电化学传感ELISA试剂卡

技术领域

本发明涉及体外诊断领域，具体地涉及电化学传感ELISA试剂卡。

背景技术

酶联免疫吸附测定(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)是体外诊断免疫学检测中常用的方法，将抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合，从而进行免疫反应的定性或定量检测方法，ELISA常用的方法包括：直接法、间接法、双抗体夹心法和竞争法。

传统ELISA因其具有较好的敏感性、特异性、重复性，又因其使用试剂具有较好的稳定性且易于保存，使得ELISA广泛用于抗原/抗体检测。但是传统ELISA存在诸多不足：样本/试剂消耗量大；检测指标单一；吸光度测量易受液体体积影响；信号检测(吸光度)依赖于价格昂贵的酶标仪；实验操作步骤繁琐且费时，对操作人员的要求较高；试剂盒价格较为昂贵。如上诸多不足，限制了ELISA应用于资源有限地区。

随着新技术发展和多学科交叉融合，将电化学生物传感器和微流控芯片相结合，构建一种新型ELISA，不仅摆脱上述传统ELISA的诸多不足，而且在灵敏度、检测速度、检测通量、检测成本等方面均有所改善。

电化学生物传感器(ElectrochemicalBiosensor)是指由生物材料作为敏感元件，电极(固体电极、离子选择性电极、气敏电极等)作为转换元件，以电势或电流为特征检测信号的传感器。由于其具有可靠性高、操作简便、检测下限低等优点，并且具有直接反馈采集的电信号的特点，十分有利于检测系统的小型化和集成化，现已被广泛用于医疗健康、食品监管和环境监测等领域。

微流控(Microfluidics)是指使用微管道(尺寸为数十到数百微米)处理或操纵微小流体(体积为微升、纳升甚至阿升)的系统所涉及的科学和技术，其在医疗诊断、环境监测、食品安全、司法鉴定、石油化工等领域均有应用。微流控的优点诸多，例如：样本和试剂消耗少、集成小型化和自动化、高通量和高效率、污染少等。

发明内容

本发明的目的在于提供一种电化学传感ELISA试剂卡，将电化学生物传感器和微流控芯片相结合，解决了传统ELISA试剂盒样品/试剂消耗量大、检测指标单一、吸光度测量易受液体体积影响的技术问题。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：

本发明的电化学传感ELISA试剂卡，包括键合在一起的微流控通道本体和电化学传感器本体，其中：微流控通道本体上设置有多个“环形”液体流道，每个“环形”液体流道由工作电极覆盖流道以及对电极和参比电极覆盖流道串联而成，“环形”液体流道间通过公共流道连通；电化学传感器本体包括平板基底和在平板基底上平行印制的多个丝网印刷电极，每个丝网印刷电极包括工作电极、对电极和参比电极。

可选地，在上述电化学传感ELISA试剂卡中，工作电极覆盖流道完全覆盖工作电极，对电极和参比电极覆盖流道完全覆盖对电极和参比电极。

可选地，在上述电化学传感ELISA试剂卡中，电化学传感ELISA试剂卡插入配套仪器的适配器中，适配器包括试剂卡插入口、工作电极金属弹片、对电极金属弹片、参比电极金属弹片和导线。

可选地，在上述电化学传感ELISA试剂卡中，电化学传感ELISA试剂卡从试剂卡插入口插入适配器，丝网印刷电极的工作电极导电触片、对电极导电触片和参比电极导电触片分别与适配器的工作电极金属弹片、对电极金属弹片和参比电极金属弹片接触。

可选地，在上述电化学传感ELISA试剂卡中，公共流道上设有清洗液注入口，以及工作电极覆盖流道上设置有液体进出口。

可选地，在上述电化学传感ELISA试剂卡中，工作电极表面固定有捕获抗体且使用封闭液进行封闭。

可选地，在上述电化学传感ELISA试剂卡中，微流控通道本体和电化学传感器本体通过超声键合、热压键合、等离子体键合、胶粘接键合中的一种键合在一起。

可选地，在上述电化学传感ELISA试剂卡中，微流控通道本体的材质为为聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯(PS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)中的一种。

可选地，在上述电化学传感ELISA试剂卡中，平板基底的材质为聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚苯乙烯(PS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)中的一种。

可选地，在上述电化学传感ELISA试剂卡中，工作电极和对电极的材质为碳、金、铂、石墨烯、碳纳米管中的一种；参比电极的材质为银/氯化银复合材料。

本发明的有益效果为：

本发明的电化学传感ELISA试剂卡，将电化学生物传感器和微流控芯片相结合，不仅使样品/试剂消耗极少，而且能够实现多通路/多指标同时检测。由于采用电化学传感检测方式，使得配套的仪器设备小巧、便携、廉价，完全摆脱了传统ELISA实验中对酶标仪的依赖。相比于传统ELISA实验吸光度的测量，电化学传感基于电信号的检测方式可提升检测的速度、灵敏度和选择性；检测过程不受液体体积、样品颜色和深浊度的影响；实验操作简单，对操作人员没有严格要求。基于上述优势，使得电化学传感ELISA试剂卡具有广泛的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1A是本发明的电化学传感ELISA试剂卡和适配器的的结构示意图；

图1B是本发明的电化学传感ELISA试剂卡的爆炸图；

图2是本发明的电化学传感ELISA试剂卡的叠加图；

图3是本发明的电化学传感ELISA试剂卡微流控通道本体的仰视图；

图4是“环形”液体流道的结构示意图；

图5是本发明的电化学传感ELISA试剂卡电化学传感器本体的俯视图；

图6是本发明的适配器的示意图；

图7是本发明的电化学传感ELISA试剂卡插入适配器的俯视图；

图8是本发明的电化学传感ELISA试剂卡和适配器的外形示意图；

图9是本发明的实施例中的电化学传感ELISA试剂卡的检测原理示意图；

图10是本发明的实施例中的工作电极表面捕获抗体固定过程的循环伏安图；

图11是本发明的实施例中工作电极表面捕获抗体固定前后的扫描电镜图；

其中，附图标记为：

1、微流控通道本体；2、电化学传感器本体；3、适配器；

1-1、工作电极覆盖流道；1-2、对电极和参比电极覆盖流道；1-3、公共流道；1-4、液体进出口；1-5、清洗液注入口；2-1、工作电极；2-2、对电极；2-3、参比电极；2-4、工作电极导电触片；2-5、对电极导电触片；2-6、参比电极导电触片；2-7、平板基底；3-1、试剂卡插入口；3-2、工作电极金属弹片；3-3、对电极金属弹片；3-4、参比电极金属弹片；3-5、导线。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的电化学传感ELISA试剂卡的技术方案进行清楚、完整的描述。

如图1A、1B和图2所示，本发明的实施例的电化学传感ELISA试剂卡包括：键合在一起的微流控通道本体1和电化学传感器本体2，其中，微流控通道本体1和电化学传感器本体2采用等离子体键合工艺键合。

如图3和4所示，微流控通道本体1上设置有多个“环形”液体流道，每个“环形”液体流道由工作电极覆盖流道1-1以及对电极和参比电极覆盖流道1-2串联而成，“环形”液体流道间通过公共流道1-3连通。公共流道1-3上设有一个清洗液注入口1-5，以及工作电极覆盖流道1-1上设置有液体进出口1-4，其中，工作电极覆盖流道1-1设置为圆形。

如图5所示，电化学传感器本体2是在平板基底2-7上平行印制多个丝网印刷电极制作而成。丝网印刷电极为三电极体系，每个丝网印刷电极包括工作电极2-1、对电极2-2和参比电极2-3，丝网印刷电极的三个导电触片(工作电极导电触片2-4、对电极导电触片2-5和参比电极导电触片2-6)分别与适配器中的三个金属弹片(工作电极金属弹片、对电极金属弹片、参比电极金属弹片)接触。微流控通道本体1上设置的工作电极覆盖流道1-1完全覆盖电化学传感器本体2表面印制的工作电极2-1；对电极和参比电极覆盖流道1-2完全覆盖对电极2-2和参比电极2-3。以及工作电极2-1表面固定有捕获抗体且使用封闭液牛血清白蛋白溶液进行封闭，其中，捕获抗体的固定在以下会详细描述。

如图6、图7和图8所示，电化学传感ELISA试剂卡插入配套仪器的适配器3中，并与适配器3中的金属弹片接触。适配器3包括试剂卡插入口3-1、工作电极金属弹片3-2、对电极金属弹片3-3、参比电极金属弹片3-4和导线3-5。电化学传感ELISA试剂卡从试剂卡插入口3-1插入适配器3中，丝网印刷电极的三个导电触片(工作电极导电触片2-4、对电极导电触片2-5、参比电极导电触片2-6)分别与适配器3中的三个金属弹片(工作电极金属弹片3-2、对电极金属弹片3-3、参比电极金属弹片3-4)接触，适配器3的导线3-5连接配套电化学仪器。

本实施例中，微流控通道本体1的材质为为聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯(PS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)中的一种，优选为聚二甲基硅氧烷(PDMS)。

平板基底2-7的材质为聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚苯乙烯(PS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)中的一种，优选为聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)。

电化学传感器本体2表面印制的丝网印刷电极中，工作电极2-1和对电极2-2的材质为碳、金、铂、石墨烯、碳纳米管中的一种，优选为碳；参比电极2-3的材质为银/氯化银复合材料。

电化学传感ELISA试剂卡的键合：

1.对微流控通道本体1和电化学传感器本体2进行表面处理；

2.微流控通道本体1的设置有流道的一侧面向电化学传感器本体2印制有丝网印刷电极的一侧；

3.微流控通道本体1上设置的工作电极覆盖流道1-1完全覆盖电化学传感器本体2表面印制的工作电极2-1；微流控通道本体1设置的对电极和参比电极覆盖流道1-2完全覆盖电化学传感器本体2表面印制的对电极2-2和参比电极2-3；

4.采用等离子体键合工艺，将微流控通道本体1和电化学传感器本体2键合，键合工艺选用超声键合、热压键合、等离子体键合、胶粘接键合中的一种。

图9为电化学传感ELISA试剂卡的检测原理示意图，其中(a)为捕获抗体固定，(b)为待测抗原捕获，(c)为与酶标记检测抗体形成免疫夹心复合物(即，酶标记检测抗体-待测抗原-捕获抗体复合物)，(d)为加入底物，检测电信号。电化学传感ELISA试剂卡具体相关操作步骤如下。

捕获抗体的固定，包括以下步骤：

1.通过液体进出口1-4，使用移液枪向工作电极覆盖流道1-1中注入链霉亲和素溶液，37℃孵育2小时后，链霉亲和素通过物理吸附作用固定在工作电极2-1表面和PDMS材质工作电极覆盖流道1-1内表面(PDMS是疏水性材料)；

2.通过液体进出口1-4，使用移液枪从工作电极覆盖流道1-1中移除链霉亲和素溶液；

3.通过液体进出口1-4，使用移液枪向工作电极覆盖流道1-1中注入牛血清白蛋白溶液，37℃孵育1小时后，牛血清白蛋白通过物理吸附作用固定在工作电极2-1表面和PDMS材质工作电极覆盖流道1-1内表面；

4.通过液体进出口1-4，使用移液枪从工作电极覆盖流道1-1中移除牛血清白蛋白溶液；

5.通过液体进出口1-4，使用移液枪向工作电极覆盖流道1-1中注入生物素标记捕获抗体溶液，37℃孵育30分钟后，生物素与链霉亲和素特异性结合，捕获抗体间接固定在工作电极2-1表面和PDMS材质工作电极覆盖流道1-1内表面；

6.通过液体进出口1-4，使用移液枪从工作电极覆盖流道1-1中移除生物素标记捕获抗体溶液；

7.将工作电极2-1表面固定捕获抗体的电化学传感ELISA试剂卡密封于铝箔袋中，储存于4℃备用。

图10为工作电极2-1表面捕获抗体固定过程的循环伏安图(测试底液：5mMK

电化学传感ELISA试剂卡的使用，包括以下步骤：

1.从铝箔袋中取出电化学传感ELISA试剂卡，将其水平放置，设置有液体进出口1-4、清洗液注入口1-5的一面朝上；

2.使用磷酸缓冲盐溶液(PBST)溶液清洗电化学传感ELISA试剂卡流道(工作电极覆盖流道1-1、对电极和参比电极覆盖流道1-2、公共流道1-3)内表面和丝网印刷电极(工作电极2-1、对电极2-2、参比电极2-3)表面。通过清洗液注入口1-5，向电化学传感ELISA试剂卡中注入PBST溶液，PBST溶液依次流经公共流道1-3、对电极和参比电极覆盖流道1-2、工作电极覆盖流道1-1，最后从液体进出口1-4流出；清洗完成后，通过清洗液注入口1-5，向电化学传感ELISA试剂卡中注入空气，从而移除流道中的残留PBST溶液；

3.加入待测样本溶液。通过液体进出口1-4，使用移液枪向工作电极覆盖流道1-1中注入待测样本溶液，37℃孵育30分钟后，待测抗原与捕获抗体特异性结合，在工作电极2-1表面和PDMS材质工作电极覆盖流道1-1内表面形成待测抗原-捕获抗体复合物；

4.移除工作电极覆盖流道1-1中的待测样本溶液，并清洗工作电极2-1表面和PDMS材质工作电极覆盖流道1-1内表面。通过清洗液注入口1-5，向电化学传感ELISA试剂卡中注入PBST溶液，PBST溶液依次流经公共流道1-3、对电极和参比电极覆盖流道1-2、工作电极覆盖流道1-1，最后从液体进出口1-4流出，此过程一方面移除了工作电极覆盖流道1-1中的待测样本溶液，另一方面，清洗了工作电极2-1表面和PDMS材质工作电极覆盖流道1-1内表面；移除待测样本溶液并清洗完成后，通过清洗液注入口1-5，向电化学传感ELISA试剂卡中注入空气，从而移除流道中的残留PBST溶液；

5.加入酶标记检测抗体溶液。通过液体进出口1-4，使用移液枪向工作电极覆盖流道1-1中注入酶标记检测抗体溶液，37℃孵育30分钟后，检测抗体与待测抗原特异性结合，在工作电极2-1表面和PDMS材质工作电极覆盖流道1-1内表面形成免疫夹心结构(酶标记检测抗体-待测抗原-捕获抗体复合物)；

6.移除工作电极覆盖流道1-1中的酶标记检测抗体溶液，并清洗工作电极2-1表面和PDMS材质工作电极覆盖流道1-1内表面。通过清洗液注入口1-5，向电化学传感ELISA试剂卡中注入PBST溶液，PBST溶液依次流经公共流道1-3、对电极和参比电极覆盖流道1-2、工作电极覆盖流道1-1，最后从液体进出口1-4流出，此过程一方面移除了工作电极覆盖流道1-1中的酶标记检测抗体溶液，另一方面，清洗了工作电极2-1表面和PDMS材质工作电极覆盖流道1-1内表面；移除酶标记检测抗体溶液并清洗完成后，通过清洗液注入口1-5，向电化学传感ELISA试剂卡中注入空气，从而移除流道中的残留PBST溶液；

7.加入底物溶液。通过清洗液注入口1-5，向电化学传感ELISA试剂卡中注入底物溶液，底物溶液依次流经公共流道1-3、对电极和参比电极覆盖流道1-2、工作电极覆盖流道1-1，最后充满电化学传感ELISA试剂卡的流道(工作电极覆盖流道1-1、对电极和参比电极覆盖流道1-2、公共流道1-3)。底物溶液接触PDMS材质工作电极覆盖流道1-1内表面的同时，覆盖工作电极2-1、对电极2-2和参比电极2-3的表面；

8.将电化学传感ELISA试剂卡从试剂卡插入口3-1插入适配器3，丝网印刷电极的三个导电触片(工作电极导电触片2-4、对电极导电触片2-5、参比电极导电触片2-6)分别与适配器3中的三个金属弹片(工作电极金属弹片3-2、对电极金属弹片3-3、参比电极金属弹片3-4)接触，适配器3的导线3-5连接配套电化学仪器，利用三电极检测体系进行电流测量，定量待测抗原，完成多通路同时检测。

9.使用后，将电化学传感ELISA试剂卡从适配器3的试剂卡插入口3-1中拔出，并将电化学传感ELISA试剂卡丢弃至生化垃圾箱即可。

除非另有定义，本申请中使用的所有技术和/或科学术语具有与由本申请所涉及的领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本申请中提到的材料、方法和实施例仅为说明性的，而非限制性的。

虽然已结合具体实施方式对本申请进行了描述，在本申请的发明主旨下，本领域的技术人员可以进行适当的替换、修改和变化，这种替换、修改和变化仍属于本申请的保护范围。