促进太空香蕉组培苗生长的丛枝菌根真菌筛选与接种方法

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体是涉及一种促进太空香蕉组培苗生长的丛枝菌根真菌筛选与接种方法。

背景技术

太空香蕉是芭蕉科芭蕉属的巴西蕉经过外太空辐射突变的一种新品种，该品种口感好，产量高，是蕉农首选品种。目前，香蕉栽培依靠大量的化肥，不合理的施用导致资源浪费，生态污染，蕉园土壤板结、微生物群落活力低，而且香蕉种植都是以组织培养的无菌苗为主，有益共生微生物极少，影响苗期植株的生长，抗病虫害和其它抗逆性差，进而极大地影响香蕉的生长和产量。

丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)能够与陆地上85％以上的植物建立共生关系，形成丛枝菌根。大量研究表明，接种AMF能提高幼苗成活率，促进植株对矿质营养的吸收，增加产量，提高植物抗病性等。因AMF具有广谱适应性和功能多面性，作为一种新型的微生物肥料，在减少环境污染和提高植株产量等方面具有无法比拟的作用。因此筛选对太空香蕉组培苗生长有促进作用的优良菌株很有必要，也为蕉苗专用菌肥研发和田间推广生产应用提供科学依据。

发明内容

本发明的目的是提供一种促进太空香蕉组培苗生长的丛枝菌根真菌筛选与接种方法。该发明方法方便简单、精准实施，可操作性强；该发明分离并培养丛枝菌根真菌种类白色球囊霉(Glomus albidum)，制备形成有利于太空香蕉组培苗生长的菌剂，目标明确、效果显著；该发明制备的共生菌剂接种太空香蕉，太空香蕉生长迅速、产量提高、抗逆性增加，为香蕉产业发展提供技术支持。

本发明包括以下步骤：

1)丛枝菌根真菌的土样采集：随机选择生长健壮的太空香蕉植株，在其根际采集土样；首先去除1～3cm地表面的杂草、枯枝落叶等覆盖物，然后挖取0～15cm深的土壤装入塑料袋中；样品采回后倒出，去除碎石、枯枝等杂物后放在阴凉通风处自然晾干保存备用；

2)丛枝菌根真菌的分离：将步骤1)风干的土样，放入容器中加水浸泡，浸泡后过双层分样筛，上层筛孔径1mm，下层筛400目，反复洗刷土样，收集下层筛中的残留物于大号离心管中离心，去掉上清液后加入50％的蔗糖溶液，搅拌均匀后迅速放入离心机再离心，取出将上清液倒入400目筛中，收集残留物于培养皿中；

3)丛枝菌根真菌接种剂单孢扩繁：将步骤2)分离筛选的孢子，单个孢子分离出来在宿主白三叶草中进行单孢扩繁；

4)丛枝菌根真菌的筛选与鉴定：单孢扩繁培养1个月后，根据步骤2)方法分离白三叶草培养基质中的丛枝菌根真菌孢子，观察孢子的形状、颜色、孢壁颜色、孢壁结构、组成孢子内含物等，测量孢子大小、孢壁厚度；鉴定并筛选出为丛枝菌根真菌的白色球囊霉(Glomus albidum)；

5)接种菌剂的制备：将含有步骤4)鉴定为白色球囊霉的培养基质，在大量播种白三叶草分盆培养，培养1～2个月后抽样镜检观察确认侵染成功后，将含有孢子、菌丝及侵染根段的根际土作为接种菌剂；

6)太空香蕉组培苗移栽接种菌剂：将步骤5)处理的接种菌剂与栽培基质按质量比1︰5～10进行混合，然后挑选长势一致的太空香蕉组培苗移栽到含有接种菌剂的栽培基质中培养。

在步骤2)中，所述浸泡的时间可为30～50min，根据土质的不同，适当延长浸泡时间；所述离心是以3000r/min的速度离心3min；所述再离心是以1500r/min的速度离心2min。

在步骤3)中，所述丛枝菌根真菌单孢扩繁，单孢扩繁的基质可采用河沙与泥炭土为3︰1；生长环境：光照强度1500～2500Lux，光照时间12h/d。

在步骤4)中，所述丛枝菌根真菌的白色球囊霉(Glomus albidum)的形态为：

孢子单生，颜色淡黄色，球形，平均直径为182.03μm；孢子壁2层，第1层无色透明，稍厚或与内层等厚，1.5μm；内层浅黄，稍薄，1.0μm；与Melzer’s试剂反应不明显，孢子内含物为白色至近透明的大小不等的圆珠状油滴。

在步骤5)中，所述白三叶草的培养基质为河沙和泥炭土按体积比3︰1混合，生长环境：光照强度1500～2500Lux，光照时间12h/d。

在步骤6)中，所述栽培基质为红壤和泥炭土按体积比2︰1混合，生长环境：光照强度1500～2500Lux，光照时间12h/d。

本发明提供一种有效促进太空香蕉组培苗生长的丛枝菌根真菌筛选与接种方法，通过实验证实，接种菌剂后，蕉苗地上和地下部分发生明显变化，发现该菌种可作为一种高效安全的生物肥料。

1、植株生物量增加：接种丛枝菌根真菌显著地增加地上部分和根系的干重，促进太空香蕉植株的营养生长。

2、植株根系增长明显：丛枝菌根真菌对太空香蕉根表面积和根直径生长有明显的促进作用，有利于香蕉根系的吸收功效，增加植物对矿质营养的吸收，改善植物生长状况，使得菌根化的太空香蕉苗生长优势明显。

3、丛枝菌根真菌对太空香蕉组培苗植株具有明显的促生作用，可作为蕉苗专用菌肥；在微生物菌剂和生物有机肥生产应用中具有广阔的前景。作为一种可再生的、可持续发展的资源，其生态经济效益和环境可持续效应更优于其它生物肥料。

附图说明

图1为本发明实施例丛枝菌根真菌白色球囊霉(Glomus albidum)的孢子形态图(显微镜下400倍)。

图2为本发明实施例太空香蕉苗接种白色球囊霉菌剂后的生长情况对照图。其中，左图为接种白色球囊霉菌剂；右图为空白对照。

图3为本发明实施例太空香蕉苗接种白色球囊霉菌剂后的根系对照图。其中，上为空白对照，下为接种白色球囊霉菌剂。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

本发明实施例包括以下步骤：

1)丛枝菌根真菌的土样采集：在厦门市园林植物园姜目园随机选择生长健壮的太空香蕉植株，在其根际采集土样。首先去除1～3cm地表面的杂草、枯枝落叶等覆盖物，然后挖取0～15cm深的土壤装入塑料袋中。样品采回后倒出，去除碎石、枯枝等杂物后放在阴凉通风处自然晾干保存备用。

2)丛枝菌根真菌的分离：将步骤(1)风干的土样100g，放入大烧杯中加水浸泡约30min，根据土质的不同，适当延长浸泡时间，浸泡一段时间后过双层分样筛(上层筛孔径1mm，下层筛400目)，反复洗刷土样，收集下层筛中的残留物于大号离心管中，在离心机中以3000r/min的速度离心3min，去掉上清液后加入50％的蔗糖溶液，搅拌均匀后迅速放入离心机，以1500r/min的速度离心2min，取出将上清液倒入400目筛中，收集残留物于培养皿中。

3)丛枝菌根真菌接种剂单孢扩繁：将步骤2)分离筛选的孢子，单个孢子分离出来在宿主白三叶草中进行单孢扩繁。

4)丛枝菌根真菌的筛选与鉴定：单孢扩繁培养1个月后，根据上述步骤2)方法分离白三叶草培养基质中的丛枝菌根真菌孢子，孢子用解剖针挑取到载玻片上，用水作为浮载剂进行观察，然后加入Melzer's染液制片，于体视显微镜下观察孢子的形状、颜色、孢壁颜色、孢壁结构、组成孢子内含物等，测量孢子大小、孢壁厚度；鉴定并筛选出为丛枝菌根真菌的白色球囊霉(Glomus albidum)(图1)。

5)接种菌剂的制备：将含有上述步骤4)鉴定为白色球囊霉的培养基质，再大量播种白三叶草分盆培养，培养1～2个月后抽样镜检观察确认侵染成功后，将含有孢子、菌丝及侵染根段的根际土作为接种菌剂。

6)太空香蕉组培苗移栽接种菌剂：将步骤5)处理的接种菌剂与栽培基质按照质量比1︰5～10进行混合，然后挑选长势一致的太空香蕉组培苗移栽到含有接种菌剂的栽培基质中培养，在培养4～12周中，有接种菌剂的栽培基质上培育的太空香蕉组培苗生长速度、生物量极显著高于无接种菌剂的太空香蕉组培苗。

在步骤3)和步骤5)中，所述丛枝菌根真菌单孢扩繁，白三叶草培养基质为河沙和泥炭土按体积比3︰1混合。

在步骤6)中，所述栽培基质为红壤和泥炭土按体积比2︰1混合。

在步骤3)、5)和6)中，白三叶草、培苗生长环境：光照强度1500～2500Lux，光照时间12h/d，温度26(±2)℃。

本发明实施例所述培养的条件如下：

(1)培养基质分别为：

A.丛枝菌根真菌单孢扩繁基质：河沙与泥炭土为3:1。

B.栽培基质：红壤与泥炭土为2:1。

(2)白三叶草生长环境：光照强度1500～2500Lux，光照时间12h/d，温度26(±2)℃。

(3)移栽的生长环境：光照强度1500～2500Lux，光照时间12h/d，温度26(±2)℃。

应用制备接种菌剂的丛枝菌根真菌种类白色球囊霉(Glomus albidum)的形态：

孢子单生，颜色淡黄色，球形，平均直径为182.03μm。孢子壁2层，第1层无色透明，稍厚或与内层等厚，1.5μm；内层浅黄，稍薄，1.0μm。与Melzer’s试剂反应不明显。孢子内含物为白色至近透明的大小不等的圆珠状油滴。

太空香蕉接种丛枝菌根真菌白色球囊霉的菌剂(图2左)平均株高、茎粗、地上部干重、根系干重为6.40cm、0.77cm、0.918g和0.400g，分别比空白对照组(图2右)提高了35.3％、35.1％、99.1％、50.4％。香蕉接种本发明的菌剂，对香蕉地上部分生物量生长有明显促进作用。

太空香蕉接种丛枝菌根真菌白色球囊霉的菌剂(图3下)后的蕉苗总根长显著增加，比空白对照(图3上)处理增长10.3％；处理组根总投影面积为123.878cm