一种烟草瞬时表达调控关键因子及其在提高瞬时表达效率中的应用

技术领域

本发明涉及植物转基因技术领域，尤其涉及一种烟草瞬时表达调控关键因子及其在提高瞬时表达效率中的应用。

背景技术

植物瞬时表达技术是通过分子生物学手段将外源基因在底盘植物中短时间内表达的技术。该技术不需要外源基因整合到底盘植物基因组上，不存在基因飘移等风险，具有快速、高效、易量产等特点，被广泛应用的基因功能研究及生物反应器领域。瞬时表达作为最新一代生物反应器技术已经开始用于药用蛋白、疫苗等开发；2022年加拿大卫生部已批准新冠疫苗产品Covifenz(基于植物的病毒样颗粒[VLP]，重组，佐剂)。该疫苗适用于18-64岁人群，进行主动免疫，以预防由SARS-CoV-2引起的新冠肺炎，该疫苗的生产正是通过烟草瞬时表达系统完成的。因此，瞬时表达技术正在推动生物制药领域的技术革新。

瞬时表达技术的关键就是外源蛋白的高效表达，只有高效的瞬时表达系统才能够满足该技术的产业化需求，但目前的烟草瞬时表达技术效率低，成本高，无法满足大量生产的需要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是目前的烟草瞬时表达技术效率低，成本高，无法满足大量生产的需要。

为解决上述问题，本发明发现了一种烟草瞬时表达调控关键因子TEF1，能够作为促进因子应用到烟草瞬时表达效率提升。通过构建了35S::TEF1过表达载体，侵染外植体，提高了烟草的瞬时表达效率，而表达效率的提升会大大降低蛋白表达成本。

为达到上述目的，本发明具体通过以下技术方案实现：

一种烟草瞬时表达调控关键因子，其核酸序列为SEQ ID NO.1。

SEQ ID NO.1：

ATGCTTACTTTGCTTCTTGGATTTGACACAAAATCTGCTGCTGCTCTTTCCAAATGTATGATAATGGGGGCATCAGCATCATCAGTATGGTACAATTTGAGGGTACCACATCCATGCAGAGAAGTACCTATACTTGATTATGATTTGGCTCTATTATTTCAGCCTATGCTCATGTTTGGCATCACACTTGGTGTTTCTCTAAGTGTTGTCTTCCCTTATTGGCTCATTACTGTTCTCATCATCATCCTCTTCATGGGGACTTCATCAAGATCATTTTTTAAAGCAATTGAGATGTGGAAAGAAGAAACAATTTTCAAGAAATCAATGGAAGAAGTTCCAGTTAATTCACGTGGTGAACTTATTGTTATTGATACAATGTATGAGCCACTGGTCCCTAGGGAGGAGAAAACACCACTGGAAATTTTTAGGTTCAACCTTAATTTGAAGAGAATTATGGTGCTCTTCTTAGTATGGTTCATATTTCTGATTCTTCAAGTGTTCAAGAACGATCTAATGGCTTGTTCTCCATTGTACTGGGTGCTCAACTTACTACAGTTCCCAGTAGCATTCACAGTGTTTGGATATGAATGTGTGAAATTGTACAAGGAAAGCAAGAAGAGGAGACTTGAAGGGAATACACAGTCAATATGTGAGGCTGACATTCAATGGACTGCCACAAACCTCATCTTCTGTGCCCTTTGTGGCATATTGGGAGGCACTGTTGGAGGATTGCTTGGATCTGGTGGTGGATTCATTCTTGGCCCTCTTCTTCTTGAGATTGGAGTTATCCCTCAGGTAGCTAGTGCGACAGCAACATTTGTGATGATGTTCTCATCGTCTTTATCAGTGGTGGAGTTTTATCTCCTCAAGAGATTTCCAATGCCTTATGCTCTATATCTCATGAGTGTATCTATTCTTGCTGGCTTTTGGGGACAATGCTTCATTAGAAAACTTATCGCAATCTTAAAGAGAGCATCACTCATTGTATTCATACTTTCTGGTGTCATTTTCGCCAGCGCTCTCACAATGGGAGTGGTCGGGATAGAGAAGAGCATCAGTATGATACAGAACCATGAGTTCATGGGGTTCTTGGATTTCTGCAGCAGTCAATAA

本发明命名该瞬时表达调控关键因子为TEF1_CDS，转录数据表明该基因在农杆菌入侵烟草后明显下调表达，推测TEF1的表达量降低能够抵抗外源菌的入侵。烟草瞬时表达本质上是农杆菌入侵叶片的过程因此，降低烟草对外源菌的侵染能力就可以提高瞬时表达效率，TEF1表达降低可能提高植物对外源菌的侵染，因此，本专利通过过量表达TEF1可以降低烟草对外源菌的入侵，进而提高瞬时表达效率。

一种利用上述瞬时表达调控关键因子构建的过表达载体35S::TEF1，其核酸序列为SEQ ID NO.2。

SEQ ID NO.2：

TGGCAGGATATATTGTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGAATTAACGCCGAATTAATTCGAGCTCGGATCTGATAATTTATTTGAAAATTCATAAGAAAAGCAAACGTTACATGAATTGATGAAACAATACAAAGACAGATAAAGCCACGCACATTTAGGATATTGGCCGAGATTACTGAATATTGAGTAAGATCACGGAATTTCTGACAGGAGCATGTCTTCAATTCAGCCCAAATGGCAGTTGAAATACTCAAACCGCCCCATATGCAGGAGCGGATCATTCATTGTTTGTTTGGTTGCCTTTGCCAACATGGGAGTCCAAGATTCTGCAGTCAAATCTCGGTGACGGGCAGGACCGGACGGGGCGGTACCGGCAGGCTGAAGTCCAGCTGCCAGAAACCCACGTCATGCCAGTTCCCGTGCTTGAAGCCGGCCGCCCGCAGCATGCCGCGGGGGGCATATCCGAGCGCCTCGTGCATGCGCACGCTCGGGTCGTTGGGCAGCCCGATGACAGCGACCACGCTCTTGAAGCCCTGTGCCTCCAGGGACTTCAGCAGGTGGGTGTAGAGCGTGGAGCCCAGTCCCGTCCGCTGGTGGCGGGGGGAGACGTACACGGTCGACTCGGCCGTCCAGTCGTAGGCGTTGCGTGCCTTCCAGGGGCCCGCGTAGGCGATGCCGGCGACCTCGCCGTCCACCTCGGCGACGAGCCAGGGATAGCGCTCCCGCAGACGGACGAGGTCGTCCGTCCACTCCTGCGGTTCCTGCGGCTCGGTACGGAAGTTGACCGTGCTTGTCTCGATGTAGTGGTTGACGATGGTGCAGACCGCCGGCATGTCCGCCTCGGTGGCACGGCGGATGTCGGCCGGGCGTCGTTCTGGGCTCATCGATTCGATTTGGTGTATCGAGATTGGTTATGAAATTCAGATGCTAGTGTAATGTATTGGTAATTTGGGAAGATATAATAGGAAGCAAGGCTATTTATCCATTTCTGAAAAGGCGAAATGGCGTCACCGCGAGCGTCACGCGCATTCCGTTCTTGCTGTAAAGCGTTGTTTGGTACACTTTTGACTAGCGAGGCTTGGCGTGTCAGCGTATCTATTCAAAAGTCGTTAATGGCTGCGGATCAAGAAAAAGTTGGAATAGAAACAGAATACCCGCGAAATTCAGGCCCGGTTGCCATGTCCTACACGCCGAAATAAACGACCAAATTAGTAGAAAAATAAAAACTGACTCGGATACTTACGTCACGTCTTGCGCACTGATTTGAAAAATCTCAGAATTCCACGTAATAAGTGTGCGTTGAATTTATTCGCAAAAACATTGCATATTTTCGGCAAAGTAAAATTTTGTTGCATACCTTATCAAAAAATAAGTGCTGCATACTTTTTAGAGAAACCAAATAATTTTTTATTGCATACCCGTTTTTAATAAAATACATTGCATACCCTCTTTTAATAAAAAATATTGCATACTTTGACGAAACAAATTTTCGTTGCATACCCAATAAAAGATTATTATATTGCATACCCGTTTTTAATAAAATACATTGCATACCCTCTTTTAATAAAAAATATTGCATACGTTGACGAAACAAATTTTCGTTGCATACCCAATAAAAGATTATTATATTGCATACCTTTTCTTGCCATACCATTTAGCCGATCAATTGTGCTCGGCACACGTGCAATTCGAGCTCCCTACCCCTACTCCAAAAATGTCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCTATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATTTCGGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTCATCGAAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCTATCATTCAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGACATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACCCCTACTCCAAAAATGTCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCTATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATTTCGGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTCATCGAAAGGACAGTAGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCTATCATTCAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGACATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGCCACCATGCTCGAGCCCGGGACTAGTATGCTTACTTTGCTTCTTGGATTTGACACAAAATCTGCTGCTGCTCTTTCCAAATGTATGATAATGGGGGCATCAGCATCATCAGTATGGTACAATTTGAGGGTACCACATCCATGCAGAGAAGTACCTATACTTGATTATGATTTGGCTCTATTATTTCAGCCTATGCTCATGTTTGGCATCACACTTGGTGTTTCTCTAAGTGTTGTCTTCCCTTATTGGCTCATTACTGTTCTCATCATCATCCTCTTCATGGGGACTTCATCAAGATCATTTTTTAAAGCAATTGAGATGTGGAAAGAAGAAACAATTTTCAAGAAATCAATGGAAGAAGTTCCAGTTAATTCACGTGGTGAACTTATTGTTATTGATACAATGTATGAGCCACTGGTCCCTAGGGAGGAGAAAACACCACTGGAAATTTTTAGGTTCAACCTTAATTTGAAGAGAATTATGGTGCTCTTCTTAGTATGGTTCATATTTCTGATTCTTCAAGTGTTCAAGAACGATCTAATGGCTTGTTCTCCATTGTACTGGGTGCTCAACTTACTACAGTTCCCAGTAGCATTCACAGTGTTTGGATATGAATGTGTGAAATTGTACAAGGAAAGCAAGAAGAGGAGACTTGAAGGGAATACACAGTCAATATGTGAGGCTGACATTCAATGGACTGCCACAAACCTCATCTTCTGTGCCCTTTGTGGCATATTGGGAGGCACTGTTGGAGGATTGCTTGGATCTGGTGGTGGATTCATTCTTGGCCCTCTTCTTCTTGAGATTGGAGTTATCCCTCAGGTAGCTAGTGCGACAGCAACATTTGTGATGATGTTCTCATCGTCTTTATCAGTGGTGGAGTTTTATCTCCTCAAGAGATTTCCAATGCCTTATGCTCTATATCTCATGAGTGTATCTATTCTTGCTGGCTTTTGGGGACAATGCTTCATTAGAAAACTTATCGCAATCTTAAAGAGAGCATCACTCATTGTATTCATACTTTCTGGTGTCATTTTCGCCAGCGCTCTCACAATGGGAGTGGTCGGGATAGAGAAGAGCATCAGTATGATACAGAACCATGAGTTCATGGGGTTCTTGGATTTCTGCAGCAGTCAATAAGGATCCGGACCGCCACCGGGGCCATGGGTTAACCCTAGGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGAAGCTTAGGCCTTCTAGAACGCGTTGCCGAGCACAATTGATCGGCTAAATGGTATGGCAAGAAAAGGTATGCAATATAATAATCTTTTATTGGGTATGCAACGAAAATTTGTTTCGTCAACGTATGCAATATTTTTTATTAAAAGAGGGTATGCAATGTATTTTATTAAAAACGGGTATGCAATATAATAATCTTTTATTGGGTATGCAACGAAAATTTGTTTCGTCAAAGTATGCAATATTTTTTATTAAAAGAGGGTATGCAATGTATTTTATTAAAAACGGGTATGCAATAAAAAATTATTTGGTTTCTCTAAAAAGTATGCAGCACTTATTTTTTGATAAGGTATGCAACAAAATTTTACTTTGCCGAAAATATGCAATGTTTTTGCGAATAAATTCAACGCACACTTATTACGTGGACGTCGAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGCTAGAGCAGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTAAACTATCAGTGTTTGACAGGATATATTGGCGGGTAAACCTAAGAGAAAAGAGCGTTTATTAGAATAACGGATATTTAAAAGGGCGTGAAAAGGTTTATCCGTTCGTCCATTTGTATGTGCATGCCAACCACAGGGTTCCCCTCGGGATCAAAGTACTTTGATCCAACCCCTCCGCTGCTATAGTGCAGTCGGCTTCTGACGTTCAGTGCAGCCGTCTTCTGAAAACGACATGTCGCACAAGTCCTAAGTTACGCGACAGGCTGCCGCCCTGCCCTTTTCCTGGCGTTTTCTTGTCGCGTGTTTTAGTCGCATAAAGTAGAATACTTGCGACTAGAACCGGAGACATTACGCCATGAACAAGAGCGCCGCCGCTGGCCTGCTGGGCTATGCCCGCGTCAGCACCGACGACCAGGACTTGACCAACCAACGGGCCGAACTGCACGCGGCCGGCTGCACCAA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本发明构建的35S::TEF1过表达载体，通过农杆菌(35S::TEF1)与目标农杆菌(含有pJL-TRBO-GFP，可表达绿色荧光蛋白)共转化试验发现，在瞬时表达后，TEF1的高表达明显提高了GFP的表达水平；表明TEF1能够作为促进因子应用到烟草瞬时表达效率提升。该方法操作简单易行，没有额外成本支出，瞬时表达效率提升效果好，表达效率的提升会大大降低蛋白表达成本。

其中，pJL-TRBO-GFP的核酸序列为SEQ ID NO.3。

SEQ ID NO.3：

GGGTAAACCTAAGAGAAAAGAGCGTTTATTAGAATAATCGGATATTTAAAAGGGCGTGAAAAGGTTTATCCGTTCGTCCATTTGTATGTGCATGCCAACCACAGGAGATCTCAGTAAAGCGCTGGCTGCTGAACCCCCAGCCGGAACTGACCCCACAAGGCCCTAGCGTTTGCAATGCACCAGGTCATCATTGACCCAGGCGTGTTCCACCAGGCCGCTGCCTCGCAACTCTTCGCAGGCTTCGCCGACCTGCTCGCGCCACTTCTTCACGCGGGTGGAATCCGATCCGCACATGAGGCGGAAGGTTTCCAGCTTGAGCGGGTACGGCTCCCGGTGCGAGCTGAAATAGTCGAACATCCGTCGGGCCGTCGGCGACAGCTTGCGGTACTTCTCCCATATGAATTTCGTGTAGTGGTCGCCAGCAAACAGCACGACGATTTCCTCGTCGATCAGGACCTGGCAACGGGACGTTTTCTTGCCACGGTCCAGGACGCGGAAGCGGTGCAGCAGCGACACCGATTCCAGGTGCCCAACGCGGTCGGACGTGAAGCCCATCGCCGTCGCCTGTAGGCGCGACAGGCATTCCTCGGCCTTCGTGTAATACCGGCCATTGATCGACCAGCCCAGGTCCTGGCAAAGCTCGTAGAACGTGAAGGTGATCGGCTCGCCGATAGGGGTGCGCTTCGCGTACTCCAACACCTGCTGCCACACCAGTTCGTCATCGTCGGCCCGCAGCTCGACGCCGGTGTAGGTGATCTTCACGTCCTTGTTGACGTGGAAAATGACCTTGTTTTGCAGCGCCTCGCGCGGGATTTTCTTGTTGCGCGTGGTGAACAGGGCAGAGCGGGCCGTGTCGTTTGGCATCGCTCGCATCGTGTCCGGCCACGGCGCAATATCGAACAAGGAAAGCTGCATTTCCTTGATCTGCTGCTTCGTGTGTTTCAGCAACGCGGCCTGCTTGGCCTCGCTGACCTGTTTTGCCAGGTCCTCGCCGGCGGTTTTTCGCTTCTTGGTCGTCATAGTTCCTCGCGTGTCGATGGTCATCGACTTCGCCAAACCTGCCGCCTCCTGTTCGAGACGACGCGAACGCTCCACGGCGGCCGATGGCGCGGGCAGGGCAGGGGGAGCCAGTTGCACGCTGTCGCGCTCGATCTTGGCCGTAGCTTGCTGGGCCATCGAGCCGACGGACTGGAAGGTTTCGCGGGGCGCACGCATGACGGTGCGGCTTGCGATGGTTTCGGCATCCTCGGCGGAAAACCCCGCGTCGATCAGTTCTTGCCTGTATGCCTTCCGGTCAAACGTCCGATTCATTCACCCTCCTTGCGGGATTGCCCCGACTCACGCCGGGGCAATGTGCCCTTATTCCTGATTTGACCCGCCTGGTGCCTTGGTGTCCAGATAATCCACCTTATCGGCAATGAAGTCGGTCCCGTAGACCGTCTGGCCGTCCTTCTCGTACTTGGTATTCCGAATCTTGCCCTGCACGAATACCAGCGACCCCTTGCCCAAATACTTGCCGTGGGCCTCGGCCTGAGAGCCAAAACACTTGATGCGGAAGAAGTCGGTGCGCTCCTGCTTGTCGCCGGCATCGTTGCGCCACATCTAGGTACTAAAACAATTCATCCAGTAAAATATAATATTTTATTTTCTCCCAATCAGGCTTGATCCCCAGTAAGTCAAAAAATAGCTCGACATACTGTTCTTCCCCGATATCCTCCCTGATCGACCGGACGCAGAAGGCAATGTCATACCACTTGTCCGCCCTGCCGCTTCTCCCAAGATCAATAAAGCCACTTACTTTGCCATCTTTCACAAAGATGTTGCTGTCTCCCAGGTCGCCGTGGGAAAAGACAAGTTCCTCTTCGGGCTTTTCCGTCTTTAAAAAATCATACAGCTCGCGCGGATCTTTAAATGGGGTGTCTTCTTCCCAGTTTTCGCAATCCACATCGGCCAGATCGTTATTCAGTAAGTAATCCAATTCGGCTAAGCGGCTGTCTAAGCTATTCGTATAGGGACAATCCGATATGTCGATGGAGTGAAAGAGCCTGATGCACTCCGCATACAGCTCGATAATCTTTTCAGGGCTTTGTTCATCTTCATACTCTTCCGAGCAAAGGACGCCATCGGCCTCACTCATGAGCAGATTGCTCCAGCCATCATGCCGTTCAAGGTGCAGGACCTTTGGAACAGGCAGCTTTCCTTCCAGCCATAGCATCATGTCCTTTTCCCGTTCCACATCATAGGTGGTCCCTTTATACCGGCTGTCCGTCATTTTTAAATATAGGTTTTCATTTTCTCCCACCAGCTTATATACCTTAGCAGGAGACATTCCTTCCGTATCTTTTACGCAGCGGTATTTTTCGATCAGTTTTTTCAATTCCGGTGATATTCTCATTTTAGCCATTTATTATTTCCTTCCTCTTTTCTACAGTATTTAAAGATACCCCAAGAAGCTAATTATAACAAGACGAACTCCAATTCACTGTTCCTTGCATTCTAAAACTTTAAATACCAGAAAACAGCTTTTTCAAAGTTGTTTTCAAAGTTGGCGTATAACATAGTATCGACGGAGCCGATTTTGAAACCACAATTATGGGTGATGCTGCAACTCGAGCGGGCCGGGAGGGTTCGAGAAGGGGGGGCACCCCCCTTCGGCGTGCGCGGTCACGCGCACAGGGCGCAGCCCTGGTTAAAAACAAGGTTTATAAATATTGGTTTAAAAGCAGGTTAAAAGACAGGTTAGCGGTGGCCGAAAAACGGGCGGAAACCCTTGCAAATGCTGGATTTTCTGCCTGTGGACAGCCCCTCAAATGTCAATAGGTGCGCCCCTCATCTGTCAGCACTCTGCCCCTCAAGTGTCAAGGATCGCGCCCCTCATCTGTCAGTAGTCGCGCCCCTCAAGTGTCAATACCGCAGGGCACTTATCCCCAGGCTTGTCCACATCATCTGTGGGAAACTCGCGTAAAATCAGGCGTTTTCGCCGATTTGCGAGGCTGGCCAGCTCCACGTCGCCGGCCGAAATCGAGCCTGCCCCTCATCTGTCAACGCCGCGCCGGGTGAGTCGGCCCCTCAAGTGTCAACGTCCGCCCCTCATCTGTCAGTGAGGGCCAAGTTTTCCGCGAGGTATCCACAACGCCGGCGGCCGGCCGCGGTGTCTCGCACACGGCTTCGACGGCGTTTCTGGCGCGTTTGCAGGGCCATAGACGGCCGCCAGCCCAGCGGCGAGGGCAACCAGCCCGGTGAGCGTCTCTAGTGGACTGATGGGCTGCCTGTATCGAGTGGTGATTTTGTGCCGAGCTGCCGGTCGGGGAGCTGTTGGCTGGCTGGTGGCAGGATATATTGTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTAAAGTACTGGGGTGGTTTTGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCTGCAGGTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGGTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAAACAACAGACAACATTACAATTACTATTTACAATTACAATGGCATACACACAGACAGCTACCACATCAGCTTTGCTGGACACTGTCCGAGGAAACAACTCCTTGGTCAATGATCTAGCAAAGCGTCGTCTTTACGACACAGCGGTTGAAGAGTTTAACGCTCGTGACCGCAGGCCCAAGGTGAACTTTTCAAAAGTAATAAGCGAGGAGCAGACGCTTATTGCTACCCGGGCGTATCCAGAATTCCAAATTACATTTTATAACACGCAAAATGCCGTGCATTCGCTTGCAGGTGGATTGCGATCTTTAGAACTGGAATATCTGATGATGCAAATTCCCTACGGATCATTGACTTATGACATAGGCGGGAATTTTGCATCGCATCTGTTCAAGGGACGAGCATATGTACACTGCTGCATGCCCAACCTGGACGTTCGAGACATCATGCGGCACGAAGGCCAGAAAGACAGTATTGAACTATACCTTTCTAGGCTAGAGAGAGGGGGGAAAACAGTCCCCAACTTCCAAAAGGAAGCATTTGACAGATACGCAGAAATTCCTGAAGACGCTGTCTGTCACAATACTTTCCAGACATGCGAACATCAGCCGATGCAGCAATCAGGCAGAGTGTATGCCATTGCGCTACACAGCATATATGACATACCAGCCGATGAGTTCGGGGCGGCACTCTTGAGGAAAAATGTCCATACGTGCTATGCCGCTTTCCACTTCTCCGAGAACCTGCTTCT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一种烟草瞬时表达调控关键因子TEF1在提高烟草瞬时表达效率中的应用。

一种利用烟草瞬时表达调控关键因子TEF1提供烟草瞬时表达效率的方法，包括以下步骤：

(1)活化农杆菌菌株；

(2)扩大培养；

(3)农杆菌侵染。

进一步的，步骤(1)包括从超低温冰箱中取出冻存的农杆菌，在含有特定抗生素的固体培养基上划线培养3天；挑取长势良好的单菌落接入含相应抗生素的10mLYEP培养基。

进一步的，步骤(1)中35S::TEF1农杆菌培养基加入的抗生素为利福平和卡那霉素；pJL-TRBO-GFP农杆菌培养基加入的抗生素为Rif和卡那霉素。

进一步的，步骤(2)包括准备2份YEP培养基，分别接菌35S::TEF1和pJL-TRBO-GFP，标记为35S::TEF1以及pJL-TRBO-GFP，220rpm 28℃摇菌过夜。

进一步的，步骤(3)包括配置侵染液体；测定步骤(2)中农杆菌OD600值到1.2左右后常温离心，加入适量侵染液；测定OD600均为0.6左右后，按照35S::TEF1:pJL-TRBO-GFP1：1比例将农杆菌加入侵染液，配置200mL 35S::TEF1，pJL-TRBO-GFP混合侵染液，单独pJL-TRBO-GFP侵染液为对照；室温静置2小时，准备侵染，将长势良好的本氏烟草导致含有侵染液的烧杯中，真空侵染1分钟，反复2次，侵染结束后，将本氏烟在纯净水中冲洗2遍，放置暗处24小时，后正常条件培养3天即可。

进一步的，步骤(3)中侵染液体为10mM MgCl2,10mM MES,100nMAS。

本发明的有益效果在于：:

(1)发现了一种烟草瞬时表达调控关键因子TEF1，该基因在农杆菌入侵烟草后明显下调表达，可以用于调控烟草瞬时表达效率。

(2)构建了35S::TEF1过表达载体，侵染外植体后，瞬时表达后，能够使得TEF1高表达，进一步明显提高了GFP的表达水平。

(3)给出了一种提高烟草瞬时表达效率的方法，通过构建了35S::TEF1过表达载体，侵染外植体，提高了烟草的瞬时表达效率，而表达效率的提升会大大降低蛋白表达成本。

附图说明

图1是TEF1基因在农杆菌侵染3小时、12小时后的表达量。

图2是35S::TEF1增加病毒介导的本氏烟草瞬时表达效率图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

(1)设计TEF1的基因特异引物并加接头(TEF1-P004F：CGAGCCCGGGACTAGTATGCTTACTTTGCTTCTTGG；TEF1-P004R：GTGGCGGTCCGGATCCTTATTGACTGCTGCAGAAATC),黄色标记为接头，目的是与酶切后的载体通过同源重组方式连接；

(2)利用高保真酶，以烟草cDNA为模板，TEF1-P004F/R为引物，进行PCR扩增；程序为95℃3min；(95℃30s，56℃10s，72℃30s)35个循环；72℃10min；常温保持；

(3)将PCR产物跑琼脂糖凝胶，并回收目标片段；

(4)内切酶SpeI和BamH1酶切p004载体，胶回收酶切后的载体片段；

(5)通过infusion的方法将片段与酶切后的载体连接，程序为：50℃15min；4℃保持；

(6)将上述连接产物转化入大肠杆菌DH5a；37℃培养过夜，挑取3个单克隆，送公司测序；

(7)提取测序正确的克隆菌质粒，命名为35S::TEF1

实施例2：

本实施例所用试剂及浓度：500mM MES，50mMAS(乙酰丁香酮)，1M MgCl2；所用农杆菌菌株为GV3101。

一种利用烟草瞬时表达调控关键因子TEF1提供烟草瞬时表达效率的方法，包括以下步骤：

(1)活化菌株：从-70℃超低温冰箱中取出甘油冻存的农杆菌，在含有特定抗生素(35S::TEF1农杆菌培养基加入抗生素利福平(Rif)和卡那霉素(Kan)；pJL-TRBO-GFP农杆菌培养基加入Rif和卡那霉素(Kan))的固体培养基上划线培养3天；挑取长势良好的单菌落接入10mLYEP培养基(含相应抗生素)；

(2)扩大培养：准备2份200mLYEP培养基，分别接菌35S::TEF1和pJL-TRBO-GFP，标记为35S::TEF1(抗生素卡那霉素和利福平)，pJL-TRBO-GFP(抗生素卡那霉素和利福平)，220rpm 28℃摇菌过夜；

(3)农杆菌侵染：配置侵染液体(10mM MgCl2,10mM MES,100nMAS)；测定上述农杆菌OD600值到1.2左右，分别5000rpm转速，常温离心10分钟，加入适量侵染液，测定OD600均为0.6左右，按照1：1比例配置200mL 35S::TEF1,pJL-TRBO-GFP混合侵染液，单独pJL-TRBO-GFP侵染液为对照；室温静置2小时，准备侵染，将长势良好的本氏烟草导致含有侵染液的烧杯中，真空侵染1分钟，反复2次，真空条件：12psi，侵染结束后，将本氏烟在纯净水中冲洗2遍，放置暗处24小时，后正常条件培养3天。

绿色荧光蛋白的检测：

将侵染后的本氏烟在紫外等下观测，GFP表达情况，分别观察3天、4天、5天两种侵染条件下GFP表达量，明确35S::TEF1对病毒介导的瞬时表达体系的促进作用。

实验结果：

图1：农杆菌GV3101侵染烟草叶片，0小时，3小时，12小时提取RNA，反转录成cDNA，通过qRT-PCR方法检测TEF1基因的表达情况，结果表明，农杆菌入侵后，TEF1基因表达降低，暗示该基因在外源菌入侵后，通过表达降低的手段抵抗外源菌的侵染；

图2：pJL-TRBO-GFP为表达GFP蛋白的载体，通过比较分析，绿色荧光蛋白GFP的表达情况是35S::TEF1农杆菌与pJL-TRBO-GFP农杆菌混合侵染烟草叶片比pJL-TRBO-GFP单独侵染烟草叶片要高，4天表现更明显，5天两者都达到峰值；表明35S::TEF1促进瞬时表达蛋白的表现在侵染后4天效果最好。

实施例3：

不需要验证结果的步骤：

(1)活化农杆菌；超低温冰箱取出冻存的农杆菌划线过夜培养，第二天挑取长势良好的菌斑，在10mLYEP加入kan，Rif抗生素，摇菌，200rpm 24hours；

(2)扩大培养菌株；吸取上述农杆菌1mL，加入到50mLYEP培养基中(加入kan，Rif抗生素)

(3)将含有35S::TEF1农杆菌50mL加入到离心管中，5000rpm转速离心10min，去上清，加入50mL侵染液，调节OD600约为0.6，静止3hour；

(4)利用注射器(无针头)吸取上述液体，从烟草叶片背面注射入烟草，数量无限制，在黑暗中培养24hour；

(5)将上述烟草移到光照下，正常培养7天左右，并将侵染过的叶片做标记，可作为高效侵染烟草的底盘材料；待准备完目标农杆菌侵染液后，可直接进行注射或者真空侵染。

需要说明的是，虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本领域技术人员根据发明的基本思想，可以对本发明进行种修改和改进。只要不脱离本发明的基本思想，均应当在本发明的保护范围内。