聚合胆汁酸衍生物抑制乙型肝炎病毒和丁型肝炎病毒和NTCP运输

背景技术

超过三分之一的世界人口被乙肝病毒(HBV)感染，目前有2亿4千万人慢性感染，并且有1千5百万人也感染丁肝病毒(HDV)。HBV感染和相关疾病每年引起约1百万例死亡。

我们以前鉴定到牛磺胆酸钠共转运多肽(NTCP)这种肝细胞的关键胆汁盐转运蛋白是HBV和HDV两者的功能受体，并且我们示出了胆汁酸可以抑制HBV和HDV感染(Yan等，Elife 1:e00049,2012；Yan等，J Virol 87:7977-7991,2013；Yan等，J Virol 88:3273-3284,2014)。也已报道了其他NTCP抑制剂干扰HBV和HDV感染，包括厄贝沙坦、依泽替米贝、利托那韦(6)和CSA(例如Blanchet等，Antiviral research 106:111-115,2014)。

我们合成了胆汁酸衍生物，并使用我们的补充有人类NTCP细胞的人类肝细胞瘤HepG2细胞(HepG2-NTCP)培养系统来评估它们对病毒感染和底物运输的抑制效应。通过仔细的定量分析，我们在某些批次的胆汁酸中发现了异常的HBV抑制活性，并调查了这些活性差异的来源。我们确定了某些批次具有污染的聚合胆汁盐副产物，并且解析了这些杂质与相应的正常胆汁盐相比具有更高的比活性。然后，我们制备了许多各不相同的聚合胆汁盐的纯化的批次，并在各种不同单体和连键中证实了所述聚合形式的提高的活性。因此，我们公开了聚合胆汁酸衍生物(PBAD)通过靶向hNTCP而抑制HBV和HDV感染的用途和组合物。

发明概述

本发明提供了用于治疗HBV或HDV感染或抑制人牛磺胆酸钠共转运多肽(hNTCP)的方法和组合物。在一种情况下，所述方法包括向需要的人给药聚合胆汁酸或其盐。所述方法可以包括确定所述人有这种需求的先行步骤，和/或检测得到的治疗效果的后续步骤。

在实施方式中：

(i)所述聚合胆汁酸包含2、3或4个共价连接的单体，每个单体独立地具有式I的结构：

其中每个C1-C24独立地任选被下述基团取代：烃或杂烃基或含有杂原子的官能团(非氢取代基)；或任选取代的烷基或杂烷基、烯基或杂烯基、炔基或杂炔基、烷氧基或杂烷氧基，包括每一者的环状和取代的形式，芳基和杂芳基，其中杂形式包含1-4个杂原子例如N、O、P和S；或取代或未取代的(C1-C4)烷基、(C2-C4)烯基、(C6-C8)烯基、(C2-C4)炔基、(C6-C8)炔基、(C1-C4)烷氧基、(C6-C8)烷氧基、3-氧杂环丁烷基氧基、3-四氢呋喃基氧基、Cl、F、氟取代的(C1-C2)烷基、(C1-C4)烷基-SO

(ii)每个取代基独立地是：

OH，OAc(Ac＝COCH

或具有最多15个碳原子的支链或非支链烷基、芳基、烯基或炔基游离基，具有3至15个碳原子的环烷基游离基，苯基或苯甲基游离基，其是未取代的或者被卤素、(C1-C4)-烷基、(C1-C4)-烷氧基或(C1-C6)-烷基胺或杂原子(例如-SO

(iii)C3、C6、C7和C24各自独立地被下述基团取代：

权利要求2的取代基；或

权利要求3的取代基；或

-NR1R2、-OR或–COR，其中R、R1和R2各自独立地是H或权利要求2的取代基。

(iv)C24被下述基团取代：

-CH

-CONHCH

-COOH、-COOR、-CONH

其中每个R独立地是H，具有最多15个碳原子的支链或非支链烷基、芳基、烯基或炔基游离基，具有3至10个碳原子的环烷基游离基或苯基或苯甲基游离基，其是未取代的或者被卤素(例如F、Cl、Br)、(C1-C4)-烷基或(C1-C4)-烷氧基或(C1-C6)-烷基胺单、双或三取代。

(v)C3、C6和C7各自独立地被下述基团取代：

其中R、R1和R2各自独立地是具有最多15个碳原子的支链或非支链烷基、芳基、烯基或炔基游离基，具有3至15个碳原子的环烷基游离基或苯基或苯甲基游离基，其是未取代的或者被卤素(例如F、Cl、Br)、(C1-C4)-烷基或(C1-C4)-烷氧基或(C1-C6)-烷基胺单、双或三取代。

(vi)所述单体由1或2或3个各自独立为L的连接物连接，其中L是：

(a)具有最多15个碳原子的支链或非支链烷基、芳基、烯基或炔基游离基，其任选被取代并且任选含有杂原子；

(b)具有3至15个碳原子的环烷基游离基或苯基或苯甲基游离基，其是未取代的或者被卤素(例如F、Cl、Br)、(C1-C4)-烷基或(C1-C4)-烷氧基或(C1-C6)-烷基胺单、双或三取代；或

(c)2至200个原子之间、优选地4至100个原子之间、更优选地4至25个原子之间并且MW在20至2K D之间、优选地在40至1K D之间、更优选地在56至1K D之间的连续链。L可以是左右对称的或不对称的，并且可以连接不同的、等距的或一致的M1和M2，通常具有约3至3K A之间、优选地约6至2000A之间、更优选地约12至1000A之间等的跨度；或

(d)用酰胺或酯键键合的烷基、芳基和杂原子、氨基酸或其他氨基烷基磺酸。

(vii)所述聚合胆汁酸包含TUDCA部分；

(viii)所述聚合胆汁酸公开在本文的表中；

(ix)所述聚合胆汁酸采取预定的、单位剂量有效量。

(x)所述方法还包括向所述人给药第二种不同的HBV或HDV药物，和/或检测产生的hNTCP或HBV或HDV感染的抑制。

另一方面，本发明提供了组合物，其包含与第二种不同的HBV或HDV药物共同配制或共同包装或共同给药的聚合胆汁酸或其盐。

在实施方式中，所述聚合胆汁酸是在本文中一般性或具体公开的化合物，包括包含2、3或4个共价连接的单体的聚合酸，每个单体独立地具有式I(同上文)的结构；和/或所述药物是拉米夫定(Epivir)、阿德福韦(Hepsera)、替诺福韦(Viread)、替比夫定(Tyzeka)、恩替卡韦(Baraclude)、波生坦、氧甾酮、依泽替米贝、利血平、罗素伐他汀或溴磺酞钠。

本发明涵盖了本文中叙述的特定实施方式的所有组合。

附图说明

图1是用于研究药物候选物的效能和机制的测定法的示意图。

图2显示了PBAD抑制NTCP介导的HBV和HDV感染。(A-B)在指定的不同浓度的PBAD存在下，用HBV(A)和对照病毒VSV-HBeAg(B)感染的HepG2-NTCP。在感染后第5天(dpi)，通过ELISA检测分泌的HBeAg的水平。(C)在指定的不同浓度的PBAD存在下，用HDV感染的HepG2-NTCP。在感染后第5天，用FITC偶联的4G5染色细胞内δ抗原，并用DAPI进行核染色。

图3显示了PBAD在进入水平上抑制HBV感染。在HBV感染之前(A)或之后(B)，将HepG2-NTCP细胞与指定的不同浓度的PBAD温育。所述处理持续24小时。在5dpi，通过ELISA检测分泌的HBeAg的水平。

图4显示了某些PBAD显著阻断底物被NTCP的摄取。(A)在指定的化学品或myr47(一种对应于L包膜蛋白的前47个氨基酸并在N-端具有肉豆蔻酰化修饰的肽)存在下，对HepG2-NTCP细胞进行[3H]牛磺胆酸盐摄取测定。(B)[3H]牛磺胆酸盐摄取被3UT(NQL-012)、3TPT(NQL-018)、DiU(NQL-009)和myr47的剂量依赖性抑制。将指定的化学品与[3H]牛磺胆酸盐一起添加到HepG2-NTCP细胞上并温育10min，然后确定[3H]牛磺胆酸盐摄取效率。(C)3UT(NQL-012)、3TPT(NQL-018)和myr47抑制NTCP介导的[3H]牛磺胆酸盐摄取的IC50。在摄取测定之前，将HepG2-NTCP细胞用指定浓度的3UT(NQL-012)、3TPT(NQL-018)或Myr47预处理2小时。

图5显示了在HepG2-NTCP细胞上，PBAD抑制HBV感染的IC50。在指定的不同浓度的PBAD存在下，将HepG2-NTCP细胞用HBV感染。在5dpi，使用ELISA检查培养基中的HBeAg水平。

图6显示了3UT(NQL-012)、DiU(NQL-009)和3TPT(NQL-018)在细胞培养物中的毒性。将HepG2-NTCP细胞与指定浓度下的3UT(NQL-012)、DiU(NQL-009)或3TPT(NQL-018)温育48小时，在5dpi，评估细胞存活性并获取图像。

图7显示了PBAD通过靶向NTCP并阻断NTCP与HBV preS1结构域之间的相互作用来抑制病毒感染。(A)FITC-preS1肽与NTCP的结合被PBAD阻断。FITC-preS1结合测定法在指定浓度的化学品存在下进行。(B)3TPT(NQL-018)和myr47抑制FITC-preS1肽与NTCP之间的结合的剂量依赖性测定法。当HepG2-NTCP细胞被预先温育(上图)或与化学品共同温育(下图)3小时时，评估所述结合。

图8显示了连键基团的长度对PBAD活性的影响。我们比较了3TPT(NQL-018)(双酯键，在中间具有5个碳原子)和3THT(双酯键，在中间具有7个碳原子)的活性。在指定浓度的PBAD存在下，将HepG2-NTCP细胞用HBV感染。在5dpi检查培养基中分泌的HBeAg的水平，并且在图中注明了它们的IC50值。

图9显示了PBAD剂量依赖性地抑制HDV感染。在指定的不同浓度的PBAD存在下，将HepG2-NTCP细胞用HDV感染。在感染后第6天，用FITC偶联的单克隆抗体4G5染色细胞内δ抗原。由此计算HDV感染比率。

图10显示了连键基团对PBAD的体外稳定性的影响。在病毒感染前将TUDCA、NQL018、NQL044和NQL055与HBV接种物温育不同时间，并且它们存在于感染期间的接种物中。在5dpi，通过ELISA检测分泌的HBeAg的水平。只有NQL018在长时间温育后显示出活性降低。

图11显示在指定的PBAD存在下，将HepaRG细胞用HBV感染。在5dpi，通过ELISA检测分泌的HBsAg和HBeAg的水平。

图12显示具有各种不同单体和连键的不同PBAD的结构活性关系分析。在指定的不同浓度的PBAD存在下，将HepG2-NTCP细胞用HBV感染。在5-6dpi，通过ELISA检测分泌的HBeAg的水平。

本发明的特定实施方式的描述

本申请包括治疗慢性HBV和HDV感染，针对由垂直传播和意外暴露引起的新的HBV感染提供保护，预防肝移植后的HBV复发和指示NTCP抑制的疾病，例如保护肝细胞免于摄取有毒的胆汁酸或其他NTCP运输的药剂。

提供特定实施方式和实例的描述是出于说明而不是限制的目的。本领域技术人员将会容易地认识到，各种不同的非关键参数可以被改变或修改以产生本质上相似的结果。

除非禁忌或另有注明，否则在这些描述和整个本说明书中，没有具体数量的指称意味着一个或多个，术语“或”意味着和/或，并且多核苷酸序列被理解为涵盖相反链以及本文中描述的可替选骨架。此外，属类用速记法叙述用于记叙所述属类的所有成员；例如，(C1-C3)烷基的叙述是速记法，其用于叙述所有C1-C3烷基：甲基、乙基和丙基，包括其异构体。

胆汁酸是甾类酸，其在甾烷核心中包含4个环，并在C17碳上包含通常为5至8个碳并以羧基作为末端的侧链。胆汁酸涵盖了天然产物例如在哺乳动物的胆汁中存在的胆汁酸，及其合成的衍生物例如在本文中公开的衍生物。

当在本文中使用时，术语“杂原子”通常意味着除了碳或氢之外的任何原子。优选的杂原子包括氧(O)、磷(P)、硫(S)、氮(N)、硅(Si)和卤素，并且优选的杂原子官能团是卤代甲酰基、羟基、醛、胺、季铵盐、胺氧化物、氮杂、二氮杂、叠氮基、氮杂环丙烷、二氮杂环丙烷、肼、腙、羧基、氰基、硫氰基、羰基、卤素、氢过氧基、环氧化物、过氧化物、肟、亚胺、酰亚胺、酰胺、醛亚胺、异腈、异氰酸酯、异硫氰酸酯、硝酸酯、腈、亚硝酸酯、氮化物、硝基、亚硝基、磷酸酯、硫代膦酸酯、膦酰基、磷化物、季鏻盐、甲硅烷、烷基甲硅烷、硅氧烷、卤代甲硅烷、硫化物、亚硫酸酯、磺酸酯、硫代硫酸酯、磺酰基、亚砜、磺酰亚胺、砜、亚砜亚胺、锍和巯基。

除非另有陈述，否则术语“烷基”本身或作为另一个取代基的一部分，意味着直链或支链或环烃类游离基或其组合，其是完全饱和的，具有指定的碳原子数目(即C1-C8意味着1至8个碳)。烷基的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基，以及例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基的同系物和异构体等。

术语“烯基”本身或作为另一个取代基的一部分，意味着直链或支链或环烃类游离基或其组合，其可以是单或多不饱和的，具有指定的碳原子数目(即C2-C8意味着2至8个碳)和一个或多个双键。烯基的实例包括乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)及其更长链的同系物和异构体。

术语“炔基”本身或作为另一个取代基的一部分，意味着直链或支链烃类游离基或其组合，其可以是单或多不饱和的，具有指定的碳原子数目(即C2-C8意味着2至8个碳)和一个或多个叁键。炔基的实例包括乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基及其更长链的同系物和异构体。

术语“亚烷基”本身或作为另一个取代基的一部分，意味着衍生自烷基的二价游离基，正如由-CH

术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷基硫基”(或硫代烷氧基)以其惯常的意义使用，并且分别是指那些通过氧原子、氨基或硫原子附连到分子的剩余部分的烷基。

除非另有陈述，否则术语“杂烷基”本身或与另一个术语组合时，意味着稳定的直链或支链或环烃类游离基或其组合，其由所陈述数目的碳原子和1至3个选自O、N、P、Si和S的杂原子构成，其中所述氮、硫和磷原子可以任选地被氧化，并且所述氮和磷杂原子可以任选地被季化。杂原子O、N、P和S可以位于所述杂烷基的任何内部位置处。杂原子Si可以位于所述杂烷基的任何位置处，包括烷基被附连到分子的剩余部分处的位置。实例包括-CH

同样地，术语“杂亚烷基”本身或作为另一个取代基的一部分，意味着源自于杂烷基的二价游离基，正如由-CH

除非另有陈述，否则术语“环烷基”和“杂环烷基”本身或与其他术语组合时，分别表示“烷基”和“杂烷基”的环状版本。因此，环烷基具有指定的碳原子数目(即C3-C8意味着3至8个碳原子)，并且也可以具有1或2个双键。杂环烷基由指定数目的碳原子和1至3个选自O、N、P、Si和S的杂原子构成，其中所述氮和硫原子可以任选地被氧化，并且所述氮和磷杂原子可以任选地被季化。另外，对于杂环烷基来说，杂原子可以占据所述杂环被附连到分子的剩余部分处的位置。环烷基的实例包括环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的实例包括1-(1,2,5,6-四氢吡啶-基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。

除非另有陈述，否则术语“卤代”和“卤素”自身或作为另一个取代基的一部分，意味着氟、氯、溴或碘原子。另外，诸如“卤代烷基”的术语意味着包括用数目在1至(2m'+1)的范围内的卤素原子取代的烷基，所述卤素原子可以相同或不同，其中m'是所述烷基中碳原子的总数。例如，术语“卤代(C1-C4)烷基”意味着包括三氟甲基、2,2,2-三氟乙基,4-氯丁基、3-溴丙基等。因此，术语“卤代烷基”包括单卤代烷基(用1个卤素原子取代的烷基)和多卤代烷基(用数目在2至(2m'+1)的范围内的卤素原子取代的烷基，其中m'是所述烷基中碳原子的总数)。除非另有陈述，否则术语“全卤代烷基”意味着用(2m'+1)个卤素原子取代的烷基，其中m'是所述烷基中碳原子的总数。例如，术语“全卤代(C1-C4)烷基”意味着包括三氟甲基、五氯乙基、1,1,1-三氟-2-溴-2-氯乙基等。

术语“酰基”是指从有机酸通过除去所述酸的羟基部分而得到的基团。因此，酰基意味着包括例如乙酰基、丙酰基、丁酰基、癸酰基、新戊酰基、苯甲酰基等。

除非另有陈述，否则术语“芳基”意味着多不饱和的通常为芳香族的烃类取代基，其可以是单环或稠合在一起或共价连接的多个环(至多5个环)。芳基的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基和1,2,3,4-四氢萘。

术语“杂芳基”是指含有0至6个选自N、O和S的杂原子的芳基(或环)，其中所述氮和硫原子任选地被氧化，并且所述氮杂原子任选地被季铵化。杂芳基可以通过杂原子附连到分子的剩余部分。杂芳基的非限制性实例包括1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。

为简洁起见，术语“芳基”当与其他术语组合使用时(例如芳氧基、芳基硫氧基、芳基烷基)，包括如上所定义的芳基和杂芳基环两者。因此，术语“芳基烷基”意味着包括那些其中芳基被附连到烷基的游离基(例如苯甲基、苯乙基、吡啶基甲基等)，包括那些其中碳原子(例如亚甲基)已被例如氧原子替换的烷基(例如苯氧基甲基、2-吡啶氧基甲基、3-(1-萘氧基)丙基等)。

每个上述术语(例如“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”)意味着包括所指示的游离基的取代和未取代的形式两者。每种类型的游离基的优选取代基在下文中提供。

用于烷基和杂烷基游离基(以及那些被称为亚烷基、烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的基团)的取代基可以是选自下列的各种不同基团：-OR'，＝O，＝NR'，＝N-OR'，-NR'R"，-SR'，卤素，-SiR'R"R'"，-OC(O)R'，-C(O)R'，-CO

用于烷基和杂烷基游离基的优选取代基选自：-OR'，＝O，-NR'R"，-SR'，卤素，-SiR'R"R'"，-OC(O)R'，-C(O)R'，-CO

同样地，用于芳基和杂芳基的取代基是不同的，并选自：卤素，-OR'，-OC(O)R'，-NR'R"，-SR'，-R'，-CN，-NO

用于芳基和杂芳基的优选取代基选自：卤素，-OR'，-OC(O)R'，-NR'R"，-SR'，-R'，-CN，-NO

当在本文中使用时，取代基-CO

芳基或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选地被式-T-C(O)-(CH

优选的取代基在本文中公开并在表、结构、实施例和权利要求书中示例，并且可以跨本发明的不同化合物应用，即任何给定化合物的取代基可以与其他化合物组合使用。

在特定实施方式中，适用的取代基独立地是取代或未取代的杂原子、取代或未取代的任选杂原子的C1-C6烷基、取代或未取代的任选杂原子的C2-C6烯基、取代或未取代的任选杂原子的C2-C6炔基或取代或未取代的任选杂原子的C6-C14芳基，其中每个杂原子独立地是氧、磷、硫或氮。

在更具体的实施方式中，适用的取代基独立地是醛、醛亚胺、烷酰基氧基、烷氧基、烷氧基羰基、烷氧基、烷基、胺、季铵盐、胺氧化物、氮杂、二氮杂、叠氮基、氮杂环丙烷、二氮杂环丙烷、肼、腙、卤素、氨基甲酰基、羰基、羧酰胺基、羧基、氰基、硫氰基、酯、卤素、卤代甲酰基、氢过氧基、羟基、环氧化物、过氧化物、肟、亚胺、酰亚胺、酰胺、醛亚胺、异腈、异氰酸酯、异硫氰酸酯、N-叔丁氧基羰基、硝酸酯、腈、亚硝酸酯、硝基、亚硝基、磷酸酯、硫代膦酸酯、磷化物、膦酰基、季鏻盐、甲硅烷、烷基甲硅烷、硅氧烷、卤代甲硅烷、硫化物、亚硫酸酯、磺酸酯、硫代硫酸酯、磺酰基、磺基、亚砜、磺酰亚胺、砜、亚砜亚胺、锍、巯基、硫醇、硫氰基、三氟甲基或三氟甲基醚(OCF

术语“可药用盐”意味着包括取决于本文描述的化合物上存在的具体取代基，使用相对无毒的酸或碱制备的活性化合物的盐。当本发明的化合物含有相对酸性的官能团时，可以通过将这些化合物的中性形式与足量的纯净或在适合的惰性溶剂中的所需碱相接触，来获得碱加成盐。可药用碱加成盐的实例包括钠盐、钾盐、钙盐、铵盐、有机胺盐或镁盐或类似的盐。当本发明的化合物含有相对碱性的官能团时，可以通过将这些化合物的中性形式与足量的纯净或在适合的惰性溶剂中的所需酸相接触，来获得酸加成盐。可药用酸加成盐的实例包括源自于无机酸例如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、酸式碳酸、磷酸、一氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、酸式硫酸、氢碘酸或磷酸等的盐，以及源自于相对无毒的有机酸例如乙酸、丙酸、异丁酸、草酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、延胡索酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸等的盐。还包括氨基酸的盐例如精氨酸盐等，以及有机酸例如葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸等的盐。本发明的某些特定化合物含有碱性和酸性官能团两者，允许所述化合物被转化成碱或酸加成盐。

所述化合物的中性形式可以通过将所述盐与碱或酸相接触并以常规方式分离母体化合物来再生。所述化合物的母体形式在某些物理性质例如在极性溶剂中的溶解性上与各种不同的盐形式有差异，但在其他方面所述盐与所述化合物的母体形式对于本发明的目的来说是等同的。

除了盐形式之外，本发明提供了采取前体药物形式的化合物。本文描述的化合物的前体药物是在生理条件下经历化学变化以提供本发明的化合物的化合物。另外，前体药物可以在离体环境中通过化学或生物化学方法转变成本发明的化合物。例如，当置于含有适合的酶或化学试剂的透皮贴片储库中时，前体药物可以缓慢转变成本发明的化合物。前体药物通常是有用的，因为在某些情况下，它们可能比母体药物更容易给药。例如，与母体药物相比，它们通过口服给药的生物可利用性可能更高。前体药物也可能在药物组合物中具有比母体药物更高的溶解性。在本领域中已知广泛的各种前体药物衍生物，例如那些依赖于前体药物的水解切割或氧化活化的衍生物。前体药物的非限制性实例是作为酯(“前体药物”)给药，但随后被代谢水解成羧酸这种活性实体的本发明的化合物。其他实例包括本发明的化合物的肽基衍生物。

本发明的某些化合物可以非溶剂化形式以及溶剂化形式包括水合形式存在。一般来说，溶剂化形式等同于非溶剂化形式，并打算涵盖在本发明的范围之内。本发明的某些化合物可以多种结晶或无定形形式存在。一般来说，所有物理形式对于本发明所设想的用途来说是等同的，并打算涵盖在本发明的范围之内。

某些主题化合物具有不对称碳原子(光学中心)或双键；消旋体、非对映异构体、几何异构体和具体制定或描述的手性是优选的，并且在许多情况下对于最适活性来说是关键的；然而，所有这些异构体都打算涵盖在本发明的范围之内。

本发明的化合物也可以在构成这些化合物的一个或多个原子处含有非天然比例的原子同位素。例如，所述化合物可以用放射活性同位素例如氚(

术语“治疗有效量”是指主题化合物的在一定显著程度上引发研究人员、兽医、医生或其他临床医生所寻求的组织、系统、动物或人类的生物学或医学响应的量，例如当给药时足以在一定程度上防止待治疗病症或障碍的一种或多种症状的发生或缓解所述症状的量。治疗有效量将随着化合物、疾病及其严重性和待治疗哺乳动物的年龄、体重等而变。

本发明还提供了包含主题化合物和可药用赋形剂的药物组合物，特别是包含单位剂量的主题化合物的这类组合物，特别是与描述使用所述组合物治疗适用疾病或病症(本文中的)的说明书共同包装的这类组合物。

用于给药的组合物可以采取散装液体溶液或悬液或散装粉剂的形式。然而，更通常情况下，所述组合物以单位剂量形式存在，以便于准确计算剂量。术语“单位剂量形式”是指适合作为单一剂量用于人类对象和其他哺乳动物的物理上分立的单位，每个单位含有经计算能产生所需治疗效果的预定量的活性材料，并与适合的药物赋形剂相结合。典型的单位剂量形式包括液体组合物的预装填的预先测量过的安瓿或注射器，或在固体组合物的情况下丸剂、片剂、胶囊、锭剂等。在这些组合物中，所述组合物通常是少量组分(约0.1至约50重量％或优选地约1至约40重量％)，其余部分是各种不同的介质或载体和有助于形成所需剂型的加工助剂。

适合的赋形剂或载体和用于制备可给药的组合物的方法对于本领域技术人员来说是已知的或显而易见的，并且更详细地描述在出版物例如《Remington制药学》(Remington's Pharmaceutical Science)，Mack Publishing Co,NJ(1991)中。此外，有利的是，所述化合物可以与本文中描述的或以其他方式在本领域中已知的其他治疗药剂、特别是其他抗糖尿病药物或减肥药联合使用。因此，所述组合物可以分开地、联合地或组合在单一剂量单位中给药。

给药的量取决于化合物配方、给药途径等，并且一般在日常试验中凭经验确定，因此取决于靶、宿主和给药途径等，必然发生变动。一般来说，根据具体应用，制剂的单位药剂中活性化合物的量可以从约1、3、10或30至30、100、300或1000mg变化或调整。在特定实施方式中，将单位剂量形式包装在适合于顺序使用的合装包中，例如包含至少6、9或12个单位剂量形式的板的泡罩包装。使用的实际剂量可以根据患者的需求和待治疗病症的严重性而变。对于特定情况来说适合的剂量的确定在本领域的技术范围之内。一般来说，治疗从低于化合物的最适剂量的较小剂量开始。随后少量提高剂量，直至达到在所述情况下的最佳效果。为方便起见，如果需要，可以将每日总剂量分开并在一日中分份给药。

所述化合物可以通过各种不同方法给药，包括但不限于肠胃外、表面、口服或局部给药，例如通过气溶胶或透皮给药，用于预防性和/或治疗性治疗。此外，依照专业临床医生的知识，治疗方案(例如剂量和给药次数)可以根据给药的治疗剂对患者的观察到的效果并根据疾病对给药的治疗剂的观察到的响应来改变。

本发明的治疗剂可以治疗有效的剂量和量，在用于患者治疗的治疗有效的方案的过程中给药。对于更强效的化合物来说，每千克患者体重微克(μg)级的量可能是足够的，例如在约1、10或100μg/kg至约0.01、0.1、1、10或100mg/kg患者体重的范围内，尽管最适剂量是化合物特异性的并且一般凭经验为每种化合物单独确定。

一般来说，临床试验中的常规实验将为最佳治疗效果、每种治疗剂、每种给药方案确定具体范围，并且也将根据患者的状况和对初次给药的响应性，将对特定患者的给药调整到有效和安全的范围之内。然而，最终给药方案将按照主治临床医生的判断，考虑到诸如患者的年龄、状况和大小以及化合物的效能、待治疗疾病的严重性等因素来调节。例如，化合物的剂量方案可以是10mg至2000mg/日、优选为10至1000mg/日、更优选为50至600mg/日，在2至4个(优选为2个)分药剂中口服给药。也可以使用间歇式疗法(例如三周中的一周或四周中的三周)。

应该理解，本文中描述的实施例和实施方式仅仅是出于说明的目的，本领域技术人员将根据它们提出各种不同的修改或改变，这些修改或改变应该被包含在本申请的精神和范围以及随附的权利要求书的范围之内。本文中引用的所有出版物、专利和专利申请、包括其中的引文，为所有目的整体通过参考并入本文。

实施例

PBAD，包括3UT(NQL-012)、7UT(NQL-015)、DIU(NQL-009)和3TPT(NQL-018)，作为HBV和HDV病毒感染的抑制剂显示出极大提高的效能。我们的数据表明它们可以抑制HBV和HDV对HepG2-NTCP细胞的感染，其IC50低至小于50nM，这比它们的常见前体牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)低100倍。PBAD也可以显著阻断NTCP的底物摄取，因此它们也可以充当NTCP转运抑制剂。

表A

表A(续)

表A(续)

表A(续)

表A(续)

表A(续)

表A(续)

表A(续)：

表A(续)：

表B

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PBAD强力且特异性地抑制HBV和HDV感染。一些天然胆汁酸的抑制效果已被我们(Yan等，J Virol,Mar 2014,88(6):3273-3284)和其他人描述：Ni等，Gastroenterol,Apr2014,146(4):902-905；Konig等，J Hepatol,online 15May 2014。首先，我们聚焦于胆汁酸衍生物修饰(反应图式1)。将含有或不含修饰的一级或二级胆汁盐包括胆酸(CA)、牛磺胆酸(TCA)、甘氨胆酸(GCA)、石胆酸(LCA)、脱氧胆酸(DCA)、牛磺石胆酸(TLCA)、鹅去氧胆酸(CDCA)、熊去氧胆酸(UDCA)、猪去氧胆酸(HDCA)、牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)和其他列出的衍生物与HepG2-NTCP细胞温育，并且随后通过荧光显微术检查FITC标记的pre-S1肽与受体的结合。与胆汁酸阻断pre-S1脂肽结合到NTCP的结果相一致，这些NTCP的底物降低了HDV感染，正如由被感染细胞的细胞内HDVδ抗原的染色所指示的。我们进一步评估了这些胆汁盐在抑制HBV感染中的能力。当在所指示的胆汁盐存在下将HepG2-NTCP用HBV病毒接种时，分泌的HBV e抗原(HBeAg)的水平降低，其中TUDCA在所有试验的胆汁酸衍生物中是最强效的。我们试验的一些修饰的单体胆汁酸包括7-Diz-TUDCA、Iso-TUDCA、CA-UDCA、Diz-UDCA、3-Diz-TUDCA、生物素-UDCA、3-OAc-TUDCA没有显示出与天然单体TUDCA相比显著提高的抑制效率(表C)。

表C

NTCP胆酸单体抑制剂

在活性杂质的定量分析的基础上，我们检查了几种聚合胆汁酸衍生物(表D)。我们首先合成了“头对尾”聚合物，例如二聚体3-UT(NQL-012)和7-UT(NQL-015)。对于“头对头”模序来说，我们尝试了DIU(NQL-009)，其通过酯键直接相连，其他类型的连接正在研究中。对于“尾对尾”连接来说，将3-TPT(NQL-018)和3-TPAT(NQL-044)通过双重酯或酰胺键连接在一起，中间具有5个碳，更多或更少的键连接将尽可能研究。我们发现3-UT(NQL-012)、7-UT(NQL-015)、DIU(NQL-009)、3-TPT(NQL-018)和3-TPAT(NQL-044)针对HBV和HDV两者具有高的抗病毒活性，其中3-TPT对HBV的IC50低至51nM(图5，也请参见图2和3)。

表D试验的PBAD的分子设计

这些数据表明，基于UDCA和TUDCA模序的二聚体胆汁酸具有对抗HBV和HDV感染的活性。

本发明涵盖了本文中公开的两个相同或不同单体胆汁酸衍生物(式I-IV)的所有组合，包括可替选的连接物、它们的可药用盐、共轭酸形式、代谢衍生物，以及这些衍生物和盐的合成、纯化和使用，包括被显示为3-UT(NQL-012)、7-UT(NQL-015)、DIU(NQL-009)、3-TPT和3-TPAT(NQL-044)的结构，它们具有两个UDCA或TUDCA，使用一个UDCA或TUDCA上的酸基团与另一个UDCA或TUDCA上的一个羟基之间的酯键连接(反应图式2)，并包括反应图式3中的式(II)、(III)、(IV)和(V)的二聚体胆汁酸衍生物。

在表E中，二聚体胆汁酸衍生物中的U和T可以是对称的(彼此一致)或不对称的(UDCA与TUDCA的组合)。L是U与T的不同位置之间的偶联连接基团。对于“头对头”的式(V)U1-L-U2来说，L通过共价键在20至24位置处(通过碳原子或其上的取代基)连接U1和U2的两个侧链。对于“头对尾”的式(VI)3-U1-L-U2来说，L通过共价键连接到U1的一个侧链上的20至24位置(通过碳原子或其上的取代基)和U2的3-位置(通过碳原子或取代基X原子)。对于“头对尾”的式(VII)7-U1-L-U2来说，L通过共价键连接到U1的一个侧链上的20至24位置(通过碳原子或其上的取代基)和U2的7-位置(通过碳原子或取代基X原子)。对于“尾对尾”的式(VIII)T1-L-T2来说，L通过共价键连接到T1的3-或7-位置(通过碳原子或取代基X或Y原子)和T2的3-或7-位置(通过碳原子或取代基X或Y原子)。数目n和m可以是任何阿拉伯数字。

表E基于UDCA的二聚体胆汁酸衍生物的化学设计

本发明涵盖了基于B的单体胆汁酸模序的二聚体胆汁酸(表F)，并且除了在表E中示出的UDCA和TUDCA二聚体衍生物之外，本发明总体涵盖了表F中的式(IX)、(X)和(XI)的二聚体胆汁酸衍生物。

在表F中：二聚体胆汁酸衍生物中的B1和B2可以是对称的(彼此一致)或不对称的(所有上面提到的单体胆汁酸衍生物可能性的组合)。L是B1与B2的不同位置之间的偶联连接基团。对于“头对头”的式(IX)B1-L-B2来说，L通过共价键在20至24位置处(通过碳原子或其上的取代基)连接B1和B2的两个侧链。对于“头对尾”的式(X)B1-L-B2来说，L通过共价键连接到B1的一个侧链上的20至24位置(通过碳原子或其上的取代基)和B2的1至19的任何位置(通过环A、B、C和D上的碳原子或其上的取代基原子)。对于“尾对尾”的式(XI)B1-L-B2来说，L通过共价键连接到B1的1至19的任一位置(通过环A、B、C和D上的碳原子或其上的取代基原子)和B2的1至19的任何位置(通过环A、B、C和D上的碳原子或其上的取代基原子)。数目n和m可以是任何阿拉伯数字。

表F二聚体胆汁酸衍生物的化学设计

我们还试验并发现了三聚体胆汁酸衍生物的抗HBV和抗HDV活性，尽管线性三聚体胆汁酸胆汁酸3UUT(参见表D)的活性不如二聚体对应物高(图5，也参见图2和3)。活性三聚体被表G中的式(XII)涵盖。

表G三聚体胆汁酸衍生物的化学设计

对于表G中的三聚体结构(XII)来说：

L是B1、B2和B3之间的偶联连接基团。其中B1、B2和B3是单体胆汁酸衍生物。对于三聚体式(XII)来说，L通过共价键连接到单体胆汁酸衍生物的1至24的任何位置处(碳原子或其上的取代基原子)。数目n、m和o可以是任何阿拉伯数字。

PBAD在进入水平上抑制HBV感染。为了剖析PBAD的抗病毒机制，我们进行了时间过程研究以寻找它们的作用时间窗口。我们发现，这些PBAD当在病毒接种在细胞上之前或期间添加时具有活性，但在病毒接种后添加时没有活性，表明它们可能作用于早期进入过程(图3)。

PBAD显著阻断NTCP的底物摄取。我们进一步分析了PBAD处理对NTCP介导的[3H]标记的牛磺胆酸盐摄取的影响(图4)。在共温育测定法中，大多数高效抑制HBV和HDV感染的PBAD例如3-UT(NQL-012)、7-UT(NQL-015)和3TPT(NQL-018)也抑制NTCP底物摄取，与TUDCA相比具有明显更高的效率(图4A、B)。我们还在预处理测定法中评估了3UT(NQL-012)和3TPT(NQL-018)的摄取抑制。结果显示，3UT(NQL-012)的IC50为108.6nM，3TPT(NQL-018)的IC50为58.7nM，接近于阳性对照试剂(HBV L蛋白的preS1肽)的IC50(图4C)。

PBAD对HepG2-NTCP细胞上的HBV感染的IC50。我们进行了剂量依赖性抑制分析，以更加定量地确定PBAD的IC50。正如在图5中所示，3TPT(NQL-018)显示出最佳的抗HBV活性，其中IC50为51.04nM，比它的单体前体(TUDCA)低100倍。3UT(NQL-012)和DiU(NQL-009)的效能略微低于3TPT(NQL-018)。它们的IC50值分别为100nM和110nM。

PBAD的体外细胞毒性。我们还进行了实验以确定三种PBAD(3-UT(NQL-012)、DIU(NQL-009)、3TPT(NQL-018))对HepG2-NTCP细胞系的LD50。我们用不同浓度的PBAD将细胞处理48小时，并在将它们在PMM中进一步培养3天后捕获细胞的图像。如图6中所示，使用3UT(NQL-012)的处理在高浓度下引起显著的细胞死亡，LD50接近25μM。在高达200μM的DIU(NQL-009)和3TPT(NQL-018)处理后没有观察到可检测的细胞毒性，所述浓度比它对HBV感染的抑制浓度高2000-4000倍。

PBAD通过靶向NTCP并阻断它与HBV preS1结构域的相互作用来抑制病毒感染。我们利用FITC-preS1肽结合测定法来检查PBAD是否阻断FITC-preS1结合到NTCP。如图7A中所示，某些PBAD确实阻断preS1与NTCP之间的相互作用，并且效率与它们的抗HBV活性相关。有趣的是，高浓度的3UUT(NQL-016)、DIU(NQL-009)和CSA引起FITC-preS1肽聚集，这可能归因于它们的疏水性质。此外，我们试验了使用不同浓度3TPT(NQL-018)的预处理与共温育的效果的比较。图7B显示，3TPT(NQL-018)预处理的效果不如共温育的效果强。

PBAD的体外稳定性可以通过连键的优化来增强。我们进行了具有相似结构但具有不同连键的几种PBAD的稳定性分析。图10显示，基于酯键的3TPT(NQL018，表H)在与接种物长时间温育后不稳定。作为比较，NQL044和NQL055稳定得多，因为没有观察到显著的效能降低。这表明体外和体内稳定性在很大程度上由连键基团的特点决定。

表H具有不同连键的UDCA的二聚体胆汁酸衍生物的化学结构实例

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PBAD的抗病毒效能在其他HBV感染系统(HepaRG)上也可以重复并具有相似的抑制曲线。如图11中所示，我们在HepaRG细胞上进行了HBV感染测定，在所述细胞中内源的NTCP表达可以在DMSO后诱导。HBV感染在NQL028、NQL018、NQL029、NQL019和NQL021存在下进行，所有这些物质是具有不同连键长度的基于双酯的PBAD。它们都抑制HBV感染，并且抑制曲线与来自于HepG2-NTCP细胞上的HBV感染的结果相似。

PBAD的结构活性关系分析。在图12中，我们显示了在不同浓度的指定PBAD存在下用HBV感染HepG2-NTCP细胞的结果，所述PBAD具有各种不同的单体和连键。每张图比较了具有相似结构的不同PBAD的效能(表H)，并根据结果分析了它们的结构差异对抗病毒效能的影响。

材料和方法。细胞培养。人肝癌细胞系HepG2来自于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)；人肝癌细胞系(Huh-7)来自于中国科学院典型培养物保藏中心细胞库(Cell Bank of Type Culture Collection,Chinese Academyof Sciences)。将它们用增补有10％胎牛血清(FBS，Gibco)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，Invitrogen)在37℃下培养，每2天定期传代。HepG2NTCP稳定细胞系从HepG2细胞产生，并维持在增补有10％ FBS和500μg/ml G418的DMEM中。将HepG2-NTCP稳定细胞系在胶原蛋白(BD)包被的板或碟子上培养。将这些细胞在PTH维护培养基(PMM)中培养24小时，然后进行病毒感染、肽结合、底物摄取和其他与NTCP相关的实验。

肽、抗体和其他试剂。FITC-pre-S1肽源自于HBV(C-型，GenBank登记号EU554535.1)的pre-S1结构域，其含有前59个残基，具有氨基端肉豆蔻酰基化修饰并在羧基端偶联萤光素异硫氰酸酯(FITC)；myr(+)47肽含有HBV的pre-S1结构域的2-47位残基并具有N-端肉豆蔻酰基化。所有这些肽都由SunLight peptides Inc.(中国北京)合成。1C10是识别HBV核心蛋白的小鼠单克隆抗体(mAb)；4G5是特异性靶向HDVδ抗原的小鼠mAb，#36抗体是特异性靶向NTCP的小鼠mAb。所有mAb都在实验室中通过常规的杂交瘤技术开发。大多数天然胆汁酸购自Sigma Aldrich。活性为15.3Ci/mmol(0.185TBq/mmol)的[3H]标记的牛磺胆酸盐和液体闪烁混合物(Ultima GOLD

病毒生产。病毒粒子在病毒生产质粒转染后从Huh7细胞生产。在转染后，向细胞重新补充PMM，在转染后第3天和第6天收集含有病毒的培养基，离心并储存在-80℃。

FITC-preS1肽结合测定法。将表达NTCP的细胞在PTH维护培养基(PMM)中培养24hrs，然后进行本测定法。对于免疫荧光显微术来说，将细胞与在WME或PMM中稀释的400nMFITC-pre-S1肽在37℃下温育约2～3小时。然后，将细胞用WME清洗一次，然后直接使用荧光显微镜观察。

HBV和HDV感染测定法。在感染之前将HepG2NTCP细胞在PMM中培养12-24小时，然后用200基因组当量复数(mge)的HBV或500mge的HDV接种，在含有5％PEG8000的PMM存在下在37℃温育约24小时。如具体测定法中所指示的，向所述细胞添加待试验的化学物质。在感染后向接种物重新补充PMM。在感染后第5天(dpi)检测感染。

[3H]底物摄取测定法。[3H]牛磺胆酸盐摄取测定法按照以前描述的流程进行(60)。总的来说，将HepG2-NTCP细胞在PMM中培养12-24小时，然后在摄取测定法之前使用或不使用指定的化学物质进行处理。对于底物摄取测定法来说，通常将细胞与0.5μl(0.5μCi)溶解在Na+Ringer’s溶液中的[3H]-牛磺胆酸盐，在具有或没有化学物质存在下在37℃温育10mins。然后，将细胞用PBS清洗一次，用100μl含有1％ TritonX-100的H

用于检测HBeAg和HBsAg的ELISA测定法。用于HBeAg和HBsAg检测的ELISA试剂盒来自于Wantai Pharm Inc.(中国北京)。在感染后2-5天从感染的HepG2NTCP细胞收集上清液。使用来自于Wantai Pharm Inc.(中国北京)的商品化试剂盒，按照制造商的说明书测量培养基中的分泌的HBeAg和HBsAg。

免疫染色测定法。对于HBV感染来说，将感染的细胞用PBS清洗两次，并在室温下在3.7％聚甲醛(PFA)中固定10mins。随后，将细胞在室温下用0.5％ Trition X-100/PBS通透化10mins，在37℃下用3％ BSA阻断1小时，然后与5μg/ml识别HBcAg的小鼠mAb1C10温育，随后用FITC偶联的第二抗体染色。核用DAPI染色为蓝色。将染色的细胞用荧光显微镜(Nikon)成像。对于HDV感染来说，在5dpi，将HDV感染的细胞在室温下用100％甲醇固定10mins，然后用5μg/ml FITC偶联的4G5染色细胞内δ抗原，并用DAPI将核染色成蓝色。通过Eclipse Ti荧光显微镜(Nikon)收集图像，并示出了代表性图片。

PBAD的合成。通过已知方法，或者如果未知的话通过下文中详细描述的方法，从B1或B2制备通式(I)至(VIII)的化合物。连键L从B1或B2上活化的官能团，通过特别是缩合或亲核取代反应过程中共价键的构建来产生。通过合成3-取代的或3-连接的聚合胆汁酸来应用无保护策略。例如，在胆汁酸上的缩合和取代优选地发生在位置3中，其次是位置7。活化的羧酸例如酰基氯、酸酐或氨基酯，在有机或无机碱例如三烷基胺、吡啶、NaOH、KOH等存在下，将直接与游离醇或氨基反应以形成酯或酰胺键。用于这种类型的反应的适合的溶剂包括四氢呋喃、二氯甲烷、醚、乙腈、二甲氧基乙烷和二甲基甲酰胺。通过使用适合的保护基团例如乙酰基酯、三苯甲基、烷基(芳基)甲硅烷基、苯甲基、碳酸烯丙酯、羧基苯甲基和醚，可以选择性地实现在7位和其他位置上的反应。

生物活性聚合胆汁酸衍生物的制备示出在表C和D中，正如从熊去氧胆酸(UDCA)合成3-UT(NQL-012)、3-TPT(NQL-018)和3-TAPT(NQL-044)所示例的。

表I 3-UT(NQL-012)的合成途径

在10mL单颈圆底烧瓶中，将(4R)-4-((3R,7S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-3,7-二羟基-10,13-二甲基十六氢-1H-环戊烷[α]菲-17-基)戊酸(UDCA)(23.5mg，0.06mmol，1.5当量)在室温下溶解在DMF(1mL)中。然后添加2-((4R)-4-((3R,7S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-3,7-二羟基-10,13-二甲基十六氢-1H-环戊烷[α]菲-17-基)戊酰胺基)乙磺酸(TUDCA)(20mg，0.04mmol，1.0当量)、N,N-二异丙基乙基胺(DIEA)(15.5mg，0.12mmol，3.0当量)、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)(5mg，0.04mmol，1.0当量)和N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)(16.5mg，0.08mmol，2.0当量)。在所述添加完成后，将混合物在室温搅拌14h。将混合物浓缩并通过制备HPLC进行纯化，以获得作为白色固体的目标产物(5.0mg)。

表J的实例类似于表I来获得。

实例

表K NQL-018的合成途径

在10mL单颈圆底烧瓶中，将2-((4R)-4-((3R,7S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-3,7-二羟基-10,13-二甲基十六氢-1H-环戊烷[α]菲-17-基)戊酰胺基)乙磺酸(UDCA)(50.0mg，0.1mmol，2.0当量)在室温下溶解在DMF(1mL)中。然后添加戊二酸(6.6mg，0.05mmol，1.0当量)、N,N-二异丙基乙基胺(DIEA)(25.8mg，0.2mmol，4.0当量)、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)(6.1mg，0.05mmol，1.0当量)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)(23.0mg，0.12mmol，2.4当量)。在所述添加完成后，将混合物在室温下搅拌14h。将混合物浓缩并直接使用。

在10mL单颈圆底烧瓶中，将上述5-(((3R,7S,9S,10S,13R,14S,17R)-7-羟基-10,13-二甲基-17-((R)-5-氧-5-((2-磺乙基)氨基)戊-2-基)十六氢-1H-环戊烷[α]菲-3-基)氧基)-5-氧戊酸(30.6mg，0.05mmol，1.0当量)在室温下溶解在DMF(1mL)中。然后添加2-((4R)-4-((3R,7S,8R,9S,10S,13R,14S,17R)-3,7-二羟基-10,13-二甲基十六氢-1H-环戊烷[α]菲-17-基)戊酰胺基)乙磺酸(25.0mg，0.05mmol，1.0当量)、1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧六氟磷酸盐(HATU)(19.0mg，0.05mmol，1.0当量)和N,N-二异丙基乙基胺(DIEA)(25.8mg，0.2mmol，4.0当量)。在所述添加完成后，将混合物在室温下搅拌14h。将混合物浓缩并通过pre-HPLC进行纯化，以得到作为白色固体的目标产物(9.3mg)，其通过NMR和质谱得到确认。

表L的实例类似于表K来获得。

实例

表M NQL-044的合成途径

在100mL单颈圆底烧瓶中，将(4R)-4-((3R,7S,9S,10S,13R,14S,17R)-3,7-二羟基-10,13-二甲基十六氢-1H-环戊烷[α]菲-17-基)戊酸(10.0g，25.5mmol，1.0当量)在室温下溶解在MeOH(100mL)中。然后添加PTSA(催化剂)。在所述添加完成后，将混合物在80℃搅拌14h。将混合物浓缩并用浓NaHCO

在100mL三颈圆底烧瓶中，将PPh3(2.6g，10.0mmol，2.0当量)在-15℃下溶解在无水THF(100mL)中，然后在Ar下逐滴加入DIAD(2.02g，10mmol，2.0当量)。10min后，逐滴添加溶解在THF(10mL)中的(4R)-4-((3R,7S,9S,10S,13R,14S,17R)-3,7-二羟基-10,13-二甲基十六氢-1H-环戊烷[α]菲-17-基)戊酸甲酯(2.0g，5.0mmol，1.0当量)。将混合物在室温搅拌30min。然后加入甲磺酸(960mg，10.0mmol，2.0当量)。在所述添加完成后，将混合物在室温搅拌14h。通过添加浓NaHCO

在25mL单颈圆底烧瓶中，将(4R)-4-((3S,7S,9S,10S,13R,14S,17R)-7-羟基-10,13-二甲基-3-((甲基磺酰基)氧基)十六氢-1H-环戊烷[α]菲-17-基)戊酸甲酯(1.2g，2.5mmol，1.0当量)在室温下溶解在DMF(10mL)中。然后添加NaN

将所述粗产物在室温下溶解在MeOH(10mL)中。然后加入Pd/C(0.5g)并用充满H

在10mL单颈圆底烧瓶中，将(4R)-4-((3R,7S,9S,10S,13R,14S,17R)-3-氨基-7-羟基-10,13-二甲基十六氢-1H-环戊烷[α]菲-17-基)戊酸甲酯(120.0mg，0.3mmol，1.0当量)在室温下溶解在DMF(2.0mL)中。然后添加2-戊二酸(39.6mg，0.3mmol，1.0当量)、DIEA(116.0mg，0.9mmol，3.0当量)、DMAP(36mg，0.3mmol，1.0当量)和EDC(173mg，0.9mmol，3.0当量)。在所述添加完成后，将混合物在室温搅拌24h。所述混合物通过UPLC得以确认，浓缩并通过层析柱进行纯化(DCM:MeOH＝20:1)，以得到目标产物(52mg)。

在10mL单颈圆底烧瓶中，将(4R)-4-((3S,7R,10S,13R,17R)-7-羟基-3-(5-(((3R,7S,10S,13R,17R)-7-羟基-17-((R)-5-甲氧基-5-氧戊-2-基)-10,13-二甲基十六氢-1H-环戊烷[α]菲-3-基)氨基)-5-氧戊酰胺基)-10,13-二甲基十六氢-1H-环戊烷[α]菲-17-基)戊酸甲酯(52.0mg，0.057mmol，1.0当量)在室温下溶解在THF(1.0mL)/MeOH(0.2mL)/H

将所述粗产物在室温下溶解在DMF(1.5mL)中。然后添加2-氨基乙磺酸(42.5mg，0.34mmol，6.0当量)、DIEA(58.8mg，0.46mmol，8.0当量)、DMAP(7mg，0.05mmol，1.0当量)和EDC(32.6mg，0.17mmol，3.0当量)。在所述添加完成后，将混合物在室温搅拌14h。将混合物浓缩并通过pre-HPLC进行纯化，以得到作为白色固体的目标产物(0.7mg)，其通过NMR和质谱得以确认。

表N的实例类似于表M来获得。

实例

表O NQL-055的合成途径

在100mL单颈圆底烧瓶中，将(4R)-4-((3R,7S,9S,10S,13R,14S,17R)-3,7-二羟基-10,13-二甲基十六氢-1H-环戊烷[α]菲-17-基)戊酸(406.0mg，1.0mmol，1.0当量)和3-溴丙-1-炔(476.0mg，4.0mmol，4.0当量)在室温下溶解在DMF(2mL)中。在所述添加完成后，将混合物在室温下搅拌14h。将所述混合物用水洗涤并用EA萃取，浓缩并通过层析柱进行纯化(DCM:MeOH＝20:1)，以得到目标产物(50mg)，其通过NMR得以确认。

在100mL单颈圆底烧瓶中，将(4R)-4-((3R,7S,9S,10S,13R,14S,17R)-3,7-二羟基-10,13-二甲基十六氢-1H-环戊烷[α]菲-17-基)戊酸(10.0g,25.5mmol，1.0当量)在室温下溶解在MeOH(100mL)中。然后添加PTSA(催化剂)。在所述添加完成后，将混合物在80℃下搅拌14h。将混合物浓缩并用浓NaHCO

在100mL三颈圆底烧瓶中，将PPh

在25mL单颈圆底烧瓶中，将(4R)-4-((3S,7S,9S,10S,13R,14S,17R)-7-羟基-10,13-二甲基-3-((甲基磺酰基)氧基)十六氢-1H-环戊烷[α]菲-17-基)戊酸甲酯(1.2g，2.5mmol，1.0当量)在室温下溶解在DMF(10mL)中。然后添加NaN

在10mL单颈圆底烧瓶中，将(4R)-4-((3R,7S,9S,10S,13R,14S,17R)-3-叠氮基-7-羟基-10,13-二甲基十六氢-1H-环戊烷[α]菲-17-基)戊酸甲酯(35.5mg，0.084mmol，1.5当量)和(4R)-4-((3R,7S,9S,10S,13R,14S,17R)-3-(乙炔基氧基)-7-羟基-10,13-二甲基十六氢-1H-环戊烷[α]菲-17-基)戊酸甲酯(25.0mg，0.056mmol，1.0当量)在室温下溶解在DMF(2.0mL)中。然后添加H

在10mL单颈圆底烧瓶中，将(4S)-4-((3S,7R,9R,10R,13S,14R,17S)-7-羟基-3-((1-((3R,7S,9S,10S,13R,14S,17R)-7-羟基-17-((R)-5-甲氧基-5-氧戊-2-基)-10,13-二甲基十六氢-1H-环戊烷[a]菲-3-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)-10,13-二甲基十六氢-1H-环戊烷[a]菲-17-基)戊酸甲酯(20.0mg，0.023mmol，1.0当量)在室温下溶解在THF(1.0mL)/MeOH(0.2mL)/H

将所述粗产物在室温下溶解在DMF(1.5mL)中。然后添加2-氨基乙磺酸(17.8mg，0.142mmol，6.0当量)、DIEA(24.7mg，0.192mmol，8.0当量)、DMAP(3mg，0.024mmol，1.0当量)和EDC(13.6mg，0.71mmol，3.0当量)。在所述添加完成后，将混合物在室温搅拌14h。将混合物浓缩并通过pre-HPLC进行纯化，得到作为白色固体的目标产物(4.4mg)，其通过NMR得以确认。

表P的实例类似于表O来获得。

实例

表Q NQL-052的合成途径

在100mL单颈圆底烧瓶中，将(4R)-4-((3R,7S,9S,10S,13R,14S,17R)-3,7-二羟基-10,13-二甲基十六氢-1H-环戊烷[α]菲-17-基)戊酸(10.0g,25.5mmol，1.0当量)在室温下溶解在MeOH(100mL)中。然后添加PTSA(催化剂)。在所述添加完成后，将混合物在80℃搅拌14h。将所述混合物浓缩并用浓NaHCO

在25mL单颈圆底烧瓶中，将(4R)-4-((3R,7S,9S,10S,13R,14S,17R)-3,7-二羟基-10,13-二甲基十六氢-1H-环戊烷[a]菲-17-基)戊酸甲酯(203.0mg，0.5mmol，1.0当量)在室温下溶解在DMF(10mL)中。然后添加1,5-二溴戊烷(111.5mg，0.5mmol，1.0当量)和KOH(56.0mg，1.0mmol，2.0当量)。在所述添加完成后，将混合物在室温搅拌36h。将混合物用水洗涤并用EA萃取，浓缩，以得到粗产物，其被直接使用。

在10mL单颈圆底烧瓶中，将4,4'-((3R,3'R,7S,7'S,10S,10'S,13R,13'R,17R,17'R)-(戊烷-1,5-二基双(氧基))双(7-羟基-10,13-二甲基十六氢-1H-环戊烷[a]菲-3,17-二基))(4R,4'R)-二戊酸二甲酯(粗品)在室温下溶解在THF(1.0mL)/MeOH(0.2mL)/H

将所述产物在室温下溶解在DMF(1.5mL)中。然后添加2-氨基乙磺酸(42.5mg，0.34mmol，6.0当量)、DIEA(58.8mg，0.46mmol，8.0当量)、DMAP(7mg，0.05mmol，1.0当量)和EDC(32.6mg，0.17mmol，3.0当量)。在所述添加完成后，将混合物在室温搅拌14h。将所述混合物浓缩并通过pre-HPLC进行纯化，以得到作为白色固体的目标产物(2.6mg)，其通过NMR和UPLC/MS得以确认。

表R的实例类似于表Q来获得。

实例

/>

表S NQL-052的合成途径

在100mL单颈圆底烧瓶中，将(4R)-4-((3R,7S,9S,10S,13R,14S,17R)-3,7-二羟基-10,13-二甲基十六氢-1H-环戊烷[α]菲-17-基)戊酸(10.0g,25.5mmol，1.0当量)在室温下溶解在MeOH(100mL)中。然后添加PTSA(催化剂)。在所述添加完成后，将混合物在80℃搅拌14h。将混合物浓缩并用浓NaHCO

在100mL三颈圆底烧瓶中，将PPh

在25mL单颈圆底烧瓶中，将(4R)-4-((3S,7S,9S,10S,13R,14S,17R)-7-羟基-10,13-二甲基-3-((甲基磺酰基)氧基)十六氢-1H-环戊烷[α]菲-17-基)戊酸甲酯(1.2g，2.5mmol，1.0当量)在室温下溶解在DMF(10mL)中。然后添加NaN

将所述粗产物在室温下溶解在MeOH(10mL)中。然后添加Pd/C(0.5g)并使用充满H

在10mL单颈圆底烧瓶中，将(4R)-4-((3R,7S,9S,10S,13R,14S,17R)-3-氨基-7-羟基-10,13-二甲基十六氢-1H-环戊烷[α]菲-17-基)戊酸甲酯(120.0mg，0.3mmol，1.0当量)在室温下溶解在DMF(2.0mL)中。然后添加2-戊二酸(39.6mg，0.3mmol，1.0当量)、DIEA(116.0mg，0.9mmol，3.0当量)、DMAP(36mg，0.3mmol，1.0当量)和EDC(173mg，0.9mmol，3.0当量)。在所述添加完成后，将混合物在室温搅拌24h。所述混合物通过UPLC得以确认，浓缩并通过层析柱进行纯化(DCM:MeOH＝20:1)，得到目标产物(52mg)。

在10mL单颈圆底烧瓶中，将(4R)-4-((3S,7R,10S,13R,17R)-7-羟基-3-(5-(((3R,7S,10S,13R,17R)-7-羟基-17-((R)-5-甲氧基-5-氧戊-2-基)-10,13-二甲基十六氢-1H-环戊烷[α]菲-3-基)氨基)-5-氧戊酰胺基)-10,13-二甲基十六氢-1H-环戊烷[α]菲-17-基)戊酸甲酯(45.0mg，0.05mmol，1.0当量)在室温下溶解在THF(1.0mL)/MeOH(0.2mL)/H

将所述粗产物在室温下溶解在DMF(1.5mL)中。然后添加乙烷-1,2-二醇(2.2mg，0.035mmol，0.7当量)、DIEA(25.8mg，0.2mmol，4.0当量)、DMAP(6mg，0.05mmol，1.0当量)和DCC(31.0mg，0.15mmol，3.0当量)。在所述添加完成后，将混合物在室温搅拌14h。将所述混合物浓缩并通过pre-HPLC进行纯化，得到作为白色固体的目标产物(3.4mg)，其通过NMR得以确认。

表T的实例类似于表S来获得。

实例

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