamia属物种、隆脉木虱属物种(Agonoscena spp.)、甘蓝粉虱(Aleyrodes proletella)、甘蔗穴粉虱(Aleurolobusbarodensis)、丝绒粉虱(Aleurothrixus floccosus)、植莲木虱(Allocaridaramalayensis)、杧果叶蝉属物种(Amrasca spp.)、飞廉短尾蚜(Anuraphis cardui)、肾圆盾蚧属物种(Aonidiella spp.)、苏联黄粉蚜(Aphanostigma pini)、蚜属物种(Aphis spp.)(例如,Apis gossypii)、葡萄叶蝉(Arboridia apicalis)、Arytainilla属物种、小圆盾蚧属物种(Aspidiella spp.)、圆盾蚧属物种(Aspidiotus spp.)、Atanus属物种、茄沟无网蚜(Aulacorthum solani)、烟草粉虱(Bemisia tabaci)、Blastopsylla occidentalis、Boreioglycaspis melaleucae、李短尾蚜(Brachycaudus helichrysi)、Brachycolus属物种、甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae)、Cacopsylla属物种、小褐稻虱(Calligyponamarginata)、黄头大叶蝉(Carneocephala fulgida)、甘蔗粉角蚜(Ceratovacunalanigera)、沫蝉科(Cercopidae)、蜡蚧属物种(Ceroplastes spp.)、草莓钉蚜(Chaetosiphon fragaefolii)、蔗黄雪盾蚧(Chionaspis tegalensis)、茶绿叶蝉(Chlorita onukii)、棉蝗(Chondracris rosea)、核桃黑斑蚜(Chromaphisjuglandicola)、黑褐圆盾蚧(Chrysomphalus ficus)、玉米叶蝉(Cicadulina mbila)、Coccomytilus halli、软蚧属物种(Coccus spp.)、茶藨隐瘤蚜(Cryptomyzus ribis)、Cryptoneossa属物种、Ctenarytaina属物种、Dalbulus属物种、柑橘粉虱(Dialeurodescitri)、柑桔木虱(Diaphorina citri)、白背盾蚧属物种(Diaspis spp.)、履绵蚧属物种(Drosicha spp.)、西圆尾蚜属物种(Dysaphis spp.)、灰粉蚧属物种(Dysmicoccus spp.)、小绿叶蝉属物种(Empoasca spp.)、绵蚜属物种(Eriosoma spp.)、斑叶蝉属物种(Erythroneura spp.)、Eucalyptolyma属物种、褐木虱属物种(Euphyllura spp.)、殃叶蝉(Euscelis bilobatus)、拂粉蚧属物种(Ferrisia spp.)、咖啡地粉蚧(Geococcuscoffeae)、Glycaspis属物种、银合欢木虱(Heteropsylla cubana)、棘状异木虱(Heteropsylla spinulosa)、假桃病毒叶蝉(Homalodisca coagulata)、翅尖头叶蝉(Homalodisca vitripennis)、梅大尾蚜(Hyalopterus arundinis)、吹绵蚧属物种(Iceryaspp.)、片角叶蝉属物种(Idiocerus spp.)、扁喙叶蝉属物种(Idioscopus spp.)、灰飞虱(Laodelphax striatellus)、Lecanium属物种、蛎盾蚧属物种(Lepidosaphes spp.)、萝卜蚜(Lipaphis erysimi)、长管蚜属物种(Macrosiphum spp.)、二点叶蜂(Macrostelesfacifrons)、Mahanarva属物种、高粱蚜(Melanaphis sacchari)、Metcalfiella属物种、麦无网蚜(Metopolophium dirhodum)、黑缘平翅斑蚜(Monellia costalis)、Monelliopsispecanis、瘤蚜属物种(Myzus spp.)、莴苣衲长管蚜(Nasonovia ribisnigri)、黑尾叶蝉属物种(Nephotettix spp.)、Nettigoniclla spectra、褐飞虱(Nilaparvata lugens)、Oncometopia属物种、普来隆旌蚧(Orthezia praelonga)、中华稻蝗(Oxya chinensis)、Pachypsylla属物种、杨梅缘粉虱(Parabemisia myricae)、Paratrioza属物种、片盾蚧属物种(Parlatoria spp.)、天疱疮属物种(Pemphigus spp.)、及蝽科物种(Pentatomidae)(例如,褐翅椿象(Halyomorpha halys))、玉米蜡蝉(Peregrinus maidis)、绵粉蚧属物种(Phenacoccus spp.)、杨平翅绵蚜(Phloeomyzus passerinii)、忽布疣蚜(Phorodonhumuli)、葡萄根瘤蚜属物种(Phylloxera spp.)、苏铁褐点并盾蚧(Pinnaspisaspidistrae)、臀纹粉蚧属物种(Planococcus spp.)、Prosopidopsylla flava、梨形原绵蚧(Protopulvinaria pyriformis)、桑白盾蚧(Pseudaulacaspis pentagona)、粉蚧属物种(Pseudococcus spp.)、Psyllopsis属物种、木虱属物种(Psylla spp.)、金小蜂属物种(Pteromalus spp.)、Pyrilla属物种、笠圆盾蚧属物种(Quadraspidiotus spp.)、Quesadagigas、平刺粉蚧属物种(Rastrococcus spp.)、缢管蚜属物种(Rhopalosiphum spp.)、黑盔蚧属物种(Saissetia spp.)、葡萄带叶蝉(Scaphoideus titanus)、麦二叉蚜(Schizaphisgraminum)、苏铁刺圆盾蚧(Selenaspidus articulatus)、长唇基飞虱属物种(Sogataspp.)、白背飞虱(Sogatella furcifera)、Sogatodes属物种、三角蝶(Stictocephalafestina)、梣粉虱(Siphoninus phillyreae)、Tenalaphara malayensis、台诺非拉属物种(Tetragonocephela spp.)、美国核桃黑蚜(Tinocallis caryaefoliae)、广胸沫蝉属物种(Tomaspis spp.)、声蚜属物种(Toxoptera spp.)、温室白粉虱(Trialeurodesvaporariorum)、木虱属物种(Trioza spp.)、小叶蝉属物种(Typhlocyba spp.)、尖盾蚧属物种(Unaspis spp.)、葡萄根瘤虱(Viteus vitifolii)、么叶蝉属物种(Zygina spp.);
来自膜翅目,例如顶切叶蚁属物种(Acromyrmex spp.)、菜叶蜂属物种(Athaliaspp.)、切叶蚁属物种(Atta spp.)、松叶蜂属物种(Diprion spp.)、实叶蜂属物种(Hoplocampa spp.)、毛蚁属物种(Lasius spp.)、小黄家蚁(Monomorium pharaonisspp.)、树蜂属物种(Sirex spp.)、入侵红火蚁(Solenopsis invicta)、酸臭蚁属物种(Tapinoma spp.)、大树蜂属物种(Urocerus spp.)、胡蜂属物种(Vespa spp.)、或黑树蜂属物种(Xeris spp.)。
在一些情况下,昆虫来自等足目(Isopoda),例如,鼠妇(Armadillidiumvulgare)、栉水虱潮虫(Oniscus asellus)、或球鼠妇(Porcellio scaber)。
在一些情况下,昆虫来自等翅目(Isoptera),例如,乳白蚁属物种(Contariniaspp.)、Cornitermes cumulans、堆砂白蚁属物种(Cryptotermes spp.)、楹白蚁属物种(Incisitermes spp.)、稻麦小白蚁(Microtermes obesi)、土白蚁属物种(Odontotermesspp.)、或散白蚁属物种(Reticulitermes spp)。
在一些情况下,昆虫来自鳞翅目(Lepidoptera),例如小蜡螟(Achroiagrisella)、桑剑纹夜蛾(Acronicta major)、褐带卷蛾属物种(Adoxophyes spp.)、白纹伊蚊(Aedia leucomelas)、地夜蛾属物种(Agrotis spp.)、阿拉巴马属物种(Alabama spp.)、脐橙螟(Amyelois transitella)、条麦蛾属物种(Anarsia spp.)、干煞夜蛾属物种(Anticarsia spp.)、Argyroploce属物种、甘蓝夜蛾(Barathra brassicae)、禾弄蝶(Borbocinnara)、棉潜蛾(Bucculatrix thurberiella)、松尺蠖(Bupalus piniarius)、干夜蛾属物种(Busseola spp.)、Cacoecia属物种、茶细蛾(Caloptilia theivora)、烟卷蛾(Capuareticulana)、苹果蠹蛾(Carpocapsa pomonella)、桃小食心虫(Carposina niponensis)、冬尺蛾(Cheimatobia brumata)、禾草螟属物种(Chilo spp.)、卷蛾属物种(Choristoneuraspp.)、葡萄果蠹蛾(Clysia ambiguella)、Cnaphalocerus属物种、稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)、云卷蛾属物种(Cnephasia spp.)、蒂蛀虫属物种(Conopomorpha spp.)、球颈象属物种(Conotrachelus spp.)、Copitarsia属物种、小卷蛾属物种(Cydia spp.)、Dalaca noctuides、绢野螟属物种(Diaphania spp.)、蔗螟(Diatraea saccharalis)、钻夜蛾属物种(Earias spp.)、Ecdytolopha aurantium、Elasmopalpus lignosellus、甘薯杆螟(Eldana saccharina)、粉斑螟属物种(Ephestiaspp.)、叶小卷蛾属物种(Epinotia spp.)、苹果褐卷蛾(Epiphyas postvittana)、荚斑螟属物种(Etiella spp.)、Eulia属物种、女贞细卷蛾(Eupoecilia ambiguella)、毒蛾属物种(Euproctis spp.)、切夜蛾属物种(Euxoa spp.)、脏切叶蛾属物种(Feltia spp.)、大蜡螟(Galleria mellonella)、细蛾属物种(Gracillaria spp.)、小食心虫属物种(Grapholithaspp.)、甘蔗螟属物种(Hedylepta spp.)、铃夜蛾属物种(Helicoverpa spp.)、实夜蛾属物种(Heliothis spp.)、褐家蛾(Hofmannophila pseudospretella)、同斑螟属物种(Homoeosoma spp.)、长卷蛾属物种(Homona spp.)、苹果巢蛾(Hyponomeuta padella)、柿举肢蛾(Kakivoria flavofasciata)、夜蛾属物种(Laphygma spp.)、梨小食心虫(Laspeyresia molesta)、茄黄斑螟(Leucinodes orbonalis)、银潜蛾属物种(Leucopteraspp.)、紫藤潜叶细蛾属物种(Lithocolletis spp.)、绿果冬夜蛾(Lithophaneantennata)、花翅小蛾属物种(Lobesia spp.)、豆白隆切根虫(Loxagrotis albicosta)、毒蛾属物种(Lymantria spp.)、潜蛾属物种(Lyonetia spp.)、天幕毛虫(Malacosomaneustria)、豆荚野螟(Maruca testulalis)、甘蓝夜蛾(Mamstra brassicae)、稻暮眼蝶(Melanitis leda)、毛胫夜蛾属物种(Mocis spp.)、Monopis obviella、粘虫(Mythimnaseparata)、橡长角蛾(Nemapogon cloacellus)、水螟属物种(Nymphula spp.)、Oiketicus属物种、Oria属物种、瘤丛螟属物种(Orthaga spp.)、秆野螟属物种(Ostrinia spp.)、负泥虫(Oulema oryzae)、小眼夜蛾(Panolis flammea)、稻弄蝶属物种(Parnara spp.)、红铃虫属物种(Pectinophora spp.)、潜叶蛾属物种(Perileucoptera spp.)、茄麦蛾属物种(Phthorimaea spp.)、柑橘潜叶蛾(Phyllocnistis citrella)、小潜细蛾属物种(Phyllonorycter spp.)、粉蝶属物种(Pieris spp.)、荷兰石竹小卷蛾(Platynotastultana)、印度谷螟(Plodia interpunctella)、金翅夜蛾属物种(Plusia spp.)、小菜蛾(Plutella xylostella)、小白巢蛾属物种(Prays spp.)、斜纹夜蛾属物种(Prodeniaspp.)、烟草天蛾属物种(Protoparce spp.)、拟粘液蛾属物种(Pseudaletia spp.)、一星黏虫(Pseudaletia unipuncta)、大豆夜蛾(Pseudoplusia includens)、玉米螟(Pyraustanubilalis)、Rachiplusia nu、禾螟属物种(Schoenobius spp.)、白禾螟属物种(Scirpophaga spp.)、稻白螟(Scirpophaga innotata)、Scotia segetum、蛀茎夜蛾属物种(Sesamia spp.)、大螟(Sesamia inferens)、长须卷蛾属物种(Sparganothis spp.)、夜蛾属物种(Spodoptera spp.)、Spodoptera praefica、展足蛾属物种(Stathmopoda spp.)、花生麦蛾(Stomopteryx subsecivella)、透翅蛾属物种(Synanthedon spp.)、安第斯马铃薯块茎蛾(Tecia solanivora)、Thermesia gemmatalis、木塞谷蛾(Tinea cloacella)、袋谷蛾(Tinea pellionella)、幕谷蛾(Tineola bisselliella)、卷叶蛾属物种(Tortrixspp.)、毛毡衣蛾(Trichophaga tapetzella)、粉夜蛾属物种(Trichoplusia spp.)、三化螟(Tryporyza incertulas)、番茄斑潜蝇(Tuta absoluta)、或灰蝶属物种(Viracholaspp.)。
在一些情况下,昆虫来自以下目:直翅目(Orthoptera)或跳跃目(Saltatoria),例如,家蟋蟀(Acheta domesticus)、Dichroplus属物种、蝼蛄属物种(Gryllotalpa spp.)、蔗蝗属物种(Hieroglyphus spp.)、飞蝗属物种(Locusta spp.)、黑蝗属物种(Melanoplusspp.)、或Schistocerca gregaria。
在一些情况下,昆虫来自虱目(Phthiraptera),例如,毛虱属物种(Damaliniaspp.)、血虱属物种(Haematopinus spp.)、毛虱属物种(Linognathus spp.)、虱属物种(Pediculus spp.)、阴虱(Ptirus pubis)、毛虱属物种(Trichodectes spp.)。
在一些情况下,昆虫来自啮虫目(Psocoptera),例如,Lepinatus属物种、或书虱属物种(Liposcelis spp)。
在一些情况下,昆虫来自蚤目(Siphonaptera),例如,角叶蚤属物种(Ceratophyllus spp.)、栉首蚤属物种(Ctenocephalides spp.)、致痒蚤(Pulexirritans)、穿皮潜蚤(Tunga penetrans)、或Xenopsylla cheopsis。
在一些情况下,昆虫来自缨翅目(Thysanoptera),例如玉米黄呆蓟马(Anaphothrips obscurus)、稻蓟马(Baliothrips biformis)、鲜食葡萄镰蓟马(Drepanothrips reuteri)、Enneothrips flavens、花蓟马属物种(Frankliniella spp.)、阳蓟马属物种(Heliothrips spp.)、温室条蓟马(Hercinothrips femoralis)、腹钩蓟马(Rhipiphorothrips cruentatus)、硬蓟马属物种(Scirtothrips spp.)、Taeniothripscardamomi、或蓟马属物种(Thrips spp)。
在一些情况下,昆虫来自衣鱼目(Zygentoma)(=缨尾目(Thysanura)),例如毛衣鱼属物种(Ctenolepisma spp.)、家衣鱼(Lepisma saccharina)、盗火虫(Lepismodesinquilinus)、或小灶衣鱼(Thermobia domestica)。
在一些情况下,昆虫来自综合纲(Symphyla),例如小幺蚰属物种(Scutigerellaspp)。
在一些情况下,昆虫是螨,包括但不限于跗线螨,诸如Phytonemus pallidus、侧多食跗线螨(Polyphagotarsonemus latus)、Tarsonemus bilobatus等;真足螨,诸如白菜螨(Penthaleus erythrocephalus)、叶爪螨(Penthaleus major)等;叶螨,诸如真梶小爪螨(Oligonychus shinkaji)、桔全爪螨(Panonychus citri)、桑全爪螨(Panonychus mori)、苹果全爪螨(Panonychus ulmi)、神泽氏叶螨(Tetranychus kanzawai)、二斑叶螨(Tetranychus urticae)等;瘿螨,诸如茶尖叶节蜱(Acaphylla theavagrans)、曲瘿螨(Aceria tulipae)、番茄刺皮瘿螨(Aculops lycopersici)、皮氏刺皮瘿螨(Aculopspelekassi)、苹果刺锈螨(Aculus schlechtendali)、Eriophyes chibaensis、柑橘锈螨(Phyllocoptruta oleivora)等;粉螨,诸如罗宾根螨(Rhizoglyphus robini)、腐食酪螨(Tyrophagus putrescentiae)、三叶螨(Tyrophagus similis)等;蜂窝螨,诸如大蜂螨(Varroa jacobsoni)、狄斯瓦螨(Varroa destructor)等;蜱亚目,诸如微小牛蜱(Boophilus microplus)、血红扇头蜱(Rhipicephalus sanguineus)、长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)、褐黄血蜱(Haemophysalis flava)、铃头血蜱(Haemophysalis campanulata)、卵形硬蜱(Ixodes ovatus)、全沟硬蜱(Ixodespersulcatus)、花蜱属物种(Amblyomma spp.)、革蜱属物种(Dermacentor spp.)等;肉食螨科(Cheyletidae),诸如Cheyletiella yasguri、布氏姬螯螨(Cheyletiella blakei)等;蠕形螨科(Demodicidae),诸如犬蠕形螨(Demodex canis)、猫蠕形螨(Demodex cati)等;痒螨科(Psoroptidae),诸如羊痒螨(Psoroptes ovis)等;Scarcoptidae,诸如人疥螨(Sarcoptes scabiei)、猫耳螨(Notoedres cati)、膝螨属物种(Knemidocoptes spp.)等。
表8示出了可以使用本文描述的PMP组合物和相关方法处理或预防的引起侵染的昆虫的进一步实例。
表8.昆虫有害生物
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iv.软体动物
PMP组合物和相关方法可以用于降低软体动物的适应度,例如以预防或处理植物中的软体动物侵染。术语“软体动物”包括属于软体动物门的任何生物体。包括用于将通过使软体动物与PMP组合物接触而将PMP组合物递送至软体动物的方法。另外地或可替代地,方法包括通过使植物与PMP组合物接触而将生物型杀有害生物剂递送至处于软体动物侵染的风险或具有软体动物侵染的植物。
PMP组合物和相关方法适用于预防或处理农业和园艺中陆生腹足类(例如,蛞蝓和蜗牛)的侵染。它们包括主要作为杂食性有害生物出现在农业和园艺作物上的所有陆生蛞蝓和蜗牛。例如,软体动物可以属于以下科:玛瑙螺科(Achatinidae)、野蛞蝓科(Agriolimacidae)、瓶螺科(Ampullariidae)、阿勇蛞蝓科(Arionidae)、巴蜗牛科(Bradybaenidae)、大蜗牛科(Helicidae)、Hydromiidae、椎实螺科(Lymnaeidae)、小蛞蝓科(Milacidae)、尾环蜗牛科(Urocyclidae)、或蛞蝓科(Veronicellidae)。
例如,在一些情况下,软体动物是玛瑙螺属物种(Achatina spp.)、Archachatina属物种(例如,Archachatina marginata)、野蛞蝓属物种(Agriolimax spp.)、Arion属物种(例如,A.ater、A.circumscriptus、A.distinctus、A.fasciatus、A.hortensis、A.intermedius、红色蛞蝓(A.rufus)、A.subfuscus、A.silvaticus、A.lusitanicus)、Arliomax属物种(例如,Ariolimax columbianus)、双脐螺属物种(Biomphalaria spp)、缓行螺属物种(Bradybaena spp.)(例如,B.fruticum)、小泡螺属物种(Bulinus spp.)、蜗牛属物种(Cantareus spp.)(例如,棕色庭园蜗牛(C.asperses))、葱蜗牛属物种(Cepaeaspp.)(例如,花园葱蜗牛(C.hortensis)、森林蜗牛(C.nemoralis)、花园葱蜗牛(C.hortensis))、白蜗牛属物种(Cernuella spp.)、螺蜗牛属物种(Cochlicella spp.)、Cochlodina属物种(例如,C.laminata)、颈蛞蝓属物种(Deroceras spp.)(例如,田地颈蛞蝓(D.agrestis)、D.empiricorum、光滑颈蛞蝓(D.laeve)、D.panornimatum、网纹颈蛞蝓(D.reticulatum))、圆盘蜗牛属物种(Discus spp.)(例如,圆形圆盘蜗牛(D.rotundatus))、Euomphalia属物种、土蜗属物种(Galba spp.)(例如,截形土蜗(G.trunculata))、大蜗牛属物种(Helicella spp.)(例如,H.itala、H.obvia)、Helicigona属物种(例如,H.arbustorum)、Helicodiscus属物种、Helix属物种(例如,H.aperta、H.aspersa、H.pomatia)、Limax属物种(例如,L.cinereoniger、L.flavus、L.marginatus、L.maximus、L.tenellus)、Limicolaria属物种(例如,Limicolaria aurora)、椎实螺属物种(Lymnaea spp.)(例如,静水椎实螺(L.stagnalis))、Mesodon属物种(例如,Mesonthyroidus)、蒙纳螺属物种(Monadenia spp.)(例如,信念蒙纳螺(Monadenia fidelis))、Milax属物种(例如,M.gagates、M.marginatus、M.sowerbyi、M.budapestensis)、钉螺属物种(Oncomelania spp.)、Neohelix属物种(例如,Neohelix albolabris)、钻螺属物种(Opeas spp.)、Otala属物种(例如,Otala lacteal)、Oxyloma属物种(例如,O.pfeifferi)、福寿螺属物种(Pomacea spp.)(例如,小管福寿螺(P.canaliculata))、琥珀螺属物种(Succinea spp.)、Tandonia属物种(例如,T.budapestensis、T.sowerbyi)、Theba属物种、瓦娄蜗牛属物种(Vallonia spp.)、或琥珀蜗牛属物种(Zonitoides spp.)(例如,光洁琥珀蜗牛(Z.nitidus))。
v.线虫
PMP组合物和相关方法可以用于降低线虫的适应度,例如以预防或处理植物中的线虫侵染。术语“线虫”包括属于线虫动物门的任何生物体。包括用于将通过使线虫与PMP组合物接触而将PMP组合物递送至线虫的方法。另外地或可替代地,方法包括通过使植物与PMP组合物接触而将生物型杀有害生物剂递送至处于线虫侵染的风险或具有线虫侵染的植物。
PMP组合物和相关方法适用于预防或处理引起损害植物的线虫的侵染,这些线虫包括例如,根结线虫属物种(Meloidogyne spp.)(根结)、异皮线虫属物种(Heteroderaspp.)、球异皮线虫属物种(Globodera spp.)、短体线虫属物种(Pratylenchus spp.)、螺旋线虫属物种(Helicotylenchus spp.)、相似穿孔线虫(Radopholus similis)、鳞球茎茎线虫(Ditylenchus dipsaci)、肾形肾状线虫(Rotylenchulus reniformis)、剑线虫属物种(Xiphinema spp.)、滑刃线虫属物种(Aphelenchoides spp.)和芹刺线虫(Belonolaimuslongicaudatus)。在一些情况下,线虫是植物寄生线虫或生活在土壤中的线虫。植物寄生线虫包括但不限于,体外寄生物,诸如剑线虫属物种(Xiphinema spp.)、长针线虫属物种(Longidorus spp.)、和毛刺线虫属物种(Trichodorus spp.);半寄生物,诸如垫刃线虫属物种(Tylenchulus spp.);移栖体内寄生物,如短体线虫属物种(Pratylenchus spp.)、穿孔线虫属物种(Radopholus spp.)、和盾线虫属物种(Scutellonema spp.);定栖寄生物,诸如异皮线虫属物种(Heterodera spp.)、球异皮线虫属物种(Globodera spp.)、和根结线虫属物种(Meloidogyne spp.);以及茎叶体内寄生物,诸如茎线虫属物种(Ditylenchusspp.)、滑刃线虫属物种(Aphelenchoides spp.)、和潜根线虫属物种(Hirschmaniellaspp.)。特别有害的根寄生土壤线虫是诸如异皮线虫属(Heterodera)或球异皮线虫属(Globodera)的囊肿形成线虫、和/或根结线虫属(Meloidogyne)的根结线虫。这些属的有害物种是例如,南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、大豆孢囊线虫(Heteroderaglycines,soybean cyst nematode)、马铃薯白线虫(Globodera pallida)和马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis),用本文描述的PMP组合物有效地控制这些物种。然而,本文描述的PMP组合物的使用决不限于这些属或物种,而且也以相同的方式延伸至其他线虫。
可以通过本文描述的方法和组合物靶向的线虫的其他实例包括但不限于例如居农粗纹膜垫刃线虫(Aglenchus agricola)、小麦粒线虫(Anguina tritici)、花生滑刃线虫(Aphelenchoides arachidis)、草莓滑刃线虫(Aphelenchoides fragaria)以及一般的滑刃线虫属物种(Aphelenchoides spp.)类茎和叶体内寄生虫、细小刺线虫(Belonolaimusgracilis)、长尾剌线虫(Belonolaimus longicaudatus)、诺顿刺线虫(Belonolaimusnortoni)、椰子伞滑刃线虫(Bursaphelenchus cocophilus)、Bursaphelenchus eremus、松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)、拟松材线虫(Bursaphelenchus mucronatus)以及一般的伞滑刃属物种(Bursaphelenchus spp.)、胡桃线虫(Cacopaurus pestis)、弯曲小环线虫(Criconemella curvata)、刻线小环线虫(Criconemella onoensis)、装饰小环线虫(Criconemella ornata)、Criconemella rusium、薄叶小环线虫(Criconemella xenoplax)(=Mesocriconema xenoplax)和一般的小环线虫属物种(Criconemella spp.)、Criconemoides femiae、Criconemoides onoense、Criconemoides ornatum和一般的轮线虫属物种(Criconemoides spp.)、腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)、鳞球茎茎线虫(Ditylenchus dipsaci)、食菌茎线虫(Ditylenchus myceliophagus)和一般的茎线虫属物种(Ditylenchus spp.)类茎和叶体内寄生虫、Dolichodorus heterocephalus、马铃薯白线虫(Globodera pallida)(=Heterodera pallida)、马铃薯金线虫(Globoderarostochiensis)(马铃薯胞囊线虫(potato cyst nematode))、茄球异皮线虫(Globoderasolanacearum)、烟草球异皮线虫(Globodera tabacum)、弗吉尼亚球异皮线虫(Globoderavirginia)和一般的球异皮线虫属物种(Globodera spp.)类固着性胞囊形成寄生虫、双角螺旋线虫(Helicotylenchus digonicus)、双宫双角螺旋线虫(Helicotylenchusdihystera)、刺桐双角螺旋线虫(Helicotylenchus erythrine)、多带双角螺旋线虫(Helicotylenchus multicinctus)、短小双角螺旋线虫(Helicotylenchus nannus)、假强壮双角螺旋线虫(Helicotylenchus pseudorobustus)和一般的螺旋线虫属物种(Helicotylenchus spp.)、半轮线虫(Hemicriconemoides)、蚤缀鞘线虫(Hemicycliophoraarenaria)、Hemicycliophora nudata、微细鞘线虫(Hemicycliophora parvana)、Heterodera avenae、十字花科异皮线虫(Heterodera cruciferae)、大豆异皮线虫(Heterodera glycines)(大豆胞囊线虫)、水稻异皮线虫(Heterodera oryzae)、甜菜异皮线虫(Heterodera schachtii)、玉米异皮线虫(Heterodera zeae)和一般的异皮线虫属物种(Heterodera spp.)类固着性囊孢形成寄生虫、纤细潜根线虫(Hirschmaniellagracilis)、水稻潜根线虫(Hirschmaniella oryzae)、刺尾潜根线虫(Hirschmaniellaspinicaudata)和一般的潜根线虫属物种(Hirschmaniella spp.)类茎和叶的内寄生虫、埃及纽带线虫(Hoplolaimus aegyptii)、加州纽带线虫(Hoplolaimus califomicus)、哥伦比亚纽带线虫(Hoplolaimus columbus)、帽状纽带线虫(Hoplolaimus galeatus)、印度纽带线虫(Hoplolaimus indicus)、大针纽带线虫(Hoplolaimus magnistylus)、不强纽带线虫(Hoplolaimus pararobustus)、非洲长针线虫(Longidorus africanus)、短环长针线虫(Longidorus breviannulatus)、逸去长针线虫(Longidorus elongatus)、光头长针线虫(Longidorus laevicapitatus)、藤蔓长针线虫(Longidorus vineacola)和一般的长针线虫属物种(Longidorus spp.)类外寄生虫、高粱根结线虫(Meloidogyne acronea)、非洲根结线虫(Meloidogyne africana)、花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)、泰晤士花生根结线虫(Meloidogyne arenaria thamesi)、Meloidogyne artiella、哥伦比亚根结线虫(Meloidogyne chitwoodi)、咖啡根结线虫(Meloidogyne coffeicola)、埃塞俄比亚根结线虫(Meloidogyne ethiopica)、短小根结线虫(Meloidogyne exigua)、伪哥伦比亚根结线虫(Meloidogyne fallax)、禾草根结线虫(Meloidogyne graminicola)、禾本科根结线虫(Meloidogyne graminis)、北方根结线虫(Meloidogyne hapla)、南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、Meloidogyne incognita acrita、爪哇根结线虫(Meloidogynejavanica)、吉库尤根结线虫(Meloidogyne kikuyensis)、微小根结线虫(Meloidogyneminor)、纳西根结线虫(Meloidogyne naasi)、巴拉那根结线虫(Meloidogyneparanaensis)、泰晤士根结线虫(Meloidogyne thamesi)和一般的根结线虫属物种(Meloidogyne spp.)类固着性囊孢形成寄生虫、瓢线虫属物种(Meloinema spp.)、异常珍珠线虫(Nacobbus aberrans)、Neotylenchus vigissi、Paraphelenchuspseudoparietinus、葱副毛刺线虫(Paratrichodorus allius)、裂片副毛刺线虫(Paratrichodorus lobatus)、微小拟毛刺线虫(Paratrichodorus minor)、矮小拟毛刺(Paratrichodorus nanus)、胼胝副毛刺线虫(Paratrichodorus porosus)、光滑副毛刺线虫(Paratrichodorus teres)和一般的副毛刺线虫属物种(Paratrichodorus spp.)、弯钩针线虫(Paratylenchus hamatus)、微小针线虫(Paratylenchus minutus)、突出针线虫(Paratylenchus projectus)和一般的针线虫属物种(Paratylenchus spp.)、敏捷短体线虫(Pratylenchus agilis)、艾氏短体线虫(Pratylenchus alleni)、安第斯短体线虫(Pratylenchus andinus)、最短尾短体线虫(Pratylenchus brachyurus)、谷类短体线虫(Pratylenchus cerealis)、咖啡短体线虫(Pratylenchus coffeae)、刻痕短体线虫(Pratylenchus crenatus)、德式短体线虫(Pratylenchus delattrei)、圆尾短体线虫(Pratylenchus giibbicaudatus)、古氏短体线虫(Pratylenchus goodeyi)、钩状短体线虫(Pratylenchus hamatus)、六纹短体线虫(Pratylenchus hexincisus)、卢斯短体线虫(Pratylenchus loosi)、落选短体线虫(Pratylenchus neglectus)、穿刺短体线虫(Pratylenchus penetrans)、草地短体线虫(Pratylenchus pratensis)、Pratylenchusscribneri、精美短体线虫(Pratylenchus teres)、索氏短体线虫(Pratylenchusthornei)、伤残短体线虫(Pratylenchus vulnus)、玉米短体线虫(Pratylenchus zeae)和一般的短体线虫属物种(Pratylenchus spp.)类迁移性内寄生虫、Pseudohalenchusminutus、大齿平滑垫刃线虫(Psilenchus magnidens)、肿大平滑垫刃线虫(Psilenchustumidus)、查尔斑皮线虫(Punctodera chalcoensis)、锐利五沟线虫(Quinisulciusacutus)、柑橘穿孔线虫(Radopholus citrophilus)、相似穿孔线虫(Radopholussimilis)、一般的穿孔线虫属物种(Radopholus spp.)类迁移性内寄生虫、北方小盘旋线虫(Rotylenchulus borealis)、小肾状线虫(Rotylenchulus parvus)、肾形小盘旋线虫(Rotylenchulus reniformis)和一般的小盘旋线虫属物种(Rotylenchulus spp.)、直沟盘旋线虫(Rotylenchus laurentinus)、Rotylenchus macrodoratus、强壮盘旋线虫(Rotylenchus robustus)、单型盘旋线虫(Rotylenchus uniformis)和一般的盘旋线虫属物种(Rotylenchus spp.)、小班盾线虫(Scutellonema brachyurum)、缓慢盾线虫(Scutellonema bradys)、格尾盾线虫(Scutellonema clathricaudatum)和一般的盾线虫属物种(Scutellonema spp.)类迁移性内寄生虫、根瘿亚蟃线虫(Subanguina radiciola)、烟草头线虫(Tetylenchus nicotianae)、圆筒毛刺线虫(Trichodorus cylindricus)、微小毛刺线虫(Trichodorus minor)、原始毛刺线虫(Trichodorus primitivus)、最近毛刺线虫(Trichodorus proximus)、相似毛刺线虫(Trichodorus similis)、少见毛刺线虫(Trichodorus sparsus)和一般的毛刺线虫属物种(Trichodorus spp.)类体外寄生虫、农田矮化线虫(Tylenchorhynchus agri)、甘蓝矮化线虫(Tylenchorhynchus brassicae)、清亮矮化线虫(Tylenchorhynchus clarus)、克莱顿矮化线虫(Tylenchorhynchusclaytoni)、指状矮化线虫(Tylenchorhynchus digitatus)、伊布里矮化线虫(Tylenchorhynchus ebriensis)、最大矮化线虫(Tylenchorhynchus maximus)、裸矮化线虫(Tylenchorhynchus nudus)、普通矮化线虫(Tylenchorhynchus vulgaris)和一般的矮化线虫属物种(Tylenchorhynchus spp.)、半穿刺线虫(Tylenchulus semipenetrans)和一般的小垫刃属物种(Tylenchulus spp.)类半寄生虫、美洲剑线虫(Xiphinemaamericanum)、短颈剑线虫(Xiphinema brevicolle)、裂尾剑线虫(Xiphinemadimorphicaudatum)、标准剑线虫(Xiphinema index)和一般的剑线虫属物种(Xiphinema)类外寄生物。
线虫有害生物的其他实例包括属于以下科的物种:环线虫科(Criconematidae)、刺线虫科(Belonolaimidae)、枪形科(Hoploaimidae)、异皮线虫科(Heteroderidae)、长针线虫科(Longidoridae)、短体线虫科(Pratylenchidae)、毛刺线虫科(Trichodoridae)、或粒线虫科(Anguinidae)。
表9示出了可以使用本文描述的PMP组合物和相关方法处理或预防的线虫和与其相关的疾病的进一步实例。
表9.线虫有害生物
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vi.病毒
PMP组合物和相关方法可以用于降低病毒的适应度,例如以预防或处理植物中的病毒感染。包括用于将通过使病毒与PMP组合物接触而将PMP组合物递送至病毒的方法。另外地或可替代地,方法包括通过使植物与PMP组合物接触而将PMP组合物递送至处于病毒感染的风险或具有病毒感染的植物。
PMP组合物和相关方法适用于递送至引起植物中的病毒疾病的病毒,包括表10中列出的病毒和疾病。
表10.病毒性植物病原体
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C.向植物共生体的递送
本文提供了向植物共生体递送本文披露的PMP组合物的方法。包括用于将通过使共生体与PMP组合物接触而将PMP组合物递送至共生体(例如,细菌内共生体、真菌内共生体、或昆虫)的方法。方法可以用于增加植物共生体(例如,对植物的适应度有益的共生体)的适应度。在一些情况下,可以用未负载的PMP处理植物共生体。在其他情况下,PMP包括异源功能剂,例如肥料剂。
因此,这些方法可以用于增加植物共生体的适应度。在一个方面,本文提供了一种增加共生体的适应度的方法,该方法包括向该共生体递送本文描述的PMP组合物(例如,以有效量和有效持续时间)以相对于未处理的共生体(例如,未递送该PMP组合物的共生体)增加该共生体的适应度。
在一个方面,本文提供了一种增加真菌(例如,植物的真菌内共生体)的适应度的方法,其中该方法包括向该内共生体递送包含多个PMP的PMP组合物(例如,本文描述的PMP组合物)。例如,植物共生体可以是内共生真菌,诸如以下属的真菌:曲霉科(Aspergillaceae)、角担菌科(Ceratobasidiaceae)、Coniochaetaceae、虫草菌科(Cordycipitaceae)、伏革菌科(Corticiaceae)、Cystofilobasidiaceae、小戴卫霉科(Davidiellaceae)、德巴利酵母科(Debaryomycetaceae)、排腔科(Dothioraceae)、白粉菌科(Erysiphaceae)、线黑粉菌科(Filobasidiaceae)、小丛壳科(Glomerellaceae)、齿菌科(Hydnaceae)、肉座菌科(Hypocreaceae)、小球腔菌科(Leptosphaeriaceae)、蒙塔腔菌科(Montagnulaceae)、被孢霉科(Mortierellaceae)、小球腔菌科(Mycosphaerellaceae)、丛赤壳科(Nectriaceae)、圆盘菌科(Orbiliaceae)、暗球腔菌科(Phaeosphaeriaceae)、孢菌科(Pleosporaceae)、假散囊菌科(Pseudeurotiaceae)、根霉科(Rhizopodaceae)、核盘菌科(Sclerotiniaceae)、韧革菌科(Stereaceae)、或发菌科(Trichocomacea)。
在另一个方面,本文提供了一种增加细菌(例如,植物的细菌内共生体)的适应度的方法,其中该方法包括向该细菌递送包含多个PMP的PMP组合物(例如,本文描述的PMP组合物)。例如,植物共生体可以是内共生细菌,诸如以下属的细菌:醋杆菌科(Acetobacteraceae)、酸杆菌科(Acidobacteriaceae)、热酸菌科(Acidothermaceae)、气球菌科(Aerococcaceae)、产碱菌科(Alcaligenaceae)、第二节脂环酸芽胞杆菌科(Alicyclobacillaceae)、交替单胞菌科(Alteromonadaceae)、厌氧绳菌科(Anaerolineaceae)、橙单胞菌科(Aurantimonadaceae)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、噬菌弧菌科(Bacteriovoracaceae)、蛭弧菌科(Bdellovibrionaceae)、慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)、短杆菌科(Brevibacteriaceae)、布鲁氏菌科(Brucellaceae)、伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、Carboxydocellaceae、柄杆菌科(Caulobacteraceae)、纤维素单胞菌科(Cellulomonadaceae)、噬几丁质菌科(Chitinophagaceae)、着色菌科(Chromatiaceae)、西索恩氏菌科(Chthoniobacteraceae)、Chthonomonadaceae、梭菌科(Clostridiaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)、克斯体科(Coxiellaceae)、蟑螂杆状体科(Cryomorphaceae)、圆杆菌科(Cyclobacteriaceae)、噬纤维菌科(Cytophagaceae)、异常球菌科(Deinococcaceae)、皮杆菌科(Dermabacteraceae)、皮生球菌科(Dermacoccaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、肠球菌科(Enterococcaceae)、赤杆菌科(Erythrobacteraceae)、纤维杆菌科(Fibrobacteraceae)、火色杆菌科(Flammeovirgaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)、弗兰克氏菌科(Frankiaceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、盖勒氏菌科(Gaiellaceae)、芽单胞菌科(Gemmatimonadaceae)、地嗜皮菌科(Geodermatophilaceae)、糖霉菌科(Gly corny cetaceae)、Haliangiaceae、盐单胞菌科(Halomonadaceae)、全孢菌科(Holosporaceae)、生丝微菌科(Hyphomicrobiaceae)、Iamiaceae、间孢囊菌科(Intrasporangiaceae)、动孢囊菌科(Kineosporiaceae)、科里氏菌科(Koribacteraceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、乳酸细菌科(Lactobacillaceae)、军团菌科(Legionellaceae)、钩端螺旋体科(Leptospiraceae)、明串珠菌科(Leuconostocaceae)、甲基杆菌科(Methylobacteriaceae)、甲基孢囊菌科(Methylocystaceae)、嗜甲基菌科(Methylophilaceae)、微杆菌科(Microbacteriaceae)、微球菌科(Micrococcaceae)、小单孢菌科(Micromonosporaceae)、莫拉氏菌科(Moraxellaceae)、分枝杆菌科(Mycobacteriaceae)、支原体科(Mycoplasmataceae)、粘液球菌科(Myxococcaceae)、中村氏菌科(Nakamurellaceae)、奈瑟氏菌科(Neisseriaceae)、亚硝化单胞菌科(Nitrosomonadaceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)、海洋螺菌科(Oceanospirillaceae)、丰佑菌科(Opitutaceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、第三节类芽胞杆菌科(Paenibacillaceae)、副衣原体科(Parachlamydiaceae)、巴斯德菌科(Pasteurellaceae)、扩展杆菌科(Patulibacteraceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、叶杆菌科(Phyllobacteriaceae)、鱼立克次体科(Piscirickettsiaceae)、浮霉菌科(Planctomycetaceae)、动性球菌科(Planococcaceae)、多囊菌科(Polyangiaceae)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、原孢子科(Promicromonosporaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、假诺卡氏科(Pseudonocardiaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、红杆菌科(Rhodobacteraceae)、红螺菌科(Rhodospirillaceae)、玫瑰弯菌科(Roseiflexaceae)、红色杆菌科(Rubrobacteriaceae)、Sandaracinaceae、血杆菌科(Sanguibacteraceae)、腐螺旋菌科(Saprospiraceae)、慢反应脂肪酸菌科(Segniliparaceae)、希瓦氏菌科(Shewanellaceae)、华杆菌科(Sinobacteraceae)、索利氏菌科(Solibacteraceae)、Solimonadaceae、土壤红杆菌科(Solirubrobacteraceae)、鞘脂杆菌科(Sphingobacteriaceae)、鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、螺原体科(Spiroplasmataceae)、鱼孢菌科(Sporichthyaceae)、第五节芽胞乳杆菌科(Sporolactobacillaceae)、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、链球菌科(Streptococcaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)、互营杆菌科(Syntrophobacteraceae)、韦荣氏菌科(Veillonellaceae)、疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)、周蝶菌科(Weeksellaceae)、黄色杆菌科(Xanthobacteraceae)或黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)。
在又另一个方面,本文提供了一种增加昆虫(例如,植物的昆虫共生体)的适应度的方法,其中该方法包括向该昆虫递送包含多个PMP的PMP组合物(例如,本文描述的PMP组合物)。在一些情况下,昆虫是植物授粉者。例如,昆虫可以是膜翅目属或双翅目属。在一些情况下,膜翅目属的昆虫是蜜蜂。在其他情况下,双翅目属的昆虫是蝇。
在一些情况下,由于施用PMP组合物,共生体适应度的增加可表现为共生体生理学的改善(例如,健康或存活改善)。在一些情况下,与未递送PMP组合物的共生体相比,生物体的适应度可以通过一种或多种参数来测量,该一种或多种参数包括但不限于繁殖速率、寿限、移动性、繁殖力、体重、代谢速率或活动、或存活。例如,相比于未施用PMP组合物的共生体生物体,本文提供的方法或组合物可有效改善共生体的总体健康或改善共生体的总体存活。在一些情况下,相对于参考水平(例如,在未接受PMP组合物的共生体中发现的水平),共生体的存活增加大约2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、或大于100%。在一些情况下,与未施用PMP组合物的共生体生物体相比,这些方法和组合物有效增加共生体繁殖(例如,繁殖速率)。在一些情况下,相对于参考水平(例如,在未接受PMP组合物的共生体中发现的水平),这些方法和组合物有效地将其他生理参数(诸如移动性、体重、寿限、繁殖力、或代谢速率)增加约2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、或大于100%。
在一些情况下,与未施用PMP组合物的共生体生物体相比,生物体适应度的增加可表现为该生物体进行的所希望的活动(例如,授粉、捕食有害生物、种子传播、或废物或有机材料分解)的频率或功效的增加。在一些情况下,相对于参考水平(例如,在未接受PMP组合物的共生体中发现的水平),本文提供的方法和组合物可以有效地将该共生体进行所希望的活动(例如,授粉、捕食有害生物、种子传播、或废物或有机材料分解)的频率或功效增加约2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、或大于100%。
在一些情况下,与未施用PMP组合物的共生体生物体相比,该共生体适应度增加可表现为在该共生体中一种或多种营养物(例如,维生素、碳水化合物、氨基酸、或多肽)生产的增加。在一些情况下,相对于参考水平(例如,在未接受PMP组合物的共生体中发现的水平),本文提供的方法或组合物可以有效地将共生体中的营养物(例如,维生素、碳水化合物、氨基酸、或多肽)的生产增加约2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、或大于100%。在一些情况下,本文提供的方法或组合物可通过增加共生体中一种或多种微生物(例如,内共生体)产生或代谢的营养物来增加相关植物中的营养物。
在一些情况下,与未施用PMP组合物的共生体生物体相比,共生体适应度的增加可以表现为共生体对杀有害生物剂的敏感性的降低和/或共生体对杀有害生物剂的抗性的增加。在一些情况下,相对于参考水平(例如,在未接受PMP组合物的共生体中发现的水平),本文提供的方法或组合物可以有效地将共生体对杀有害生物剂的敏感性降低约2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、或大于100%。
在一些情况下,与未施用PMP组合物的共生体生物体相比,共生体适应度的增加可表现为该共生体对化感剂的敏感性的降低和/或该共生体对化感剂的抗性的增加。在一些情况下,相对于参考水平(例如,在未接受PMP组合物的共生体中发现的水平),本文提供的方法或组合物可以有效地将共生体对化感剂的抗性增加约2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、或大于100%。在一些情况下,化感剂是咖啡因、大豆半胱氨酸蛋白酶抑制剂N、单萜类、二萜酸、或酚类化合物。在一些情况下,本文提供的方法和组合物可通过增加共生体将化感剂代谢或降解为可用底物的能力来降低共生体对化感剂的敏感性。
在一些情况下,与未施用PMP组合物的共生体生物体相比,本文提供的方法或组合物可以有效地增加共生体对寄生生物或病原体(例如,真菌的、细菌的、或病毒的病原体或寄生螨(例如,蜜蜂中的狄斯瓦螨(Varroa destructor))的抗性。在一些情况下,相对于参考水平(例如,在未接受PMP组合物的共生体中发现的水平),本文提供的方法或组合物可以有效地将共生体对病原体或寄生生物(例如,真菌病原体、细菌病原体或病毒病原体;或者寄生螨(例如,蜜蜂中的狄斯瓦螨(Varroa destructor))的抗性增加约2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、或大于100%。
在一些情况下,与未施用PMP组合物的共生体生物体相比,共生体适应度增加可表现为其他适应度优点,如对某些环境因素(例如,高温或低温耐受性)的耐受性提高、在某些生境中的存活能力提高、或维持某种饲料的能力提高(例如,代谢大豆和玉米的能力提高)。在一些情况下,本文提供的方法和组合物可以以本文描述的多种方式中的任一种来有效增加共生体适应度。此外,PMP组合物可以增加任何数量的共生体纲、目、科、属、或物种(例如,1个共生体物种、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、200、250、500、或更多个共生体物种)中的共生体适应度。在一些情况下,PMP组合物作用于单一共生体纲、目、科、属、或物种。
可以使用本领域的任何标准方法来评估共生体适应度。在一些情况下,可以通过评价单独的共生体来评估共生体适应度。可替代地,可以通过评价共生体群体来评估共生体适应度。例如,共生体适应度增加可表现为与其他昆虫的成功竞争的增加,从而导致该共生体群体的规模增加。
本文进一步描述了可以用本发明的组合物或相关方法处理的植物共生体的实例。
i.真菌
PMP组合物和相关方法可以用于增加真菌(例如,植物的内共生体的真菌(例如,菌根真菌))的适应度。
在一些情况下,真菌属于以下科:曲霉科、角担菌科、Coniochaetaceae、虫草菌科、伏革菌科、Cystofilobasidiaceae、小戴卫霉科、德巴利酵母科、排腔科、白粉菌科、线黑粉菌科、小丛壳科、齿菌科、肉座菌科、小球腔菌科、蒙塔腔菌科、被孢霉科、小球腔菌科、丛赤壳科、圆盘菌科、暗球腔菌科、孢菌科、假散囊菌科、根霉科、核盘菌科、韧革菌科、或发菌科。
在一些情况下,真菌是具有与植物的根缔合的菌根(例如,外生菌根或内生菌根)的真菌,包括属于球囊菌门(Glomeromycota)、担子菌门(Basidiomycota)、子囊菌门(Ascomycota)或接合菌门(Zygomycota)的真菌。
ii.细菌
PMP组合物和相关方法可以用于增加细菌(例如,植物的内共生体的细菌(例如,固氮细菌))的适应度。
例如,细菌可以是食酸菌属(Acidovorax)、农杆菌属、芽孢杆菌属、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、短小杆菌属(Curtobacterium)、肠杆菌属(Enterobacter)、埃希氏杆菌属(Escherichia)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、泛菌属(Pantoea)、假单胞菌属(Pseudomonas)、青枯菌属(Ralstonia)、根瘤菌属(Rhizobium)、糖杆菌属(Saccharibacillus)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)或寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)。
在一些情况下,细菌属于以下科:醋杆菌科、酸杆菌科、热酸菌科、气球菌科、产碱菌科、第二节脂环酸芽胞杆菌科、交替单胞菌科、厌氧绳菌科、橙单胞菌科、芽孢杆菌科、噬菌弧菌科、蛭弧菌科、慢生根瘤菌科、短杆菌科、布鲁氏菌科、伯克氏菌科、Carboxydocellaceae、柄杆菌科、纤维素单胞菌科、噬几丁质菌科、着色菌科、西索恩氏菌科、Chthonomonadaceae、梭菌科、丛毛单胞菌科、棒状杆菌科、克斯体科、蟑螂杆状体科、圆杆菌科、噬纤维菌科、异常球菌科、皮杆菌科、皮生球菌科、肠杆菌科、肠球菌科、赤杆菌科、纤维杆菌科、火色杆菌科、黄杆菌科、弗兰克氏菌科、梭杆菌科、盖勒氏菌科、芽单胞菌科、地嗜皮菌科、糖霉菌科、Haliangiaceae、盐单胞菌科、全孢菌科、生丝微菌科、Iamiaceae、间孢囊菌科、动孢囊菌科、科里氏菌科、毛螺菌科、乳酸细菌科、军团菌科、钩端螺旋体科、明串珠菌科、甲基杆菌科、甲基孢囊菌科、嗜甲基菌科、微杆菌科、微球菌科、小单孢菌科、莫拉氏菌科、分枝杆菌科、支原体科、粘液球菌科、中村氏菌科、奈瑟氏菌科、亚硝化单胞菌科、诺卡氏菌科、类诺卡氏菌科、海洋螺菌科、丰佑菌科、草酸杆菌科、第三节类芽胞杆菌科、副衣原体科、巴斯德菌科、扩展杆菌科、消化链球菌科、叶杆菌科、鱼立克次体科、浮霉菌科、动性球菌科、多囊菌科、紫单胞菌科、普雷沃氏菌科、原孢子科、假单胞菌科、假诺卡氏科、根瘤菌科、红杆菌科、红螺菌科、玫瑰弯菌科、红色杆菌科、Sandaracinaceae、血杆菌科、腐螺旋菌科、慢反应脂肪酸菌科、希瓦氏菌科、华杆菌科、索利氏菌科、Solimonadaceae、土壤红杆菌科、鞘脂杆菌科、鞘脂单胞菌科、螺原体科、鱼孢菌科、第五节芽胞乳杆菌科、葡萄球菌科、链球菌科、链霉菌科、互营杆菌科、韦荣氏菌科、疣微菌科、周蝶菌科、黄色杆菌科或黄单胞菌科。
在一些情况下,内共生细菌属于选自由以下组成的组的科:芽孢杆菌科、伯克氏菌科、丛毛单胞菌科、肠杆菌科、黄杆菌科、甲基杆菌科、微杆菌科、类芽孢杆菌科、假单胞菌科、根瘤菌科、鞘脂单胞菌科和黄单胞菌科。
在一些情况下,内共生细菌属于选自由以下组成的组的属:食酸菌属、农杆菌属、芽孢杆菌属、伯克霍尔德氏菌属、金黄杆菌属、短小杆菌属、肠杆菌属、埃希氏杆菌属、甲基杆菌属、类芽孢杆菌属、泛菌属、假单胞菌属、青枯菌属、糖杆菌属、鞘氨醇单胞菌属和寡养单胞菌属。
iii.昆虫
PMP组合物和相关方法可以用于增加昆虫(例如,对植物有益的昆虫)的适应度。术语昆虫包括在任何发育阶段(即,未成熟昆虫和成虫昆虫)的属于节肢动物门以及属于昆虫纲(Insecta)或蛛形纲(Arachnida)的任何生物体。例如,宿主可以包括在农业应用中使用的昆虫(包括有助于作物的授粉、传播种子或有害生物控制的昆虫)。
在一些情况下,宿主有助于植物授粉(例如,蜂、甲虫、黄蜂、蝇、蝴蝶或蛾)。在一些情况下,有助于植物授粉的宿主是蜂。在一些情况下,蜂属于以下科:地花蜂科(Andrenidae)、蜜蜂科(Apidae)、分舌花蜂科(Colletidae)、隧蜂科(Halictidae)、或切叶蜂科(Megachilidae)。在一些实例中,有助于植物授粉的宿主是甲虫。在具体情况下,PMP组合物可以用于增加蜜蜂的适应度。
在一些情况下,有助于植物授粉的宿主是甲虫,例如,吉丁虫科(Buprestidae)、花萤科(Cantharidae)、天牛科(Cerambycidae)、叶甲科(Chrysomelidae)、郭公虫科(Cleridae)、瓢虫科(Coccinellidae)、叩甲科(Elateridae)、长朽木甲科(Melandryidae)、芫菁科(Meloidae)、拟花萤科(Melyridae)、花蚤科(Mordellidae)、露尾甲科(Nitidulidae)、拟天牛科(Oedemeridae)、金龟子科(Scarabaeidae)、或隐翅虫科(Staphyllinidae)。
在一些情况下,有助于植物授粉的宿主是蝴蝶或蛾(例如,鳞翅目)。在一些情况下,蝴蝶或蛾是以下科中的物种:尺蛾科(Geometridae)、蝶科(Hesperiidae)、灰蝶科(Lycaenidae)、夜蛾科(Noctuidae)、蛱蝶科(Nymphalidae)、凤蝶科(Papilionidae)、粉蝶科(Pieridae)、或天蛾科(Sphingidae)。
在一些情况下,有助于植物授粉的宿主是蝇(例如,双翅目)。在一些情况下,蝇属于以下科:花蝇科(Anthomyiidae)、毛蚊科(Bibionidae)、蜂虻科(Bombyliidae)、丽蝇科(Calliphoridae)、瘿蚊科(Cecidomiidae)、Certopogonidae、Chrionomidae、眼蝇科(Conopidae)、蚊科(Culicidae)、长足虻科(Dolichopodidae)、舞虻科(Empididae)、水蝇科(Ephydridae)、尖翅蝇科(Lonchopteridae)、蝇科(Muscidae)、菌蚊科(Mycetophilidae)、蚤蝇科(Phoridae)、蚋科(Simuliidae)、水虻科(Stratiomyidae)、或食蚜蝇科(Syrphidae)。
在一些情况下,有助于授粉的宿主是蚂蚁(例如,蚁科(Formicidae))、叶蜂(例如,叶蜂科(Tenthredinidae))、或黄蜂(wasp)(例如,泥蜂科(Sphecidae)或胡蜂科(Vespidae))。
D.递送至动物病原体
本文提供了通过使病原体与PMP组合物接触而将PMP组合物例如,根据本文的方法或生物反应器制造的)递送至动物(例如,人)病原体(例如,本文所公开的病原体)的方法。如本文所用,术语“病原体”是指通过以下方式引起动物的疾病或疾病症状的生物体,诸如微生物或无脊椎动物:例如(i)直接感染动物,(ii)产生引起动物的疾病或疾病症状的因子(例如,产生病原体毒素等的细菌),和/或(iii)引发动物的免疫(例如,炎症反应)(例如,咬昆虫(biting insect),例如臭虫)。如本文所用,病原体包括但不限于细菌、原生动物、寄生生物、真菌、线虫、昆虫、类病毒和病毒、或其任何组合,其中每种病原体能够(自身或与另一种病原体共同)引发动物(例如,人)的疾病或症状。
在一些情况下,可以用未负载的PMP处理动物(例如,人)病原体。在其他情况下,PMP包括异源功能剂,例如,异源治疗剂(例如,抗细菌剂、抗真菌剂、杀昆虫剂、杀线虫剂、抗寄生生物剂、抗病毒剂或驱避剂)。方法可以用于降低动物病原体的适应度,例如作为递送PMP组合物的结果以预防或处理病原体感染或控制病原体的扩散。
可以根据本文描述的方法靶向的病原体的实例包括细菌(例如,链球菌属物种、肺炎球菌属物种、假单胞菌属物种、志贺氏菌属物种、沙门氏菌属物种、弯曲杆菌属物种或埃希氏杆菌属物种)、真菌(酵母属物种或念珠菌属物种)、寄生昆虫(例如,臭虫属物种)、寄生线虫(例如,Heligmosomoides属物种)、或寄生原生动物(例如,滴虫病(Trichomoniasis)物种)。
例如,本文提供了一种降低病原体的适应度的方法,该方法包括向该病原体递送本文描述的PMP组合物,其中相对于未处理的病原体,该方法降低该病原体的适应度。在一些实施例中,方法包括将组合物递送至其中病原体生长、生活、繁殖、进食或侵染的至少一个生境。在本文描述的方法的一些情况下,将组合物作为病原体可食用组合物递送,以被该病原体摄食。在本文描述的方法的一些情况下,将组合物以液体、固体、气雾剂、糊剂、凝胶或气体的形式递送(例如,至病原体)。
本文还提供了一种降低寄生昆虫的适应度的方法,其中该方法包括向该寄生昆虫递送包含多个PMP的PMP组合物。在一些情况下,该方法包括向该寄生昆虫递送包含多个PMP的PMP组合物,其中该多个PMP包含杀昆虫剂。例如,寄生昆虫可以是臭虫。本文提供了寄生昆虫的其他非限制性实例。在一些情况下,相对于未处理的寄生昆虫,该方法降低该寄生昆虫的适应度
本文另外提供了一种降低寄生线虫的适应度的方法,其中该方法包括向该寄生线虫递送包含多个PMP的PMP组合物。在一些情况下,该方法包括向该寄生线虫递送包含多个PMP的PMP组合物,其中该多个PMP包含杀线虫剂。例如,寄生线虫是多形螺旋线虫(Heligmosomoides polygyrus)。本文提供了寄生线虫的其他非限制性实例。在一些情况下,相对于未处理的寄生线虫,该方法降低该寄生线虫的适应度。
本文进一步提供了一种降低寄生原生动物的适应度的方法,其中该方法包括向该寄生原生动物递送包含多个PMP的PMP组合物。在一些情况下,该方法包括向该寄生原生动物递送包含多个PMP的PMP组合物,其中该多个PMP包含抗寄生生物剂。例如,寄生原生动物可以是阴道毛滴虫(T.vaginalis)。本文提供了寄生原生动物的其他非限制性实例。在一些情况下,相对于未处理的寄生原生动物,该方法降低该寄生原生动物的适应度。
作为递送PMP组合物的结果的病原体适应度的降低可以以许多种方式表现。在一些情况下,作为递送PMP组合物的结果,病原体适应度的降低可以表现为病原体的生理学的劣化或下降(例如,健康或存活降低)。在一些情况下,与未施用PMP组合物的病原体相比,生物体的适应度可以通过一种或多种参数来测量,该一种或多种参数包括但不限于繁殖速率、生育力、寿限、生存力、移动性、繁殖力、病原体发育、体重、代谢速率或活动、或存活。例如,本文提供的方法或组合物可以有效降低病原体的总体健康或降低病原体的总体存活。在一些情况下,相对于参考水平(例如,在未接受PMP组合物的病原体中发现的水平),病原体的存活降低大约2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、或大于100%。在一些情况下,与未施用PMP组合物的病原体相比,这些方法和组合物有效降低病原体繁殖(例如,繁殖速率、生育力)。在一些情况下,相对于参考水平(例如,在未接受PMP组合物的病原体中发现的水平),这些方法和组合物有效地将其他生理参数(诸如移动性、体重、寿限、繁殖力、或代谢速率)降低约2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、或大于100%。
在一些情况下,与未递送PMP组合物的病原体相比,有害生物适应度的降低可以表现为病原体对抗病原体剂的敏感性的增加和/或病原体对抗病原体剂的抗性的降低。在一些情况下,相对于参考水平(例如,在未接受PMP组合物的有害生物中发现的水平),本文提供的方法或组合物可以有效地将病原体对杀有害生物剂的敏感性增加约2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、或大于100%。
在一些情况下,与未递送PMP组合物的病原体相比,病原体适应度的降低可表现为其他适应度劣势,诸如对某些环境因素的耐受性(例如,高温或低温耐受性)降低、在某些生境中存活的能力降低、或维持某种饮食的能力降低。在一些情况下,本文提供的方法或组合物可以以本文描述的任何多种方式有效降低病原体适应度。此外,PMP组合物可以降低任何数量的病原体纲、目、科、属、或物种(例如,1个病原体物种、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、200、250、500、或更多个病原体物种)中的病原体适应度。在一些情况下,PMP组合物作用于单一有害生物纲、目、科、属、或物种。
可以使用本领域的任何标准方法来评估病原体适应度。在一些情况下,可以通过评价单独的病原体来评估有害生物适应度。可替代地,可以通过评价病原体群体来评估有害生物适应度。例如,病原体适应度的降低可表现为与其他病原体的成功竞争的降低,从而导致病原体群体规模的减小。
本文描述的PMP组合物和相关方法可用于降低动物病原体的适应度并且从而处理或预防动物的感染。本文进一步描述了可以用本发明的组合物或相关方法处理的动物病原体或其媒介的实例。
i.真菌
PMP组合物和相关方法可以用于降低真菌的适应度,例如以预防或处理动物中的真菌感染。包括用于将通过使真菌与PMP组合物接触而将PMP组合物递送至真菌的方法。另外地或可替代地,该方法包括通过向该动物施用PMP组合物来预防或处理处于真菌感染(例如,由本文描述的真菌引起的)风险的动物或有需要的动物的真菌感染。
PMP组合物和相关方法适用于处理或预防动物的真菌感染,包括由真菌引起的感染,该真菌属于子囊菌门(尖孢镰孢、杰氏肺囊虫(Pneumocystis jirovecii)、曲霉属物种、粗球孢子菌/波萨达斯球孢子菌(Coccidioides immitis/posadasii)、白色念珠菌(Candida albicans))、担子菌门(新型线黑粉菌(Filobasidiella neoformans)、毛孢子菌属(Trichosporon))、微孢子门(Microsporidia)(家兔脑胞内原虫(Encephalitozooncuniculi)、肠微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi))、毛霉亚门(Mucoromycotina)(卷枝毛霉(Mucor circinelloides)、稻根霉菌(Rhizopus oryzae)、伞状毛霉菌(Lichtheimiacorymbifera))。
在一些情况下,真菌感染是由属于以下的引起的:子囊菌门、担子菌门、壶菌门(Chytridiomycota)、微孢子门、或接合菌门。真菌感染或过度生长可以包括一种或多种真菌物种,例如白色念珠菌、热带念珠菌(C.tropicalis)、近平滑念珠菌(C.parapsilosis)、光滑念珠菌(C.glabrata)、耳念珠菌(C.auris)、克鲁斯念珠菌(C.krusei)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、球形马拉色菌(Malassezia globose)、限制马拉色菌(M.restricta)、或汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、串珠状赤霉(Gibberellamoniliformis)、甘蓝链格孢菌(Alternaria brassicicola)、新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)、杰氏肺囊虫(P.jirovecii)、鼠源肺囊虫(P.murina)、兔源肺囊虫(P.oryctolagi)、大鼠源肺囊虫(P.wakefieldiae)、和棒曲霉(Aspergillus clavatus)。真菌物种可以被认为是病原体或机会病原体。
在一些情况下,真菌感染是由念珠菌属真菌引起的(即,念珠菌属感染)。例如,念珠菌属感染可以是由念珠菌属真菌引起的,该念珠菌属真菌选自由以下组成的组:人白色念珠菌(C.albicans)、光滑念珠菌、都柏林念珠菌(C.dubliniensis)、克鲁斯念珠菌、耳念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、拟平滑念珠菌(C.orthopsilosis)、吉利蒙念珠菌(C.guilliermondii)、多皱念珠菌(C.rugose)、和葡萄牙念珠菌(C.lusitaniae)。可以通过本文披露的方法处理的念珠菌属感染包括但不限于念珠菌血症、口咽念珠菌病、食管念珠菌病、粘膜念珠菌病、生殖器念珠菌病、外阴阴道念珠菌病、直肠念珠菌病、肝念珠菌病、肾念珠菌病、肺念珠菌病、脾念珠菌病、耳霉菌病、骨髓炎、化脓性关节炎、心血管念珠菌病(例如,心内膜炎)、和侵入性念珠菌病。
ii.细菌
PMP组合物和相关方法可以用于降低细菌的适应度,例如以预防或处理动物中的细菌感染。包括用于将通过使细菌与PMP组合物接触而将PMP组合物施用于细菌的方法。另外地或可替代地,该方法包括通过向该动物施用PMP组合物来预防或处理处于细菌感染(例如,由本文描述的细菌引起的)风险的动物或有需要的动物的细菌感染。
PMP组合物和相关方法适用于预防或处理由下文进一步描述的任何细菌引起的动物的细菌感染。例如,细菌可以是属于以下的细菌:芽孢杆菌目(Bacillales)(炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、金色葡萄球菌(S.aureus)、产单核细胞李斯特菌(L.monocytogenes))、乳酸杆菌目(Lactobacillales)(肺炎链球菌(S.pneumoniae)、酿脓链球菌(S.pyogenes))、梭菌目(Clostridiales)(肉毒棱菌(C.botulinum)、艰难梭菌(C.difficile)、产气荚膜梭菌(C.perfringens)、破伤风梭菌(C.tetani))、螺旋体目(Spirochaetales)(伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、苍白密螺旋体(Treponemapallidum))、衣原体目(Chlamydiales)(沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophila psittaci))、放线菌目(Actinomycetales)(白喉棒状杆菌(C.diphtheriae)、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、鸟分支杆菌(M.avium))、立克次氏体目(Rickettsiales)(普氏立克次氏体(R.prowazekii)、立氏立克次氏体(R.rickettsii)、斑疹伤寒立克次氏体(R.typhi)、嗜吞噬细胞无形体(A.phagocytophilum)、查菲埃立克体(E.chaffeensis))、根瘤菌目(Rhizobiales)(羊布鲁氏杆菌(Brucella melitensis))、伯克霍尔德氏菌目(Burkholderiales)(百日咳博代氏杆菌(Bordetella pertussis)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallei)、类鼻疽伯克霍尔德氏菌(B.pseudomallei))、奈瑟氏菌目(Neisseriales)(淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis))、弯曲菌目(Campylobacterales)(空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori))、军团菌目(Legionellales)(嗜肺军团杆菌(Legionella pneumophila))、假单胞菌目(Pseudomonadales)(鲍曼不动杆菌(A.baumannii)、卡他莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))、气单胞菌目(Aeromonadales)(气单胞菌属物种(Aeromonas sp.))、弧菌目(Vibrionales)(霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus))、硫发菌目(Thiotrichales)、巴斯德氏菌目(Pasteurellales)(流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae))、肠杆菌目(Enterobacteriales)(肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、鼠疫耶尔森菌(Yersiniapestis)、小肠结肠炎耶尔森菌(Y.enterocolitica)、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)、大肠杆菌(E.coli))。
iii.寄生昆虫
PMP组合物和相关方法可以用于降低寄生昆虫的适应度,例如以预防或处理动物中的寄生昆虫感染。术语“昆虫”包括在任何发育阶段(即,未成熟昆虫和成虫昆虫)的属于节肢动物门以及属于昆虫纲(Insecta)或蛛形纲(Arachnida)的任何生物体。包括用于将通过使昆虫与PMP组合物接触而将PMP组合物递送至昆虫的方法。另外地或可替代地,该方法包括通过向该动物施用PMP组合物来预防或处理处于寄生昆虫感染(例如,由本文描述的寄生昆虫引起的)风险的动物或有需要的动物的寄生昆虫感染。
PMP组合物和相关方法适用于预防或处理由寄生昆虫导致的动物感染,包括由属于以下的昆虫导致的感染:虱毛目(Phthiraptera):虱目(Anoplura)(吸虱(Suckinglice))、丝角亚目(Ischnocera)(咀虱(Chewing lice))、钝角亚目(Amblycera)(咀虱)。蚤目(Siphonaptera):蚤科(Pulicidae)(猫蚤(Cat flea))、角叶蚤科(Ceratophyllidae)(鸡蚤(Chicken-flea))。双翅目(Diptera):蚊科(Culicidae)(蚊子)、蠓科(Ceratopogonidae)(蠓(Midge))、毛蠓科(Psychodidae)(蚋(Sandfly))、蚋科(Simuliidae)(黑蝇(Blackfly))、虻科(Tabanidae)(马蝇(Horse-fly))、蝇科(Muscidae)(马蝇等)、丽蝇科(Calliphoridae)(丽蝇(Blowfly))、舌蝇科(Glossinidae)(采采蝇(Tsetse-fly))、狂蝇科(Oestridae)(肤蝇(Bot-fly))、虱蝇科(Hippoboscidae)(虱蝇)。半翅目(Hemiptera):猎蝽科(Reduviidae)(猎蝽(Assassin-bug))、臭虫科(Cimicidae)(臭虫)。蛛形纲(Arachnida):疥螨科(Sarcoptidae)(疥螨(Sarcoptic mite))、痒螨科(Psoroptidae)(痒螨(Psoropticmite))、胞螨科(Cytoditidae)(气囊螨(Air-sac mite))、鸡雏螨属(Laminosioptes)(囊螨(Cyst-mite))、羽螨科(Analgidae)(羽螨(Feather-mite))、粉螨科(Acaridae)(谷螨(Grain-mite))、蠕形螨科(Demodicidae)(毛囊螨(Hair-follicle mite))、姬肉食螨科(Cheyletiellidae)(毛螨(Fur-mite))、恙螨科(Trombiculidae)(恙螨(Trombiculid))、皮刺螨科(Dermanyssidae)(鸟螨(Bird mite))、巨刺螨科(Macronyssidae)(鸟螨)、隐喙蜱科(Argasidae)(软蜱(Soft-tick))、硬蜱科(Ixodidae)(硬蜱(Hard-tick))。
iv.原生动物
PMP组合物和相关方法可以用于降低寄生原生动物的适应度,例如以预防或处理动物中的寄生原生动物感染。术语“原生动物”包括属于原生动物门的任何生物体。包括用于将通过使寄生原生动物与PMP组合物接触而将PMP组合物递送至寄生原生动物的方法。另外地或可替代地,该方法包括通过向该动物施用PMP组合物来预防或处理处于原生动物感染(例如,由本文描述的原生动物引起的)风险的动物或有需要的动物的原生动物感染。
PMP组合物和相关方法适用于预防或处理由动物中的寄生原生动物导致的感染,这些寄生原生动物包括属于以下的原生动物:眼虫门(Euglenozoa)(克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、利什曼原虫属物种(Leishmaniaspp.))、异叶足纲(Heterolobosea)(福氏纳格里阿米巴原虫(Naegleria fowleri))、双滴虫目(Diplomonadida)(肠贾第虫(Giardia intestinalis))、变形虫门(Amoebozoa)(卡氏棘阿米巴(Acanthamoeba castellanii)、狒狒巴拉姆希阿米巴(Balamuthiamandrillaris)、痢疾变形虫(Entamoeba histolytica))、芽囊原虫属(Blastocystis)(人芽囊原虫(Blastocystis hominis))、顶复亚门(Apicomplexa)(微小巴贝虫(Babesiamicroti)、微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、卡耶塔环孢子虫(Cyclosporacayetanensis)、疟原虫属物种(Plasmodium spp.)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii))。
v.线虫
PMP组合物和相关方法可以用于降低寄生线虫的适应度,例如以预防或处理动物中的寄生线虫感染。包括用于将通过使寄生线虫与PMP组合物接触而将PMP组合物递送至寄生线虫的方法。另外地或可替代地,该方法包括通过向该动物施用PMP组合物来预防或处理处于寄生线虫感染(例如,由本文描述的寄生线虫引起的)风险的动物或有需要的动物的寄生线虫感染。
PMP组合物和相关方法适用于预防或处理由动物中的寄生线虫导致的感染,这些寄生线虫包括属于以下的线虫:线虫纲(Nematoda)(蛔虫(roundworm)):广州管圆线虫(Angiostrongylus cantonensis)(鼠肺虫(rat lungworm))、人蛔虫(Ascarislumbricoides)(人类蛔虫(human roundworm))、浣熊贝蛔虫(Baylisascaris procyonis)(浣熊蛔虫(raccoon roundworm))、毛首鞭虫(Trichuris trichiura)(人类鞭虫(humanwhipworm))、螺旋状旋毛形线虫(Trichinella spiralis)、粪类圆线虫(Strongyloidesstercoralis)、班氏吴策线虫(Wuchereria bancrofti)、马来布鲁线虫(Brugia malayi)、十二指肠钩口线虫(Ancylostoma duodenale)和美洲板口线虫(Necator americanus)(人类钩虫(human hookworm))、多节绦虫亚纲(Cestoda)(绦虫(tapeworm)):细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)、多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis)、猪带绦虫(Taenia solium)(猪肉绦虫(pork tapeworm))。
vi.病毒
PMP组合物和相关方法可以用于降低病毒的适应度,例如以预防或处理动物中的病毒感染。包括用于将通过使病毒与PMP组合物接触而将PMP组合物递送至病毒的方法。另外地或可替代地,该方法包括通过向该动物施用PMP组合物来预防或处理处于病毒感染(例如,由本文描述的病毒引起的)风险的动物或有需要的动物的病毒感染。
PMP组合物和相关方法适用于预防或处理动物的病毒感染,包括由属于以下的病毒导致的感染:DNA病毒:细小病毒科(Parvoviridae)、乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)、多瘤病毒科(Polyomaviridae)、痘病毒科(Poxviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae);单链负链RNA病毒:沙粒病毒科(Arenaviridae)、副粘液病毒科(Paramyxoviridae)(腮腺炎病毒(Rubulavirus)、呼吸道病毒(Respirovirus)、肺炎病毒(Pneumovirus)、麻疹病毒(Moribillivirus))、纤丝病毒科(Filoviridae)(马尔堡病毒(Marburgvirus)、埃博拉病毒(Ebolavirus))、波纳病毒科(Bornaoviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、内罗病毒(Nairovirus)、汉坦病毒(Hantaviruses)、正本雅病毒(Orthobunyavirus)、白蛉病毒(Phlebovirus)。单链正链RNA病毒:星状病毒科(Astroviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)(风疹病毒(Rubivirus)、甲病毒(Alphavirus))、黄病毒科(Flaviviridae)(肝炎病毒(Hepacivirus)、黄病毒(Flavivirus))、小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)(肝病毒(Hepatovirus)、鼻病毒(Rhinovirus)、肠病毒(Enterovirus));或dsRNA和逆转录病毒:呼肠孤病毒科(Reoviridae)(轮状病毒(Rotavirus)、科罗拉多蜱传热病毒(Coltivirus)、东南亚十二节段RNA病毒(Seadornavirus))、逆转录病毒科(Retroviridae)(δ逆转录病毒(Deltaretrovirus)、慢病毒(Lentivirus))、肝脱氧核糖核酸病毒科(Hepadnaviridae)(正嗜肝DNA病毒(Orthohepadnavirus))。
E.向病原体媒介的递送
本文提供了通过使病原体媒介与PMP组合物接触而将PMP组合物(例如,根据本文的方法或生物反应器制造的)递送至病原体媒介(如本文所公开的病原体媒介)的方法。如本文所用,术语“媒介”是指可以将动物病原体从贮存器(reservoir)携带或传播给动物的昆虫。示例性媒介包括昆虫,诸如具有刺吸式口器的那些昆虫,如在半翅目(Hemiptera)和一些膜翅目以及双翅目(Diptera)中发现的昆虫,如蚊子、蜜蜂、黄蜂(wasp)、蠓、虱子、采采蝇、跳蚤以及蚁,连同蛛形纲动物(如蜱和螨)的成员。
在一些情况下,可以用未负载的PMP处理动物(例如,人)病原体的媒介。在其他情况下,PMP包括异源功能剂,例如,异源治疗剂(例如,抗细菌剂、抗真菌剂、杀昆虫剂、杀线虫剂、抗寄生生物剂、抗病毒剂或驱避剂)。方法可以用于降低病原体媒介的适应度,例如作为递送PMP组合物的结果以控制病原体的扩散。可以根据本发明方法靶向的病原体媒介的实例包括昆虫,诸如本文描述的那些。
例如,本文提供了一种降低动物病原体媒介的适应度的方法,该方法包括向该媒介递送有效量的本文描述的PMP组合物,其中相对于未处理的媒介,该方法降低该媒介的适应度。在一些情况下,方法包括将组合物递送至其中媒介生长、生活、繁殖、进食或侵染的至少一个生境。在一些情况下,将组合物作为可食用组合物递送,以被该媒介摄食。在一些情况下,媒介是昆虫。在一些情况下,昆虫是蚊子、蜱、螨、或虱子。在一些情况下,将组合物以液体、固体、气雾剂、糊剂、凝胶或气体的形式递送(例如,至病原体媒介)。
例如,本文提供了一种降低动物病原体的昆虫媒介的适应度的方法,其中该方法包括向该媒介递送包含多个PMP的PMP组合物。在一些情况下,该方法包括向该媒介递送包含多个PMP的PMP组合物,其中该多个PMP包含杀昆虫剂。例如,昆虫媒介可以是蚊子、蜱、螨、或虱子。本文提供了病原体媒介的其他非限制性实例。在一些情况下,相对于未处理的媒介,该方法降低该媒介的适应度。
在一些情况下,作为施用组合物的结果,媒介适应度的降低可表现为媒介的生理学的劣化或下降(例如,健康或存活降低)。在一些情况下,与未递送组合物的媒介生物体相比,生物体的适应度可以通过一种或多种参数来测量,该一种或多种参数包括但不限于繁殖速率、寿限、移动性、繁殖力、体重、代谢速率或活动、或存活。例如,本文提供的方法或组合物可以有效地降低媒介的总体健康或降低媒介的总体存活。在一些情况下,相对于参考水平(例如,在未接受组合物的媒介中发现的水平),媒介的存活降低大约2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、或大于100%。在一些情况下,与未递送组合物的媒介生物体相比,这些方法和组合物有效降低媒介繁殖(例如,繁殖速率)。在一些情况下,相对于参考水平(例如,在未递送组合物的媒介中发现的水平),这些方法和组合物有效地将其他生理参数(诸如移动性、体重、寿限、繁殖力、或代谢速率)降低约2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、或大于100%。
在一些情况下,与未递送组合物的媒介生物体相比,媒介适应度的降低可表现为媒介对杀有害生物剂的敏感性的增加和/或媒介对杀有害生物剂的抗性的降低。在一些情况下,相对于参考水平(例如,在未接受组合物的媒介中发现的水平),本文提供的方法或组合物可以有效地将媒介对杀有害生物剂的敏感性增加约2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、或大于100%。杀有害生物剂可以是本领域已知的任何杀有害生物剂,包括杀昆虫剂。在一些情况下,与未递送组合物的媒介相比,本文提供的方法或组合物可以通过降低媒介的将杀有害生物剂代谢或降解成可用底物的能力来增加媒介对杀有害生物剂的敏感性。
在一些情况下,与未递送组合物的媒介生物体相比,媒介适应度的降低可表现为其他适应度劣势,诸如对某些环境因素的耐受性(例如,高温或低温耐受性)降低、在某些生境中存活的能力降低、或维持某种饮食的能力降低。在一些情况下,本文提供的方法或组合物可以以本文描述的任何多种方式有效地降低媒介适应度。此外,组合物可以降低任何数量的媒介纲、目、科、属、或物种(例如,1个媒介物种、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、200、250、500、或更多个媒介物种)中的媒介适应度。在一些情况下,组合物作用于单一媒介纲、目、科、属、或物种。
可以使用本领域的任何标准方法来评估媒介适应度。在一些情况下,可以通过评价单独的媒介来评估媒介适应度。可替代地,可以通过评价媒介群体来评估媒介适应度。例如,媒介适应度的降低可表现为与其他媒介的成功竞争的降低,从而导致媒介群体规模的减小。
通过降低携带动物病原体的媒介的适应度,本文提供的组合物有效减少传播媒介扩散的疾病。可以使用本文描述的任何配制品和递送方法以一定量和持续时间将组合物递送至昆虫,该量和持续时间有效地减少疾病传播(例如,减少媒介之间的垂直或水平传播和/或减少向动物的传播)。例如,与未递送组合物的媒介生物体相比,本文描述的组合物可以使媒介传播的病原体的垂直或水平传播减少约2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、或更多。作为另一个实例,与未递送组合物的媒介生物体相比,本文描述的组合物可以使昆虫媒介的媒介效能减少约2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、或更多。
可通过本文提供的组合物和方法控制的疾病的非限制性实例包括:由披膜病毒科(Togaviridae)病毒(例如,基孔肯雅病、罗斯河热(Ross River fever)、马亚罗病毒、奥绒绒热(Onyon-nyong fever)、辛德毕斯热(Sindbis fever)、东部脑脊髓炎、西方马脑脊髓炎(Wesetern equine encephalomyelitis)、委内瑞拉马脑脊髓炎(Venezualan equineencephalomyelitis)、或巴尔马森林病毒(Barmah forest))引起的疾病;由黄病毒科病毒(例如,登革热、黄热病、凯萨努森林病、鄂木斯克出血热、日本脑炎、墨累山谷脑炎、罗氏(Rocio)、圣路易脑炎(St.Louis encephalitis)、西尼罗河脑炎(West Nileencephalitis)、或蜱传播的脑炎)引起的疾病;由布尼亚病毒科(Bunyaviridae)病毒(例如,白蛉热(Sandly fever)、裂谷热、拉克罗斯脑炎(La Crosse encephalitis)、加州脑炎(California encephalitis)、克里米亚-刚果出血热、或奥罗普切热(Oropouche fever))引起的疾病;由弹状病毒科(Rhabdoviridae)病毒(例如,水泡性口炎)引起的疾病;由Orbiviridae(例如,蓝舌病(Bluetongue))引起的疾病;由细菌(例如,鼠疫、土拉菌病、Q热(Q fever)、落基山斑疹热(Rocky Mountain spotted fever)、鼠型斑疹伤寒、南欧斑疹热(Boutonneuse fever)、昆士兰壁虱斑疹伤寒(Queensland tick typhus)、西伯利亚斑疹伤寒(Siberian tick typhus)、恙虫病、回归热(Relapsing fever)、或莱姆病)引起的疾病;或由原生动物(例如,疟疾、非洲锥虫病、那加那病、查加斯病、利什曼病、梨浆虫病、班氏丝虫病(Bancroftian filariasis)、或布鲁格丝虫病(Brugian filariasis))引起的疾病。
i.病原体媒介
本文提供的方法和组合物可以用于降低动物病原体的媒介的适应度。在一些情况下,媒介可以是昆虫。例如,昆虫媒介可以包括但不限于:具有刺吸式口器的那些昆虫,如在半翅目(Hemiptera)和一些膜翅目(Hymenoptera)以及双翅目(Diptera)中发现的昆虫,如蚊子、蜜蜂、黄蜂、蠓、虱子、采采蝇、跳蚤以及蚁,连同蛛形纲动物(如蜱和螨)的成员;以下的目、纲或科:蜱螨目(蜱和螨),例如隐喙蜱科(Argasidae)、皮刺螨科(Dermanyssidae)、硬蜱科(Ixodidae)、痒螨科(Psoroptidae)或疥螨科(Sarcoptidae)的代表,以及花蜱属物种(Amblyomma spp.)、Anocenton属物种(Anocenton spp.)、锐缘蜱属物种(Argas spp.)、牛蜱属物种(Boophilus spp.)、姬螯螨属物种(Cheyletiella spp.)、足螨属物种(Chorioptes spp.)、蠕形螨属物种(Demodex spp.)、革蜱属物种(Dermacentor spp.)、Denmanyssus属物种(Denmanyssus spp.)、血蜱属物种(Haemophysalis spp.)、璃眼蜱属物种(Hyalomma spp.)、硬蜱属物种(Ixodes spp.)、Lynxacarus属物种(Lynxacarus spp.)、中气门目属物种(Mesostigmata spp.)、耳螨属物种(Notoednes spp.)、钝缘蜱属物种(Ornithodoros spp.)、禽刺螨属物种(Ornithonyssus spp.)、残喙蜱属物种(Otobiusspp.)、耳痒螨属物种(otodectes spp.)、肺刺螨属物种(Pneumonyssus spp.)、螨属物种(Psoroptes spp.)、扇头蜱属物种(Rhipicephalus spp.)、疥螨科疥螨属物种(Sancoptesspp.)、或恙螨属物种(Trombicula spp.)的代表;虱目(Anoplura)(吸虱(sucking lice)和咬虱(biting lice)),例如牛虱属物种(Bovicola spp.)、血虱属物种(Haematopinusspp.)、毛虱属物种(Linognathus spp.)、禽羽虱属物种(Menopon spp.)、虱属物种(Pediculus spp.)、天疱疮属物种(Pemphigus spp.)、根瘤蚜属物种(Phylloxera spp.)、或管虱属物种(Solenopotes spp.)的代表;双翅目(Diptera)(蝇),例如伊蚊属物种(Aedesspp.)、按蚊属物种(Anopheles spp.)、丽蝇属物种(Calliphora spp.)、金蝇属物种(Chrysomyia spp.)、斑虻属物种(Chrysops spp.)、锥蝇属物种(Cochliomyia spp.)、Cw/ex属物种(Cw/ex spp.)、库蠓属物种(Culicoides spp.)、黄蝇属物种(Cuterebra spp.)、皮蝇属物种(Dermatobia spp.)、胃蝇属物种(Gastrophilus spp.)、舌蝇属物种(Glossinaspp.)、血蝇属物种(Haematobia spp.)、麻虻属物种(Haematopota spp.)、虱蝇属物种(Hippobosca spp.)、牛皮蝇属物种(Hypoderma spp.)、绿蝇属物种(Lucilia spp.)、角蝇属物种(Lyperosia spp.)、蜱蝇属物种(Melophagus spp.)、狂蝇属物种(Oestrus spp.)、绿蝇属物种(Phaenicia spp.)、白蛉属物种(Phlebotomus spp.)、伏蝇属物种(Phormiaspp.)、壁虱(Acari)(犬疥螨(sarcoptic mange),例如,疥螨科属物种(Sarcoptidaespp.)、麻蝇属物种(Sarcophaga spp.)、蚋属物种(Simulium spp.)、螫蝇属物种(Stomoxysspp.)、虻属物种(Tabanus spp.)、螗蜩属物种(Tannia spp.)、或Zzpu/alpha属物种(Zzpu/alpha spp.)的代表;食毛目(Mallophaga)(咬虱(biting lice),例如,Damalina属物种(Damalina spp.)、猫羽虱属物种(Felicola spp.)、袋鼠虱属物种(Heterodoxus spp.)、或毛虱属物种(Trichodectes spp.)的代表;或者蚤目(Siphonaptera)(无翅昆虫),例如,角叶蚤属物种(Ceratophyllus spp.)、客蚤属物种(Xenopsylla spp)的代表;臭虫科(Cimicidae)(椿象),例如,臭虫属物种(Cimex spp.)、Tritominae属物种(Tritominaespp.)、Rhodinius属物种(Rhodinius spp.)、或锥蝽属物种(Triatoma spp.)的代表。
在一些情况下,昆虫是来自双翅目(例如,长角亚目(Nematocera),例如,Colicidae科)的吸血昆虫(blood-sucking insect)。在一些情况下,昆虫来自蚊亚科(Culicinae)、短咀蚊亚科(Corethrinae)、蠓科(Ceratopogonidae)、或蚋科(Simuliidae)。在一些情况下,昆虫属于库蚊属物种(Culex spp.)、赛保蚊属物种(Theobaldia spp.)、伊蚊属物种(Aedes spp.)、按蚊属物种(Anopheles spp.)、伊蚊属物种(Aedes spp.)、Forciponiyia属物种(Forciponiyia spp.)、库蠓属物种(Culicoides spp.)、或Helea属物种(Helea spp.)。
在某些情况下,昆虫是蚊子。在某些情况下,昆虫是蜱。在某些情况下,昆虫是螨。在某些情况下,昆虫是咬虱(biting louse)。
F.应用方法
本文描述的植物可以以允许将组合物递送或施用于植物的任何合适方式暴露于本文所述的PMP组合物。PMP组合物可以单独递送或与其他活性(例如,肥料剂)或非活性物质组合递送,并且可以通过例如喷雾、注射(例如,显微注射)、通过植物、倾倒、浸渍,以浓缩液体、凝胶、溶液、悬浮液、喷雾、粉剂、丸剂、块剂、砖剂等(配制成递送有效浓度的PMP组合物)的形式来应用。施用本文描述的组合物的量和位置通常由以下确定:植物的生境、植物可以被PMP组合物靶向的生命周期阶段、进行应用的位点、以及PMP组合物的物理和功能特征。
在一些情况下,通过例如背包喷雾、空中喷雾、作物喷雾/尘剂等将组合物直接喷雾到植物(例如作物)上。在将PMP组合物递送至植物的情况下,接受PMP组合物的植物可以处于植物生长的任何阶段。例如,配制的PMP组合物可以在植物生长的早期阶段以种子包衣或根处理剂的形式或在作物周期的后期阶段以总植物处理剂的形式来应用。在一些情况下,PMP组合物可以以外用剂的形式应用于植物。
此外,可以将PMP组合物(例如,在植物生长的土壤中,或在用于浇灌植物的水中)作为通过植物组织而吸收和分布的内吸剂(systemic agent)应用。在一些情况下,植物或食物生物体可以经遗传转化以表达PMP组合物。
延迟释放或持续释放也可以通过以下方式完成:向PMP组合物或具有一种或多种PMP组合物的组合物包覆可溶解或生物可侵蚀的包衣层(诸如明胶),该包衣层在使用环境中溶解或侵蚀,从而然后使PMP组合物可用,或者通过将药剂分散在可溶解或可侵蚀的基质中。此类持续释放和/或分配装置可以有利地用于始终维持本文描述的一种或多种PMP组合物的有效浓度。
在一些情况下,将PMP组合物递送至植物的部分(例如,叶、种子、花粉、根、果实、芽或花)或组织、细胞、或其原生质体。在一些情况下,将PMP组合物递送至植物的细胞。在一些情况下,将PMP组合物递送至植物的原生质体。在一些情况下,将PMP组合物递送至植物的组织。例如,可以将组合物递送至植物的分生组织(例如,顶端分生组织、侧生分生组织、或居间分生组织)。在一些情况下,将组合物递送至植物的永久组织(例如,简单组织(例如,薄壁组织、厚角组织、或厚壁组织)或复杂的永久组织(例如,木质部或韧皮部))。在一些情况下,将组合物递送至植物胚胎。
在一些情况下,可以建议将PMP组合物以PMP/公顷(g/ha或kg/ha)的量或活性成分(例如,含有或不含异源功能剂的PMP)或酸等效物/公顷(kg a.i./ha或g a.i./ha)的量用于田地应用。在一些情况下,可能需要将在本发明组合物中的较低量的异源功能剂应用于土壤、植物培养基、种子植物组织、或植物以达到与在缺少PMP的组合物中应用异源功能剂的情况下相同的结果。例如,异源功能剂的量可以以比在非PMP组合物中应用的相同异源功能剂(例如直接应用相同异源功能剂而没有PMP)小约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、50、或100倍(或在约2与约100倍之间的任何范围,例如约2至10倍;约5至15倍、约10至20倍;约10至50倍)的水平应用。本发明的PMP组合物可以以各种量/公顷(例如以约0.0001、0.001、0.005、0.01、0.1、1、2、10、100、1,000、2,000、5,000(或在约0.0001与5,000之间的任何范围)kg/ha)来应用。例如,约0.0001至约0.01、约0.01至约10、约10至约1,000、约1,000至约5,000kg/ha。
G.治疗方法
本文描述的PMP组合物可用于多种治疗方法中。例如,方法和组合物可用于预防或治疗动物(例如,人)中的病原体感染。如本文所用,术语“处理”是指为了预防和/或治疗目的而向动物施用药物组合物。“预防感染”是指对尚未患病但易感于特定疾病或在其他方面处于特定疾病风险的动物的预防性处理。“处理感染”是指向已经患有疾病的动物施用处理剂以改善或稳定动物的病症。本发明方法涉及将本文描述的PMP组合物递送至动物,例如人。
例如,本文提供了一种处理具有真菌感染的动物的方法,其中该方法包括向该动物施用有效量的包含多个PMP的PMP组合物。在一些情况下,该方法包括向该动物施用有效量的包含多个PMP的PMP组合物,其中该多个PMP包含抗真菌剂。在一些情况下,抗真菌剂是核酸,该核酸抑制引起该真菌感染的真菌中基因(例如,增强丝状生长蛋白(EFG1))的表达。在一些情况下,真菌感染是由白色念珠菌引起的。在一些情况下,组合物包含从拟南芥属质外体EV产生的PMP。在一些情况下,方法降低或显著消除真菌感染。
在另一个方面,本文提供了一种处理具有细菌感染的动物的方法,其中该方法包括向该动物施用有效量的包含多个PMP的PMP组合物。在一些情况下,该方法包括向该动物施用有效量的包含多个PMP的PMP组合物,并且其中该多个PMP包含抗细菌剂(例如,两性霉素B)。在一些情况下,细菌是链球菌属物种(Streptococcus spp.)、肺炎球菌属物种(Pneumococcus spp.)、假单孢菌属物种(Pseudomonas spp.)、志贺氏菌属物种(Shigellaspp)、沙门氏菌属物种(Salmonella spp.)、弯曲菌属物种(Campylobacter spp.)、或埃希氏杆菌属物种(Escherichia spp.)。在一些情况下,组合物包含从拟南芥属质外体EV产生的PMP。在一些情况下,方法降低或显著消除细菌感染。在一些情况下,动物是人、兽医动物、或牲畜动物。
本发明方法可用于处理动物的感染(例如,如由动物病原体引起的),这是指将处理剂施用于已经患有疾病的动物以改善或稳定动物的病症。这可以涉及使一种或多种病原体在动物中、上或周围的病原体定殖相对于起始量减少(例如,减少约1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或100%)和/或允许个体受益(例如,以足以消释症状的量减少定殖)。在这种情况下,处理的感染可表现为症状的减轻(例如,减轻约1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或100%)。在一些情况下,处理的感染可以有效增加个体存活的可能性(例如,使存活的可能性增加约1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或100%)或增加群体的总体存活(例如,使存活的可能性增加约1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或100%)。例如,组合物和方法可以有效地“基本上消除”感染,这是指感染的减少量足以可持续地消释动物的症状(例如,至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月)。
本发明方法可用于预防感染(例如,如由动物病原体引起的),这是指以足以维持初始病原体群体(例如,近似地在健康个体中发现的量)、预防感染开始和/或预防与感染相关的症状或病症的量预防一种或多种病原体在动物中、上或周围的定殖增加(例如,相对于未处理的动物,约1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、或多于100%)。例如,在准备进行侵入性医疗程序(例如,准备手术,诸如接受移植、干细胞疗法、移植物、假体、接受长期或频繁的静脉内导管插入、或接受在重症监护病房(intensive care unit)中的处理)时、在免疫功能低下的个体(例如,患有癌症、HIV/AIDS、或正在服用免疫抑制剂的个体)中、或在经受长期抗生素疗法的个体中,个体可以接受预防性治疗以预防真菌感染。
PMP组合物可以被配制用于施用或通过合适的方法施用,该合适的方法包括例如,静脉内、肌内、皮下、皮内、经皮、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鞘内、鼻内、阴道内、直肠内、外用、瘤内、经腹膜、结膜下、囊内、经粘膜、心包内、脐内、眼内、眼眶内、口服、外用、透皮、玻璃体内(例如,通过玻璃体内注射)、通过滴眼液、通过吸入、通过注射、通过植入、通过输注、通过连续输注、通过直接局部灌注浸浴靶细胞、通过导管、通过灌洗、在霜剂中、或在脂质组合物中。在本文描述的方法中使用的组合物也可以全身或局部施用。施用方法可以根据不同因素(例如,所施用的化合物或组合物,以及所治疗的病症、疾病或障碍的严重性)而变化。在一些情况下,静脉内、肌内、皮下、外用、口服、透皮、腹膜内、眼眶内、通过植入、通过吸入、鞘内、心室内、或鼻内施用PMP组合物。给药可以通过任何合适的途径进行,例如通过注射,诸如静脉内或皮下注射,部分取决于施用是短暂的还是长期的。本文考虑了各种给药方案,包括但不限于在各个时间点上的单次或多次施用、推注施用、和脉冲输注。
对于本文描述的感染的预防或处理(当单独使用或与一种或多种另外的其他治疗剂组合使用时),将取决于待处理的疾病的类型、疾病的严重性和病程、是否为预防或治疗目的而施用、先前的疗法、患者的临床病史以及对PMP组合物的反应。PMP组合物可以例如一次或经一系列处理施用于患者。对于经若干天或更长的重复施用,取决于病症,通常将持续处理直到出现所希望的对疾病症状的抑制或不再可检测到感染。这样的剂量可以例如每周或每两周间歇地施用(例如,使得患者接受例如约两剂至约二十剂的PMP组合物。可以施用初始较高的负载剂量,然后施用一个或多个较低的剂量。然而,其他剂量方案可能是有用的。通过常规技术和测定容易监测此疗法的进展。
在一些情况下,施用于个体(例如,人)的PMP组合物的量可以在个体的体重的约0.01mg/kg至约5g/kg(例如,约0.01mg/kg-0.1mg/kg、约0.1mg/kg-1mg/kg、约1mg/kg-10mg/kg、约10mg/kg-100mg/kg、约100mg/kg-1g/kg、或约1g/kg-5g/kg)的范围内。在一些情况下,施用于个体(例如,人)的PMP组合物的量是个体的体重的至少0.01mg/kg(例如,至少0.01mg/kg、至少0.1mg/kg、至少1mg/kg、至少10mg/kg、至少100mg/kg、至少1g/kg、或至少5g/kg)。剂量可以以单剂量或以多剂量(例如,2、3、4、5、6、7或多于7剂)施用。在一些情况下,施用于动物的PMP组合物可以单独施用或与另外的治疗剂组合施用。与单一处理相比,可以减少在组合处理中施用的抗体的剂量。通过常规技术容易监测此疗法的进展。
V.试剂盒
本发明还提供了一种试剂盒,该试剂盒包含具有本文描述的PMP组合物的容器。该试剂盒可进一步包括用于根据本发明的方法将PMP组合物应用于或递送至植物的说明材料。本领域技术人员应认识到,用于在本发明的方法中应用PMP组合物的说明书可以是任何形式的说明书。此类说明书包括但不限于书面说明书材料(诸如标签、小册子、手册)、口述说明书材料(诸如在录音带或CD上)或视频说明书(诸如在录像带或DVD上)。
实例
以下是本发明的方法的实例。应理解,鉴于以上提供的一般性描述,可以实践各种其他的实施例。
目录(实例):
实例1:从植物细胞培养基中粗分离植物信使包
此实例描述了各种植物细胞培养基中粗分离植物信使包(PMP)。
实验设计:
a)从烟草BY-2细胞培养基分离PMP
将烟草BY-2(Nicotiana tabacum L cv.Bright Yellow 2;#PC-1181)细胞培养物获得自德国微生物和细胞培养物保藏中心(German Collection of Microorganisms andCell Cultures)(莱布尼茨研究所DSMZ(Leibniz Institute DSMZ),布伦瑞克(Braunschweig),德国)。将细胞在黑暗中于26℃,在振荡器上以130rpm,在包含补充有30g/L蔗糖、2.0mg/L磷酸二氢钾、0.1g/L肌醇、0.2mg/L 2,4-二氯苯氧基乙酸、和1mg/L硫胺素HCl的MS盐的MS(Murashige和Skoog,1962)BY-2培养基(pH 5.8)中进行培养。将BY-2细胞每周通过将5%(v/v)的7日龄细胞培养物转移到100mL新鲜液体培养基中进行传代培养。72-96小时后,收集BY-2培养基并且在4℃下以300g离心10分钟以除去细胞。收集含有PMP的上清液,并且通过在0.85μm过滤器上过滤来清除碎片。如实例2所描述的纯化PMP。
b)从大豆细胞培养基分离PMP
大豆(大豆(Glycine max(L.)Merr.)栽培品种Mandarin;#PC-1026)细胞培养物获得自德国微生物和细胞培养物保藏中心(莱布尼茨研究所DSMZ,德国)。将细胞在黑暗中于23℃,在振荡器上以100rpm,在B5培养基(pH 5.5)中进行培养,该培养基由具有维生素的1XB5 Gamborg盐(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)G5893)、20g/L蔗糖(西格玛奥德里奇公司)和2mg/L 2,4-二氯苯氧基乙酸组成。所有试剂均购自西格玛奥德里奇公司。将大豆细胞每周通过将20%(v/v)的7日龄细胞培养物转移到100mL新鲜液体培养基中进行传代培养。72-96小时后,收集大豆培养基并且在4℃下以300g离心10分钟以除去细胞。收集含有PMP的上清液,并且通过在0.85μm过滤器上过滤来清除碎片。如实例2所描述的纯化PMP。
c)从玉米细胞培养基分离PMP
黑色墨西哥甜玉米细胞系(BMS;玉蜀黍(Zea mays);CCL84842)获得自拟南芥生物资源中心(Arabidopsis Biological Resource Center)(ABRC,美国)。将细胞在黑暗中于23℃,在振荡器上以100rpm,在MS培养基(pH 5.8)中进行培养,该培养基由4.3g/L MS盐(西格玛奥德里奇公司M5524)、30g/L蔗糖和2mg/mL 2,4-二氯苯氧基乙酸组成。所有试剂均购自西格玛奥德里奇公司。将BMS细胞每周通过将20%(v/v)的7日龄细胞培养物转移到100mL新鲜液体培养基中进行传代培养。72-96小时后,收集BMS培养基并且在4℃下以300g离心10分钟以除去细胞。收集含有PMP的上清液,并且通过在0.85μm过滤器上过滤来清除碎片。如实例2所描述的纯化PMP。
d)从小麦细胞培养基分离PMP
小麦(小麦(Triticum aestivum);#PC-998)细胞培养物获得自德国微生物和细胞培养物保藏中心(莱布尼茨研究所DSMZ,德国)。将细胞在黑暗中于23℃,在振荡器上以100rpm,在B5培养基(pH 5.5)中进行培养,该培养基由具有维生素的1X B5 Gamborg盐(西格玛奥德里奇公司G5893)、20g/L蔗糖(西格玛奥德里奇公司)和2mg/L 2,4-二氯苯氧基乙酸组成。所有试剂均购自西格玛奥德里奇公司。将小麦细胞通过将20%(v/v)的14日龄细胞培养物转移到100mL新鲜液体培养基中进行传代培养。72-96小时后,收集小麦培养基并且在4℃下以300g离心10分钟以除去细胞。收集含有PMP的上清液,并且通过在0.85μm过滤器上过滤来清除碎片。如实例2所描述的纯化PMP。
e)从柚子细胞培养基分离PMP
柚子(Citrus decumana(L.)L.栽培品种White Marsh;#PC-44)细胞培养物获得自德国微生物和细胞培养物保藏中心(莱布尼茨研究所DSMZ,布伦瑞克,德国)。将细胞在黑暗中于23℃,在振荡器上以100rpm,在LS培养基(pH 6)中进行培养,该培养基由1650mg/L NH
f)从葡萄细胞培养基分离EV
葡萄(葡萄(Vitis vinifera);#PC-1137)细胞培养物获得自德国微生物和细胞培养物保藏中心(莱布尼茨研究所DSMZ,布伦瑞克,德国)。将细胞在黑暗中于23℃,在振荡器上以100rpm,在B5培养基(pH 5.5)中进行培养,该培养基由具有维生素的1X B5 Gamborg盐(西格玛奥德里奇公司G5893)、20g/L蔗糖(西格玛奥德里奇公司)和2mg/L 2,4-二氯苯氧基乙酸组成。所有试剂均购自西格玛奥德里奇公司。将葡萄细胞通过将20%(v/v)的14日龄细胞培养物转移到100mL新鲜液体培养基中进行传代培养。72-96小时后,收集葡萄培养基并且在4℃下以300g离心10分钟以除去细胞。收集含有PMP的上清液,并且通过在0.85μm过滤器上过滤来清除碎片。如实例2所描述的纯化PMP。
实例2:纯化的植物信使包(PMP)的生产
此实例描述了使用超滤与尺寸排阻色谱法(密度梯度(碘克沙醇或蔗糖))的组合并且通过沉淀或尺寸排阻色谱法除去聚集体如实例1所描述从粗PMP级分生产纯化的PMP。
实验设计:
a)使用超滤与尺寸排阻色谱法的组合纯化BY-2PMP
使用100-kDA截留分子量(MWCO)Amicon旋转过滤器(默克密理博公司(MerckMillipore))浓缩来自实例1a的粗BY-2PMP级分。随后,将浓缩的粗PMP溶液负载到PURE-EV尺寸排阻色谱柱(HansaBioMed生命科学公司(HansaBioMed Life Sciences Ltd))上,并且根据制造商的说明进行分离。洗脱后合并纯化的含有PMP的级分。任选地,可以使用100kDaMWCO Amicon旋转过滤器或通过切向流过滤(TFF)进一步浓缩PMP。如实例3所描述的分析纯化的PMP。
b)使用碘克沙醇梯度纯化BMS PMP
如实例1a中所描述的分离粗BMS PMP,并且通过使用碘克沙醇梯度生产PMP,如在Rutter和Innes,Plant Physiology.[植物生理学]2016中所描述。为了制备不连续的碘克沙醇梯度(OptiPrep;西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)),通过将60%OptiPrep储备水溶液稀释在囊泡分离缓冲剂(VIB;20mM MES和0.1M NaCl,pH 6)中来产生40%(v/v)、20%(v/v)、10%(v/v)和5%(v/v)碘克沙醇的溶液。通过使3mL 40%溶液、3mL 20%溶液、3mL10%溶液和2mL 5%溶液分层形成梯度。将来自实例1a的粗PMP溶液在4℃下以40,000g离心60min。将沉淀物重悬于0.5mL的VIB中并且在梯度顶部上分层。在4℃下以100,000g进行离心17h。弃去梯度的顶部的前4.5mL,并且随后收集3体积的含有质外体PMP的0.7mL,用VIB补足至3.5mL,并且在4℃下以100,000g离心60min。将沉淀物用3.5mL的VIB洗涤,并且在相同的离心条件下再沉淀。将纯化的PMP沉淀物合并用于后续分析,如实例3所描述。
c)使用蔗糖梯度纯化小麦细胞培养物PMP
如实例1中所描述的分离粗小麦细胞培养物PMP,以150,000g离心90min,并且然后将含有PMP的沉淀物重悬于1mL PBS中,如Mu等人,Molecular Nutrition&Food Research.[分子营养与食物研究]2014所描述。将重悬的沉淀物转移至蔗糖步进梯度(8%/15%/30%/45%/60%)并且以150,000g离心120min以产生纯化的PMP。从30%/45%界面收获纯的小麦细胞培养物PMP,并且随后分析,如实例3中所描述。
d)从分离的BY-2PMP中除去聚集体
为了从如实例1中所描述的粗BY-2PMP中或来自实例2a-2c的纯化的PMP中除去蛋白质聚集体,可以包括另外的纯化步骤。使粗或纯的PMP溶液经过一系列pH值,以使蛋白质聚集体沉淀在溶液中。通过添加氢氧化钠或盐酸将pH调节至3、5、7、9和11。使用校准的pH探针测量pH。一旦溶液处在指定的pH,就将其过滤以除去微粒。可替代地,可以使用如Polymin-P或Praestol 2640的带电聚合物的添加将PMP溶液絮凝。简而言之,将2-5g/LPolymin-P或Praestol 2640添加到溶液中并且与叶轮混合。然后将溶液过滤以除去微粒。可替代地,通过增加盐浓度来增溶聚集体。将NaCl添加到PMP溶液中,直到它处于1mol/L。然后将溶液过滤以产生PMP。可替代地,通过增加温度来增溶聚集体。将PMP溶液在混合下加热,直至其达到50℃的均匀温度持续5分钟。然后将PMP混合物过滤以分离PMP。可替代地,可溶性污染物通过使用尺寸排阻色谱柱根据标准程序从PMP溶液中分离,其中PMP洗脱在第一级分中,而蛋白质和核糖核蛋白以及一些脂蛋白则随后洗脱。蛋白质聚集体去除的效率通过在去除蛋白质聚集体之前和之后经由二喹啉甲酸测定法(BCA)/Bradford蛋白质定量测量和比较蛋白质浓度来确定。如实例3所描述的分析纯化的PMP。
实例3:植物信使包表征
此实例描述了如实例2中所描述纯化的PMP的表征。
实验设计:
a)确定PMP浓度
根据制造商的说明,通过使用NanoFCM的高灵敏度流式细胞术、或使用MalvernNanoSight的纳米颗粒跟踪分析(NTA)、或通过使用iZon qNano的可调电阻脉冲传感(TRPS)确定PMP颗粒浓度。通过使用DC蛋白质测定(Bio-Rad)确定纯化的PMP的蛋白质浓度。使用荧光亲脂性染料(如DiOC6(ICN生物医学公司(ICN Biomedicals)))确定纯化的PMP的脂质浓度,如Rutter和Innes,Plant Physiol.[植物生理学]2017所描述。简而言之,将来自实例2的纯化的PMP沉淀物重悬于100mL用MES缓冲剂(20mM MES,pH 6)加1%植物蛋白酶抑制剂混合物(西格玛奥德里奇公司)和2mM 2,29-联吡啶二硫化物稀释的10mM DiOC6(ICN生物医学公司)。将重悬的PMP在37℃下孵育10min,用3mL MES缓冲剂洗涤,再沉淀(40,000g,60min,在4℃下),并且然后重悬于新鲜的MES缓冲剂中。在485nm激发和535nm发射下测量DiOC6荧光强度。
b)PMP的生物物理学和分子表征
根据来自以下文献的方案,在JEOL 1010透射电子显微上通过电子和低温电子显微镜术表征PMP:Wu等人,Analyst.[分析者]2015。根据制造商的说明,通过高灵敏度流式细胞术(NanoFCM)、Malvern NanoSight或iZon qNano确定PMP的大小,并且使用MalvernZetasizer或iZon qNano测量PMP的ζ电位。使用氯仿萃取从PMP中分离脂质,并且用LC-MS/MS进行表征,如Xiao等人Plant Cell.[植物细胞],2010所证实。萃取和纯化糖基肌醇磷酸神经酰胺(GIPC),如Cacas等人,Plant Physiology.[植物生理学]2016所描述,并且通过如上所描述的LC-MS/MS进行分析。根据说明,使用来自赛默飞世尔公司(Thermo Fisher)的Quant-It试剂盒对总RNA、DNA和蛋白质进行表征。根据以下文献中的方案,通过LC-MS/MS对PMP上的蛋白质进行表征:Rutter和Innes,Plant Physiology[植物生理学],2016。使用Trizol提取RNA和DNA,用来自依诺米那公司(Illumina)的具有Ribo-Zero植物试剂盒和Nextera配对文库制备型试剂盒(Nextera Mate Pair Library Prep Kit)的TruSeq总RNA制备成文库,并且根据制造商的说明在Illumina MiSeq上测序。
实例4:植物信使包稳定性的表征
此实例描述了在许多种储存和生理条件下测量PMP的稳定性。
实验设计:
使如实例1和2所描述产生的PMP经受各种条件。将PMP悬浮在水、5%蔗糖或PBS中,并且在-20℃、4℃、20℃、和37℃下放置1、7、30和180天。也将PMP悬浮在水中,并且使用旋转蒸发仪系统干燥,并且分别在4℃、20℃、和37℃下放置1、7、30和180天。也将PMP悬浮在水或5%蔗糖溶液中,在液氮中速冻并且冻干。在1、7、30和180天后,然后将干燥且冻干的PMP重悬于水中。还将在温度高于0℃的条件下进行的前三个实验暴露在人造阳光模拟器中,以便确定模拟室外紫外线条件下的含量稳定性。还使PMP经受在添加或不添加1单位胰蛋白酶的pH为1、3、5、7和9缓冲溶液中或在其他模拟胃液中在37℃、40℃、45℃、50℃、和55℃的温度下持续1、6和24小时。
在这些处理的每个之后,使PMP回到20℃,中和至pH 7.4,并且使用实例3中描述的一些或全部方法进行表征。
实例5:使用非生物刺激剂增强植物细胞培养物中PMP的产生
此实例描述了由非生物刺激物引起的、植物细胞培养物中PMP的产生的增强。将BY-2细胞系用作模型植物细胞系,并且将温度、pH、光和盐度用作模型非生物刺激剂。
a)BY2生长条件和接种物的制备
如实例1中所述,将BY-2细胞在黑暗中于26℃,在Innova 44R定轨振荡器上以130rpm,在MS(Murashige和Skoog,1962)培养基(pH 5.8)中进行培养。将BY-2细胞每周通过将5%(v/v)的7日龄细胞培养物转移到250mL无菌摇瓶中的100mL新鲜液体培养基中进行常规传代培养。
用于诱导实验的接种的预培养物应处于指数生长期。为了确定指数生长的细胞的血细胞压积(PCV)百分比或鲜重(FW),基于每个至少由三个生物学重复组成的样品,从摇瓶培养物中记录生长曲线。在三个摇瓶中接种5%-10%(v/v)的常规BY-2培养物。在0、72、96、120、148、172和196小时时取出10mL样品。通过将10mL细胞培养物样品转移到刻度管中,并在室温下以4000x g离心5min来测量%PCV。%PCV是细胞沉淀物的体积与细胞+培养基的体积的比率x 100%。通过经滤纸(孔径4-12μm)真空过滤10mL的培养基并称量保留在滤纸上的细胞来确定鲜重(FW)。然后,将细胞在60℃下干燥直至重量保持恒定(至少24h)以确定干重(DW)。将%PCV、FW和DW根据培养时间作图以获得生长曲线。为了确定预培养的最佳收获时间(即指数生长期中期),可以对数据绘制指数函数,然后使用拟合的导数绘制生长率,或者肉眼确定预培养的最佳收获时间。
对于实验,从指数生长期中7日龄预培养物中确定鲜重,并且将在终体积为100mL的BY2培养基中的终浓度为3% FW(3g细胞/100mL)的新鲜培养物接种到250mL一次性摇瓶中。
b)通过温度诱导增加烟草BY-2细胞产生PMP
为了确定温度对BY-2细胞产生PMP的影响,如实例5a所述制备100mL BY-2培养物,并使其在以下温度下生长:20℃、26℃(正常对照温度)和30℃,并且每个时间点每个温度下有三个烧瓶。24、48、72和96小时后,通过分析实例5a中所述的10mL细胞培养物来确定FW和DW,并且使用1mL细胞培养物样品,通过向0.9mL细胞培养物中添加0.1mL 0.4%(m/v)台盼蓝溶液并孵育5min并记录下来以确定死细胞的百分比(死细胞的比例不应超过5%)。通过实例1和实例2中所述的方法从剩余的细胞培养物中产生PMP,并如实例3中所述确定PMP浓度和尺寸分布。确定了每克FW和DW BY-2细胞产生的PMP的相对浓度,并用于比较不同的时间点和温度条件。温度改变刺激PMP的产生。
c)通过pH诱导增加烟草BY-2细胞产生PMP
为了确定pH对BY-2细胞产生PMP的影响,如实例5a所述,在pH 4.5、pH 5、pH 5.8(对照pH)、pH 6和pH 6.5的MS培养基中制备100mL BY-2培养物,并使其在26℃下在黑暗中生长,并且每个时间点每个条件下有三个烧瓶。24、48、72和96小时后,通过分析实例5a中所述的10mL细胞培养物来确定FW和DW,并且使用1mL细胞培养物样品,通过向0.9mL细胞培养物中添加0.1mL 0.4%(m/v)台盼蓝溶液并孵育5min并记录下来以确定死细胞的百分比(死细胞的比例不应超过5%)。通过实例1和实例2中所述的方法从剩余的细胞培养物中产生PMP,并如实例3中所述确定PMP浓度和尺寸分布。确定了每克FW和DW BY-2细胞产生的PMP的相对浓度,并用于比较不同的时间点和pH条件。pH改变刺激PMP的产生。
d)通过光诱导增加烟草BY-2细胞产生PMP
为了确定光对BY-2细胞产生PMP的影响,如实例5a所述制备100mL BY-2培养物,并使其在26℃下,在黑暗(对照)中或短日(8h光照)或长日(16h光照)条件下,在120μmol m
e)通过盐诱导增加烟草BY-2细胞产生PMP
为了确定盐度对BY-2细胞产生PMP的影响,如实例5a所述,在补充有NaCl至终浓度为0(对照)、0.5g/L NaCl、1g/L NaCl、2.5g/L NaCl和5g/L NaCl的MS培养基中制备100mLBY-2培养物,并使其在26℃下在黑暗中生长,并且每个时间点每个条件下有三个烧瓶。24、48、72和96小时后,通过分析实例5a中所述的10mL细胞培养物来确定FW和DW,并且使用1mL细胞培养物样品,通过向0.9mL细胞培养物中添加0.1mL 0.4%(m/v)台盼蓝溶液并孵育5min并记录下来以确定死细胞的百分比(死细胞的比例不应超过5%)。通过实例1和实例2中所述的方法从剩余的细胞培养物中产生PMP,并如实例3中所述确定PMP浓度和尺寸分布。确定了每克FW和DW BY-2细胞产生的PMP的相对浓度,并用于比较不同的时间点和盐度条件。盐度改变刺激PMP的产生。
实例6:使用生物刺激剂增强植物细胞培养物中PMP的产生
此实例描述了由生物刺激物引起的植物细胞培养物中PMP的产生的增强。将BY-2细胞系用作模型植物细胞系,并且将壳聚糖(真菌)、flg22(细菌)和ELF18(细菌)刺激剂用作模型生物刺激剂。
a)BY-2生长条件和接种物的制备
如实例1中所述,将BY-2细胞在黑暗中于26℃,在Innova 44R定轨振荡器上以130rpm,在MS(Murashige和Skoog,1962)培养基(pH 5.8)中进行培养。将BY-2细胞每周通过将5%(v/v)7日龄细胞培养物转移到250mL无菌摇瓶中的100mL新鲜液体培养基中进行常规传代培养。
用于诱导实验的接种的预培养物应处于指数生长期。为了确定指数生长的细胞的血细胞压积(PCV)百分比或鲜重(FW),基于每个至少由三个生物学重复组成的样品,从摇瓶培养物中记录生长曲线。在三个摇瓶中接种5%-10%(v/v)的常规BY-2培养物。在0、72、96、120、148、172和196小时时取出10mL样品。通过将10-mL细胞培养物样品转移到刻度管中,并在室温下以4000x g离心5min来测量%PCV。%PCV是细胞沉淀物的体积与细胞+培养基的体积的比率x 100%。通过经滤纸(孔径4-12μm)真空过滤10mL的培养基并称量保留在滤纸上的细胞来确定鲜重(FW)。然后,将细胞在60℃下干燥直至重量保持恒定(至少24h)以确定干重(DW)。将%PCV、FW和DW根据培养时间作图以获得生长曲线。为了确定预培养的最佳收获时间(即指数生长期中期),可以对数据绘制指数函数,然后使用拟合的导数绘制生长率,或者肉眼确定预培养的最佳收获时间。
对于实验,从指数生长期中7日龄预培养物中确定鲜重,并且将在终体积为100mL的BY-2培养基中的终浓度为3% FW(3g细胞/100mL)的新鲜培养物接种到250mL一次性摇瓶中。
b)通过壳聚糖诱导增加烟草BY-2细胞产生PMP
为了确定壳聚糖对BY-2细胞产生PMP的影响,如实例6a所述,在补充有0(对照)、25mg/L壳聚糖(西格玛奥德里奇公司)、50mg/L壳聚糖和100mg/L壳聚糖的MS培养基中制备100mL BY-2培养物,并使其在26℃下在黑暗中生长,并且每个时间点每个条件下有三个烧瓶。24、48、72和96小时后,通过分析实例6a中所述的10mL细胞培养物来确定FW和DW,并且使用1mL细胞培养物样品,通过向0.9mL细胞培养物中添加0.1mL 0.4%(m/v)台盼蓝溶液并孵育5min并记录下来以确定死细胞的百分比(死细胞的比例不应超过5%)。通过实例1和实例2中所述的方法从剩余的细胞培养物中产生PMP,并如实例3中所述确定PMP浓度和尺寸分布。确定了每克FW和DW BY-2细胞产生的PMP的相对浓度,并用于比较不同的时间点和壳聚糖条件。壳聚糖刺激PMP的产生。
c)通过flg22诱导增加烟草BY-2细胞产生PMP
为了确定flg22肽(QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA)(SEQ ID NO:7)对BY-2细胞产生PMP的影响,如实例6a所述,在补充有0(对照)、5μM flg22(AnaSpec AS-62633)、10μM flg22和20μM flg22的MS培养基中制备100mL BY-2培养物,并使其在26℃下在黑暗中生长,并且每个时间点每个条件下有三个烧瓶。24、48、72和96小时后,通过分析实例6a中所述的10mL细胞培养物来确定FW和DW,并且使用1mL细胞培养物样品,通过向0.9mL细胞培养物中添加0.1mL 0.4%(m/v)台盼蓝溶液并孵育5min并记录下来以确定死细胞的百分比(死细胞的比例不应超过5%)。通过实例1和实例2中所述的方法从剩余的细胞培养物中产生PMP,并如实例3中所述确定PMP浓度和尺寸分布。确定了每克FW和DW BY-2细胞产生的PMP的相对浓度,并用于比较不同的时间点和flg22条件。Flg22刺激PMP的产生。
d)通过elf18诱导增加烟草BY-2细胞产生PMP
为了确定elf18肽(Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)(SEQ ID NO:8)对BY-2细胞产生PMP的影响,如实例5a所述,在补充有0(对照)、50nM elf18(EZBiolab)、100nM elf18和500nMelf18、1μM elf18、2.5μM elf18和5μM elf18的MS培养基中制备100mL BY-2培养物,并使其在26℃下在黑暗中生长,并且每个时间点每个条件下有三个烧瓶。24、48、72和96小时后,通过分析实例5a中所述的10mL细胞培养物来确定FW和DW,并且使用1mL细胞培养物样品,通过向0.9mL细胞培养物中添加0.1mL 0.4%(m/v)台盼蓝溶液并孵育5min并记录下来以确定死细胞的百分比(死细胞的比例不应超过5%)。通过实例1和实例2中所述的方法从剩余的细胞培养物中产生PMP,并如实例3中所述确定PMP浓度和尺寸分布。确定了每克FW和DW BY-2细胞产生的PMP的相对浓度,并用于比较不同的时间点和温度条件。Elf18刺激PMP的产生。
实例7:使用化学刺激剂增强植物细胞培养物中PMP的产生
此实例描述了由化学刺激物引起的、植物细胞培养物中PMP的产生的增强。将BY-2细胞系用作模型植物细胞系,并且将水杨酸、苯并噻二唑(BTH)、2,6-二氯异烟酸和茉莉酮酸甲酯用作模型化学激发剂。
a)BY-2生长条件和接种物的制备
如实例1中所述,将BY-2细胞在黑暗中于26℃,在Innova 44R定轨振荡器上以130rpm,在MS(Murashige和Skoog,1962)培养基(pH 5.8)中进行培养。将BY-2细胞每周通过将5%(v/v)7日龄细胞培养物转移到250mL无菌摇瓶中的100mL新鲜液体培养基中进行常规传代培养。
用于诱导实验的接种的预培养物应处于指数生长期。为了确定指数生长的细胞的血细胞压积(PCV)百分比或鲜重(FW),基于每个至少由三个生物学重复组成的样品,从摇瓶培养物中记录生长曲线。在三个摇瓶中接种5%-10%(v/v)的常规BY-2培养物。在0、72、96、120、148、172和196小时时取出10mL样品。通过将10-mL细胞培养物样品转移到刻度管中,并在室温下以4000x g离心5min来测量%PCV。%PCV是细胞沉淀物的体积与细胞+培养基的体积的比率x 100%。通过经滤纸(孔径4-12μm)真空过滤10mL的培养基并称量保留在滤纸上的细胞来确定鲜重(FW)。然后,将细胞在60℃下干燥直至重量保持恒定(至少24h)以确定干重(DW)。将%PCV、FW和DW根据培养时间作图以获得生长曲线。为了确定预培养的最佳收获时间(即指数生长期中期),可以对数据绘制指数函数,然后使用拟合的导数绘制生长率,或者肉眼确定预培养的最佳收获时间。
对于实验,从指数生长期中7日龄预培养物中确定鲜重,并且将在终体积为100mL的BY2培养基中的终浓度为3% FW(3g细胞/100mL)的新鲜培养物接种到250mL一次性摇瓶中。
b)通过茉莉酮酸甲酯诱导增加烟草BY-2细胞产生PMP
为了确定茉莉酮酸甲酯对BY-2细胞产生PMP的影响,如实例7a所述,在补充有0(对照)、50μM茉莉酮酸甲酯(西格玛奥德里奇公司)、100μM茉莉酮酸甲酯和200μM茉莉酮酸甲酯的MS培养基中制备100mL BY-2培养物,并使其在26℃下在黑暗中生长,并且每个时间点每个条件下有三个烧瓶。24、48、72和96小时后,通过分析实例7a中所述的10mL细胞培养物来确定FW和DW,并且使用1mL细胞培养物样品,通过向0.9mL细胞培养物中添加0.1mL 0.4%(m/v)台盼蓝溶液并孵育5min并记录下来以确定死细胞的百分比(死细胞的比例不应超过5%)。通过实例1和实例2中所述的方法从剩余的细胞培养物中产生PMP,并如实例3中所述确定PMP浓度和尺寸分布。确定了每克FW和DW BY-2细胞产生的PMP的相对浓度,并用于比较不同的时间点和茉莉酮酸甲酯条件。茉莉酮酸甲酯刺激PMP的产生。
c)通过水杨酸诱导增加烟草BY-2细胞产生PMP
为了确定水杨酸对BY-2细胞产生PMP的影响,如实例7a所述,在补充有0(对照)、500μM水杨酸(西格玛奥德里奇公司)、1mM水杨酸、2mM水杨酸和5mM水杨酸的MS培养基中制备100mL BY-2培养物,并使其在26℃下在黑暗中生长,并且每个时间点每个条件下有三个烧瓶。24、48、72和96小时后,通过分析实例7a中所述的10mL细胞培养物来确定FW和DW,并且使用1mL细胞培养物样品,通过向0.9mL细胞培养物中添加0.1mL 0.4%(m/v)台盼蓝溶液并孵育5min并记录下来以确定死细胞的百分比(死细胞的比例不应超过5%)。通过实例1和实例2中所述的方法从剩余的细胞培养物中产生PMP,并如实例3中所述确定PMP浓度和尺寸分布。确定了每克FW和DW BY-2细胞产生的PMP的相对浓度,并用于比较不同的时间点和水杨酸条件。水杨酸刺激PMP的产生。
d)通过苯并噻二唑诱导增加烟草BY-2细胞产生PMP
为了确定苯并-(1,2,3)-噻二唑-7-硫代甲酸S-甲酯(苯并噻二唑,BTH)对BY-2细胞产生PMP的影响,如实例7a所述,在补充有0(对照)、500μM苯并噻二唑(西格玛奥德里奇公司)、300μM苯并噻二唑、100μM苯并噻二唑和50μM苯并噻二唑的MS培养基中制备100mL BY-2培养物,并使其在26℃下在黑暗中生长,并且每个时间点每个条件下有三个烧瓶。24、48、72和96小时后,通过分析实例7a中所述的10mL细胞培养物来确定FW和DW,并且使用1mL细胞培养物样品,通过向0.9mL细胞培养物中添加0.1mL 0.4%(m/v)台盼蓝溶液并孵育5min并记录下来以确定死细胞的百分比(死细胞的比例不应超过5%)。通过实例1和实例2中所述的方法从剩余的细胞培养物中产生PMP,并如实例3中所述确定PMP浓度和尺寸分布。确定了每克FW和DW BY-2细胞产生的PMP的相对浓度,并用于比较不同的时间点和BTH条件。苯并噻二唑刺激PMP的产生。
e)通过2,6-二氯异烟酸诱导增加烟草BY-2细胞产生PMP
为了确定2,6-二氯异烟酸对BY-2细胞产生PMP的影响,如实例7a所述,在补充有0(对照)、500μM 2,6-二氯异烟酸(西格玛奥德里奇公司)、250μM 2,6-二氯异烟酸、100μM 2,6-二氯异烟酸和50μM 2,6-二氯异烟酸的MS培养基中制备100mL BY-2培养物,并在26℃下在黑暗中生长,并且每个时间点每个条件下有三个烧瓶。24、48、72和96小时后,通过分析实例7a中所述的10mL细胞培养物来确定FW和DW,并且使用1mL细胞培养物样品,通过向0.9mL细胞培养物中添加0.1mL 0.4%(m/v)台盼蓝溶液并孵育5min并记录下来以确定死细胞的百分比(死细胞的比例不应超过5%)。通过实例1和实例2中所述的方法从剩余的细胞培养物中产生PMP,并如实例3中所述确定PMP浓度和尺寸分布。确定了每克FW和DW BY-2细胞产生的PMP的相对浓度,并用于比较不同的时间点和2,6-二氯异烟酸条件。2,6-二氯异烟酸刺激PMP的产生。
实例8:通过在植物中过表达泡外复合物成员来增强PMP的释放
此实例描述了通过泡外复合物成员(如EXO70A1和EXO84)的过表达来增强从植物细胞和植物中释放PMP。在此实例中,EXO70A1是模型泡外复合物成员,BY-2是模型细胞系,并且将欧洲油菜用作模型植物。
a)产生用于农杆菌介导的转染的Exo70A1过表达构建体
欧洲油菜(BnaCnng02750D-1,CDY10374)中的Exo70A1先前已经由Samuel等人(2009)The Pant Cell[植物细胞]第21卷:2655-2671鉴定。通过IDT合成完整的BnExo70A1编码序列,该序列包括KOZAK序列、Nco1 3'和5'酶位点,并去除终止密码子,以使用获得自马克基因技术公司(Marker Gene Technologies)的pCambia1302植物表达载体产生BnExo70A1:mgfp5融合蛋白。在此载体中,CaMV35S启动子的双增强子版本可驱动BnExo70A1:mgfp5融合蛋白,其以CaMV35S多聚A信号终止。为了克隆该构建体,用NcoI消化BnExo70A1合成序列和pCambia1302载体,分离并将BnExo70A1连接到载体中。根据制造商的方法,将pCambia1302-BnExo70A1进行序列验证并转化到大肠杆菌(E.coli)和GV3101::pMP90根癌农杆菌中。
>BnExo70A1合成序列(SEQ ID NO:9)
ACGAccatggaccATGGCCGTCGATAGCCGAATGGATCTGCTCAGCGAAAGAGCTGTGCTGATGAGAGAGTCTCTCCAGAAGAGTCAAACCATCACCGATAATGTCGTCTCCATCCTCGGCTCCTTCGATAGCCGTCTCTCTGCTCTTGAATCCGCCATGCGTCCCACTCAGATTAGAACGCATGCGATAAGGAAAGCTCACGAGAATATCGATAAGACTCTCAAATCCGCTGAGGTTATTCTCTCTCAGTTTGATCTCCTCCGTCAGGCAGAGACTAAAGTACTCAAGGGGCCACATGAGGACCTGGAGAGTTATTTGGAGGCAATAGCTCAACTCAGAAAAGTTATTCGTTATTTTAGCAGCAACAAAGGCTTTAAGAACAGTGATGGAGTCCTCAACCATGCAAATAGCTTGCTTGCCAAAGCTCAGTCGAAGCTGGAGGAGGAGTTTAAACAGTTGCTAGCTTCTTACAGCAAAGCTGTGGAGCCTGATCGCCTTTTTGATGGCCTTCCTAACTCACTGAGACCATCCGCTGACGGTGAGGGTAATGGAAAAGCCCACGGAGGACACCATAACGATGACTCAGAAACTGCTGCTTATACACTTCCAGTCCTCATTCCATCAAGGGTATTGCCACTTTTGCATGATTTGGCTCAGCAAATGGTTCAGGCTGGTCACCAGCAACTGCTGCTACAAATTTATAGAGAAACACGTACTTTTGTATTGGAAGAGAGCTTAAGAAAATTGGGAGTTGAAAAACTTAGCAAAGAGGATGTTCAGAGGATGCAGTGGGAAGTTTTGGAGGCCAAAATTGGAAATTGGATCCATTTCATGCGCATTGCTGTTAAATTGCTCTTTGCTGGAGAAAGGCAAGTATGTGACCAGATATTCCGAGGCTTCGATTCTCTTAGTGATCAGTGTTTTGCAGAAGTTACAGTGAGCAGTGTCTCAATGCTACTTAGCTTTGGGGATGCCATAGCTAGGAGCAAGAGATCTCCAGAAAAGTTGTTTGTACTCTTAGACATGTATGAAATAATGCGGGAGCTTCATTCAGAGATTGAGACAATTTTCAAAGGTAAAGCATGCCTTGAAATTAGAAACTCTGCTACGGGGTTGACAAAGCGGCTGGCGCAGACTGCTCAGGAAACATTTGGTGACTTCGAAGAAGCTGTAGAAAAAGATGCTACAAAGACTGCTGTTCTAGATGGGACTGTCCACCCACTAACAAGCTATGTTATCAATTATGTCAAGTTCTTATTTGACTACCAAGCGACTTTGAAGCAACTTTTCTCGGAATTTGGAAATGGAGATGACTCGAACTCTCAGCTTGCATCCGTAACAATGAGGATAATGCAGGCGCTTCAAAACAACCTGGAGGGAAAATCGAAACAGTACAAAGATCAAGCACTGACACACTTGTTCTTGATGAACAACATACATTACATGGTTAGATCTGTGCGCAGGTCAGAAGCCAAGGATTTGTTAGGCGATGATTGGGTTCAAAGGCACAGGCGTGTCGTTCAGCAACATGCAAACCTATACAAAAGGACTGCTTGGACAAAGATATTACAAACCTCGTCGGCGCAAGGGTTGACCTCATCCGGAGGAGGAAGTGTAGAGGGAGGAAACAGCAGCGGAGTTTCGAGAGGGTTACTGAAAGAGAGGTTCAAGATGTTCAATATGCAATTTGATGAGTTGCATCAGAGACAATCACAATGGACAGTTCCGGACACAGAGCTAAGAGAGTCACTAAGACTTGCTGTTGCTGAAGTATTATTGCCTGCTTACAGATCATTCCTCAAACGCTTTGGGCCTCTGGTTGAGAGTGGGAAGAATTCTCAGAGATACATAAAGTATACAGCTGAAGATCTTGAGAGATTGTTGGGTGAGTTGTTTGAAGGAAAGTCTATGAACGAACCACGACGGccatggACGA
b)BnExo70A1:mgfp5在欧洲油菜(B napus)中的过表达诱导质外体中PMP释放增强
使欧洲油菜Westar栽培品种在生长室、在长日条件(由16小时光照/8小时黑暗的光周期组成)、在22C下生长。
将BnExo70A1:mgfp5使用携带pCambia1302-BnExo70A1的根癌农杆菌转化到欧洲油菜植物中,如Samuel等人(2009)The Plant Cell[植物细胞]第21卷:2655-2671所述,并如马克基因技术公司所述用潮霉素B进行选择。通过使用引物(BnExo70-FW 5’cgcccgggatggccgtcgatagccgaa 3’(SEQ ID NO:10)、BnExo70-REV 5’cgcgggcccttaccgtcgtggttcattcat 3’(SEQ ID NO:11))的RT-PCR筛选用于Exo70A1表达的转基因系,以检测Exo70A1 mRNA,并且将肌动蛋白(肌动蛋白-FW 5’ggctgatggtgaagatattca 3’(SEQ ID NO:12)、肌动蛋白-REV 5’caagcacaataccagtagtac3’(SEQ ID NO:13))用作阳性对照。对于RT-PCR,从各种转基因植物和对照植物的柱头中分离总RNA,并将其用于通过寡核苷酸(dT)介导的反转录来合成cDNA。通过蛋白质印迹来确定GFP水平。将稳健的转基因系培养多代以确保转基因的稳定整合。
从4-6周龄对照和转基因欧洲油菜的质外体洗涤液分离EV,如Rutter和Innes,Plant Physiol[植物生理学]2016所描述。简而言之,收获整个叶,并且用囊泡分离缓冲剂(20mM MES、2mM CaCl2和0.1M NaCl,pH 6)真空渗透。将经渗透的植物小心地吸干以除去多余的液体,置于30mL注射器中,并且在50mL锥形管中在2℃下以700g离心20min,以收集含有EV的质外体细胞外液。接下来,将质外体细胞外液通过0.85μm过滤器过滤以除去大颗粒,并且如实例2中所描述产生PMP。根据实例3中所述的方法,将BnExo70A1中的质外体液中PMP的浓度与非转基因植物中的质外体液中PMP的浓度进行比较。植物细胞中Exo70A1的过表达增加PMP的释放。
c)BnExo70A1:mgfp5在BY-2细胞中的过表达诱导培养基中PMP释放增强
将烟草BY-2(Nicotiana tabacum L cv.Bright Yellow 2;#PC-1181)细胞培养物获得自德国微生物和细胞培养物保藏中心(莱布尼茨研究所DSMZ,布伦瑞克,德国)。将细胞在黑暗中于26℃,在振荡器上以130rpm,在包含补充有30g/L蔗糖、2.0mg/L磷酸二氢钾、0.1g/L肌醇、0.2mg/L 2,4-二氯苯氧基乙酸、和1mg/L硫胺素HCl的MS盐的MS(Murashige和Skoog,1962)BY-2培养基(pH 5.8)中进行培养。
将BnExo70A1:mgfp5使用携带pCambia1302-BnExo70A1的根癌农杆菌转化到BY-2原生质体细胞中以产生稳定的转基因系,如Raven等人,2015 Biotechnology andBioengineering[生物技术和生物工程],第112卷,第2期所述,并如马克基因技术公司所述用潮霉素B进行选择。如实例8b所述,在预先选择50个具有强GFP荧光的独立愈伤组织克隆后,通过RT-PCR筛选用于Exo70A1表达的克隆。从五个表现最好的克隆建立细胞悬浮培养物。
将对照BY-2细胞和BY-2-BnExo70A1:mgfp5细胞每周通过将5%(v/v)7日龄细胞培养物转移到100mL新鲜液体培养基中进行传代培养。为了确定Exo70A1过表达对BY-2细胞释放PMP的影响,如实例7a所述制备100mL BY-2培养物,并使其在26℃下在黑暗中生长,并且每个时间点每个条件下有三个烧瓶。24、48、72和96小时后,通过分析实例7a中所述的10mL细胞培养物来确定FW和DW,并且使用1mL细胞培养物样品,通过向0.9mL细胞培养物中添加0.1mL 0.4%(m/v)台盼蓝溶液并孵育5min并记录下来以确定死细胞的百分比(死细胞的比例不应超过5%)。通过实例1和实例2中所述的方法从剩余的细胞培养物中产生PMP,并如实例3中所述确定PMP浓度和尺寸分布。将每克FW和DW BY-2细胞产生的PMP的相对浓度与每克FW和DW BY-2-BnExo70A1:mgfp5细胞产生的PMP的相对浓度进行比较。Exo70A1的过表达刺激PMP的产生。
实例9:使用生物反应器,从植物细胞培养物中扩大分离PMP
此实例描述了从植物细胞培养扩大到大型生物反应器的PMP生产,例如,在100mL、200mL、5L和100L生物反应器中的PMP生产。将BY-2细胞系用作模型植物细胞系。
a)BY2生长条件
如实例1中所述,将BY-2细胞在黑暗中于26℃,在Innova 44R定轨振荡器上以130rpm,在MS(Murashige和Skoog,1962)培养基(pH 5.8)中进行培养。将BY-2细胞每周通过将5%(v/v)7日龄细胞培养物转移到250mL无菌摇瓶中的100mL新鲜液体培养基中进行常规传代培养。
用于诱导实验的接种的预培养物应处于指数生长期。为了确定指数生长的细胞的血细胞压积(PCV)百分比或鲜重(FW),基于每个至少由三个生物学重复组成的样品,从摇瓶培养物中记录生长曲线。在三个摇瓶中接种5%-10%(v/v)的常规BY-2培养物。在0、72、96、120、148、172和196小时时取出10mL样品。通过将10-mL细胞培养物样品转移到刻度管中,并在室温下以4000x g离心5min来测量%PCV。%PCV是细胞沉淀物的体积与细胞+培养基的体积的比率x100%。通过经滤纸(孔径4-12μm)真空过滤10mL的培养基并称量保留在滤纸上的细胞来确定鲜重(FW)。然后,将细胞在60℃下干燥直至重量保持恒定(至少24h)以确定干重(DW)。将%PCV、FW和DW根据培养时间作图以获得生长曲线。为了确定预培养的最佳收获时间(即指数生长期中期),可以对数据绘制指数函数,然后使用拟合的导数绘制生长率,或者肉眼确定预培养的最佳收获时间。
对于生物反应器扩大,从指数生长期中7日龄预培养物中确定鲜重,并且将在终体积为100mL的BY-2培养基中的终浓度为3% FW(30g细胞/L)的新鲜培养物接种到250mL一次性摇瓶中。
b)使用生物反应器可扩大烟草BY-2细胞产生PMP
为了证明在大型生物反应器中BY-2细胞可以扩大生长,同时产生相似浓度的PMP,可以以不同的一次性生物反应器形式培养BY-2细胞,修改自Raven等人,2015Biotechnology and Bioengineering[生物技术和生物工程],第112卷,第2期。如实例9a所述,通过在MS培养基中接种具有3% FW(30g BY-2细胞/L)的新鲜培养物,比较100mL和500mL烧瓶以及5L和100L生物反应器中的PMP产量。
与BPM-60系统(科耐公司(Kuhner AG))一起使用的250mL一次性摇瓶的培养体积为100mL,而500-mL玻璃摇瓶则装有200mL。将所有的摇瓶培养物在黑暗中以180rpm并且于26℃在Innova 44R振荡培养箱(d
在七天的处理时间内监测生长参数、耗氧量和PMP产量。在0、24、48、72、96、120、144、168小时,通过分析实例9a中所述的10mL细胞培养物来确定FW和DW,并且使用1mL细胞培养物样品,通过向0.9mL细胞培养物中添加0.1mL 0.4%(m/v)台盼蓝溶液并孵育5min并记录下来以确定死细胞的百分比(死细胞的比例不应超过5%)。在24、48、72、96、120和144小时,从所有不同大小的容器中收集100mL细胞培养物(将5L/100L生物反应器连续取样,对于较小的容器,在不同收集时间点对额外的烧瓶进行接种)。
接下来,将收获的培养肉汤中的细胞材料通过真空过滤经两层Miracloth(默克密理博公司(Merck-Millipore))除去,并且将剩余的培养基过滤,并使用切向流过滤(TFF,HansaBiomed公司)将粗PMP浓缩,然后使用尺寸排阻色谱法(HansaBiomed公司)或如实例2所述的其他方法生产PMP。如实例3所述确定PMP浓度和尺寸分布。确定了每克FW和DW BY-2细胞产生的PMP的相对浓度,并用于比较不同的培养容器。
对于所有的培养容器,BY-2生长曲线和每克BY2细胞FW/DW的PMP产量是相似的,这表明PMP生产可有效地扩大至生物反应器。
实例10:从植物细胞培养基生产PMP
此实例证实,可以从植物细胞培养物生产PMP。在此实例中,黑色墨西哥甜玉米(BMS)细胞系是模型植物细胞系。
a)玉米BMS细胞系PMP的产生
从拟南芥生物资源中心(ABRC)购买黑色墨西哥甜玉米(BMS)细胞系,并使其在含有4.3g/L Murashige和Skoog基础盐混合物(Sigma M5524)、2%蔗糖(S0389,密理博西格玛公司)、1x MS维生素溶液(M3900,密理博西格玛公司)、2mg/L 2,4-二氯苯氧基乙酸(D7299,密理博西格玛公司)和250ug/L硫胺素HCL(V-014,密理博西格玛公司)的Murashige和Skoog基础培养基(pH 5.8)中在24℃下在搅拌(110rpm)下生长,并且每7天传代20%体积/体积。
传代后三天,收集160ml BMS细胞,并且以500x g旋转沉降5min以除去细胞以及以10,000x g旋转沉降40min以除去大碎片。使培养基通过0.45μm过滤器以除去大颗粒,并且将过滤的培养基浓缩并且通过TFF(5nm孔径)洗涤(100ml MES缓冲剂、20mM MES、100mMNaCL,pH 6)至4mL(40x)。接下来,使用尺寸排阻色谱法洗脱含有PMP的级分,通过NanoFCM、通过在280nm处的吸光度
这些数据显示,可以从植物液体培养基分离、纯化和浓缩PMP。
实例11:PMP在植物中的摄取
此实例证实了PMP在植物体中被吸收和系统地运送的能力。在此实例中,将拟南芥幼苗PMP用作模型PMP,并且将拟南芥属幼苗和苜蓿芽用作模型植物。
a)拟南芥幼苗培养基PMP的产生
从ABRC获得野生型拟南芥(At)Col-0种子并且用70%乙醇进行表面灭菌,然后将其与50%漂白剂/0.1%triton X-100一起孵育10分钟,并且进行4次无菌ddH
b)用DyLight 800 NHS酯标记拟南芥幼苗PMP
在实例11(a)中产生了拟南芥幼苗(At)PMP。将PMP用DyLight 800 NHS酯(生命技术公司(Life Technologies),#46421)共价膜染料(DyL800)标记。简而言之,将Dyl800溶解在DMSO中至最终浓度为10mg/ml,将200μl的PMP与5μl染料混合,在振荡器上在室温下孵育1h,并且通过在4℃下以100,000x g超速离心1小时将标记的PMP洗涤2-3次。将沉淀物用1.5ml超纯水重悬。为了控制潜在染料聚集体的存在,根据相同的步骤制备仅染料的对照样品,添加200μl超纯水代替PMP。将最终DyL800标记的PMP沉淀物和仅DyL800染料的对照重悬于最少量的超纯水中,并且通过NanoFCM进行表征。At DyL800标记的PMP的最终浓度为1.14x10
c)拟南芥和苜蓿对DyL800标记的At PMP的摄取
为了评价PMP是否可以在植物体内被吸收和系统地运送,使拟南芥属幼苗在筛网过滤器的顶部上的如实例11(a)中描述的液体培养物中萌发,以允许根穿过网生长,并且允许At幼苗部分暴露于PMP溶液。从当地超市获得苜蓿芽。通过分别在23℃下使部分根暴露(拟南芥幼苗在漂浮在PMP溶液中的网中、或苜蓿芽部分根暴露在1.5ml Eppendorf管中)22或24小时,将9日龄拟南芥属幼苗和苜蓿芽用水(阴性对照)、仅DyL800染料(染料对照)、DyL800标记的At(2.2x10
与阴性对照(苜蓿芽叶中的一些自发荧光)和仅染料的对照相比,在拟南芥属幼苗和苜蓿芽两者中所有PMP源均显示荧光信号(白色为高荧光信号,黑色为无信号),这表明PMP被这两种植物吸收(图2)。未暴露于PMP溶液的拟南芥属叶或苜蓿茎区域中荧光信号的存在表明在植物体内PMP的主动转运。
这些数据显示分泌的PMP可以在植物体内被吸收以及转运。
实例12:从十字花科植物水培培养物中生产PMP
此实例证实,可以从植物水培培养物生产PMP。在此实例中,将拟南芥幼苗用作模型植物。
a)拟南芥水培幼苗培养物PMP的产生
野生型拟南芥Col-0种子获得自拟南芥生物资源中心(ABRC)。将种子用70%乙醇进行表面灭菌,然后将其与50%漂白剂/0.1% TritonT
接下来,采用尺寸排阻色谱法洗脱含有PMP的级分,通过NanoFCM、在280nm处的吸光度
这些数据证明,生长在水培培养物中的植物分泌PMP至培养基中(分泌的PMP),将这些分泌的PMP分离、纯化并浓缩以产生包含分泌的PMP的PMP组合物。
实例13:从十字花科植物根培养物中生产PMP
此实例证实,可以从植物根培养物生产PMP。在此实例中,将拟南芥用作模型植物。
a)拟南芥根培养物PMP的产生
将拟南芥(拟南芥属)生态型Columbia(Col-0)的种子如下进行灭菌:70%乙醇持续1min,50%家用漂白剂与0.1% Triton X-100(西格玛公司(Sigma))持续10min,用无菌去离子水洗涤三次。将灭菌的种子重悬在无菌的0.1%琼脂糖中,并且在黑暗中在4℃下分层三天。然后将种子放置在用医用胶带(3M)密封的1/2MS板(Murashige&Skoog基础盐混合物(西格玛公司)2.15g/L、蔗糖10g/L、MES(西格玛公司)0.5g/L、phytoagar(Duchefa)5g/L,用KOH调节至pH 5.8)上,并且在植物生长培养箱中放置七天(16小时光照,23C/21C白天/黑夜)。将幼苗从板上转移到无菌的125mL锥形瓶(赛默飞世尔公司;通气的,无挡板的)中,该锥形瓶含有25mL拟南芥属根培养物(ARC)培养基(Murashige&Skoog基础盐混合物(西格玛公司)4.3g/L、6%KH
这些数据证明,可以从根培养物分离、纯化和浓缩PMP。
实例14:使用非生物、生物和化学刺激剂增强植物细胞培养物中PMP的产生
此实例证实,可以通过非生物和生物刺激物诱导从植物细胞培养物中产生PMP。将黑色墨西哥甜玉米(BMS)细胞培养物用作模型植物细胞系,将氯化钠和水杨酸用作模型非生物刺激物,并且将鞭毛蛋白22(flg22)用作模型生物刺激物。
a)黑色墨西哥甜玉米(BMS)细胞培养条件
黑色墨西哥甜玉米(BMS)细胞购自ABRC。使BMS细胞在含有4.3g/L Murashige和Skoog基础盐混合物(西格玛公司M5524)、2%蔗糖(S0389,密理博西格玛公司)、2mg/L 2,4-二氯苯氧基乙酸(D7299,密理博西格玛公司)、250ug/L硫胺素HCL(V-014,密理博西格玛公司)和1x MS维生素在ddH
c)通过鞭毛蛋白22诱导玉米BMS细胞产生PMP增加
为了确定鞭毛蛋白肽flg22(QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA(SEQ ID NO:14)(AnaSpecAS-62633)对玉米BMS细胞产生PMP的影响,如上所述制备200mL的BMS细胞培养物。进行细胞毒性测定以确定不影响明显的BMS细胞生长的flg22的浓度范围,并且确定了1μM的flg22浓度与细胞生长相容。将30mL的BMS细胞悬浮液分配到各个125mL锥形培养通气烧瓶中。平行地,将89.55mL的新鲜培养基与在超纯无菌水中制备的450μL的400μM flg22肽悬浮液混合至最终浓度为2μM。对于对照条件,添加450μL超纯无菌水代替flg22。然后,将30mL的培养基/flg22或培养基/水混合物添加到含有30mL细胞悬浮液(1:1v/v)的每个烧瓶中,使flg22最终浓度为1μM。对于flg22处理和对照条件均进行了生物学三次重复试验。使对照细胞和经flg22处理的细胞在24℃下在搅拌(110rpm)下生长96小时。
孵育96小时后,以如下相同条件处理经过flg22处理的细胞培养物和对照细胞培养物。如上文所述,使用1mL的细胞培养物样品来确定PCV(图5A)。将细胞沉积到烧瓶的底部以收集30mL的培养基,并且以4000x g离心15min,然后进行1μm和0.45μm过滤。然后,将20mL所得的培养基通过超速离心(45min,100,000x g,4℃)浓缩。将最终的PMP沉淀物重悬于200μL的无菌PBS(pH 7.4)中。使用由制造商提供的浓度和尺寸标准通过NanoFCM来确定PMP浓度和PMP尺寸,并且通过Pierce
d)通过水杨酸诱导玉米BMS细胞产生PMP增加
为了确定水杨酸(SA)对玉米BMS细胞产生PMP的影响,如上所述制备200mL的BMS细胞培养物。进行细胞毒性测定以确定不影响明显的BMS细胞生长的SA的浓度范围,并且发现100μM的浓度与细胞生长相容。将30mL的BMS细胞悬浮液分配到各个125mL锥形培养通气烧瓶中。平行地,将89.82mL的新鲜培养基与180μL的在二甲基亚砜(DMSO)中制备的100mM水杨酸溶液混合至最终浓度为200μM。对于对照条件,添加180μL DMSO代替水杨酸。然后,将30mL的培养基/SA或培养基/水混合物添加到含有30mL细胞悬浮液(1:1v/v)的每个烧瓶中,使最终SA浓度为100μM。对于SA处理和对照条件均进行了生物学三次重复试验。使SA处理和对照细胞培养物在24℃下在搅拌(110rpm)下生长96小时。
孵育96小时后,以如下相同条件处理经过SA处理的细胞培养物和对照细胞培养物。如上文所述,使用1mL的细胞培养物样品来确定它们的PCV(图6A)。将细胞沉积到烧瓶的底部以收集30mL的培养基,并且以4000x g离心15min,然后进行1μm和0.45μm过滤。然后,将20mL所得的培养基通过超速离心(45min,100,000x g,4℃)浓缩。将最终的PMP沉淀物重悬于200μL的无菌PBS(pH 7.4)中。使用由制造商提供的浓度和尺寸标准通过NanoFCM来确定PMP浓度和PMP尺寸,并且通过Pierce
实例15:使用生物反应器,从植物细胞培养基中大规模生产PMP此实例证实,可以从大规模植物细胞培养物生产PMP。在此实例中,将黑色墨西哥甜玉米(BMS)细胞系用作模型植物细胞系用于PMP生产。
a)玉米BMS细胞系PMP的产生
如实例12(a)所述培养玉米BMS细胞。BMS细胞在约30%的PCV下每7天传代一次。如实例12(a)所述确定PCV。
b)使用生物反应器,从植物细胞培养基中扩大生产PMP
对于PMP生产,使BMS细胞生长直至细胞PCV为25%。然后,允许4L细胞沉淀并收集3L上层BMS培养基,并且以3000x g旋转沉降20min,以10,000x g旋转沉降40min以去除大碎片。添加EDTA至最终浓度为50mM,并且将pH调节至7.5。将培养基通过11μm、1μm和0.45μm过滤器过滤以除去大颗粒和聚集体。将所得的过滤的培养基浓缩10倍,用10x体积(v/v,3.3LPBS1x,pH 7.4)洗涤,并且使用切向流过滤(TFF)系统(300kDa孔径,瑞普利金公司(Repligen))浓缩至60mL(50x)。接下来,我们使用尺寸排阻色谱法(SEC)洗脱含有PMP的级分,通过NanoFCM分析这些级分的PMP浓度和尺寸(图7A和7B)。通过Pierce
这些数据证明,培养的植物细胞分泌PMP至培养基中,并且这些PMP可以在扩大生产中从生物反应器分离、纯化和浓缩。
实例16:从生长在水培培养物中的番茄的根中分离PMP,并且使用化学刺激物增加PMP的产生。
此实例证实,可以从植物水培培养物生产PMP。在此实例中,将番茄用作模型植物。此外,此实例证明了可以通过化学刺激物诱导从植物水培培养物中产生PMP。将水杨酸用作模型化学刺激物。
a)水培培养物中番茄植物的生长
将番茄(番茄(Solanum lycopersicum))栽培品种Moneymaker的种子如下进行灭菌:70%乙醇持续3min,50%家用漂白剂与0.1% Triton X-100(西格玛公司)持续20min,用无菌去离子水洗涤三次。使灭菌的种子在用医用胶带(3M)密封的无菌培养皿中的湿润的滤纸
b)使用水杨酸刺激PMP产生
为了确定水杨酸对生长在水培培养物中的番茄植物产生PMP的影响,将三周龄的植物用1mM水杨酸通过添加至液体生长培养基中而处理三天。将水杨酸(西格玛公司)制备成在DMSO(西格玛公司)中的1M储备液。将无菌200μL水杨酸或无菌200μL DMSO分别添加至处理植物和对照植物中,将生长容器用医用胶带重新密封,并且将植物放回生长培养箱中。
c)由生长在水培培养物中的番茄根产生的PMP的分离
将培养基(每个容器180mL)收集并且以4,000x g离心30min以沉淀碎片。将上清液通过1μM和0.45μM PES过滤器
其他实施例
本发明的一些实施例在以下编号的段落内。
1.一种用于产生植物信使包(PMP)的方法,该方法包括:
(a)获得其中已培养植物、植物部分、或植物细胞的培养基;以及
(b)从该培养基中纯化PMP。
2.一种用于产生植物PMP的方法,该方法包括:
(a)在培养基中培养植物、植物部分、或植物细胞;
(b)收获该培养基或其部分;以及
(c)从该培养基中纯化PMP。
3.如段落1或2所述的方法,其中该培养基是液体培养基。
4.如段落3所述的方法,其中该液体培养基处于水培系统中。
5.如段落1或2所述的方法,其中该培养基是凝胶培养基。
6.如段落5所述的方法,其中该凝胶培养基是琼脂或琼脂糖。
7.如段落1或2所述的方法,其中该培养基是半固体或固体培养基。
8.如段落7所述的方法,其中该半固体或固体培养基是无菌的天然土壤或无菌的合成土壤。
9.如段落1-8中任一项所述的方法,其中该培养基包含常量营养素、微量营养素、盐、酶、抗生素、抗真菌剂、或植物生长因子中的一种或多种。
10.如段落1-9中任一项所述的方法,其中在生物反应器中进行该培养。
11.如段落10所述的方法,其中该生物反应器是具有至少1L、10L、50L、100L、或500L的容量的容器。
12.如段落1-11中任一项所述的方法,其中该收获包括将该植物、植物部分、或植物细胞与该植物培养基分离。
13.如段落1-12中任一项所述的方法,其中该收获不包括破坏该植物、植物部分、或植物细胞。
14.如段落12或13所述的方法,其中该分离包括重力沉降、离心、旋转过滤器、和膜系统中的一种或多种。
15.如段落14所述的方法,其中该收获包括将该植物、植物部分、或植物细胞和该培养基离心。
16.如段落1-13中任一项所述的方法,其中该收获包括将该培养基榨汁。
17.如段落1-13中任一项所述的方法,其中该收获包括洗涤该培养基。
18.如段落1-17中任一项所述的方法,其中定期收获并更换该培养基。
19.如段落1-18中任一项所述的方法,其中以至少1L的体积提供该培养基。
20.如段落1-19中任一项所述的方法,其中该植物是幼苗。
21.如段落20所述的方法,其中该幼苗在该培养基中萌发。
22.如段落1-19中任一项所述的方法,其中该植物部分是胚根或根。
23.如段落22所述的方法,其中该根不与植物地上部分连接。
24.如段落1-19中任一项所述的方法,其中该植物部分是花粉粒。
25.如段落1-19中任一项所述的方法,其中该植物部分是愈伤组织。
26.如段落1-25中任一项所述的方法,其中该植物是双子叶植物或单子叶植物,或该植物部分是双子叶植物或单子叶植物的一部分。
27.如段落1-26中任一项所述的方法,其中该植物或植物部分是大豆植物或其一部分、蚕豆植物或其一部分、拟南芥属植物或其一部分、番茄植物或其一部分、大麦植物或其一部分、或燕麦植物或其一部分。
28.如段落1-19中任一项所述的方法,其中该植物细胞是烟草BY-2细胞。
29.如段落1-28中任一项所述的方法,其中该植物、植物部分、或植物细胞已经生长了至少24小时。
30.如段落29所述的方法,其中该植物、植物部分、或植物细胞已经生长了至少1周。
31.如段落1-30中任一项所述的方法,其中该植物、植物部分、或植物细胞是基因修饰的。
32.如段落31所述的方法,其中该基因修饰的植物、植物部分、或植物细胞含有相对于未修饰的植物、植物部分、或植物细胞可有效增加来自该植物、植物部分、或植物细胞的PMP的产生的基因修饰。
33.如段落31或32所述的方法,其中该基因修饰的植物、植物部分、或植物细胞含有相对于未修饰的植物、植物部分、或植物细胞可有效增加该植物、植物部分、或植物细胞中EXO70a1或EXO84的表达的基因修饰。
34.如段落33所述的方法,其中该基因修饰是EXO70a1或EXO84转基因的稳定整合。
35.如段落1-34中任一项所述的方法,该方法进一步包括将该植物、植物部分、或植物细胞暴露于有效量的刺激剂中以增加PMP的产生。
36.如段落35所述的方法,其中该刺激剂是生物刺激剂。
37.如段落36所述的方法,其中该生物刺激剂是微生物刺激剂。
38.如段落37所述的方法,该微生物刺激剂是细菌多肽、细菌糖、细菌核酸、或细菌小分子。
39.如段落38所述的方法,其中该细菌多肽是延伸因子Tu 18(EFT18)。
40.如段落37所述的方法,其中该微生物刺激剂是真菌多肽、真菌糖、真菌核酸、或真菌小分子。
41.如段落40所述的方法,其中该真菌多肽是鞭毛蛋白2。
42.如段落37所述的方法,其中该微生物刺激剂是微生物。
43.如段落42所述的方法,其中该微生物是细菌。
44.如段落42所述的方法,其中该微生物是病毒或原生动物。
45.如段落42所述的方法,其中该微生物是真菌。
46.如段落36所述的方法,其中该植物刺激剂是非生物刺激剂。
47.如段落46所述的方法,其中该非生物刺激剂是渗透胁迫、干旱、水分剥夺、洪涝、高光强度、非常高的光强度、高温、低温、盐度、重金属毒害作用、厌氧生活、养分缺乏、养分过量、UV照射、大气污染、或诱导活性氧(ROS)的产生的化学物质。
48.如段落36所述的方法,其中该植物刺激剂是化学激发剂。
49.如段落48所述的方法,其中该化学激发剂是水杨酸。
50.如段落48所述的方法,其中该化学激发剂是苯并噻二唑。
51.如段落48所述的方法,其中该化学激发剂是2,6-二氯异烟酸。
52.如段落36所述的方法,其中该刺激剂是增加EXO70a1或EXO84的基因表达的异源核酸。
53.如段落36-52中任一项所述的方法,其中在收获该培养基之前至少24小时添加该刺激剂。
54.如段落1-53中任一项所述的方法,其中该纯化步骤包括分离出粗PMP级分,其中相对于在初始样品中的水平,该粗PMP级分具有降低水平的来自该植物或其一部分的至少一种污染物或不希望的组分。
55.如段落54所述的方法,其中该纯化步骤进一步包括纯化该粗PMP级分,从而产生多个纯PMP,其中相对于在该粗PMP级分中的水平,该多个纯PMP具有降低水平的来自该植物或其一部分的至少一种污染物或不希望的组分。
56.如段落1-55中任一项所述的方法,其中该方法进一步包括确定这些PMP的纯度并且收集鉴定为纯的PMP。
57.如段落1-56中任一项所述的方法,该方法进一步包括将这些PMP用载体配制,从而产生PMP组合物。
58.如段落57所述的方法,其中该载体是农业上可接受的载体。
59.如段落58所述的方法,其中该PMP组合物被配制用于递送至植物。
60.如段落57所述的方法,其中该载体是药学上可接受的载体。
61.如段落60所述的方法,其中该PMP组合物被配制用于向人施用。
62.如段落57-61中任一项所述的方法,其中该组合物被配制为液体、固体、气雾剂、糊剂、凝胶或气体组合物。
63.如段落57-62中任一项所述的方法,其中该PMP组合物稳定至少24小时、48小时、七天、或30天。
64.如段落57-63中任一项所述的方法,其中该PMP组合物在至少4℃、20℃、24℃、或37℃的温度下稳定。
65.如段落1-64中任一项所述的方法,该方法进一步包括使这些PMP负载有异源功能剂。
66.如段落65所述的方法,其中该异源功能剂是异源农业药剂。
67.如段落66所述的方法,其中该异源农业药剂是杀有害生物剂。
68.如段落66所述的方法,其中该异源农业药剂是肥料剂。
69.如段落66所述的方法,其中该异源农业药剂是除草剂。
70.如段落66所述的方法,其中该异源农业药剂是植物修饰剂。
71.如段落65所述的方法,其中该异源功能剂是异源治疗剂。
72.如段落71所述的方法,其中该异源治疗剂包括抗真菌剂、抗细菌剂、杀病毒剂、抗病毒剂、杀昆虫剂、杀线虫剂、抗寄生生物剂、或昆虫驱避剂。
73.一种用于产生PMP的方法,该方法包括:
(a)在生物反应器中培养植物、植物部分、或植物细胞;
(b)将该植物、植物部分、或植物细胞暴露于有效量的刺激剂中以增加PMP的产生;
(c)收获培养基;以及
(d)从该培养基中纯化PMP。
74.一种PMP组合物,该组合物包含多个PMP,其中通过包括以下步骤的方法产生这些PMP:
(a)获得其中已培养植物、植物部分、或植物细胞的培养基;以及
(b)从该培养基中纯化PMP。
75.一种PMP组合物,该组合物包含多个PMP,其中通过包括以下步骤的方法产生这些PMP:
(a)在培养基中培养植物、植物部分、或植物细胞;
(b)收获该培养基;以及
(c)从该培养基中纯化PMP。
76.如段落74或75所述的PMP组合物,该组合物进一步包括将该植物、植物部分、或植物细胞暴露于有效量的刺激剂中以增加PMP的产生。
77.如段落74-76中任一项所述的PMP组合物,其中该刺激剂是生物刺激剂、非生物刺激剂、或化学激发剂。
78.如段落74-77中任一项所述的PMP组合物,其中该纯化步骤包括分离出粗PMP级分,其中相对于在初始样品中的水平,该粗PMP级分具有降低水平的来自该植物或其一部分的至少一种污染物或不希望的组分。
79.如段落78所述的PMP组合物,其中该纯化步骤进一步包括纯化该粗PMP级分,从而产生多个纯PMP,其中相对于在该粗PMP级分中的水平,该多个纯PMP具有降低水平的来自该植物或其一部分的至少一种污染物或不希望的组分。
80.如段落74-79中任一项所述的PMP组合物,其中该PMP组合物进一步包括将这些PMP用载体配制。
81.如段落80所述的PMP组合物,其中该载体是农业上可接受的载体。
82.如段落81所述的PMP组合物,其中该PMP组合物被配制用于递送至植物。
83.如段落80所述的PMP组合物,其中该载体是药学上可接受的载体。
84.如段落83所述的PMP组合物,其中该PMP组合物被配制用于向人施用。
85.如段落74-84中任一项所述的PMP组合物,其中该组合物被配制成液体、固体、气雾剂、糊剂、凝胶或气体组合物。
86.如段落74-85中任一项所述的PMP组合物,其中该PMP组合物稳定至少24小时、48小时、七天、或30天。
87.如段落74-86中任一项所述的PMP组合物,其中该PMP组合物在至少4℃、20℃、24℃、或37℃的温度下稳定。
88.一种PMP生物反应器,该PMP生物反应器包括含有植物培养物并且任选地含有有效量的刺激剂以增加PMP产生的生物反应器。
89.如段落88所述的PMP生物反应器,其中该植物培养物是包含整个植物、植物部分、或植物细胞的培养物。
90.如段落89所述的PMP生物反应器,其中该植物是幼苗。
91.如段落89所述的PMP生物反应器,其中该植物部分是胚根或根。
92.如段落91所述的PMP生物反应器,其中该根不与植物地上部分连接。
93.如段落89所述的PMP生物反应器,其中该植物部分是花粉粒。
94.如段落89所述的PMP生物反应器,其中该植物部分是愈伤组织。
95.如段落88-94中任一项所述的PMP生物反应器,其中该植物是双子叶植物或单子叶植物,或该植物部分是双子叶植物或单子叶植物的一部分。
96.如段落88-95中任一项所述的PMP生物反应器,其中该植物或植物部分是大豆植物或其一部分、蚕豆植物或其一部分、拟南芥属植物或其一部分、番茄植物或其一部分、大麦植物或其一部分、或燕麦植物或其一部分。
97.如段落89所述的PMP生物反应器,其中该植物细胞是烟草BY-2细胞。
98.如段落88-97中任一项所述的PMP生物反应器,其中该植物、植物部分、或植物细胞已经生长了至少24小时。
99.如段落29所述的PMP生物反应器,其中该植物、植物部分、或植物细胞已经生长了至少1周。
100.如段落88-99中任一项所述的PMP生物反应器,其中该植物、植物部分、或植物细胞是基因修饰的。
101.如段落100所述的PMP生物反应器,其中该基因修饰的植物、植物部分、或植物细胞含有相对于未修饰的植物、植物部分、或植物细胞可有效增加来自该植物、植物部分、或植物细胞的PMP的产生的基因修饰。
102.如段落100或101所述的PMP生物反应器,其中该基因修饰的植物、植物部分、或植物细胞含有相对于未修饰的植物、植物部分、或植物细胞可有效增加该植物、植物部分、或植物细胞中EXO70a1或EXO84的表达的基因修饰。
103.如段落102所述的PMP生物反应器,其中该基因修饰是EXO70a1或EXO84转基因的稳定整合。
104.如段落88-103中任一项所述的PMP生物反应器,其中该刺激剂是生物刺激剂。
105.如段落104所述的PMP生物反应器,其中该生物刺激剂是微生物刺激剂。
106.如段落105所述的PMP生物反应器,该微生物刺激剂是细菌多肽、细菌糖、细菌核酸、或细菌小分子。
107.如段落106所述的PMP生物反应器,其中该细菌多肽是延伸因子Tu 18(EFT18)。
108.如段落105所述的PMP生物反应器,其中该微生物刺激剂是真菌多肽、真菌糖、真菌核酸、或真菌小分子。
109.如段落108所述的PMP生物反应器,其中该真菌多肽是鞭毛蛋白2。
110.如段落105所述的PMP生物反应器,其中该微生物刺激剂是微生物。
111.如段落110所述的PMP生物反应器,其中该微生物是细菌。
112.如段落110所述的PMP生物反应器,其中该微生物是病毒或原生动物。
113.如段落110所述的PMP生物反应器,其中该微生物是真菌。
114.如段落88-103中任一项所述的PMP生物反应器,其中该植物刺激剂是非生物刺激剂。
115.如段落114所述的PMP生物反应器,其中该非生物刺激剂是渗透胁迫、干旱、水分剥夺、洪涝、高光强度、非常高的光强度、高温、低温、盐度、重金属毒害作用、厌氧生活、养分缺乏、养分过量、UV照射、大气污染、或诱导活性氧(ROS)的产生的化学物质。
116.如段落88-103中任一项所述的PMP生物反应器,其中该植物刺激剂是化学激发剂。
117.如段落116所述的PMP生物反应器,其中该化学激发剂是水杨酸。
118.如段落116所述的PMP生物反应器,其中该化学激发剂是苯并噻二唑。
119.如段落116所述的PMP生物反应器,其中该化学激发剂是2,6-二氯异烟酸。
120.如段落88-103中任一项所述的PMP生物反应器,其中该刺激剂是增加EXO70a1或EXO84的基因表达的异源核酸。
121.如段落88-120中任一项所述的PMP生物反应器,其中在收获该培养基之前至少24小时添加该刺激剂。
122.一种增加植物的适应度的方法,该方法包括向该植物递送有效量的如段落74-87中任一项所述的PMP组合物,其中相对于未处理的植物,该方法增加该植物的适应度。
123.一种降低植物有害生物的适应度的方法,该方法包括向该植物有害生物递送有效量的如段落74-87中任一项所述的PMP组合物,其中相对于未处理的植物有害生物,该方法降低该植物有害生物的适应度。
124.一种处理有需要的动物的感染的方法,该方法包括向该动物施用有效量的如段落74-87中任一项所述的PMP组合物。
125.一种降低病原体的适应度的方法,该方法包括向该病原体递送有效量的如段落74-87中任一项所述的PMP组合物,其中相对于未处理的病原体,该方法有效降低该病原体的适应度。
126.一种降低动物病原体媒介的适应度的方法,该方法包括向该媒介递送有效量的如段落74-87中任一项所述的PMP组合物,其中相对于未处理的媒介,该方法降低该媒介的适应度。
127.一种用于产生植物信使包(PMP)的方法,该方法包括:
(a)在水培系统的培养基中培养植物或植物部分;
(b)收获该培养基;以及
(c)从该培养基中纯化PMP。
128.如段落127所述的方法,其中该植物或植物部分是番茄植物或番茄植物部分。
129.如段落127所述的方法,其中该植物是幼苗。
130.如段落127所述的方法,其中该植物部分是根。
131.如段落127所述的方法,其中该培养基是液体培养基。
132.如段落127所述的方法,其中该培养基是凝胶培养基。
133.如段落127所述的方法,其中该培养基包含常量营养素、微量营养素、盐、酶、抗生素、抗真菌剂、或植物生长因子中的一种或多种。
134.如段落127所述的方法,其中该水培系统具有至少1L的容量。
135.如段落127所述的方法,其中该水培系统具有至少100L的容量。
136.如段落127所述的方法,其中该水培系统具有至少500L的容量。
137.如段落127所述的方法,其中该收获包括从该植物或植物部分分离该培养基。
138.如段落127所述的方法,其中该收获不包括破坏该植物或植物部分。
139.如段落127所述的方法,其中将该培养进行至少1周。
尽管出于清楚理解的目的,已经通过说明和实例详细地描述了前述发明,但是描述和实例不应被解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的披露都明确地通过引用以其全文并入。
其他实施例在权利要求中。
附录
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- 一种绿色环保的食品厂生产线的污水净化处理装置
- 一种间距可调整的食品加工生产包装装置
- 一种食品生产车间纳米光子波空气灭菌净化装置
- 带壳食品乳液生产用一体化水处理装置
- 食品、装置和生产该食品的生产方法
- 食品、装置和生产该食品的生产方法