一种真菌-硅藻协同增效池塘养殖水质改良剂及制备方法

技术领域

本发明属于微生物工程技术和养殖池塘水体处理技术领域，尤其涉及一种真菌-硅藻协同增效池塘养殖水质改良剂及制备方法。

背景技术

传统集约化的池塘养殖模式常常导致池塘中残饵、粪便和肥料等有机物不断积累，造成高温季节水中氨氮、亚硝酸盐、硫化物等含量过高，导致养殖水质恶化、池塘生物负载量过高以及养殖环境生态失衡等问题，严重影响养殖收益和水产养殖业的可持续发展。例如：池塘水体中高浓度的氨氮及亚硝酸盐污染物会降低水体中的溶解氧含量，造成水体富营养化，抑制养殖动物的生长发育，导致养殖动物的疾病发生且致死。过多的磷污染物会导致大量有害藻类漂浮在养殖水表面，引发赤潮或水华，从而导致水体缺氧，降低养殖动物的免疫机能和摄食能力。化学需氧量是以化学方法测量水体中需要被氧化的还原性物质的量，数值过高则表明池塘水体中有机污染物含量过高，氧气运输能力较弱，养殖动物的呼吸过程受到抑制。重金属离子会在养殖水体中产生大量自由基，干扰细胞代谢，在养殖动物体内积累，进而进入食物链循环，对人类健康构成潜在威胁。养殖过程中残留的抗生素会扩散到水生环境中，通过选择耐抗生素物种来破坏微生物群落的平衡及浮游植物和浮游动物的多样性。致病弧菌可通过分泌溶血素、肠毒素等对水生动物产生致病作用，能在短期内感染贝类、虾类及鱼类并造成大量死亡。目前市售大部分水质改良剂的有效组分只是单一组分或者只是多种成分的机械组合，无法达到池塘养殖从业者的预期效果。

菌藻共生技术具有特异性强、生物学效价较高、不会产生二次污染等特点，能够有针对性地修复调控养殖池塘水体的缓冲能力、自净能力及抗逆性能。但是，现有的菌藻共生体系多为细菌与微藻结合，该共生体系常用于生活污水、工业废水的处理，对于池塘养殖环境下高盐度、高有机污染物的耐受性较低，且需要介入人工固定化的处理过程，培养成本较高。虫草真菌，隶属于子囊菌门、核菌纲、虫草属，含有虫草素、虫草多糖、维生素、麦角脂醇、生物碱等多种活性物质，具有极高的营养价值和保健功效；扁圆卵形藻隶属于硅藻门、羽纹纲、曲壳藻科、卵形藻属，富含胞外多糖、氨基酸以及不饱和脂肪酸等营养物质，具有生长速度快、附着强度高等特点。迄今为止，未见关于将虫草真菌与扁圆卵形藻的共生体用于海水养殖池塘水质改良的相关报道。同样未见将裙带菜粉与桑寄生提取物、荆三棱提取物作为附加组分提高菌藻共生体功能的报道。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种真菌-硅藻协同增效池塘养殖水质改良剂及制备方法。

本发明的技术解决方案是：一种真菌-硅藻协同增效池塘养殖水质改良剂，是虫草真菌（

优选的技术方案是所述共生体微球每克含虫草真菌10

一种上述真菌-硅藻协同增效池塘养殖水质改良剂的制备方法，按照如下步骤进行：

步骤1：将保藏的斜面虫草真菌转接到改良的PDA培养基上，置于培养箱中25 ℃培养5-7 d至产生真菌孢子，用无菌生理盐水清洗固体培养物，用无菌纱布过滤获得虫草真菌悬浮液；所述改良的PDA培养基是在PDA培养基内添加有裙带菜粉、桑寄生提取物及荆三棱提取物，添加量分别为裙带菜粉100-300 mg/L、桑寄生提取物50-80 mg/L、荆三棱提取物40-60 mg/L；

步骤2：将扁圆卵形藻浓缩液与虫草真菌悬浮液加入含PDA液体培养基的三角瓶中，PDA液体培养基初始pH为5.0-7.0，将三角瓶置于恒温震荡培养箱中培养，培养条件为25-30 ℃，转速120-180 r/min，光照周期为12 L/12 D，在培养箱中连续培养3-6 d后，用无菌纱布过滤收获微球，用无菌生理盐水冲洗，得到菌藻共生体微球。

优选的技术方案是所述裙带菜粉的制备方法是采集新鲜、色泽正常的裙带菜为原料，用粉碎机粉碎，粉碎粒度为40-80目，烘干至物料含水量低于6%；所述桑寄生提取物和荆三棱提取物的制备方法是将桑寄生或荆三棱用蒸馏水清洗干净，通风阴干后用匀浆机粉碎，加入质量浓度为75%的乙醇溶液，料液比为1 g/20 ml，在工作频率为50 KHZ，功率为100W的超声波作用下浸提1 h，用无菌纱布过滤去掉杂质，将浸提液减压浓缩、喷雾干燥，即得桑寄生提取物或荆三棱提取物。

优选的技术方案是所述扁圆卵形藻浓缩液按照如下方法制备而成：将扁圆卵形藻解冻后置于培养瓶中，初始接种量为10

本发明是虫草真菌（

作用原理如下：

（1）虫草真菌通过异养代谢产生胞外酶、无机营养物和二氧化碳，有助于提高扁圆卵形藻的光合效率和生物量积累；而扁圆卵形藻通过光合作用产生氧气、胞外聚合物和有机物，为虫草真菌的生长和增殖提供能量和营养源。此外，虫草真菌的菌丝能够吸附和捕获硅藻细胞，对硅藻起到抗氧化保护作用；而扁圆卵形藻具有独特的多孔状硅质膜结构，有利于能量和物质的交换，并能作为生物屏障保护藻菌共生体有效抵御入侵生物和极端环境。

（2）裙带菜粉、桑寄生、荆三棱来源广泛，具有低成本、纯天然、低毒性等优点，不会产生环境安全问题。作为虫草真菌的营养来源，裙带菜粉富含多糖、蛋白质、不饱和脂肪酸和促生长活性因子，可以有效提高虫草菌丝体中虫草素和腺苷的含量，同时可促进虫草真菌与扁圆卵形藻的粘合；桑寄生提取物具有较强的抗氧化能力，能够有效调整虫草真菌的氧化还原状态，显著提高过氧化物酶活力，有助于菌球形成疏松的网状结构、形成氧浓度梯度，使菌球内部细胞处于氧供应缺乏状态，利于菌球对扁圆卵形藻的吸附和粘合；荆三棱提取物含有大量的纤维素、蛋白质和醇类物质，具有促进氧传导、富集营养盐和积累有机物的作用，有利于养殖水体的净化，荆三棱中的白桦酯醇和甘露醇类物质对于菌丝的生长和菌球形态的控制也有积极的作用。

（3）将植物生长激素—油菜素内酯应用于扁圆卵形藻的生长和增殖，可以显著提高扁圆卵形硅藻内源生长素的含量，同时能够提高扁圆卵形硅藻的耐寒性和耐盐性，使扁圆卵形藻在高盐度的养殖海水中发挥高效的生物学功能。

附图说明

图1本发明水质改良剂的虫草真菌（A）和扁圆卵形藻（B）的形态特征图。

图2本发明各实施例的虫草真菌和扁圆卵形藻的反应机理示意图。

图3本发明各实施例真菌-硅藻共生体微球表形图。

图4本发明实施例各处理组对海水养殖池塘水体总氮含量的影响示意图。

图5本发明实施例各处理组对海水养殖池塘水体氨态氮含量的影响示意图。

图6本发明实施例各处理组对海水养殖池塘水体亚硝酸盐含量的影响示意图。

图7本发明实施例各处理组对海水养殖池塘水体总磷含量的影响示意图。

图8本发明实施例各处理组对海水养殖池塘水体磷酸盐含量的影响示意图。

图9本发明实施例各处理组对海水养殖池塘水体化学需氧量的影响示意图。

图10本发明实施例各处理组对海水养殖池塘水体重金属含量的影响示意图。

图11本发明实施例各处理组对海水养殖池塘水体抗生素含量的影响示意图。

图12本发明实施例各处理组对海水养殖池塘水体致病弧菌含量的影响示意图。

具体实施方式

实施例1

本发明的真菌-硅藻协同增效池塘养殖水质改良剂，是虫草真菌（

本发明的真菌-硅藻协同增效池塘养殖水质改良剂的制备方法，按照如下步骤进行：

步骤1：将保藏的斜面虫草真菌转接到改良的PDA培养基上，置于培养箱中25 ℃培养5-7 d至产生真菌孢子，用无菌生理盐水清洗固体培养物，用无菌纱布过滤获得虫草真菌悬浮液；所述改良的PDA培养基是在PDA培养基内添加有裙带菜粉、桑寄生提取物及荆三棱提取物，添加量分别为裙带菜粉100 mg/L、桑寄生提取物80 mg/L、荆三棱提取物50 mg/L；

裙带菜粉的制备方法是采集新鲜、色泽正常的裙带菜为原料，用粉碎机粉碎，粉碎粒度为40-80目，烘干至物料含水量低于6%；所述桑寄生提取物和荆三棱提取物的制备方法是将桑寄生或荆三棱用蒸馏水清洗干净，通风阴干后用匀浆机粉碎，加入质量浓度为75%的乙醇溶液，料液比为1 g/20 ml，在工作频率为50 KHZ，功率为100 W的超声波作用下浸提1h，用无菌纱布过滤去掉杂质，将浸提液减压浓缩、喷雾干燥，即得桑寄生提取物或荆三棱提取物；

步骤2：将扁圆卵形藻浓缩液与虫草真菌悬浮液加入含PDA液体培养基的三角瓶中，PDA液体培养基初始pH为6.0，将三角瓶置于恒温震荡培养箱中培养，培养条件为25 ℃，转速120 r/min，光照周期为12 L/12 D，在培养箱中连续培养3-6 d后，用无菌纱布过滤收获微球，用无菌生理盐水冲洗2-3次，得到菌藻共生体微球。

扁圆卵形藻浓缩液按照如下方法制备而成：将扁圆卵形藻解冻后置于培养瓶中，初始接种量为10

虫草真菌购自中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.23076；扁圆卵形藻购自广东省经济微藻种质资源库，保藏编号为SCSIO-45685。裙带菜、桑寄生、荆三棱均为市购原料。

实施例1的虫草真菌（A）和扁圆卵形藻（B）的形态特征如图1所示，虫草真菌具有管状单条的丝状结构，原生质膜紧贴于菌丝壁上，菌丝直径4.0-8.0 μm，菌丝丰满、致密，分散均匀；扁圆卵形硅藻细胞为左右对称的椭圆形结构，壳缘两侧无波状凸起，藻落分布均匀，藻体色素完好，单细胞大小为15.0-25.0 μm，藻细胞运动缓慢而持久。

实施例2

本发明的真菌-硅藻协同增效池塘养殖水质改良剂，是虫草真菌（

本发明的真菌-硅藻协同增效池塘养殖水质改良剂的制备方法，按照如下步骤进行：

步骤1：将保藏的斜面虫草真菌转接到改良的PDA培养基上，置于培养箱中25 ℃培养5-7 d至产生真菌孢子，用无菌生理盐水清洗固体培养物，用无菌纱布过滤获得虫草真菌悬浮液；所述改良的PDA培养基是在PDA培养基内添加有裙带菜粉、桑寄生提取物及荆三棱提取物，添加量分别为裙带菜粉200 mg/L、桑寄生提取物60 mg/L、荆三棱提取物60 mg/L；

裙带菜粉、桑寄生提取物及荆三棱提取物的制备方法同实施例1。

步骤2：将扁圆卵形藻浓缩液与虫草真菌悬浮液加入含PDA液体培养基的三角瓶中，PDA液体培养基初始pH为5.0，将三角瓶置于恒温震荡培养箱中培养，培养条件为28 ℃，转速140 r/min，光照周期为12 L/12 D，在培养箱中连续培养3-6 d后，用无菌纱布过滤收获微球，用无菌生理盐水冲洗2-3次，得到菌藻共生体微球。

扁圆卵形藻浓缩液按照如下方法制备而成：将扁圆卵形藻解冻后置于培养瓶中，初始接种量为10

各原料来源同实施例1。

实施例3

本发明的真菌-硅藻协同增效池塘养殖水质改良剂，是虫草真菌（

本发明的真菌-硅藻协同增效池塘养殖水质改良剂的制备方法，按照如下步骤进行：

步骤1：将保藏的斜面虫草真菌转接到改良的PDA培养基上，置于培养箱中25 ℃培养5-7 d至产生真菌孢子，用无菌生理盐水清洗固体培养物，用无菌纱布过滤获得虫草真菌悬浮液；所述改良的PDA培养基是在PDA培养基内添加有裙带菜粉、桑寄生提取物及荆三棱提取物，添加量分别为裙带菜粉300 mg/L、桑寄生提取物50 mg/L、荆三棱提取物40 mg/L；

裙带菜粉、桑寄生提取物及荆三棱提取物的制备方法同实施例1。

步骤2：将扁圆卵形藻浓缩液与虫草真菌悬浮液加入含PDA液体培养基的三角瓶中，PDA液体培养基初始pH为7.0，将三角瓶置于恒温震荡培养箱中培养，培养条件为30 ℃，转速180 r/min，光照周期为12 L/12 D，在培养箱中连续培养3-6 d后，用无菌纱布过滤收获微球，用无菌生理盐水冲洗2-3次，得到菌藻共生体微球。

扁圆卵形藻浓缩液按照如下方法制备而成：将扁圆卵形藻解冻后置于培养瓶中，初始接种量为10

各原料来源同实施例1。

本发明实施例1-3中的虫草真菌与扁圆卵形藻的反应机理如图2所示。虫草真菌可以通过异养代谢产生胞外酶、无机营养物和二氧化碳，这些物质有助于提高扁圆卵形藻的光合效率和生物量积累。反过来，扁圆卵形藻通过光合作用产生氧气、胞外聚合物和有机物，能够为虫草真菌的生长和增殖提供能量和营养源。此外，虫草真菌的菌丝能够吸附和捕获硅藻细胞，对硅藻起到抗氧化保护作用。而扁圆卵形藻具有独特的多孔状硅质膜结构，有利于能量和物质的交换，并能作为生物屏障保护藻菌共生体有效抵御入侵生物和极端环境。

本发明实施例1-3的真菌-硅藻共生体微球形态特征如图3所示，菌藻共生体微球直径3.0-6.0 mm，球体致密、紧实，具有较强的机械强度、传质性能及微生物承载能力。适宜在养殖周期内长期使用，适宜水温12-30 ℃，每次用量为4-8 g/m

实验：

对f/2培养基中油菜素内酯设置不同梯度进行优化筛选。结果表明，油菜素内酯的添加浓度为0.5-1.5 mg/L时，扁圆卵形藻的生物量积累速度明显提升，硅藻的耐寒性和耐盐性也得到显著提高（如表1所示）。

表1 油菜素内酯对扁圆卵形藻生物量及抗逆性的影响

对PDA培养基中裙带菜粉、桑寄生提取物及荆三棱提取物的添加量设置不同配比进行优化筛选。结果表明，三种活性物质的添加对于真菌-硅藻共生体微球形态的控制具有积极作用，形成的球体致密紧实，具有较强的传质性能和过氧化物酶活力（如表2所示）。

表2 裙带菜粉、桑寄生及荆三棱提取物对真菌-硅藻共生体微球性能的影响对PDA培养基中裙带菜粉、桑寄生提取物及荆三棱提取物的添加量设置不同配比进行优化筛选。结果表明，三种活性物质的添加对于真菌-硅藻共生体微球形态的控制具有积极作用，形成的球体致密紧实，具有较强的传质性能和过氧化物酶活力（如表2所示）。

表2 裙带菜粉、桑寄生及荆三棱提取物对真菌-硅藻共生体微球性能的影响

在辽宁省锦州市凌海刺参养殖区选择海水养殖池塘用于水质改良剂的应用试验。每个养殖池塘面积5000-6000 m

池塘试验结束后，从每个处理组取500 L水体样品置于圆柱型水族箱（直径100cm，高90 cm）进行污染物侵染试验。每个水族箱加入重金属、抗生素、致病弧菌混合液。其中重金属混合溶液包括铬（Cr）、砷（As）、镉（Cd）、汞（Hg），每种组分在水体中的添加浓度为100μg/L。抗生素混合溶液包括甲氧苄氨嘧啶（TMP）、磺胺甲恶唑（SMX）、四环素（TCS）、林可霉素（LIN），每种组分在水体中的添加浓度为50 μg/L。致病弧菌包括灿烂弧菌和溶藻弧菌，每种弧菌在水体中的添加浓度为10

各处理组水质改良剂对海水养殖池塘水体理化指标的影响如图4-9所示，图4是各处理组对海水养殖池塘水体总氮含量的影响示意图；图5是各处理组对海水养殖池塘水体氨态氮含量的影响示意图；图6是各处理组对海水养殖池塘水体亚硝酸盐含量的影响示意图；图7为各处理组对海水养殖池塘水体总磷含量的影响示意图；图8为各处理组本对海水养殖池塘水体磷酸盐含量的影响示意图；图9为各处理组对海水养殖池塘水体化学需氧量的影响示意图。结果表明，施用水质改良剂之前，各处理组池塘水体理化指标没有明显区别。随着试验的进行，除对照例外，各处理组均能有效改善养殖池塘水体的各项理化指标，而相比于菌对比例和藻对比例，实施例1、2、3对养殖水体的改良效果更明显。

各处理组水质改良剂对海水养殖池塘水体复合污染物的去除效率如图10-12所示，图10为各处理组对海水养殖池塘水体重金属含量的影响示意图；图11为为各处理组对海水养殖池塘水体抗生素含量的影响示意图；图12为各处理组对海水养殖池塘水体致病弧菌含量的影响示意图。结果表明，除对照例外，各处理组均能有效降低复合污染物含量，而相比于菌对比例和藻对比例，实施例1、2、3能够更显著地降低复合污染物含量。

综合以上实验结果可以看出，本发明的水质改良剂中虫草真菌与扁圆卵形藻互利共生、协同增效，可以有效降低海水养殖池塘水体中氨氮、磷及有机污染物的含量。同时可以有效去除池塘水体中的重金属、抗生素及致病弧菌，对海水养殖池塘水体具有明显的改良作用。