磁性SERS生物传感器及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物传感器制备技术领域，具体涉及一种新型磁性SERS生物传感器，可用于同时检测mRNA和miRNA等多种生物标志物。该传感器在生物医学领域有着广泛的应用前景。

背景技术

MicroRNA(miRNA)在许多生物学过程中起着至关重要的作用，例如细胞分化，细胞凋亡和癌症的发展。此外，已有研究结果表明，超过80％的人类肿瘤中存在miRNA-21过表达，而正常细胞中不存在。由于miRNA体积小、丰度低，其检测是一个具有挑战性的问题。除了miRNA外，mRNA可以翻译成蛋白质，蛋白质也被认为是在各种肿瘤中过表达的重要生物标志物。

一些检测miRNAs的新技术已经开发出来，例如实时定量荧光PCR扩增、表面增强拉曼光谱(SERS)、电化学、比色法和荧光成像检测平台。其中，基于SERS的生物传感器具有成本效益高、灵敏度高、操作简单、甚至可以单分子检测等优点，具有广阔的应用前景。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提出了一种磁性SERS生物传感器，可以用于同时检测癌细胞中mRNA和miRNA等多种生物标志物，并且操作简单，具有较高的灵敏性和特异性。

为了实现本发明的目的，一方面，本发明提出一种同时检测多个靶标的磁性SERS生物传感器，包括Fe

在一些实施例中，所述拉曼报告分子选自对氨基苯硫酚(4-ATP)、二硫代双硝基苯甲酸(DTNB)、罗丹明6G(R6G)、结晶紫(CV)、孔雀石绿(MG)或4，4’-联吡啶(44DP)。

在一些实施例中，所述Au@Ag纳米颗粒通过Au-S键与所述捕获探针DNA共价连接。

在一些实施例中，所述Fe

另一方面，本发明提出一种所述磁性SERS生物传感器的制备方法，包括：

将金纳米颗粒分别与不同拉曼报告分子共同孵育，然后在金纳米颗粒的表面上形成银壳，得到分别包含不同拉曼报告分子的多种Au@Ag纳米颗粒；

将多种Au@Ag纳米颗粒分别与不同捕获探针DNA的一端共价连接，得到多种捕获探针DNA-Au@Ag纳米颗粒复合物，将所述复合物混合并将捕获探针DNA的另一端共价连接到Fe

在一些实施例中，通过将所述Au@Ag纳米颗粒与捕获探针DNA一起孵育以使所述Au@Ag纳米颗粒通过Au-S键与所述捕获探针DNA共价连接。

在一些实施例中，所述方法包括将所述Fe

又一方面，本发明提出一种利用所述磁性SERS生物传感器检测样品中多个靶标的方法，包括：

将样品和SERS生物传感器加入含有双链特异性核酸酶(DSN)的缓冲溶液中，在50-60℃下孵育0.5-2小时，洗涤SERS生物传感器并分散到溶液中进行表面增强拉曼光谱检测。

在一些实施例中，双链特异性核酸酶DSN的量为1-5U/mL，优选为3U/mL。

在一些实施例中，所述靶标包括多种mRNA或miRNA。

在磁性SERS生物传感器中，Fe

本发明的生物传感器具有高特异性，能区分RNA序列中的单个碱基，可以检测真实肿瘤细胞系中的RNA，达到实际应用的价值。

与现有技术相比，本发明的磁性SERS生物传感器具有以下的有益效果：

基于稳定的Fe

附图说明

以下附图仅旨在于对本发明做示意性说明和解释，并不限定本发明的范围。其中：

图1为本发明实施例中磁性生物传感器的制备示意图。

图2为本发明实施例中所制备的Fe

图3为本发明实施例中所制备的AuNPs和Au@AgNPs透射电镜图和紫外吸收光谱图。

图4为本发明实施例中所制备的磁性SERS生物传感器的透射电镜图。

图5为本发明实施例1中所制备的磁性SERS生物传感器用于检测p21mRNA的拉曼图谱，其中p21 mRNA的浓度为1fM至1nM。

图6为本发明实施例2中所制备的磁性SERS生物传感器用于检测miRNA-21的拉曼图谱，其中miRNA-21的浓度为1fM至1nM。

图7为本发明实施例3中所制备的磁性SERS生物传感器用于同时检测p21 mRNA和miRNA-21的拉曼图谱，其中p21 mRNA和miRNA-21的浓度为1fM至1nM。

图8为本发明实施例4中所制备的磁性SERS生物传感器用于检测真实癌症细胞中的RNA的拉曼图谱。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

本发明实施例提供了一种磁性SERS生物传感器，包括Fe

如图1所示，本发明实施例中磁性SERS生物传感器的制备方法包括：

在金纳米颗粒(AuNPs)上分别固定拉曼报告分子对氨基苯硫酚(4-ATP)和二硫代双硝基苯甲酸(DTNB)，随后在AuNPs的表面上形成银壳，制备得到包含不同拉曼报告分子的Au@AgNPs SERS纳米标签。

将Au@AgNPs SERS纳米标签和Fe

在本发明实施例中，所述磁性SERS生物传感器中Fe

(1)通过溶剂热反应法合成磁性Fe

通常，室温环境下将1.35g的FeCl

(2)制备核壳Fe

通常，取0.10g Fe

图2为本发明实施例中所制备的Fe

在本发明实施例中，所述磁性SERS生物传感器中SERS纳米标签(Au@AgNPs)通过以下制备方法获得：

(1)通过柠檬酸钠还原法合成直径约为23nm的金纳米颗粒(AuNPs)

首先，将100mL 0.01％(w/v)的HAuCl

(2)包含拉曼报告分子(4-ATP和DTNB)的Au@AgNPs SERS纳米标签的制备如下：

将100μL的1mM 4-ATP和DTNB溶液分别添加入制备好的AuNPs(10mL)溶液中，终浓度为10μM。室温下孵育2h后，以8000rpm的速度离心10min去除多余的拉曼报告分子，所得产物重新分散在10mL超纯水中。随后，为了在AuNPs的表面上形成银壳，将1.5mL(0.1M)抗坏血酸AA和2mL(1mM)AgNO

图3为本发明实施例中所制备的AuNPs和Au@AgNPs透射电镜图和紫外吸收光谱图。从图3的透射图像得出合成均匀的金纳米颗粒(AuNPs)，直径大约为23nm。通过种子介导法合成Au@AgNPs，通过透射图像分析得出银壳的厚度估计为8nm。紫外吸收光谱表明Au在520nm处的吸收峰消失，并且8nm厚度的银壳在400nm处出现了新的吸收峰。这些结果证实了Au@AgNPs的成功合成。

在本发明实施例中，新型磁性SERS生物传感器的制备方法如下：

Au@AgNPs纳米标签和Fe

p21mRNA探针：NH2-TTTTTT CGC TGC AGG ACA CAT GGG GAG CCG AGG CAG CGTTTTTT-SH；

miRNA-21探针：NH2-TTTTTT CAA CAT CAG TCT GAT AAG CTA TTTTTT-SH

首先，将10μM CP溶液(p21 mRNA探针和miRNA-21探针)在90℃加热5min并缓慢冷却至室温进行预处理。两种CP溶液分别添加到100μL Au@AgNPs溶液中，并在室温下孵育12h以形成两种CP-Au@AgNPs。随后，将Fe

图4为本发明实施例中所制备的磁性SERS生物传感器的透射电镜图。从图中可以看出，Au@AgNPs纳米标签富集在Fe

在本发明实施例中，所述反应中拉曼报告分子的浓度优选为10μM。

在本发明实施例中，所述RNA检测反应的孵育温度优选为55℃；所述反应的时间优选为1小时，所述双链特异性核酸酶DSN(购于俄罗斯Evrogen公司)的量优选为每毫升3单位(U)。

在本发明实施例中，所述反应中RNA的浓度变化范围优选为1fM至1nM。

在检测反应体系中加入靶标RNA后，捕获探针CP可与靶标RNA杂交形成DNA-RNA异源双链体，被DSN酶特异性切割，使SERS纳米标签从Fe

实施例1

本实施例按照图1所示的路线制备磁性SERS生物传感器。

Au@AgNPs SERS纳米标签中包含的拉曼报告分子为4-ATP。需要说明的是，检测p21mRNA时的拉曼报告分子并不限于4-ATP，还可以选用DTNB、罗丹明6G、结晶紫等其他拉曼报告分子，只需确保一种拉曼报告分子和一种捕获探针仅与一种靶标对应即可。

本实施例1中包含报告分子4-ATP的Au@AgNPs纳米标签和Fe

使用磁性SERS生物传感器检测p21mRNA：

p21 mRNA定量测定步骤如下：在100μL反应溶液中进行p21 mRNA的SERS检测，反应溶液包括1×DSN主缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.5)、5mM MgCl

图5本发明实施例1定量检测p21 mRNA的拉曼图谱，从图中可以得出，随着p21mRNA浓度的升高，拉曼强度显著降低。

实施例2

本实施例按照图1所示的路线制备磁性SERS生物传感器。

Au@AgNPs SERS纳米标签中包含的拉曼报告分子为DTNB。

本实施例2中包含报告分子DTNB的Au@AgNPs纳米标签和Fe

使用磁性SERS生物传感器检测miRNA-21：

miRNA-21定量测定步骤如下：在100μL反应溶液中进行miRNA-21的SERS检测，反应溶液包括1×DSN主缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.5)、5mM MgCl

图6本发明实施例2定量检测miRNA-21的拉曼图谱，从图中可以得出，随着miRNA-21浓度的升高，拉曼强度显著降低。

实施例3

本实施例按照图1所示的路线制备磁性SERS生物传感器。

Au@AgNPs SERS纳米标签中包含的两种拉曼报告分子4-ATP和DTNB。

本实施例中包含两种报告分子4-ATP和DTNB的Au@AgNPs纳米标签和Fe

使用磁性SERS生物传感器同时检测p21 mRNA和miRNA-21：

同时检测p21 mRNA和miRNA-21步骤如下：在100μL反应溶液中进行p21 mRNA和miRNA-21的SERS检测，反应溶液包括1×DSN主缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.5)、5mMMgCl

图7本发明实施例3定量检测p21 mRNA和miRNA-21的拉曼图谱，从图中可以得出，随着p21 mRNA和miRNA-21浓度的升高，拉曼强度显著降低。

实施例4

本实施例按照图1所示的路线制备磁性SERS生物传感器。

Au@AgNPs SERS纳米标签中包含的两种拉曼报告分子4-ATP和DTNB。

本实施例中包含两种报告分子4-ATP和DTNB的Au@AgNPs纳米标签和Fe

非小细胞肺癌细胞系(A549)，人肾上皮细胞系(293T)和人宫颈癌细胞系(HeLa)三种人类细胞系来制备生物学样品总RNA。

使用磁性SERS生物传感器检测癌细胞系中的p21 mRNA和miRNA-21：

检测癌细胞系RNA的步骤如下：在100μL反应溶液中进行癌细胞系RNA的SERS检测，反应溶液包括1×DSN主缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.5)、5mM MgCl

图8本发明实施例4应用于真实的生物样品检测，分别使用了三种细胞系，非小细胞肺癌细胞系(A549)，人肾上皮细胞系(293T)和人宫颈癌细胞系(HeLa)用于检测p21 mRNA和miRNA-21。实验结果表明，该磁性SERS传感器能够区别不同癌症细胞系中的RNA的表达水平。通过与传统技术qPCR结果对比，甚至能够定量RNA的浓度。

由以上实施例可知，本发明了一种磁性SERS生物传感器，可同时检测mRNA和miRNA。该SERS生物传感器由Fe

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和修饰，这些改进和修饰也应视为在本发明的保护范围内。