嘧啶杂环类化合物治疗纤维化疾病的新用途

技术领域

本发明涉及嘧啶杂环类化合物治疗纤维化疾病的新用途，尤其是涉及其或含其的组合物在制备治疗和/或预防纤维化疾病的药物中的新用途，属于医药技术领域。

背景技术

非酒精性脂肪肝病(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除酒精和其他明确因素对肝造成损伤，是以肝细胞内脂肪堆积为主的一类综合征，包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis，NASH)、肝纤维化、肝硬化和肝癌。NAFLD发病率约占全世界人口的25.249％，近年我国NAFLD患病率逐年增高，已逐渐取代慢性病毒性肝病成为慢性肝病之首。目前缺乏针对NAFLD有效的治疗手段，临床上主要使用胰岛素增敏剂、抗氧化剂、调脂药以及护肝药物治疗NAFLD，但治疗效果不尽人意，并且临床及实验发现部分药物会产生明显的毒副作用对患者自身伤害较大。

肝纤维化(Hepatic fibrosis)是肝脏受到肝炎病毒、酒精或化学毒物等因素损伤后所致的细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)在肝脏过度沉积的结果。非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是一种同时伴有严重肝脂肪变性，小叶的综合征炎症和细胞周围纤维化，一般而言，单纯性NAFLD(肝脂肪变性)通常被认为是良性的，NASH则是一种潜在的严重疾病，约占NAFLD的5％。NASH患者极有可能发展为肝硬化和肝衰竭或肝癌。近期研究表明，肝纤维化对NASH特别重要。持续性肝损伤可使肝纤维化发展为以肝脏血管与肝小叶结构严重紊乱为主要病理表现的肝硬化，最终发展为肝功能衰竭与肝癌，是导致肝脏疾病患者死亡的主要原因之一。

NASH和肝纤维化病因复杂、表现多样，目前尚无公认的有效疗法，而肝移植术是晚期NASH肝硬化的唯一选择，且预后存活率低。因此，迫切需要开发药物用于NASH和肝纤维化的治疗。

肺纤维化，是由多种诱因引起的肺部炎症、肺泡持续性损伤、胞外基质反复破坏、修复、重建并过度沉积，最终导致肺组织结构改变、功能丧失的一类疾病。其确切的发病机制尚未完全阐明，现在仍缺乏特异有效的阻止或逆转肺纤维化的治疗手段。特发性肺纤维化(IPF)是一种慢性、进行性、纤维化性间质性肺疾病，病变局限在肺脏，好发于中老年人群，其肺组织学和/或胸部高分辨率CT(HRCT)特征性表现为普通型间质性肺炎(UIP)，病因不清。据统计，每年整体人群中的患病率约(2～29)/10万，且以每年11％的比例增长。我国作为一个老龄化严重的国家，IPF患病人数也是逐年增加，保守估计至少在50万左右。作为一种慢性间质性肺病，IPF起病隐匿、病情逐渐加重，也可表现为急性加重。IPF诊断后的平均生存期仅2.8年，死亡率高于大多数肿瘤，因此被称为一种“类肿瘤疾病”。由于IPF的不可逆性，现有的药物远远不能满足临床治疗的需求，因此开发更加高效的抗肺纤维化药物仍然迫在眉睫。

鉴于治疗和/或预防纤维化疾病的迫切需要，本领域有必要开发结构新颖，作用机制独特效果显著的抗纤维化药物。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种嘧啶杂环类化合物，该类化合物具有治疗非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化和肺纤维化(优选特发性肺纤维化)的新用途。

本发明提供一种通式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐或含所述通式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物在制备用于治疗和/或预防纤维化疾病的药物中的应用，其中，所述通式(I)所示的化合物具有如下结构：

其中，

X选自NH或O；

R

R选自

在一些实施方式中，所述通式(I)所示的化合物具有I-1～I-9所示的结构：

在一些实施方式中，所述通式(I)所示的化合物为I-3。

在一些实施方式中，所述的药学上可接受的盐选自硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、氢氯酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙酸盐、草酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、苯基乙酸盐、苯基丙酸盐、苯基丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、羟基乙酸盐、酒石酸盐、苦杏仁酸盐和磺酸盐中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述纤维化疾病选自非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化或肺纤维化。

在一些实施方式中，所述纤维化疾病为非酒精性脂肪性肝炎。

在一些实施方式中，所述纤维化疾病为肝纤维化。

在一些实施方式中，所述纤维化疾病为肺纤维化。

在一些实施方式中，所述纤维化疾病为特发性肺纤维化。

在一些实施方式中，所述的药物组合物含有作为活性成分的所述的通式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，及药用载体；选择性地，其还可以包括另一种或多种用于治疗的活性剂。

本发明通过实验证明通式(I)所示的化合物具有良好的抗非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化和特发性肺纤维化活性。

附图说明

图1为化合物I-3抗非酒精性脂肪性肝炎和肝纤维化的血清中炎症因子测试实验结果。

图2为化合物I-3抗非酒精性脂肪性肝炎和肝纤维化的AST和ALT酶活力的检测实验结果。

图3为化合物I-3抗非酒精性脂肪性肝炎和肝纤维化的血清中总胆固醇和甘油三酯测定结果。

图4为化合物I-3抗非酒精性脂肪性肝炎和肝纤维化的生化指标测定结果。

图5为化合物I-3抗非酒精性脂肪性肝炎和肝纤维化的肝组织HE染色结果。

图6为化合物I-3抗非酒精性脂肪性肝炎和肝纤维化的肝组织Masson染色结果。

图7为化合物I-3抗非酒精性脂肪性肝炎和肝纤维化的羟脯氨酸测定结果。

图8为化合物I-3对肺纤维化组织中IL-17A、IL-6、TNF-α、羟脯氨酸含量的影响结果。

图9为化合物I-3肺纤维化组织的Masson染色结果图。

图10为化合物I-3肺纤维化组织的形态学观察图。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步描述解释本发明，但这些实施例并非意味着限制本发明的范围。

本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。

实施例1NASH动物模型的建立与抗NASH和肝纤维化实验

1、实验动物来源：雄性C57BL/6J小鼠(18-22g)，由大连医科大学重大疾病基因工程模式动物研究所提供，室温25±2℃，明昼交替，自由摄食与饮水饲养。小鼠生长繁殖饲料、小鼠垫料SPF级购于大连医科大学SPF动物实验中心。

2、小鼠注射、口服药物配制：25％四氯化碳配制：25ml四氯化碳和75ml橄榄油混合均匀；灌胃处方：5％DMSO，5％吐温20，40％聚乙二醇400，50％生理盐水，分步添加逐步混匀，空白对照组口服灌胃处方溶剂。

3、动物分组及NASH模型建立及给药测试：

(1)6-8周的雄性C57BL/6J小鼠(18-22g)，按体重大小大致均匀分为空白组(阴性对照组)、模型组、10mg/ml奥贝胆酸组(阳性对照)、10mg/kg的I-3组、30mg/kg的I-3组，分别标号。空白组4只正常饲料自由饮食。其余组每组10只鼠，高脂饲料自由饮食。

(2)高脂饲料饲养小鼠8周后体重超过35g，开始25％的四氯化碳(CCl

(3)四氯化碳腹腔注射3周后灌胃给药治疗。每天记录小鼠体重变化。

(4)动物处理：实验结束前禁食不禁水隔夜，眼后静脉丛取血，血液静置后离心得血清，-80℃保存。取出肝脏，拍照后将部分肝组织置于4％多聚甲醛固定，用于组织病理研究，余下组织-80℃保存，以备后续实验使用。

血清采集：小鼠麻醉后，左手拇、食指抓取小鼠双耳及颈后皮肤，小指固定尾部，中指将小鼠左侧前肢轻压在胸骨心脏部位，无名指按在腹部。向右侧捻动拇指，压左侧眼部皮肤，使左侧眼球充血突出；如摘取右侧眼球，向左侧捻动食指可使右侧眼球充血突出。用磨砂毛细管插入小鼠后眼角，根据需要捻动拇指与食指的方向，使血液从眼眶内以不同速度垂直流入1.5mL离心管，不要按揉小鼠心脏部位，以免损伤心肺组织。血液在4℃条件下静置2h后，3500rpm离心15min，收集上清(血清)，分装后-80℃保存备用。

检测实验及结果：

试剂盒来源：谷草转氨酶(AST/GOT)、谷丙转氨酶(ALT/GPT)、总胆固醇(T-CHO)、甘油三酯(TG)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)、羟脯氨酸(HYP)检测试剂盒购自南京建成生物技术公司。

1、血清中炎症因子

用流式微球联合检测方法测定IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IL-17A等用流式细胞仪分析其含量变化。结果显示(如图1)所示。

2、血清中谷草转氨酶、谷丙转氨酶酶活力的检测

谷草转氨酶(AST/GOT)、谷丙转氨酶(ALT/GPT)根据试剂盒说明书测定，以评价小鼠肝功能。结果显示如图2。

3、血清中总胆固醇和甘油三酯测定

按照试剂盒操作说明，测定血清中总胆固醇和甘油三酯水平。结果显示如图3。

4、生化指标测定

按照试剂盒操作说明，测定血清中LDH，肝组织中MDA、SOD含量变化。结果显示如图4。

5、肝组织标本的HE染色

(1)组织常规固定，流水冲洗过夜，常规脱水包埋，切片脱蜡至水。

(2)染核：苏木素染液染色12-15分钟，自来水洗涤。

(3)分色：镜下观察，若细胞核染色过深，用1％盐酸酒精溶液分色数秒，自来水洗涤。

(4)染胞质：浸入伊红染液染色5分钟，自来水洗涤。自然风干后拍照(200倍镜观察)，结果显示如图5。

6、肝组织标本的Masson染色

(1)组织常规固定，流水冲洗过夜，常规脱水包埋，切片脱蜡至水。

(2)Weigert铁苏木素A、B液等比例混合(临用前将两液等份混合使用，不宜预先混合，否则容易氧化沉淀逐渐失去染色力)，混匀后使用，染色2分钟，流水稍冲洗。

(3)1％盐酸酒精分化3秒，流水冲洗，丽春红酸性品红染色液染1分钟，流水稍微冲洗。

(4)磷钼酸溶液处理1分钟(镜下控制，见肌纤维呈红色，胶原纤维呈淡红色即可)，95％酒精脱水多次。

(5)无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

(6)胶原纤维、粘液、软骨呈蓝色，肌纤维、纤维素和红细胞染红色，细胞核染蓝黑色，所得结果如图6所示。

7、羟脯氨酸HYP的检测

根据试剂盒说明书测定羟脯氨酸HYP(冰冻肝组织)，所得结果如图7所示。

试验结果显示：与模型组相比较，10mg/ml奥贝胆酸、10mg/kgI-3、30mg/kgI-3处理后，小鼠血清中炎症因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IL-17A等含量显著下降，而模型组与空白对照组小鼠相比血清中炎症因子显著上升。与模型组相比较，10mg/ml奥贝胆酸组、10mg/kgI-3、30mg/kgI-3处理后，显著降低了谷草转氨酶、谷丙转氨酶、总胆固醇、甘油三酯、丙二醛、乳酸脱氢酶的水平，升高超氧化物歧化酶水平，显著降低肝纤维化小鼠中羟脯氨酸水平，且化合物I-3抗炎、抗纤维化效果明显优于参照药物奥贝胆酸，化合物I-3的剂量越大效果越佳。

实施例2肺纤维化动物模型的建立及抗肺纤维实验

1、肺纤维化动物模型的建立

(1)动物：从大连医科大学实验动物研究所购买清洁级C57BL/6J小鼠(雌性)，体重18-20g。适应性养一周。小鼠随机分为正常组、模型组、尼达尼布30mg/kg、尼达尼布60mg/kg、吡非尼酮120mg/kg、吉非替尼60mg/kg、I-3 30mg/kg和I-3 60mg/kg八组。

(2)给药：正常组和模型组灌胃给予PEG400；尼达尼布30mg/kg组灌胃给予尼达尼布30mg/kg，尼达尼布60mg/kg组灌胃给予尼达尼布60mg/kg，吡非尼酮120mg/kg组灌胃给予吡非尼酮120mg/kg，吉非替尼60mg/kg组灌胃给予吉非替尼60mg/kg，I-3 30mg/kg组灌胃给予I-3 30mg/kg，I-3 60mg/kg组灌胃给予I-3 60mg/kg，各组给液体体积为0.1ml/10g体重。

(3)模型的建立：采用气管内注射法。待小鼠麻醉后，将其固定在鼠板上，棉线固定四肢和上门牙。根据小鼠按体重，使用微量注射器吸取相应体积的博来霉素药液(3mg/kg体重)滴入气管，在注入过程中随时注意小鼠的呼吸，避免出现窒息。注入博来霉素药液或生理盐水后迅速将鼠板直立，旋转鼠板，随时关注小鼠呼吸情况，若呼吸变弱，频率不稳，则要及时给与辅助呼吸，直至小鼠呼吸趋于平稳。旋转小鼠有利于博来霉素药液或生理盐水在肺部均匀分布，旋转后用75％酒精棉消毒颈部伤口，直立鼠板靠于墙面，静置小鼠5min，随时观察小鼠呼吸。静置5min后，若小鼠呼吸频率平稳，则将小鼠从鼠板上取下，放回干燥洁净的鼠笼休息，等待苏醒。给予新鲜鼠粮与水，正常饲养。

(4)模型动物处理：实验15天后，将动物处死。开胸腔取肺脏组织，用PBS清洗表面，用吸水纸吸干，称重。各组小鼠均取左肺叶，用4％多聚甲醛固定，进行组织病理切片，其它肺叶冻存于液氮保存，待检测相关指标。

2.肺组织采集与血清制备

(1)小鼠麻醉后，左手拇、食指抓取小鼠双耳及颈后皮肤，小指固定尾部，中指将小鼠左侧前肢轻压在胸骨心脏部位，无名指按在腹部。向右侧捻动拇指，压左侧眼部皮肤，使左侧眼球充血突出；如摘取右侧眼球，向左侧捻动食指可使右侧眼球充血突出。

(2)用弯头镊夹取眼球，根据需要捻动拇指与食指的方向，使血液从眼眶内以不同速度垂直流入1.5mL离心管，不要按揉小鼠心脏部位，以免损伤心肺组织。

(3)4℃条件下静置2h后，3000rpm离心20min，收集上清(血清)，分装后，-80℃保存备用。

(4)将取完血的小鼠固定在鼠板上，棉线固定四肢和上门牙。在剑突下打开腹腔，穿过横膈膜，打开胸腔，左右分别剪断肋骨，将胸骨和肋骨上翻，止血钳固定，暴露心肺将心肺取出，在PBS缓冲液中轻轻漂洗一次去除血污，肺脏表面用吸水纸吸干，剔除气管、心脏，剥离出肺脏。

1、血清中炎症因子和组织HYP的测定

用流式微球联合检测方法测定IL-6、TNF-α、IL-17A等用流式细胞仪分析其含量变化；根据试剂盒说明书测定羟脯氨酸HYP。结果如图8所示。

2、肺组织标本的Masson三色染色

(1)组织常规固定，流水冲洗过夜，常规脱水包埋，切片脱蜡至水。

(2)Weigert铁苏木素A、B液等比例混合(临用前将两液等份混合使用，不宜预先混合，否则容易氧化沉淀逐渐失去染色力)，混匀后使用，染色2分钟，流水稍冲洗。

(3)1％盐酸酒精分化3秒，流水冲洗，丽春红酸性品红染色液染1分钟，流水稍微冲洗。

(4)磷钼酸溶液处理1分钟(镜下控制，见肌纤维呈红色，胶原纤维呈淡红色即可)，95％酒精脱水多次。

(5)无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

(6)胶原纤维、粘液、软骨呈蓝色，肌纤维、纤维素和红细胞染红色，细胞核染蓝黑色，所得结果如图9所示。

3、肺纤维化组织的形态观察

实验结束后，剥离出新鲜肺脏，表面用吸水纸吸干，剔除气管、心脏，拍照。结果如图10所示。

上述试验结果显示：本发明中的化合物I-3能够显著减低血清中IL-6、TNF-α、IL-17A含量，减少肺组织胶原纤维的含量，与模型组相比，肺纤维化的主要指标有明显减低，且治疗效果优于对照药吡非尼酮，与尼达尼布近似。以上研究均预示此类分子具有开发成新型高效抗肺纤维化药物的潜力。

以上所述仅是本发明的优先实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。