一种抗逆蛋白及其编码基因在培育抗逆植物中的应用

技术领域

本发明涉及转基因植物领域，具体而言，涉及一种抗逆蛋白及其编码基因在培育抗逆植物中的应用。

背景技术

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是一种同源四倍体、异花授粉的豆科植物，其具有较高的产量与营养价值，以及良好的适口性，因此被誉为“牧草之王”；此外，它在农业生态系统中具有植被恢复、保持水土肥力、改良土壤的能力，以及作为原料生产纤维素的潜力。作为优质的蛋白饲草，紫花苜蓿是世界范围内种植最为广泛的牧草之一。

紫花苜蓿具有较高水平的营养物质含量，优质的苜蓿干草可以作为重要的蛋白源泉，在欧美等国家被广泛地应用于畜牧业，其不仅具有良好的适口性，同时也具有较高水平的粗蛋白含量，一般可达20％。粗蛋白中含有多种氨基酸，包括动物生长所必需的氨基酸和一些稀有氨基酸。此外，紫花苜蓿中含有苜蓿多糖、大豆黄酮、异黄酮等营养物质，家畜在食用后，一方面可以提高家畜的免疫能力，另一方面也可以提高家畜的肉制品质量。此外，苜蓿中还含有优质粗纤维，其可以改善肠道消化功能、调节肠道内微生物动态平衡的能力。紫花苜蓿除了被用作重要的优质饲料外，还是一种低能量、高营养的菜品，紫花苜蓿的加工产品或者其提取物也作为药物或者保健品而在市场上流通。

干旱胁迫是指植物耗水量大于吸水量时体内出现水分亏缺的现象，耐旱性则是指植物在长期的进化过程中对水分亏缺的适应和耐受能力。据统计，全球约有1/6的耕地受到了不同程度干旱的影响。干旱造成了巨大的经济损失，也制约农业进一步发展。目前，苜蓿缺乏优良品种，育成品种大多以抗盐碱、抗寒、抗虫居多，缺少耐旱品种。在干旱胁迫下，紫花苜蓿的形态会受到很大影响，主要表现在叶片一定程度的萎蔫，根系发育，分蘖分枝数的减少，植株高度等，从而对紫花苜蓿的产量与品质均造成诸多负面影响。

发掘新的耐旱基因有利于扩大紫花苜蓿生产种植规模，加快畜牧产业发展具有重要意义。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗逆蛋白及其编码基因在培育抗逆植物中的应用。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供了一种蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。

第二方面，本发明实施例提供了一种分离的核酸，其包含编码前述实施例所述的蛋白的核苷酸序列。

第三方面，本发明实施例提供了一种载体，其包括前述实施例所述的分离的核酸。

第四方面，本发明实施例提供了一种重组菌或重组细胞，其含有前述实施例所述的分离的核酸或前述实施例所述的载体。

第五方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的蛋白或前述实施例所述的分离的核酸或前述实施例所述的载体或前述实施例所述的重组菌或重组细胞在培育抗逆植物中的应用。

第六方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的蛋白或前述实施例所述的分离的核酸或前述实施例所述的载体或前述实施例所述的重组菌或重组细胞在提高植物抗逆性中的应用。

第七方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的蛋白或前述实施例所述的分离的核酸或前述实施例所述的载体或前述实施例所述的重组菌或重组细胞在培育抗逆微生物中的应用。

第八方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的蛋白或前述实施例所述的分离的核酸或前述实施例所述的载体或前述实施例所述的重组菌或重组细胞在提高微生物抗逆性中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明从豆科植物紫花苜蓿中克隆获得了Msh1基因及其蛋白，Msh1基因在干旱和盐胁迫的诱导下表达量有所增加；同时将该编码基因转入植物后可以提高目的植物的抗逆能力，有利于培育抗逆性更强的植物品种或者改造其它植物的抗逆性。

本发明为紫花苜蓿抗逆分子设计育种提供了新的基因资源，将在培育紫花苜蓿耐旱新材料中发挥重要作用，同时还为其它非粮食类经济作物抗逆性状的改良提供新方案，对畜牧业、农业、林业等具有实质性的影响。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为实施例1中为Msh1基因的特性分析；

图2为实施例2中Msh1基因受胁迫诱导时的qRT-PCR表达结果图；

图3为实施例3中分子检测在转基因拟南芥中的目的基因的结果图；

图4为实施例3中转基因拟南芥在干旱、盐胁迫平板上与野生型的萌发率的比较；

图5为实施例3中转基因拟南芥在干旱、盐胁迫平板上与野生型的根长及鲜重比较；

图6为实施例3中转基因拟南芥和野生型在干旱处理后土壤中的抗旱性评价；

图7为实施例3中转基因拟南芥和野生型在盐胁迫处理后土壤中的抗盐性评价；

图8为实施例4中转基因紫花苜蓿与野生型离体叶片的表型照片；

图9为实施例4中转基因紫花苜蓿与野生型离体叶片失水速率的测定；

图10为实施例4中转基因紫花苜蓿与野生型在土壤干旱胁迫下的表型照片。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

一方面，本发明实施例提供了一种蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No:1所示：

MMEGNTGWSVMEEDRWRKGPWTSEEDKLLIEYVKLHGEGRWNSVSRLAGLRRNGKSCRLRWVNYLRPDLKKGQITQQEESIILELHARWGNRWSTIARSLPGRTDNEIKNYWRTHFKKKTKNPSDAAEKAKNRCFKRQQQQQLKKQQQQIQMQQQQLQYNMDMKGIIDLLLEENDYCTSVPSTSQETQEMVSMYADTQEQQGCFYSMLNDNNGNVYAQESSNEENLWDGLWNLDDALGNSMQLMLQAKPANVHNVVTPFC。

本发明从豆科植物紫花苜蓿中克隆获得了Msh1基因及其蛋白，Msh1基因在干旱和盐胁迫的诱导下表达量有所增加；同时将该编码基因转入植物后可以提高目的植物的抗逆能力，有利于培育抗逆性更强的植物品种或者改造其它植物的抗逆性。

在一些实施例中，上述Msh1基因及其蛋白应用于提高植物或微生物的耐旱性。耐旱性能增强表现在转基因植物幼苗在干旱胁迫下的根系发达，根长更长等。本发明为植物耐旱分子设计育种提供了新的基因资源，将在培育植物(如紫花苜蓿)耐旱新材料中发挥重要作用，同时还为其它非粮食类经济作物耐旱性状的改良提供新方案，对畜牧业、农业、林业等具有实质性的影响。

另一方面，本发明实施例还提供了一种分离的核酸，其包含编码前述实施例所述的蛋白的核苷酸序列。

在一些实施例中，所述核酸的序列如SEQ ID NO:2所示：

aaactttatctaagttccaactttagaatatttctttcaatatgtattcaggaatgatggaaggaaacactggatggagtgtaatagaagaagatagatggaggaaaggaccttggacttctgaggaagacaaattgctcattgagtatgtcaagctgcatggtgaaggcagatggaactctgtctctaggcttgcaggtacatacatacatgatacaaccaaactttatgcacatttttgtattttaatttctaccatagtactttgtaccttagtttaattaataccaattgaattcatattcacattagaagtggagcataattattatagcaaaataacaagtaaaattaattggttccaaattttcacttaatagccttttttagcaaaaaaatttataaaaaaaaaaaaccatttttcttttacaattcttaacttcttattgatcatatattattttgacaggactgagaagaaatgggaaaagttgtagattgagatgggtgaactacctaagaccagacctcaagaagggtcagataacacaacaagaagaaagcataatcctagagctacatgctaggtggggaaacaggtacaaatttgaactatgtcccttgaacttacatgtttcttgtattagacacgtgacactttatccagacccgtgttgcgttgcgacacgggttaatgcttctagttgattattactaaatataaaacaattcaggtggtcaacaattgcgagaagcttgccgggaagaacagacaatgagataaagaactattggaggactcatttcaagaaaaagaacaaaaaccccactgatgctgctgaaaaggcgaaaaaccgttatttcaagaggcagcaacaacaacaattgaagaaacaacagcaacaagttcagatgcagcaacaacaactgcaatacaacatggacatgaaagggatcatagacttgttgcttgaggaaaatgagtactgtactagtgtaccttctacttctcaagagacacaagaaatgctttccatgtatgcagatacgcaagaacaacagggttgcttttactctatgctcaatgataataatggtaatgtctatgcacatgagtcttcaaatgaagaaattttgtgggatggactttggaacttggatgatgctcttggaaattcaatgcagctaatgctacaagcaaagccggccaatgtgtgttaa。

在一些实施例中，所述分离的核酸的序列如SEQ ID NO:3所示：

ATGATGGAAGGAAACACTGGATGGAGTGTAATGGAAGAAGATAGATGGAGGAAAGGACCTTGGACTTCTGAGGAAGACAAATTACTCATTGAGTATGTCAAGCTGCATGGTGAAGGCAGATGGAACTCTGTCTCTAGGCTTGCAGGACTGAGAAGAAATGGGAAAAGTTGTAGATTGAGATGGGTGAACTACCTAAGACCAGACCTCAAGAAGGGTCAGATAACACAACAAGAAGAAAGCATAATCCTAGAGCTACATGCTAGGTGGGGAAACAGGTGGTCAACAATTGCAAGAAGCTTGCCGGGGAGAACAGACAATGAGATAAAGAACTATTGGAGAACTCATTTCAAGAAAAAGACCAAAAACCCCTCTGATGCTGCTGAAAAGGCGAAAAATCGTTGTTTCAAGAGGCAGCAACAACAGCAATTGAAGAAACAACAGCAACAAATTCAGATGCAGCAACAACAACTGCAATACAACATGGATATGAAAGGGATCATAGACTTATTGCTTGAGGAAAATGACTACTGTACTAGTGTGCCTTCTACTTCTCAAGAGACACAAGAAATGGTTTCCATGTATGCAGATACACAAGAACAACAGGGTTGCTTTTACTCTATGCTCAATGATAATAATGGTAATGTCTATGCTCAAGAGTCTTCAAATGAAGAGAATTTGTGGGATGGACTTTGGAACTTGGATGATGCTCTTGGAAATTCAATGCAGCTAATGCTACAAGCAAAGCCAGCCAATGTGCACAATGTAGTTACTCCATTTTGTTAA。

上述SEQ ID NO:2所示核苷酸序列为Msh1基因的核酸序列，SEQ ID NO:3所示核苷酸序列为Msh1基因的CDS序列。

另一方面，本发明实施例还提供了一种载体，其包括前述任意实施例所述的分离的核酸。

在一些实施例中，所述载体包括表达载体。

所述载体还包括载体骨架。所述载体骨架可以为pBI121-35S-GUS表达载体。在一些实施例中，所述载体为上述分离的核酸插入酶切系统载体pBI121-35S-GUS表达载体的重组位点得到。

另一方面，本发明实施例还提供了一种重组菌或重组细胞，其含有前述任意实施例所述的分离的核酸或前述任意实施例所述的载体。

在一些实施方式中，所述重组细胞可以为哺乳动物细胞和细胞系。“哺乳动物细胞”包括来自哺乳动物任意成员的细胞，如人细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、猴细胞、仓鼠细胞等。在一些实施例中，细胞为小鼠细胞、人细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、CHOK1细胞、CHO-DXB11细胞、CHO-DG44细胞、CHOK1SV细胞(包括所有变体(例如，英国斯劳龙沙公司(Lonza，Slough，UK))或CHOK1SV GS-KO(谷氨酰胺合成酶敲除)细胞(包括所有变体(例如，XCEEDTM，英国斯劳龙沙公司)。

在本发明公开了蛋白的氨基酸序列的基础上，本领域技术人员容易想到采用基因工程技术或其他技术(化学合成、重组表达)制备得到该蛋白，例如从能够重组表达如上任一项所述的蛋白的重组细胞的培养产物中分离纯化得到该蛋白，这对本领域技术人员来说是容易实现的，基于此，无论采用何种技术制备本发明的抗体或其功能性片段，其均属于本发明的保护范围。

另一方面，本发明实施例提供了前述实施例所述蛋白的制备方法，其包括培养所述重组菌或重组细胞或人工合成SEQ ID NO:1所示氨基酸序列。

另一方面，本发明实施例还提供了如前述任意实施例所述的蛋白或前述任意实施例所述的分离的核酸或前述任意实施例所述的载体或前述任意实施例所述的重组菌或重组细胞在培育抗逆植物中的应用。

在一些实施例中，所述抗逆包括耐旱。

耐旱性为抗失水逆境的能力。可选地，失水逆境可以为与甘露醇终浓度为200-300mM的模拟逆境相同或者等同的自然逆境。

在一些实施例中，所述培育抗逆植物的步骤包括：提高目标植物中前述任意实施例所述蛋白的活性或前述任意实施例所述的分离的核酸的表达量，得到抗逆植物。

在一些实施例中，所述提高目标植物中前述任意实施例所述蛋白的活性或前述任意实施例所述的分离的核酸的表达量通过将前述任意实施例所述的分离的核酸导入目标植物中实现。

在一些实施例中，所述目标植物包括：双子叶植物。

在一些实施例中，所述目标植物包括：拟南芥、烟草、紫花苜蓿和蒺藜苜蓿中的任意一种。

另一方面，本发明实施例还提供了如前述任意实施例所述的蛋白或前述任意实施例所述的分离的核酸或前述任意实施例所述的载体或前述任意实施例所述的重组菌或重组细胞在提高植物抗逆性中的应用。

在一些实施例中，所述抗逆性包括：耐旱性。

在一些实施例中，所述提高植物抗逆性的方法包括：提高目标植物中前述任意实施例所述蛋白的活性或前述任意实施例所述的分离的核酸的表达量。

在一些实施例中，所述目标植物包括：双子叶植物。

在一些实施例中，所述目标植物包括：拟南芥、烟草、紫花苜蓿和蒺藜苜蓿中的任意一种。

另一方面，本发明实施例还提供了如前述任意实施例所述的蛋白或前述任意实施例所述的分离的核酸或前述任意实施例所述的载体或前述任意实施例所述的重组菌或重组细胞在培育抗逆微生物中的应用。

在一些实施例中，所述抗逆微生物包括耐旱微生物。

在一些实施例中，所述培育抗逆微生物包括：提高目标微生物中前述任意实施例所述蛋白的活性或前述任意实施例所述的分离的核酸的表达量，得到抗逆微生物。

在一些实施例中，所述提高目标微生物中前述任意实施例所述蛋白的活性或前述任意实施例所述的分离的核酸的表达量通过将前述任意实施例所述的分离的核酸导入目标微生物中实现。

在一些实施例中，所述微生物包括细菌。

在一些实施例中，所述微生物包括大肠杆菌或农杆菌。

此外，本发明实施例还提供了如前述任意实施例所述的蛋白或前述任意实施例所述的分离的核酸或前述任意实施例所述的载体或前述任意实施例所述的重组菌或重组细胞在提高微生物抗逆性中的应用。

在一些实施例中，所述抗逆性包括耐旱性。

在一些实施例中，所述提高微生物抗逆性包括：提高目标微生物中前述任意实施例所述蛋白的活性或前述任意实施例所述的分离的核酸的表达量。

在一些实施例中，所述提高目标微生物中前述任意实施例所述蛋白的活性或前述任意实施例所述的分离的核酸的表达量通过将前述任意实施例所述的分离的核酸导入目标微生物中实现。

在一些实施例中，所述微生物包括细菌。

在一些实施例中，所述微生物包括大肠杆菌或农杆菌。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

克隆和测序Msh1编码基因，包括以下步骤：

植物材料：紫花苜蓿中苜1号。

在正常条件下将健康饱满的种子在铺好双层滤纸的培养皿中萌发5天，当幼苗子叶展开后，移至配好的1/2MS营养液(pH＝5.8)。培养7天后，在1/2MS营养液中添加Mannitol至终浓度为300mM，处理24小时，分别快速的取植物地上部分和地下部分，在液氮速冻，在-80℃保存备用。

采用Trizol法提取样品的RNA，并用cDNA合成反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA；同时采CTAB法提取其DNA。PCR扩增体系的总体积为50μL，其中包括5×Phusion HFBuffer10μL，2.5mM dNTP 4μL，引物Msh1-F(5’-3’):CGCGGATCCATGTATTCAGGAATGATGGA(SEQ IDNo.4)1μL，Msh1-R(5’-3’):CGAGCTCTTAACACACATTGGCCGGCT(SEQ ID No.5)1μL，ddH

用1％琼脂糖中电泳检测结果，目的基因的长度为783bp，回收该基因的DNA片段，与表达载体pBI121-35S-GUS共同进行双酶切，酶切位点选择BamH I和Sac I，通过凝胶电泳确认酶切结果,随后使用DiaSpin柱式DNA胶回收试剂盒(B110092，上海生工生物工程股份有限公司)进行产物回收，最后,利用T4DNA连接酶(MO202,NewEnglandBiolabs北京有限公司)，将酶切后的目的片段与表达载体连接起来，转入到大肠杆菌DH5a感受态细胞，均匀涂布在含Kan的LB抗性平板涂上，37℃培养箱中过夜培养，检测并挑选合适的阳性克隆菌斑，挑入含有Kan抗性的液体培养基中，在37℃摇床中200rpm过夜培养。

菌液检测合适后送上海生工生物工程有限公司进行测序。测序结果表明菌落具有SEQ ID No.2中的核苷酸序列，将其命名为Msh1基因，将该基因编码的蛋白命名为Msh1蛋白，蛋白序列如SEQ ID No.1所示。

Msh1与其他14个物种的进行同源比对，结果如图1所示，其中与蒺藜苜蓿蛋白MtMYB14(Medtr1g073170)的同源性最高。图1中，(a)图表为Msh1的基因结构；(b)图为Msh1与其他14个物种的进行同源比对结果。

实施例2

实时荧光定量PCR分析Msh1编码的基因在干旱与盐胁迫诱导下的表达特性，包括如下步骤：

紫花苜蓿种子萌发和水培同实施例1，用12d的紫花苜蓿幼苗进行胁迫处理：

干旱处理：在1/2MS水培营养液中加入400mM Mannitol处理，处理时间分别为1，3，6，12，24h，以及复水1，3h。分别快速的取植物的地上部分和地下部分，样品在液氮速冻，在-80摄氏度保存备用。

样品RNA提取及反转录步骤与试剂同实施例1。将cDNA稀释至50ng/μL，用qRTMsh1-F(5’-3’):ATGGTGAAGGCAGATGGAACTC(SEQ ID No.6)和qRTMs MYB14-R(5’-3’):TCTTGAGGTCTGGTCTTAGGTAGT(SEQ ID No.7)检测目的基因表达量，以MsACTIN-F(5’-3’):ACTGGAATGGTGAAGGCTGG(SEQ ID No.8)和MsACTIN-R(5’-3’):TGACAATACCGTGCTCAATGG(SEQID No.9)作为内参。PCR检测体系的总体积为20μL，其中包括2×SG Fast qPCR Master Mix10μL，引qRTMsh1-F 0.5μL，引物qRTMsh1-R 0.5μL，DNF buffer 2μL，ddH

利用2-ΔΔCt方法计算相对表达量。ΔΔCt＝(Ct.目的基因-Ct.内参基因)Timex-(Ct.目的基因-Ct.内参基因)Time 0；Time x表示逆境处理的任意5个时间点，具体为1h，3h，6h，12h或24h。Time 0表示逆境处理0小时(对照组)。利用Origin 9软件进行做图。

结果见图2，在紫花苜蓿根部中，Msh1基因均受到Mannitol胁迫的诱导。

实施例3

本实施例验证Msh1在提高拟南芥抗逆性中的应用。

需要说明的是：拟南芥作为模式植物，本发明利用其对Msh1基因进行功能分析和验证，其结论可以认为等同于紫花苜蓿中Msh1调控植物响应干旱的分子机理。

本实施例的实验操作包括如下步骤:

一、制备转Msh1拟南芥。

1.重组载体的构建。

(1)Msh1基因的克隆

根据Msh1基因的序列设计引物Msh1-G-F和Msh1-G-R，引物5’端分别引入BamHI和SacI酶切位点:Msh1-F(5’-3’):CGCGGATCCATGTATTCAGGAATGATGGA(SEQ ID No.4)，Msh1-R(5’-3’):CGAGCTCTTAACACACATTGGCCGGCT(SEQ ID No.5)以实施例1中的紫花苜蓿的cDNA为模板，使用Msh1-F和Msh1-R进行PCR扩增。PCR扩增体系的总体积为50μL，其中包括5×Phusion HF Buffer 10μL，2.5mM dNTP 4μL，引物Msh1-G-F 1μL，Msh1-G-R 1μL，ddH

(2)酶切、连接。

将PCR扩增产物回收纯化，用限制性内切酶BamHI和SacI酶切，并回收酶切后的PCR产物，得到大小为783bp的酶切产物；同时，用限制性内切酶BamHI和SacI酶切pBI121-35S-GUS表达载体，回收大小约为12946bp的载体骨架。

使用DNA连接酶(TaKaRa，货号:6022)将目的基因的酶切产物和pBI121-35S-GUS表达载体的载体骨架4℃过夜连接。将连接产物热击转化大肠杆菌DH5α，37℃过夜培养，PCR检测阳性克隆并送测序。

(3)重组农杆菌的获得。

选取测序序列与Msh1的CDS序列(SEQ ID NO:3)完全一致的阳性克隆提质粒，并载体转化农杆菌EHA105，得到重组农杆菌EHA105/pBI121-Msh1，与50％甘油1:1比例混合后，液氮速冻，-80℃保存备用。

2.转Msh1拟南芥获得。

从-80℃取出重组农杆菌EHA105/pBI121-Msh1置于冰上，挑取部分冻住的菌块与3mL LB液体中，抗性为利福平和卡那霉素，在28℃和200rpm的摇床中摇24h。取2mL小摇菌液加入到200mL LB液体中，抗性为利福平和卡那霉素，在28℃和200rpm的摇床中摇20h-24h，摇到OD600＝1.2-2.0。

取部分大摇菌液离心，转速4500g，离心时间15min，倒掉LB液体，使用5％蔗糖重悬和稀释至OD600＝0.8的花浸泡缓冲液。将拟南芥(哥伦比亚生态型Col-0)花序(前两天可以剪掉果荚，提高转染效率)浸泡入侵染液中，侵染3-5s；

浸泡完毕后，取出花盆，黑暗处理24h，于温室中继续培养。1周后侵染第2次。

浸泡完毕后，取出花盆，黑暗处理24h，于温室中继续培养。1周后侵染第2次。收获T1代种子，筛选阳性植株用卡那霉素(KAN，10mg/mL)筛选，传代，直至T3代获得纯合株系。

T2代表示T1代自交产生的种子及种子生长所长成的植株，T3代表示T2代自交产生的种子及种子生长所长成的植株。

以T3代再生植株的整个植株的DNA作为模板，用目的基因引物对35S-F(5′-3′):GCACAATCCCACTATCCTTC(SEQ ID No.10)和Msh1-R(5’-3’):CGAGCTCTTAACACACATTGGCCGGCT(SEQ ID No.5)，以及Npt引物对NptII-F(5′-3′):GAGCGGCGATACCGTAAAGC(SEQ ID No.11)和NptII-R(5′-3′):TGGGTGGAGAGGCTATTCGG(SEQ ID No.12)进行PCR扩增。

Msh1和NptII基因的PCR检测体系和扩增条件一致。PCR检测体系为:PCR的总体积为20μL，其中包括2×Eco Taq PCR SuperMix 10μL，上游引物1μL，下游引物1μL，ddH

结果如图3中(a)所示，T3代有23个纯合株系在783bp扩增出单一条带。图3中(b)所示为NptII抗性的检测情况。

二、转基因植物的抗逆性评价

转基因植物的抗失水能力性评价

(1)干旱胁迫与盐胁迫对萌发率的影响：

将T3代转Msh1拟南芥的3个代表性株系OE2、OE3、OE6和野生型Co1-0各49粒种子经消毒处理后，用10uL枪头均匀分点在MS培养基和含有300mmo1/L甘露醇以及125mM氯化钠的MS培养基上，封口膜密封，4℃低温处理3d后，移入22℃，16h光照，8h黑暗，60％相对湿度的培养箱中培养8d,每天统计萌发率,每个处理设置三个生物学重复，结果取平均值，并计算标准差。

结果如图4所示：该图为野生型和转基因株系在MS培养基、含有300mM mannitol以及125mM氯化钠的MS培养基中的萌芽情况对比。

其结果显示：在MS平板上，野生型和转基因株系萌发率和萌发速率基本一致；而在300mmo1/L甘露醇平板以及125mM氯化钠平板上，Msh1转拟南芥株系的萌发率和萌发速率都明显大于野生型。

(2)失水逆境对根长的影响

植物材料为T3代转Msh1拟南芥的3个代表性株系OE2、OE3、OE6和野生型Col-0。

将每个株系的种子消毒处理后，选健康饱满的种子，用10uL枪头均匀点在培养基上，培养基分为：MS培养基、含有300mll manntiol的MS培养基上以及125mM氯化钠的MS培养基，用封口膜密封，春化3d后，移入温度22℃、光照时间为16h、相对湿度60％的培养箱中培养7d，挑选根系长度一致的3个转基因株系和野生型Co1-0幼苗分别移至MS培养基、含有300ml manntio1的MS培养基以及125mM氯化钠的MS培养基上，培养12d后统计各株系根长，每个处理设置三个生物学重复，结果取平均值，并计算标准差。

结果如图5所示：该图为T3代株系OE2、OE3、OE6和野生型株系Col-0分别在MS培养基、含有300mll mannitol的MS培养基以及125mM氯化钠的MS培养基上生长的根系对比图。

其结果显示：在MS平板上，无论是野生型和Msh1转专拟南芥株系根长基本一致；而在含有300ml manntiol的平板以及125mM氯化钠的MS培养基上，野生型比MSH1转拟南芥株系的根长较小。

(3)土壤失水对转基因植株抗性的影响

植物材料为T3代转Msh1拟南茶的3个代表性株系OE2、OE3、OE6和野生型Col-0。

将每个株系的种子消毒处理后，选健康饱满的种子，用101枪头均匀点在培养基上，用封口膜密封，春化3d后,移入温度22℃、光照时间为16h、相对湿度60％的培养箱中培养14d,将幼苗移小方盆中，每盆土壤重量一致，每盆9株苗，正常条件培养14d后，使每盆土壤吸水至饱和，然后断水,进行失水处理35d，直至野生型植株萎蔫，然后开始复水，观察植物表型并拍照(图6所示)。在此期间，每间隔5-10天进行拍照记录，并计算其土壤重量。

图6为T3代株系OE2、OE6、OE8和野生型株系分别在正常供水(Before droughttreatment)、失水处理(After drought treatment for 35days)和复水处理后(Afterrewatering for Tdays)的生长情况对比结果。

其结果显示：失水前，无论是Msh1转拟南芥株系和野生型生长状况基本一致；失水后，野生型明显比转基因株系生长情况要弱；复水后,野生型的存活率比转基因株系要低。故，本申请提供的方法能够增强拟南芥的耐旱能力,也即可延伸至该方法同样能够增强紫花苜蓿的耐旱能力。

(4)土壤盐胁迫对转基因植株抗性的影响

植物材料为T3代转Msh1拟南茶的3个代表性株系OE2、OE3、OE6和野生型Col-0。

将每个株系的种子消毒处理后，选健康饱满的种子，用101枪头均匀点在培养基上，用封口膜密封，春化3d后,移入温度22℃、光照时间为16h、相对湿度60％的培养箱中培养14d,将幼苗移小方盆中，每盆土壤重量一致，每盆9株苗，正常条件培养14d后，使每盆土壤吸水至饱和，后开始每两天在托盘中加入200mM NaCl处理，在处理12天后出现表型(图7)。

实施例4

本实施例验证Msh1在提高紫花苜蓿抗逆性中的应用。

1.重组载体的构建(同实施例3)

2.转Msh1紫花苜蓿

(1)开紫外(烧镊子)、分光光度计(等待30min)；

准备：滤纸、比色皿、5mL离心管×2、洗瓶、蒸馏水约4.5L、干净培养皿、玻璃棒、1L烧杯、漏勺、1000μL移液枪、蓝枪头、LB液体；

(2)测大摇菌液OD600是否为0.6-0.8，由公式c1V1＝c2V2计算SM4液体体积；

(3)打开4℃离心机，等待降温(关好离心机门，否则不降温)；

(4)1L烧杯中加入600mL蒸馏水+600μL吐温(吐温粘稠，吸取时需缓慢抬枪)，用玻璃棒(用蒸馏水冲洗后)搅拌至起泡，放入叶片，搅拌3-5min；

(5)倒掉吐温，用漏勺接叶片，用蒸馏水清洗叶片3次，每次搅拌2min；

(6)将洗净的叶片放入干净培养皿，盖上盖子，放入超净台；

(7)用镊子(可未灭菌)将叶片加入组培瓶①中，倒入75％酒精，晃动瓶身，15s后倒出酒精(从酒精倒入瓶内的一刻开始计数，数3-5s，倒出酒精，最后一滴酒精倒出后结束计数)；

(8)组培瓶①中加入ddH

(9)组培瓶②中配制30％漂白剂(ddH

(10)将组培瓶②中混匀的30％漂白剂倒入装叶片的组培瓶①中，缠紧封口膜，28℃100rpm摇10min(组培瓶可平放)；

(11)组培瓶①拿入超净台，用ddH

(12)超净台中，将70mL大摇菌液分装到两个50mL离心管B中(每个离心管35毫升)，4℃离心机6500rpm/4000g,10min；

(13)(快速承接上一步)超净台中，弃去上清，用50mL离心管C量取VSM4倒入两个离心管B中，用枪吹打，并用SM4溶液冲洗，倒入组培瓶③中(记清楚每次量取的体积)；

(14)用灭过菌且晾凉的镊子将叶片从组培瓶①夹入组培瓶③的侵染液中；

(15)将组培瓶③放入真空泵(可不缠封口膜)，用真空泵(气压>0.7)抽取10min(若气压较低,可抽取12min)；

准备：封口膜、冰袋、蒸馏水、超声波仪、超净台紫外(烧镊子)、取滤纸、SM4共培养培养基；

(16)在超声波仪中加入蒸馏水及冰袋，给组培瓶③封上封口膜，用超声波仪打叶片3-5min，及时晃动瓶身(侵染液略低于水面即可，避免水进入组培瓶)；

(17)拆去封口膜，抽真空10-12min；

(18)将叶片铺于滤纸上晾干(两层滤纸)，滤纸应靠近出风口处，至叶片表面无反光；

(19)将叶片平铺于SM4共培养培养基，缠封口膜；

(20)包上锡纸，黑暗处理3d(应避免农杆菌过度)；

(21)黑暗处理3天后，将SM4共培养培养基上的叶片铺于滤纸上，用手术刀切掉叶柄，然后将叶片一刀切成两半(快、准、狠)；

(22)将叶片平铺于SM4选择培养基，一皿放7个叶片，避免过于拥挤，缠封口膜，放于步入式培养箱两个月；更换愈伤组织至MSBK培养基上生长2个月，之后更换至SH9培养基，直至成苗。

(a)离体叶片失水率

为了测定叶片离体失水率，从20日龄的紫花苜蓿上采集五到六片大小相似的三叶(自顶部完全展开的第二片三叶)，立即称重(约0.3g)，然后将其放在实验室工作台(相对湿度40％，24℃)上，每1h称重，共8h。每个株系至少设置3个生物学重复。根据叶片的初始重量计算相对失水量，叶片Time

结果见图8。在取叶片后，正常条件下进行观察，在失水6h及以后，可以观察到野生型叶片的萎蔫卷曲程度高于三个过表达株系。

离体叶片失水速率的统计结果见图9。在失水6h后，三个过表达株系的失水率低于野生型。

(b)土壤干旱试验

紫花苜蓿过表达株系的抗逆性评价。

(1)转基因植株扦插和扩繁：

温室生长2月龄紫花苜蓿植株，在未开花前，剪取健康枝条(10节左右)从上至下第4-5节，长度约6-8cm，枝条顶端必须含有1个叶芽；2％次氯酸钠溶液浸泡5min，蒸馏水冲洗3遍以上；用锋利的剪刀将枝条上端剪为平口，底端剪为斜口，叶芽处留1片叶子；将枝条底端插入装有灭菌蛭石穴盘中，深度约为3cm，放置在底盘上；底盘中浇上0.05％的高锰酸钾溶液，每周补充，直至生根；2周后，扦插苗生出部分短根，将底盘中的高锰酸钾溶液换成1/2MS营养液，每隔3天浇一次，底盘不能残留营养液，以避免生绿藻；1个月后，扦插苗生出茁壮的根系，移至大盆中开展其他实验。

(2)干旱胁迫处理；

2月龄WT、OE扦插植株，给花盆停止浇水若干天，直至WT开始出现萎蔫，再复水若干7天。处理期间随时观察表型，测定生物量、成活率。

结果见图10，在干旱胁迫18天后，三个过表达株系出现显著的耐旱表型，在复水后，过表达株系表型恢复，而野生型基本死亡。

本申请提供了一种具有干旱耐受性功能的MSH1蛋白，首先通过QRT-PC实验确定了Msh1基因的表达受到干旱胁迫的诱导,然后将Msh1基因在拟南芥中过表达后发现，转基因拟南芥比野生型拟南芥具有更强的耐旱性。由于拟南芥作为模式植物，其具有的作用可以认为等同于紫花苜蓿中Msh1调控植物响应干旱的分子机理。因此，Msh1基因耐旱研究为紫花苜蓿耐旱分子设计育种提供了新的基因资源，对培育和获得具有耐旱植物及其功能增强新品种具有参考及借鉴意义。

综上所述，本申请从豆科植物紫花苜蓿中克隆得到的编码基因，在干旱、氯化钠和植物激素脱落酸的诱导下表达增加，编码的蛋白定位到细胞核、内质网和细胞膜上；编码基因转入植物后可以提高目的植物抗干早能力。编码后得到的具有耐旱能力的蛋白质有利于培育抗逆性更强的植物品种或者改造其它植物的抗逆性。

本申请提供的抗逆性基因和具有耐旱能力的蛋白质对研究相关的耐旱相关调控基因提供思路和方法,对培育和获得具有耐旱性的植物(如拟南茶、烟草或豆科植物)具有重要的参考及借鉴意义，有利于培育具有或增强千旱耐受性的紫花苜蓿、扩大紫花苜蓿生产种植规模，加快畜牧产业发展。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。