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一种登革热病毒一体化快速分型卡盒

文献发布时间：2023-06-19 11:16:08

技术领域

本发明涉及一种登革热病毒一体化快速分型卡盒，属于医学检测技术领域。

背景技术

登革热病毒(Dengue virus,DENV)是一种蚊媒传播引起的急性发热性传染病的病毒，主要发生在热带、亚热带地区，全球有100多个国家出现流行，每年大约有5000万到1亿人受到感染。随着全球气候变暖引起的地理分布区的改变、旅游、交通的加速发展及病毒载体蚊虫的迁移，登革热病毒将会波及到更多地区。目前，根据登革热病毒基因结构的包膜蛋白E抗原性不同，可分为血清DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4共四型。登革病毒感染后可导致登革热(Dengue fever，DF)、登革出血热(Dengue hemorrhagic fever，DHF)、和登革休克综合症(Dengue shock syndrome，DSS)，甚至在不及时治疗的情况下出现死亡。在临床上，症状主要表现为持续型轻度发热，并伴有严重头痛、全身乏力、眼球后疼痛、恶心、呕吐、肌肉和关节痛以及出疹。迄今为止还没有一种有效的疫苗防治登革热的发生，其防治工作非常困难。因此，临床上快速准确地诊断登革热病毒感染至关重要。

目前，检测登革热病毒感染的常规诊断方法通常包括病毒分离培养、血清学检测、核酸分子检测等方法。具体如下：

(1)病毒分离培养

登革病毒是一种具有严格的细胞内存活的生物，必须生活在活的细胞组织内，将病毒接种在细胞系上培养，根据观察病毒对其产生的变化(病变等现象)和应用特异、敏感的检测技术，检出病毒的存在和型别。需要生物安全二级(BSL-2)实验室，在标本运输过程中保持低温(冷冻或冷藏)对于病毒分离非常重要。分离到登革病毒可以确诊，但培养所需周期较长，需要数天，该法在临床诊断中应用受限，不适于快速诊断。

(2)血清学检测

当人体感染登革病毒后，血清中可产生特异性的抗体，根据抗原抗体特异性结合的原理，利用酶与底物的作用产生可见的颜色反应，显色程度与特异性抗原抗体含量呈正相关。主要通过酶联免疫(ELISA)或胶体金等方法检出，但其干扰因素较多(如温度、时间)，重复性不好；通常需5～7d血清中才能达到抗体能够检测水平，同时登革热抗体与其他黄病毒存在交叉反应，且容易受到自身抗体、嗜异性抗体等干扰，出现假阳性率较高，故血清学检测作为登革热病毒检测局限性较大。

(3)核酸分子检测法

登革病毒含RNA基因组，因此PCR前需经过逆转录酶作用，合成第一条cDNA链(RT)，再进行扩增(PCR)，即RT-PCR。多种逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法可用于登革病毒核酸检测，包括一步法RT-PCR、实时荧光RT-PCR或套式RT-PCR等方法等。根据基因扩增产物的片段大小可判断是否登革病毒或某一型登革病毒。检测所需时间短，可确诊且能分型，可用于早期诊断，但核酸检测容易因污染而产生假阳性，因此要求严格分区操作。阴性结果不能排除登革热诊断，需采集第二份标本(发病5天后)开展血清学检测，进行确诊。

采用上述方法虽然可能在临床上提供较好的价值，但具有耗时长、繁琐的操作过程、灵敏度低、免疫交叉反应、特定的昂贵仪器设备等缺点，未能在临床上大规模推广使用。尽管近几年，市场上出现多家特异性荧光探针RT-PCR技术登革热核酸检测试剂盒，以检测血清样本中登革热病毒核酸。但这些试剂盒对于基层检测实验室具有一些局限性：1)要求专业人员和二级生物安全实验室；2)特定的核酸提取方法和条件，易污染且延长操作时间；3)无论登革病毒I型、II型、III型和IV型单重检测试剂，还是双重检测试剂，在大规模样本检测时，会耗时耗力；4)存在无法一管多检直接分型，需使用者按一定配方配制反应液，操作技能要求严格。为此开发出一个省时省力的登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型全自动核酸提取扩增诊断快速分型卡盒对基层检测机构来说势在必行。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种登革热病毒一体化快速分型卡盒。它可以在相对较低成本的情况下，一管反应即可鉴别出登革病毒四种血清型，解决现行技术重复性差、检测方法耗时、操作复杂无法实现早期筛查和快速诊断等问题。

本发明的技术方案：一种登革热病毒一体化快速分型卡盒，其特点是：包括顶部带盒盖的盒体，盒体内从上至下依次设有带裂解液的裂解腔、带第一清洗液的第一清洗腔和带第二清洗液的第二清洗腔，其中裂解腔连通至盒盖，第二清洗腔连通至盒体外侧底部设置的反应腔；所述裂解腔、第一清洗腔、第二清洗腔和反应腔的两两相连区间分别设置有柱塞孔方向垂直于连接方向的柱塞，柱塞的柱塞孔内设有疏水性液态封闭材料；所述反应腔内设有扩增反应液，扩增反应液包括RNA-directTM Realtime PCR Master Mix和四组不同型登革热病毒的引物探针混合液；所述裂解腔内设有能穿过柱塞的柱塞孔的磁珠。通过推动柱塞，可以使柱塞孔对准两个相邻腔体的连通区间，此时两个腔体件依靠附着在柱塞孔内的疏水性液态封闭材料进行隔离，然后磁珠(利用外部磁钢拖动)便可穿过柱塞孔的疏水性液态封闭材料，从一个腔体转移到另一个腔体。

上述的登革热病毒一体化快速分型卡盒中，所述反应腔中的反应液的部分反应组分包埋在可熔性材料内。使反应液体系的反应液和酶促金属离子分离，避免金属离子刺激酶蛋白，延长卡盒的有效期。

前述的登革热病毒一体化快速分型卡盒中，扩增反应所需的锰离子液包埋在可熔性材料内。可熔性材料为石蜡、十二烷、十四烷、十六烷等烷烃类物质中的任意一种或多种的组合，熔点范围为20℃-95℃，优选石蜡，使用时熔化为液态的石蜡油可以防止形成气溶胶的PCR产物污染环间；石蜡油热传导性弱，有效保证PCR的温度条件；石蜡的低温凝固特性在磁珠回拖温度下降后可以固定磁珠位置。石蜡可熔性使包埋物可以使反应液从隔离状态合并。

前述的登革热病毒一体化快速分型卡盒中，所述RNA-directTM Realtime PCRMaster Mix和四组不同型登革热病毒的引物探针混合液的体积比为3～4:2～3。RNA-directTM Realtime PCR Master Mix来自于东洋纺(上海)生物科技有限公司(产品编号TTH-301)，试剂中主要含有Tth酶，该酶在Mn2+激活的条件下，具有高效的逆转录和扩增活性，可单酶完成逆转录RT-PCR全过程，且能够在卡盒使用时耐受盒内可熔性材料熔化时所需的高温(20℃-95℃)，能够在2-8度下长期保存。

前述的登革热病毒一体化快速分型卡盒中，所述四组不同型登革热病毒的引物探针混合液中的引物和探针包括：登革热病毒Ⅰ型上游引物和登革热病毒Ⅰ型下游引物，登革热病毒Ⅱ型上游引物和登革热病毒Ⅱ型下游引物，登革热病毒Ⅲ型上游引物和登革热病毒Ⅲ型下游引物，登革热病毒Ⅳ型上游引物和登革热病毒Ⅳ型下游引物，和登革热病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型的基因探针，具体为

前述的登革热病毒一体化快速分型卡盒中，所述裂解液包含乙酸-乙酸钠(1-1000mM)、PEG(0.1-10％)、GTC(0.1-10M)、Triton X-100(0.1-10％)、SLS(1-5％)，pH为2.0-7.0，溶剂为ddH

前述的登革热病毒一体化快速分型卡盒中，所述所述第一清洗液包含Tris-HCl(1-500mM，PH8.0)、KCl(10-500mM)、PEG(0.1-10％)，pH为5.0-8.0。第二清洗液均包含Tris-HCl(1-500mM，PH8.0)、KCl(10-500mM)、PEG(0.1-10％)、非蛋白封闭剂(0.1-5％)，PH值为5.0-8.0。溶剂为ddH

前述的登革热病毒一体化快速分型卡盒中，所述柱塞的柱塞孔直径为3-5mm，磁珠的直径为0.01-100μm，疏水性液态封闭材料的密度为0.1-1.5g/cm

前述的登革热病毒一体化快速分型卡盒中，所述疏水性液态封闭材料为硅油。

前述的登革热病毒一体化快速分型卡盒中，所述反应腔为置于盒体外侧的锥管，锥管一侧设有平面，便于外部磁钢将磁珠拉回至上方的可熔性材料中(降温后凝固)，进而不会对光学检测产生干扰。

与现有技术相比，本发明的登革热病毒一体化快速分型卡盒，可对登革四种血清型(登革病毒I型、II型、III型、IV型)核酸进行多重实时荧光PCR扩增，同时依据所标记的四色荧光的扩增结果进行血清分型鉴定。结合本发明经过反复研究试验而筛选出的引物与探针，使其在检测的时效性、特异性、灵敏性、便捷性和技术参数等多个方面都优于其它登革热分子诊断试剂盒，具体如下：

1)全封闭式模块化设计：本发明采用将核酸提取、扩增、检测等流程集中在全封闭卡盒内，从结构上杜绝气溶胶污染，保护检测人员安全性，无需PCR实验室。大大降低了核酸检测对实验室建设标准的要求，杜绝了因核酸提取而造成的设备污染问题。

2)时效性：本发明的核酸提取与扩增一体化进行，检测过程只需70-90分钟出结果，可以实现从样本处理到结果报告的全自动化，进一步实现RT-PCR单孔、单荧光检测通道对登革热4种血清型病毒分型，大大降低了对检验人员专业技能的要求，提高了检测效率，适用于快速的临床诊断；

3)准确性：分别针对四种血清亚型病毒核酸特异性序列设计专用引物、探针,保证检测的特异性和灵敏性，同时，可反映出样本中登革病毒感染的状态及确认是何种血清型登革病毒感染，可用于登革热的监测和防控及临床诊断,有助于登革热的早期诊断和治疗；

4)便捷性：2-8度冷藏储存，无需常规的-20度冷冻保存，有助于产品的冷链运输和保存。

此外，本发明使用柱塞结合疏水性液态封闭材料的方式对多个功能性腔体进行隔离，使各个腔体间的液体不会外溢，生物样本能够在各个腔体内分别进行裂解、清洗纯化和扩增反应，并可以利用磁珠以附着方式将核酸依次带入各个腔体，其中疏水性液态封闭材料能够对磁珠有个分散作用，它能够允许穿过磁珠和磁珠上的核酸，阻隔其它杂质，当磁珠穿过时，磁珠上附着的如一些非极性大颗粒的杂质会浸润在疏水性液态封闭材料内而被截留，可以降低杂质对检测结果的影响。

图1是本发明卡盒的结构示意图；

图2是图1的侧向示意图。

附图中的标记为：1-盒体，2-盒盖，3-裂解腔，4-第一清洗腔，5-第二清洗腔，6-反应腔，7-柱塞，8-磁珠。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。

实施例。一种登革热病毒一体化快速分型卡盒，如图1所示：包括顶部带盒盖2的盒体1，盒体1内从上至下依次设有带裂解液的裂解腔3、带第一清洗液的第一清洗腔4和带第二清洗液的第二清洗腔5，其中裂解腔3连通至盒盖2，第二清洗腔5连通至盒体1外侧底部设置的反应腔6；所述裂解腔3、第一清洗腔4、第二清洗腔5和反应腔6的两两相连区间分别设置有柱塞孔方向垂直于连接方向的柱塞7，柱塞7的柱塞孔内设有疏水性液态封闭材料；所述反应腔6内设有扩增反应液，扩增反应液包括RNA-directTM Realtime PCR Master Mix和四组不同型登革热病毒的引物探针混合液；所述裂解腔3内设有能穿过柱塞7的柱塞孔的磁珠8。所述反应腔6中的反应液的部分反应组分包埋在可熔性材料内。扩增反应所需的锰离子液包埋在可熔性材料内。所述RNA-directTM Realtime PCR Master Mix和四组不同型登革热病毒的引物探针混合液的体积比为3～4:2～3。所述四组不同型登革热病毒的引物探针混合液中的引物和探针包括：登革热病毒Ⅰ型上游引物和登革热病毒Ⅰ型下游引物，登革热病毒Ⅱ型上游引物和登革热病毒Ⅱ型下游引物，登革热病毒Ⅲ型上游引物和登革热病毒Ⅲ型下游引物，登革热病毒Ⅳ型上游引物和登革热病毒Ⅳ型下游引物，和登革热病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型的基因探针，具体为

所述裂解液包含1-1000mM乙酸-乙酸钠、0.1-10％PEG、0.1-10M GTC、0.1-10％Triton X-100和1-5％SLS组成，pH值为2.0-7.0。所述所述第一清洗液包含1-500mM Tris-HCl、10-500mM KCl和0.1-10％PEG组成，pH值为5.0-8.0；第二清洗液包含1-500mM Tris-HCl、10-500mM KCl、0.1-10％PEG和0.1-5％非蛋白封闭剂，PH值为5.0-8.0。所述锰离子液体积为5-10ul。具体组分如下：2-3ul的的醋酸锰(CH

所述柱塞7的柱塞孔直径为3-5mm，磁珠8的直径为0.1-10μm，疏水性液态封闭材料的密度为0.1-1.5g/cm

其中，RT-PCR的扩增程序如下：

其中4种不同血清型登革热病毒核酸为浙江省疾控中心提供的病毒核酸分别为D1型：Den1；D2型：Den2；D3型：Den3；D4型：Den4。

其中不同血清型病毒核酸检测的特异性，通过黄热病毒样本核酸、裂谷热病毒样本核酸、西尼罗病毒样本核酸、寨卡病毒样本核酸、基孔肯雅病毒样本核酸进行特异性检测；

其中不同血清型病毒核酸检测的灵敏性，通过不同梯度稀释病毒核酸，检测RT-PCR的扩增曲线，判定反应体系的灵敏度。

其中不同血清型病毒核酸检测的稳定性，通过登革热病毒的临床样本进行检测，以通用培养法检测试剂盒为对照。

一、引物探针设计及合成。

本发明实施例，针对NCBI上已知的最新的登革病毒I型、II型、III型和IV型全基因组序列，设计上游特异性引物、下游特异性引物和TaqMan荧光探针。

优选的，所述TaqMan荧光探针采用四色组合荧光标记物进行探针标记，以实现多重实时荧光PCR扩增，包括

登革热Ⅰ型基因探针：

5’-ROX-CATGTGGTTGGGAGCACGC-BHQ1-3’；(SEQ ID NO:9)

登革热Ⅱ型基因探针：

5’-HEX-ATTGAAGTCGAGGCCCGTTCT-BHQ1-3’；(SEQ ID NO:10)

登革热Ⅲ型基因探针：

5’-CY5-ACCTGGATGTCGGCTGAAGGAGCTTG-BHQ1-3’；(SEQ ID NO:11)

登革热Ⅳ型基因探针：

5’-FAM-CGCGGTTTCTCTCGCGTTTCA-BHQ1-3’。(SEQ ID NO:12)。

二、用于登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型RT-PCR全自动核酸提取扩增诊断一体式微流控卡盒的建立。

1分装PCR缓冲液：向扩增区底部分装35ul PCR缓冲液；

2包埋锰离子液：在PCR缓冲液上层用可熔性材料包埋5ul锰离子液；

3封闭：用适量硅油封闭反应液；

4分装第二清洗液：向第二清洗腔分装140ul第二清洗液；

5封闭：用适量硅油封闭第二清洗液；分装第一清洗液：向第一清洗腔分装140ul第一清洗液；

6封闭：用适量硅油封闭第一清洗液；

7分装裂解液：向裂解液区分装800ul裂解液。

三、使用方法及快速分型鉴定。

样本的采集、保存和运输。

1.1样本类型：血清，不能使用全血或血浆的检测；

1.2样本采集：

患者：无菌采集发病后5d内静脉血(青少年和成人取5ml，婴儿取1ml，幼儿取适量)，放冰壶送实验室分离血清，不能及时分离的，将血清置-20℃暂存；样本采集过程中注意无菌操作，从红细胞凝块中提取出血清，不能使用溶血；

1.3运输保存。

临床标本在运输和贮存过程中要避免反复冻融，等待运输的样本储存在液氮或干冰中，如果不能确保≤-20℃的条件，可在4～8℃保存24h。此外，需根据世界卫生组织试剂感染运输法规进行包装运输。

检测卡盒的使用。

打开卡盒的盖子，再打开封口膜，加入10μL的磁珠(使用前请振荡使之充分悬浮)。再加入200μL样本，用移液器分吹打试剂混匀(建议至少吹打15次)，后盖紧盖子。

实时荧光定量PCR扩增及检测。

2.1样本检测

应用全自动核酸检测荧光定量PCR仪Life Ready K1000，采用全自动核酸检测分析系统对PCR扩增产物进行分析，综合扩增曲线与Tm值判定结果。

荧光通道设定如下：

设置RT-PCR扩增程序如下：

2.2结果分析

1.检测程序运行结束后，适用仪器自动报告检测结果。

2.结果显示登革热病毒(DENV)基因分型的检测数据。

3.登革热病毒(DENV)不同分型基因鉴定结果应呈现典型S型扩增曲线(包括未到平台期的S曲线)，且每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数Ct≤38，判为登革热病毒(DENV)阳性。对各荧光基团进一步进行分析，确定所感染的登革热病毒的分型。

具体分析如下表：

3.1特异性测试

确认本发明的检测卡盒的检测限为500copies/ml。

4、利用本发明的卡盒对多个已经确认为登革热病毒的临床样本进行检测，检测结果如下：

如上表所述，登革热Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型采用本发明卡盒的检出结果与培养法结果一致，阳性检出率100％。但是，采用本发明卡盒进行检测，检出时间段、灵敏度高，而培养法耗时长。

以上所述实施例为本发明较佳实施例，并不用以限制本发明，其他的任何未背离本发明的实质原理所作的改变、修饰、替代、组合、简化均应为等效的置换方式，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州遂曾生物技术有限公司

<120> 一种登革热病毒一体化快速分型卡盒

<130> 2021012902

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA