一种梳唇石斛外植体原球茎快繁方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体为一种梳唇石斛外植体原球茎快繁方法。

背景技术

梳唇石斛又叫珍虫石斛、虫草、小黄草、圆花石斛等，主产于云南、广西、东南亚等地海拔1000-2100米的山地林中树干上，它因表皮呈虫绿色，药效高、嚼碎无渣而得名，野生珍虫斛具有独特的药用价值和观赏价值，药用价值茎能够滋阴养胃，清热生津，同时也用于阴伤津亏，口干烦渴，食少干呕，病后虚热，目暗不明，并且观赏价值也极高，花姿优雅，玲珑可爱，花色鲜艳，气味芳香，被誉为“四大观赏洋花”之一，既可做切花，也可盆栽观赏，家有数盆热闹非凡，此外，花朵剪下2-3天也不凋萎，生命力旺盛令人赞叹。

目前国内市场上流通的梳唇石斛主要以云南野生资源采摘和人工栽培为主，野生资源由于果荚少，果粉细小，在自然环境下不易萌发生长等诸多因素的制约，野生资源无止境的采挖，导致梳唇石斛野生资源逐渐减少。

近两年也有不少人对梳唇石斛进行组织培养与快速繁殖技术、人工栽培技术方面进行了大量研究和开发，但因为梳唇石斛种子资源相对匮乏，以种子为主的植物组织培养繁殖受到了很大的局限性，而以茎尖苗培养代替种子培育是解决石斛资源紧缺最有效的途径；如专利号为CN201710361851.2的一种梳唇石斛幼苗快速繁育方法，阐述在不同时期添加不同激素，增殖时期添加赤霉素，在生根阶段，添加了吲哚乙酸、赖氨酸、萘乙酸；在壮苗阶段，添加蛋白胨，来提高种子成活率；再如专利号为CN201711447130.X的一种梳唇石斛组培扩繁育苗的方法，主要在于种子消毒，保证萌发率，增加继代培养提高成苗数量。

基于上述分析，上述两种方法虽然在一定程度上解决了梳唇石斛种苗数量问题，但还是受种子数量与品质影响，难以大规模繁殖，因此，为解决此问题，提出一种梳唇石斛外植体原球茎快繁方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种梳唇石斛外植体原球茎快繁方法，解决了现有梳唇石斛资源不足、繁殖效率低的问题。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种梳唇石斛外植体原球茎快繁方法，包括以下步骤：

S1、外植体预处理：

选取野外生长3-4年、性状优良的梳唇石斛植株做为母本，在9月采集丰满、肥壮的枝条，用清洁吸水纸包裹保存，再把采集的外植体枝条去叶剥去覆盖枝条外膜，用洗涤剂清洗后清水冲洗5-10分钟，低温处理后进行切断，一个芽点为一段，最后在无菌环境中，用75％的乙醇溶液浸泡30-60s，无菌水清洗1-4次，然后用含吐温20的次氯酸钠浸泡4-8mi n，无菌水清洗3-5次，重复1-2次后备用。

S2、原球茎诱导培养：

将S1步骤中处理后的外植体放入诱导培养基中，在20-25℃的环境中进行培养，暗培养7天后，在光照强度1500-3000Lux，光照周期6h/天，培养45-50天，获得原球茎；

S3、原球茎增殖和分化培养：

将S2步骤中获得的原球茎分切并移入增殖分化培养基中，在20-25℃的环境中进行培养，并且于光照强度2000-4000Lux，光照周期6-10h/天，培养30-35天，获得大量的原球茎及丛生苗，原球茎继续重复本步骤，丛生苗进行生根培养。

优选的，所述S1步骤中，所述低温处理为放冰柜在2-5℃环境冷藏12-16小时。

优选的，所述S1步骤中，所述含吐温20的次氯酸钠溶液，包含有体积浓度0.01％-0.1％的吐温20，次氯酸钠溶液浓度为0.1％-0.15％。

优选的，所述S2步骤中，所述诱导培养基由以下质量体积浓度的组分组成：1/2MS基本培养基、1mg/L 6-BA、0.3mg/L NAA、0.3-1g/L松树皮提取物、30g/L马铃薯、30g/L糖、6.7g/L琼脂粉；所述培养基pH值为5.8-6.0。

优选的，所述S3步骤中，所述增殖分化培养基由以下质量体积浓度的组分组成：1/2MS基本培养基、0.6-1.2mg/L 6-BA、0.3mg/L NAA、0.5-2.0g/L松树皮提取物、0.5-1.0g/L水解酪蛋白、30g/L糖、6.7g/L琼脂粉；所述培养基pH值为5.8-6.0。

本发明提供了一种梳唇石斛外植体原球茎快繁方法。具备以下有益效果：

本发明通过与传统的梳唇石斛组织培养方法相比，通过外植体预处理、原球茎诱导培养、原球茎增殖和分化培养，不仅有效减少了组织培养污染率、提高了原球茎诱导率和增殖率，还提高了丛生苗成苗数量，提高了生产效率，使得原球茎诱导率提高到85％以上，增殖系数可达6以上，为工厂化生产提供了良好基础。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

本发明实施例提供一种梳唇石斛外植体原球茎快繁方法，包括以下步骤：

S1、外植体预处理：

选取野外生长3年、性状优良的梳唇石斛植株做为母本，在9月采集丰满、肥壮的枝条，用清洁吸水纸包裹保存，再把采集的外植体枝条去叶剥去覆盖枝条外膜，用洗涤剂清洗后清水冲洗8分钟，放冰柜在2℃环境冷藏12小时进行低温处理后进行切断，一个芽点为一段，最后在无菌环境中，用75％的乙醇溶液浸泡30s，无菌水清洗2次，然后用包含0.01％吐温20的0.1％次氯酸钠溶液浸泡4mi n，无菌水清洗3次，重复2次后备用。

S2、原球茎诱导培养：

将S1步骤中处理后的外植体放入诱导培养基中，在20-25℃的环境中进行培养，暗培养7天后，在光照强度1500Lux，光照周期6h/天，培养45天，获得原球茎；

具体的，诱导培养基为：1/2MS基本培养基、1mg/L 6-BA、0.3mg/L NAA、0.6g/L松树皮提取物、30g/L马铃薯、30g/L糖、6.7g/L琼脂粉；培养基pH值为5.8。

S3、原球茎增殖和分化培养：

将S2步骤中获得的原球茎分切并移入增殖分化培养基中，在20-25℃的环境中进行培养，并且于光照强度2000Lux，光照周期8h/天，培养30天，获得大量的原球茎及丛生苗，原球茎继续重复本步骤，丛生苗进行生根培养。

具体的，增殖分化培养基为：1/2MS基本培养基、1.2mg/L 6-BA、0.3mg/LNAA、2.0g/L松树皮提取物、1.0g/L水解酪蛋白、30g/L糖、6.7g/L琼脂粉；培养基pH值为5.8。

实施例2：

本发明实施例提供一种梳唇石斛外植体原球茎快繁方法，包括以下步骤：

S1、外植体预处理：

选取野外生长4年、性状优良的梳唇石斛植株做为母本，在9月采集丰满、肥壮的枝条，用清洁吸水纸包裹保存，再把采集的外植体枝条去叶剥去覆盖枝条外膜，用洗涤剂清洗后清水冲洗5分钟，放冰柜在2℃环境冷藏12小时进行低温处理后进行切断，一个芽点为一段，最后在无菌环境中，用75％的乙醇溶液浸泡45s，无菌水清洗1次，然后用包含0.05％吐温20的0.15％次氯酸钠溶液浸泡6mi n，无菌水清洗4次，重复1次后备用。

S2、原球茎诱导培养：

将S1步骤中处理后的外植体放入诱导培养基中，在20-25℃的环境中进行培养，暗培养7天后，在光照强度2000Lux，光照周期6h/天，培养50天，获得原球茎；

具体的，诱导培养基为：1/2MS基本培养基、1mg/L 6-BA、0.3mg/L NAA、0.3g/L松树皮提取物、30g/L马铃薯、30g/L糖、6.7g/L琼脂粉；培养基pH值为5.8-6.0。

S3、原球茎增殖和分化培养：

将S2步骤中获得的原球茎分切并移入增殖分化培养基中，在20-25℃的环境中进行培养，并且于光照强度3000Lux，光照周期10h/天，培养35天，获得大量的原球茎及丛生苗，原球茎继续重复本步骤，丛生苗进行生根培养。

具体的，增殖分化培养基为：1/2MS基本培养基、1.0mg/L 6-BA、0.3mg/LNAA、0.5g/L松树皮提取物、0.5g/L水解酪蛋白、30g/L糖、6.7g/L琼脂粉；培养基pH值为5.8-6.0。

实施例3：

本发明实施例提供一种梳唇石斛外植体原球茎快繁方法，包括以下步骤：

S1、外植体预处理：

选取野外生长3年、性状优良的梳唇石斛植株做为母本，在9月采集丰满、肥壮的枝条，用清洁吸水纸包裹保存，再把采集的外植体枝条去叶剥去覆盖枝条外膜，用洗涤剂清洗后清水冲洗10分钟，放冰柜在3℃环境冷藏14小时进行低温处理后进行切断，一个芽点为一段，最后在无菌环境中，用75％的乙醇溶液浸泡60s，无菌水清洗4次，然后用包含0.1％吐温20的0.12％次氯酸钠溶液浸泡8mi n，无菌水清洗5次，重复1次后备用。

S2、原球茎诱导培养：

将S1步骤中处理后的外植体放入诱导培养基中，在20-25℃的环境中进行培养，暗培养7天后，在光照强度3000Lux，光照周期6h/天，培养45天，获得原球茎；

具体的，诱导培养基为：1/2MS基本培养基、1mg/L 6-BA、0.3mg/L NAA、1g/L松树皮提取物、30g/L马铃薯、30g/L糖、6.7g/L琼脂粉；培养基pH值为6.0。

S3、原球茎增殖和分化培养：

将S2步骤中获得的原球茎分切并移入增殖分化培养基中，在20-25℃的环境中进行培养，并且于光照强度4000Lux，光照周期6h/天，培养30天，获得大量的原球茎及丛生苗，原球茎继续重复本步骤，丛生苗进行生根培养。

具体的，增殖分化培养基为：1/2MS基本培养基、0.6mg/L 6-BA、0.3mg/LNAA、1.0g/L松树皮提取物、0.5g/L水解酪蛋白、30g/L糖、6.7g/L琼脂粉；培养基pH值为6.0。

对比例1：

本对比例，即为专利号为CN201711447130.X，公开的一种梳唇石斛组培扩繁育苗的方法，其具体的梳唇石斛组织培养的外植体消毒步骤如下：

外植体消毒：选取健壮梳唇石斛3年的母本植株，在每年9月下旬梳唇石斛开花期间对石斛进行人工授粉，让其长出果荚，经过3个月的培育，将成熟果荚放置冰箱3-7℃环境下保存2周；取出果荚，用洗洁精水浸泡18mi n，洗净后用自来水冲洗12mi n，在无菌环境下用75％医用酒精浸泡并搅拌40s，无菌水冲洗4次，2％次氯酸钠消毒2mi n，无菌水冲洗4次，0.1％升汞消毒7mi n，无菌水冲洗5次，备用。

对比例2：

同实施例1，仅删除S2步骤中诱导培养的培养基中的松树皮提取物组分，即替换为外植体放入诱导培养基中，同时诱导培养基为：1/2MS基本培养基、1mg/L 6-BA、0.3mg/LNAA、30g/L马铃薯、30g/L糖、6.7g/L琼脂粉；培养基pH值为5.8。并且在20-25℃的环境中进行培养，暗培养7天后，光照强度1500Lux，光照周期6h/天，培养45天，获得原球茎。

对比例3：

同实施例1，仅删除S2步骤中暗培养处理，即替换为外植体放入诱导培养基中，同时诱导培养基为：1/2MS基本培养基、1mg/L 6-BA、0.3mg/L NAA、0.6g/L松树皮提取物、30g/L马铃薯、30g/L糖、6.7g/L琼脂粉；培养基pH值为5.8。并且在20-25℃的环境中进行培养，光照强度1500Lux，光照周期6h/天，培养45天，获得原球茎。

对比例4：

同实施例1，仅删除S3步骤中增殖培养基的水解酪蛋白组分，即替换为将原球茎分切并移入增殖分化培养基中，同时增殖分化培养基为：1/2MS基本培养基、1.2mg/L 6-BA、0.3mg/L NAA、2.0g/L松树皮提取物、30g/L糖、6.7g/L琼脂粉；培养基pH值为5.8。并且在20-25℃的环境中进行培养，光照强度2000Lux，光照周期8h/天，培养30天，获得大量原球茎及丛生苗，原球茎继续重复本步骤，丛生苗进行生根培养。

对比例5：

同实施例1，仅删除S3步骤中增殖培养基的松树皮提取物组分，即替换为将原球茎分切并移入增殖分化培养基中，同时增殖分化培养基为：1/2MS基本培养基、1.2mg/L 6-BA、0.3mg/L NAA、1.0g/L水解酪蛋白、30g/L糖、6.7g/L琼脂粉；培养基pH值为5.8。并且在20-25℃的环境中进行培养，光照强度2000Lux，光照周期8h/天，培养30天，获得大量原球茎及丛生苗，原球茎继续重复本步骤，丛生苗进行生根培养。

对比例6：

同实施例1，仅删除S3步骤中增殖培养基的6-BA组分，即替换为将原球茎分切并移入增殖分化培养基中，同时增殖分化培养基为：1/2MS基本培养基、0.3mg/L NAA、2.0g/L松树皮提取物、1.0g/L水解酪蛋白、30g/L糖、6.7g/L琼脂粉；培养基pH值为5.8。并且在20-25℃的环境中进行培养，光照强度2000Lux，光照周期8h/天，培养30天，获得大量原球茎及丛生苗，原球茎继续重复本步骤，丛生苗进行生根培养。

将上述实施例1-3和对比例1-6的污染率、原球茎诱导率、原球茎增殖系数进行测试和统计，结果如下表1所示。

表1：

注：异化不合格率＝玻璃化和畸形植株÷接种植株

由上表1可知，本发明提供的梳唇石斛外植体原球茎快繁方法能够有效地提高梳唇石斛原球茎诱导率和增殖率，同时提高了原球茎品质，降低了原球茎增殖异化不合格率，有效提高了梳唇石斛组织培养效率。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。