用于检测微生物的自给式装置和系统

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年12月10日提交的美国临时申请第62/777,473号和2019年1月30日提交的第62/798,980号的优先权。美国申请第13/773,339号、第14/625,481号、第15/263,619号、第15/409,258号、第16/298,695号和美国临时申请第62/616,956号、第62/628,616号、第62/661,739号、第62/640,793号和第62/798,980号的公开内容据此通过引用以其整体并入本文。

发明领域

本发明涉及使用重组噬菌体检测目标微生物的方法、设备、装置和系统。

技术背景

人们对提高生物、食品、水和临床样品中细菌、病毒和其它微生物的检测速度和灵敏度非常感兴趣。微生物病原体可导致人和家畜动物大量发病，并造成巨大的经济损失。微生物检测是美国食品和药物管理局(FDA)和疾病控制中心(CDC)的高度优先事项，因为摄入被某些微生物(例如葡萄球菌的种(Staphylococcus spp)、大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门菌属的种(Salmonella spp.))污染的食物会导致危及生命或致命的疾病爆发。

用于检测细菌的常规微生物测试依赖于非选择性和选择性富集培养物，随后铺板到选择性培养基上进行平板培养，并进一步测试以确认可疑菌落。此类程序可能需要数天时间。已经研究了多种快速方法并将其引入实践以减少时间需求。然而，到目前为止，减少时间要求的方法都有缺点。例如，涉及直接免疫测定或基因探针的技术通常需要过夜富集步骤以获得足够的灵敏度，因此缺乏提供当天结果的能力。聚合酶链式反应(PCR)测试也包括扩增步骤，因此能够具有非常高的灵敏度和选择性；然而，能够经济地进行PCR测试的样本量是有限的。能够进行PCR的稀释细菌悬浮液将没有细胞，因此仍然需要纯化和/或长时间的富集步骤。

常规生物富集所需的时间取决于样品中靶细菌群的生长速度、样品基质的影响以及所需的灵敏度。实际上，大多数高灵敏度方法采用过夜孵育，总共需要约24小时。由于培养需要时间，这些方法可能需要三天，这取决于要鉴定的生物体和样品来源。这种滞后时间通常是不合适的，因为这种延迟会使受污染的食物或水或其它产品进入牲畜或人体内。另外，抗生素抗性细菌和生物防御考虑的增加使得快速鉴定水、食物和临床样品中的细菌病原体成为全球范围内的关键优先事项。

因此，需要对微生物，诸如细菌和其它潜在致病微生物的更快速、简单和灵敏的检测和鉴定。

发明内容

本发明的实施方案包括用于检测微生物的装置、组合物、方法、设备、系统和套件。本发明可以以多种方式实施。

本发明的方面包括用于促进微生物检测的简易性的装置。本文描述了用于使用重组噬菌体进行检测测试样品中的微生物的测定的设备或装置。

一方面，本发明利用能够结合微生物的噬菌体的高特异性来检测低水平的微生物。在一些实施方案中，该方法在用于食品安全行业的标准尺寸的样品中检测少至10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或单个细菌。在其它实施方案中，首先将样品在有利于生长的条件下孵育9小时或更少、8小时或更少、7小时或更少、6小时或更少、5小时或更少、4小时或更少、3小时或更少、或2小时或更少的富集期。在一些实施方案中，在与重组噬菌体一起孵育之前不对样品进行富集。

在一些实施方案中，重组噬菌体被遗传修饰成包括如前所述的报告基因。在另外的实施方案中，重组噬菌体源自对待检测的微生物特异的噬菌体。例如，重组噬菌体可源自下列任一种噬菌体:沙门氏菌属(Salmonella)噬菌体SPN1S、沙门氏菌属噬菌体10、沙门氏菌属噬菌体ε15、沙门氏菌属噬菌体SEA1、沙门氏菌属噬菌体Spn1s、沙门氏菌属噬菌体P22、李斯特菌属(Listeria)噬菌体LipZ5、李斯特菌属噬菌体P40、李斯特菌属噬菌体vB_LmoM_AG20、李斯特菌属噬菌体P70、李斯特菌属噬菌体A511、葡萄球菌属(Staphylococcus)噬菌体P4W、葡萄球菌属噬菌体K、葡萄球菌属噬菌体Twort、葡萄球菌属噬菌体SA97或大肠杆菌(Escherichia coli)O157:H7噬菌体CBA120。

在一些实施方案中，可以稳定或保存所述重组噬菌体。例如，可将重组噬菌体冻干。

在某些实施方案中，报告基因产生指示剂部分。在某些实施方案中，指示剂部分可以产生内在信号。在其它实施方案中，指示剂部分包含在与底物反应时产生信号的酶。在其它实施方案中，指示剂部分包含辅因子，其在与一种或多种额外的信号产生组分反应时产生信号。例如，指示剂部分包括荧光团、荧光蛋白、颗粒和酶中的至少一种。所述酶可包含萤光素酶、磷酸酶、过氧化物酶和糖苷酶中的至少一种。萤光素酶基因可以是天然存在的基因，诸如刺虾萤光素酶、萤火虫萤光素酶、Lucia萤光素酶或海肾萤光素酶，或者其可以是基因工程改造的基因。

本发明的一些实施方案包括用于执行所述检测方法的装置或设备。在一些实施方案中，装置可包括分隔区室。在一些实施方案中，装置的各分隔区室可被配置成允许用户在所述检测方法的不同阶段组合来自不同区室的内容物。例如，可将待测试的样品在一个区室中与噬菌体组合，并使其孵育一段时间，然后加入到装置的另一个区室的内容物(诸如底物)中。在此类实施方案中，底物可以与由于重组噬菌体感染而产生的任何报告子(或指示剂部分)反应(例如，如果样品中存在靶微生物的话)。

一些实施方案包括装置，所述装置包括第一区室，所述第一区室包含重组噬菌体，所述重组噬菌体具有插入噬菌体基因组的遗传构建体，其中所述构建体包含启动子和指示剂基因；和第二区室，所述第二区室包含信号检测组分，其中所述信号检测组分有助于检测由于用重组噬菌体感染样品而产生的指示剂基因产物。在一些实施方案中，信号检测组分是底物，所述指示剂基因编码酶。在一些实施方案中，所述酶是萤光素酶。

在一些实施方案中，所述设备包括第一区室和第二区室，所述第一区室包含重组噬菌体、用于将一部分测试样品加入重组噬菌体的进口/入口，所述第二区室包含底物或其它配对试剂，其中所述方法还包括在加入所述重组噬菌体的同时或之后，将来自第二区室的底物加入到样品中。在一些实施方案中，其中所述设备包括第三区室。所述第三区室可以例如包括用于富集样品的生长培养基。在其它实施方案中，所述设备不含培养基。

在一些实施方案中，所述设备还包括含有底物的第二区室，并且其中通过将指示剂基因产物与底物接触来检测指示剂基因产物。在一些实施方案中，固相支持物是珠粒。在一些实施方案中，固相支持物包括聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、聚乳酸(PLA)和聚氯乙烯(PVC)。在一些实施方案中，固相支持物在接触样品之前是干燥的。在一些实施方案中，固相支持物在接触样品之前浸泡在培养基中。在一些实施方案中，在与重组噬菌体接触之前，用生长培养基在第三区室中孵育已经捕获一种或多种生物体的固相支持物。

在一些实施方案中，所述固相支持物用细胞结合组分包被，所述细胞结合组分以高亲和力结合样品中的目标微生物。这使得更多的细菌与固相支持物结合，并增加测定灵敏度和特异度。在其它实施方案中，将固相支持物用能够结合目标微生物的抗体包被。

在一些实施方案中，第一区室包括密封件，并且其中所述重组噬菌体与样品接触是通过破坏密封件来进行的，其中密封件的破坏导致来自第一区室的重组噬菌体与样品接触并感染样品中的所述一种或多种微生物，从而产生指示剂基因产物(指示剂蛋白)。在进一步的实施方案中，所述设备包括止动锁(stop-lock)，用于培养基、重组噬菌体和底物与样品分阶段混合(phased mixing)。

在一些实施方案中，所述指示剂基因产物包含荧光团、荧光蛋白、颗粒和酶中的至少一种。在一些实施方案中，所述酶包括萤光素酶、磷酸酶、过氧化物酶和糖苷酶中的至少一种。在一些实施方案中，萤光素酶是基因工程化的萤光素酶。在一些实施方案中，样品是食品、环境、水、商业或临床样品。

另一方面，检测样品中的一种或多种目标微生物的方法包括以下步骤：使所述样品与设备的固相支持物接触，其中所述固相支持物捕获样品中的所述一种或多种微生物(如果存在的话)，其中所述装置包括：第一区室，其包含具有插入到噬菌体基因组中的遗传构建体的重组噬菌体，其中所述构建体包含启动子和指示剂基因；使来自第一区室的重组噬菌体与样品接触，使得重组噬菌体感染样品中的所述一种或多种微生物，从而产生指示剂基因产物，并检测所述指示剂基因产物。

在一些实施方案中，所述方法包括在添加重组噬菌体之前，在生长培养基中孵育已经捕获所述一种或多种目标微生物的固相支持物一段时间。在一些实施方案中，孵育进行0-2小时。在一些实施方案中，其中在检测指示剂基因产物之前噬菌体已经与样品接触了0.5-3小时。

在一些实施方案中，该方法在用于食品安全行业的标准尺寸的样品中检测少至10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或单个细菌。在一些实施方案中，样品包括肉或蔬菜。在一些实施方案中，样品是食物、水、乳制品、环境、商业或临床样品。

在一些实施方案中，首先将样品在有利于生长的条件下孵育9小时或更少、8小时或更少、7小时或更少、6小时或更少、5小时或更少、4小时或更少、3小时或更少、或者2小时或更少的富集期。

其它实施方案包括用于检测微生物如李斯特菌属、沙门氏菌属、葡萄球菌属或大肠杆菌O157:H7的系统和套件，其包含重组噬菌体。一些实施方案还包括用于与所述重组噬菌体的指示剂部分反应的底物。这些系统或套件可包括针对本发明的噬菌体、组合物和方法所描述的特征。在其它实施方案中，本发明包括用于根据本发明的方法或系统一起使用的非瞬态计算机可读介质。

另一方面，本公开提供了用于检测样品中目标微生物的系统，其包括：设备，其包括：第一区室，其包含具有插入到噬菌体基因组中的遗传构建体的重组噬菌体，其中所述构建体包含启动子和指示剂基因；和信号检测部件，其中所述信号检测部件可检测由用重组噬菌体感染样品而产生的指示剂基因产物。在一些实施方案中，信号检测部件是手持式光度计。

附图说明

通过参考以下非限制性附图，可以更好地理解本发明。

图1显示了使用重组噬菌体检测目标细菌的方法的一个实施方案。

图2显示了使用带有拭子作为固相支持物的自给式(self-contained)设备的一个实施方案检测单核增生李斯特菌(L.Monocytogenes)培养物的结果。对应于细菌存在的信号由Hygiena、GloMax和GloMax20/20光度计检测。表1显示了对数期培养物的结果，表2显示了过夜培养物的结果。

图3A和图3B是由表1所示的数据生成的图。图3A显示了使用Hygiena检测到的信号的测量值。以指定的CFU水平用对数期细胞接种拭子。立即用李斯特菌属噬菌体混合物感染样品4小时。加入底物，在Hygiena光度计上读取样品。>10RLU的信号被认为是阳性的。使用这种方法，大约需要25,000CFU才能产生阳性结果。

图3B显示了使用GloMax 20/20和GloMax(又名GloMax 96)光度计检测到的信号测量值。以指定的CFU水平用对数期细胞接种拭子。立即用李斯特菌属噬菌体混合物感染样品4小时。加入底物，在GloMax 20/20(1mL样品)或GloMax(150μl样品)光度计上读取样品。>3.0的信号/背景比被视为阳性的。使用这种方法，大约需要5,000CFU才能产生阳性结果。

图4显示了在接种了沙门氏菌属的火鸡绞肉中检测沙门氏菌属的结果。表3显示了未接种的对照样品，表4显示了接种的火鸡样品。使用不同的孵育和感染时间而重复进行所述测试。

图5A和图5B是根据图4中的数据生成的曲线图。图6A显示，接种了沙门氏菌属的火鸡样品在测试的每次孵育和感染时间中都被检测为阳性。接种后，将火鸡样品在41℃生长24小时，然后用本申请中公开的方法进行测试。对于相对信号：0小时孵育，2小时感染>1小时孵育，0.5小时感染>0小时孵育，0.5小时感染。另外，RLU信号的比较表明，GloMax光度计的信号比Hygiena光度计的信号高得多。

图5B显示使用GloMax 20/20和GloMax光度计的检测对相同的样品产生相似的信号/背景比。虽然GloMax 20/20有更大的信号(图5A)，但背景明显高于GloMax。因此，当测定信号/背景时，两个光度计表现相似。

图6显示了在使用所述自给式设备(self-contained apparatus)进行测定之前，在已接种了沙门氏菌属的三个火鸡样品(样品21、24和26)中检测沙门氏菌属的数据。在检测信号之前，将样品感染如所指示的不同持续时间。

图7A-图7C是根据图6所示的数据生成的曲线图。图7A-图7C显示了实验结果，其中三个接种的火鸡绞肉样品被富集24小时，并采集拭子样品和测定。样品24(图7B)和26(图7C)对于具有30分钟噬菌体感染的样品，在Hygiena手持光度计上没有显示信号，但对于具有2小时感染的样品显示了信号。GloMax 20/20和GloMax光度计生成相对较低的信号。

图8A-图8C是由图6所示数据生成的曲线图。所述曲线图显示GloMax 20/20和GloMax都能够在感染30分钟后将样品21(图8A)和26(图8B)检测为阳性(信号/背景比>3.0为阳性)，但样品24(图8C)需要感染2小时才能显示阳性结果。GloMax 20/20和GloMax光度计结果相似。

图9显示了检测来自接种表面并富集了24小时的单核增生李斯特菌环境海绵样品的数据。

图10显示了使用该设备检测接种了沙门氏菌属的火鸡样品中的微生物。使用三种不同的光度计：GloMax、3M和Hygiena测量信号。

图11A、图11B和图11C描绘了用于检测微生物的自给式设备系统的一个实施方案的视图，所述设备系统具有插入到包括三个区室的容器中的拭子(图11A)或珠粒(图11B)。每个区室由快动式密封件隔开。第一区室包含噬菌体，第二区室包含底物，第三个区室包含培养基。在一些实施方案中，固相支持物是拭子。在一些实施方案中，所述装置不含培养基(图11C)。

图12A、图12B和图12C描绘了用于检测微生物的自给式设备系统的一个实施方案的视图，所述设备系统具有插入到包括三个区室的容器中的拭子(图12A)或珠粒(图12B)。每个区室由快动式密封件隔开。第一区室包含噬菌体，第二区室包含培养基，第三区室包含底物。在与噬菌体和培养基一起孵育后，可破坏分隔第二区室与第三区室的密封件。在一些实施方案中，固相支持物是拭子。在一些实施方案中，所述装置不含培养基(图12C)。

图13A、图13B和图13C描绘了用于检测微生物的自给式设备系统的一个实施方案的视图，所述设备系统具有插入到包括三个区室的容器中的拭子(图13A)或珠粒(图13B)。每个区室由快动式密封件隔开。第一区室包含培养基，第二区室包含噬菌体，第三区室包含底物。在一些实施方案中，固相支持物是拭子。在一些实施方案中，所述装置不含培养基(图13C)。

图14A、图14B和图14C描绘了用于检测微生物的自给式设备系统的一个实施方案的视图，所述设备系统具有插入到包括三个区室的容器中的拭子(图14A)或珠粒(图14B)。每个区室由快动式密封件隔开。第一区室包含培养基，第二区室包含噬菌体，第三区室包含底物。所述设备具有用于试剂分阶段混合的止动锁定机构。在一些实施方案中，所述固相支持物是拭子。在一些实施方案中，所述装置不含培养基(图14C)。

图15A、图15B和图15C描绘了用于检测微生物的自给式设备系统的一个实施方案的视图，所述设备系统具有插入到包括三个区室的容器中的拭子(图15A)或珠粒(图15B)。每个区室由快动式密封件隔开。第一区室包含培养基，第二区室包含噬菌体，第三区室包含底物。所述设备具有用于试剂分阶段混合的止动锁定机构。在一些实施方案中，所述固相支持物是拭子。在一些实施方案中，所述装置不含培养基(图15C)。

图16描绘了用于检测微生物的系统的自给式设备系统的一个实施方案的视图，所述设备系统具有插入到包括两个区室的容器中的拭子。每个区室由快动式密封件隔开。第一区室包含噬菌体，第二区室包含底物。在一些实施方案中，所述固相支持物是拭子。

图17描绘了利用自给式设备系统检测微生物的实施方案的流程图。

具体实施方式

定义

除非本文中另有定义，否则结合本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。另外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，复数术语应包括单数。通常，本文所述的与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学以及杂交结合使用的术语和所述领域的技术是本领域众所周知和常用的那些术语和技术。除非另有说明，否则已知的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法来执行，并且如贯穿本说明书论述的各种一般和更具体的参考文献中所述的。如本领域通常实现的或本文所述的，酶促反应和纯化技术按照制造商的说明进行。与本文所述的实验室程序和技术相关的术语是本领域众所周知和常用的术语。

除非另有说明，否则以下术语应理解为具有以下含义：

如本文中所用，除非另有特别说明，否则术语“一个/种”、“这个/这种”和“所述/该”可以指一个/种或多个/种。

除非明确指出仅指替代物或者替代物是互斥的，否则术语“或”的使用用于表示“和/或”，尽管本公开支持仅指替代物以及“和/或”的定义。如本文中所用，“另一个”可以表示至少第二个或更多个。

在整个本申请中，术语“约”用于表示数值包括装置、用于测定该数值的方法或样品之间存在的变化的固有误差变化。

术语“固相支持物”或“载体”意指提供生物分子可结合于其上的基底和/或表面的结构。例如，固相支持物可以是测定孔(即，诸如微量滴定板或多孔板)，或者固相支持物可以是过滤器、阵列或移动载体诸如珠粒或膜(例如，过滤板或侧流条)上的位置。

术语“指示剂”或“指示剂部分”或“可检测部分”或“可检测生物分子”或“报告子”或“标记物”是指提供可在定性或定量测定中测量的信号的分子。例如，指示剂部分可包含可用于将底物转化为可测量产物的酶。指示剂部分可以是催化产生生物发光发射的反应的酶(例如，萤光素酶、HRP或AP)。或者，指示剂部分可以是可定量的放射性同位素。或者，指示剂部分可以是荧光团。或者，可以使用其它可检测的分子。

如本文中所用，“细菌噬菌体(bacteriophage)”或“噬菌体(phage)”包括多种细菌性病毒中的一种或多种。在本公开中，术语“噬菌体(bacteriophage)”或“噬菌体(phage)”包括病毒，诸如分枝杆菌属噬菌体(诸如用于TB和副TB)、噬真菌体(mycophage)(诸如用于真菌)、支原体噬菌体，以及任何其它表示能够侵入活细菌、真菌、支原体、原生动物、酵母和其它微生物活生物体并使用它们来复制自身的病毒的术语。此处，“微观的”意指最大尺寸为1毫米或更小。噬菌体是已在自然界中进化成利用细菌作为复制自己的手段的病毒。

如本文中所用，“培养物富集”、“培养以富集”、“经培养以富集”或“富集培养”是指常规培养，诸如在有利于微生物增殖的培养基中孵育，并且不应与“富集”一词的其它可能用途(诸如通过除去样品的液体组分以浓缩其中所含的微生物而进行的富集，或不包括常规促进微生物增殖的其它形式的富集)相混淆。在本文所述方法的一些实施方案中，可采用短时间的富集培养，但这不是必需的，并且如果真使用的话，其时间比常规的富集培养短得多。

如本文中所用，“重组”是指通常在实验室进行的遗传(即。核酸)修饰，以将原本不存在的遗传物质合并在一起。该术语在本文中可与术语“经修饰的”互换使用。

如本文中所用，“RLU”是指由光度计(例如，

概述

本发明利用重组噬菌体的高特异性来检测样品中特定微生物的存在并且/或者定量所述微生物，所述重组噬菌体能够以高亲和力与特定微生物结合。

本文公开了对于使用测定法检测测试样品(例如，食物、水、乳制品、环境、商业、临床或其它生物样品)中的目标微生物显示出令人惊讶的灵敏度和速度的组合物、方法、套件和系统，所述测定法在不进行富集培养的情况下进行，或者在一些实施方案中使用微生物可在其期间潜在繁殖的最小孵育时间。这些组合物、方法、套件和系统允许在比以前认为可能的时间范围更短的时间范围内实现微生物的检测。

本发明的组合物、方法、套件和系统的实施方案可应用于在各种情况下检测各种微生物(例如，细菌、真菌、酵母)，包括但不限于检测来自食物、水、乳制品、环境、商业、临床或其它生物样品的病原体。本文公开的基于重组噬菌体的检测实施方案可适用于任何细菌或其它目标微生物(例如，病原性微生物)，对于所述细菌或微生物可获得不识别对其检测不感兴趣的微生物的特定噬菌体。本发明的方法快速提供高检测灵敏度和特异度，并且不需要常规生物富集(例如，培养)。因此，可使用本发明的方法检测多种微生物。

本发明的方法和系统的实施方案可应用于在各种情况下对各种微生物(例如，细菌、真菌、酵母)进行检测和定量，包括但不限于对来自食品、水、乳制品、环境、商业、临床或其它生物样品的病原体进行检测。本发明的方法可以快速提供高检测灵敏度和特异度，而无需常规生物富集(例如，培养)，这是一个令人惊讶的方面，因为所有具有所需灵敏度和特异度的可用方法都需要培养。

本文还公开了使用设备检测测试样品(例如，食品、水、乳制品、环境、商业、临床或其它生物样品)中的微生物的系统和方法。所述方法使用包含固相支持物的自给式设备，所述设备可用于收集样品。所述设备还包括含有噬菌体的第一区室，所述噬菌体具有插入噬菌体基因组的遗传构建体，其中所述构建体包含启动子和指示剂基因。所述方法包括将来自第一区室的重组噬菌体与样品接触，使得重组噬菌体感染样品中的一种或多种微生物，从而产生指示剂基因产物(“指示剂”)，并检测该指示剂。在一些方面，所述设备还包括第二区室，所述第二区室包含专用于检测所述指示剂的底物。在一些实施方案中，所述方法还包括将已被噬菌体感染的样品与底物接触，从而检测所述指示剂。在这些实施方案中，每个区室通过快动式密封件与紧邻的区室隔开，所述快动式密封件在破裂时允许区室的内容物离开区室并与来自样品的内容物或来自其它区室的内容物混合。例如，用户可以破坏快动式密封件，使得来自第一区室的重组噬菌体与固相支持物上的样品接触，从而感染结合在其上的微生物。在微生物感染时，指示剂基因被表达以产生指示剂蛋白，所述指示剂蛋白可被各种检测装置检测到。信号的存在表明样品中存在所述微生物。

本发明的设备、组合物、方法、套件和系统的实施方案可应用于在各种情况下检测各种微生物(例如，细菌、真菌、酵母)，包括但不限于检测来自食物、水、乳制品、环境、商业、临床或其它生物样品的病原体。本文公开的检测实施方案可适用于任何细菌或其它目标微生物(例如，病原性微生物)，对于所述细菌或目标微生物可获得不识别对其检测不感兴趣的微生物的特定重组噬菌体。本发明的方法快速提供高检测灵敏度和特异度，并且不需要常规生物富集(例如，培养)。这是令人惊讶的方面，因为所有具有所需灵敏度和特异度的可用方法都需要培养。使用自给式设备检测样品中的微生物是方便和高效的，所述设备在检测前将检测微生物所需的试剂保存在单独的区室中。所述设备易于使用，并且无需大量培训。

样品

本发明的组合物、方法、套件和系统的每个实施方案允许快速检测并且/或者定量样品中的微生物。例如，根据本发明的方法可在缩短的时期内进行，具有优异的结果。

在某些实施方案中，重组噬菌体被用于检测目标微生物。可由本发明的组合物、方法、套件和系统检测的微生物包括属于商业、医学或兽医学关注的病原体。通过本发明的方法可以检测已经鉴定出了其特异性的重组噬菌体的任何微生物。本领域技术人员将理解，除了需要有必需的重组噬菌体/微生物对之外，本发明方法的应用不受限制。

本发明可检测的细菌细胞包括，但不限于，作为食物或水传播病原体的细菌细胞。本发明可检测的细菌细胞包括但不限于沙门氏菌属的所有种、大肠杆菌的所有菌株，包括但不限于大肠杆菌O157:H7(和其它志贺毒素-和大肠杆菌的肠毒素产生性菌株)、李斯特菌属的所有种，包括但不限于单核增生李斯特菌和弯曲杆菌属(Campylobacter)的所有种。本发明可检测的细菌细胞包括但不限于作为医学或兽医学意义上的病原体的细菌细胞。此类病原体包括但不限于芽孢杆菌属的某些种(Bacillus spp.)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、布鲁氏菌属的种(Brucella spp.)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、肠杆菌属的种(Enterobacter spp.)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、宋氏志贺氏菌(Shigellasonnei)、耶尔森氏菌属的种(Yersinia spp.)、弧菌属的种(Vibrio spp.)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和链球菌属的种(Streptococcus spp.)。

样品可以是环境或食物或水样品。一些实施方案可包括医学或兽医学样品。样品可以是液体、固体或半固体。样品可以是固体表面的拭子。样本可以包括环境材料，诸如水样品、来自空气样品的滤器或来自旋风收集器的气溶胶样品。样品可以是牛肉、家禽、加工食品、牛奶、奶酪或其它乳制品。医学或兽医学样品包括但不限于血液、痰、脑脊液和粪便样品。在一些实施方案中，样品可以是不同类型的拭子。

在一些实施方案中，样品可以直接用于本发明的检测方法中，而无需制备、浓缩或稀释。例如，液体样品，包括但不限于牛奶和果汁，可以直接进行测定。在其它实施方案中，样品可被稀释或悬浮在溶液中，所述溶液可包括但不限于缓冲溶液或细菌培养基。固体或半固体样品可通过将固体在液体中绞碎、混合或将固体浸渍在液体中而悬浮在液体中。在一些实施方案中，应将样品保持在促进重组噬菌体附着于宿主细菌细胞的pH值范围内。在一些实施方案中，优选pH值范围可以是适合于噬菌体附着于细菌细胞的范围。样品还应含有适当浓度的二价和一价阳离子，包括但不限于Na

在一些实施方案中，将样品保持在维持样品中存在的任何病原体细胞的活力的温度下。在其中噬菌体附着于细菌细胞的步骤中，可将样品保持在促进噬菌体活性的温度下。此类温度至少约为25℃，但不超过约45℃。在一些实施方案中，将样品保持在约37℃。在一些实施方案中，将样品在重组噬菌体结合或感染期间进行温和的混合或摇动。

利用重组噬菌体检测微生物的方法

使用重组噬菌体检测目标微生物的方法已在前面描述过。测定可包括各种适当的对照样品。例如，不含重组噬菌体的对照样品和/或含有不含细菌的重组噬菌体的对照样品可作为对照进行测定，作为背景信号水平。

如本文所述，在某些实施方案中，本发明可包括使用重组噬菌体检测微生物的方法。本发明的方法可以以多种方式实施。

在一些方面，本发明包括用于检测目标微生物的方法。所述方法可使用重组噬菌体来检测目标微生物。例如，在某些实施方案中，目标微生物是细菌，并且重组噬菌体源自特异性识别所述目标细菌的噬菌体。在某些实施方案中，所述方法可包括通过将样品与能够结合目标细菌的多种重组噬菌体一起孵育来检测样品中的目标细菌。结合到单个微生物上的多个重组噬菌体是大于1的任何数目，但优选为至少5x10

在某些实施方案中，重组噬菌体包含指示剂部分。所述方法可包括检测重组噬菌体的指示剂部分，其中指示剂部分的阳性检测表明样品中存在目标细菌。

在一些实施方案中，本发明可包括检测样品中少至单个目标微生物的方法，所述方法包括以下步骤：将样品与结合目标微生物的多个重组噬菌体一起孵育，其中所述重组噬菌体包含指示剂部分，并在使得所述多个重组噬菌体结合目标细菌的条件下与待测样品接触；将未结合的重组噬菌体与细胞结合的重组噬菌体分离；以及检测由于细菌感染而产生的指示剂部分，其中指示剂部分的阳性检测表明样品中存在目标微生物。实施方案可包括将样品与至少5x10

在一些实施方案中，检测步骤将需要添加底物以使指示剂酶起作用。特定指示剂的选择对本发明来说并不重要，但该指示剂本身应该能够产生可检测的信号，或者是仪器可检测的，或者是与一种或多种附加信号产生性组分诸如酶/底物信号产生性系统结合而可检测的。

在某些实施方案中，可以进行测定以利用重组噬菌体来鉴定特定微生物的存在。可以对测定进行修改，以适应不同的样品类型或大小以及测定形式。采用本发明的重组噬菌体的实施方案可以允许快速检测特定的细菌菌株，取决于样品类型、样品大小和测定形式，总测定时间在1.5小时、2.0小时、2.5小时、3.0小时、3.5小时、4.0小时、4.5小时、5.0小时、5.5小时、6.0小时、6.5小时、7.0小时、7.5小时、8.0小时、8.5小时、9.0小时、9.5小时、10.0小时、10.5小时、11.0小时、11.5小时或12小时以下。例如，所需的时间可以稍短或稍长，这取决于重组噬菌体的亲和力和/或测定中待检测的细菌的类型、待测试的样品的类型和大小、物理/化学环境的复杂度以及内源性非靶标细菌污染物的浓度。

图1示出了根据本发明实施方案使用重组噬菌体检测目标细菌的测定的实施方案。用于组合试剂的多种配置和步骤是可能的。在此处示出的实施方案中，指示剂噬菌体(或冻干的指示噬菌体)的等分试样包含在装置的第一区室中。将含有细菌的拭子引入第一区室，并孵育一段时间(例如37℃下45分钟)，这段时间足以使噬菌体复制并产生可溶性指示剂(例如，萤光素酶)。然后，可破坏包含可溶性指示剂和噬菌体的第一区室与第二区室之间的密封件，以使可溶性指示剂蛋白与包含在第二区室中的底物接触。光度计可用于检测指示剂(例如，萤光素酶)与底物的反应。本文描述了利用该方法的实验。在一些实施方案中，在感染之后，装置的内容物可以被拉回第一区室中，以便将被感染的细菌与底物混合。在进一步的实施方案中，然后可将内容物推回到第二区室中，使得可以在光度计中读取指示剂信号。

在一些实施方案中，可在测试之前通过在促进生长的条件下孵育来富集样品。在此类实施方案中，富集期可为1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时或长达8小时或更长，这取决于样品类型和大小。

因此，在一些实施方案中，指示剂噬菌体包含可检测的指示剂部分，并且单个致病细胞(例如，细菌)的感染可以通过经由指示剂部分产生的放大信号来检测。因此，所述方法可包括检测噬菌体复制过程中产生的指示剂部分，其中检测到指示剂表明样品中存在目标细菌。

在一些实施方案中，指示剂噬菌体包含可检测的指示剂部分，并且单个致病细胞(例如，细菌)的感染可以通过经由指示剂部分产生的放大信号来检测。因此，所述方法可包括检测噬菌体复制过程中产生的指示剂部分，其中检测到指示剂表明样品中存在目标细菌。

如本文更详细描述的，本发明的方法和系统可利用一定浓度范围的亲代指示剂噬菌体来感染样品中存在的细菌。在一些实施方案中，将指示剂噬菌体以足以快速发现、结合和感染样品中以非常低的数量存在的靶细菌(诸如，单个细胞)的浓度添加到样品中。在一些实施方案中，噬菌体浓度可以足以在不到一小时内发现、结合并感染靶细菌。在其它实施方案中，在向样品中加入指示剂噬菌体后，这些事件可以在少于两小时或少于三小时内发生。例如，在某些实施方案中，用于孵育步骤的噬菌体浓度大于1x10

本发明的方法可包括增加灵敏度的各种其它步骤。例如，如本文更详细讨论的，所述方法可包括捕获和洗涤捕获和结合的细菌的步骤，以去除过量的重组噬菌体并增加信噪比。在一些实施方案中，指示剂部分的阳性检测要求通过检测指示剂部分产生的信号与背景的比率为至少2.0或至少2.5。

图2至图10展示了来自重组噬菌体测定的示例性实施方案的数据和这些数据的曲线图。

图2、图3A和图3B涉及单核增生李斯特菌的检测。图2显示了使用带有拭子作为固相支持物的自给式设施的一个实施方案检测单核增生李斯特菌培养物的数据。对应于细菌存在的信号由Hygiena、GloMax和GloMax 20/20光度计检测。表1显示了对数期培养的结果，表2显示了过夜培养的结果。

图3A和图3B是由表1所示的数据生成的图。图3A显示了使用Hygiena检测到的信号的测量值。用指定的CFU水平的对数期细胞接种拭子。立即用李斯特菌属噬菌体混合物感染样品4小时。加入底物，在Hygiena光度计上读取样品。>10RLU的信号被认为是阳性的。使用这种方法，大约需要25,000CFU才能产生阳性结果。

图3B显示了使用GloMax 20/20和GloMax(又名GloMax 96)光度计检测到的信号测量值。用指定的CFU水平的对数期细胞接种拭子。立即用李斯特菌属噬菌体混合物感染样品4小时。加入底物，在GloMax 20/20(1mL样品)或GloMax(150μl样品)光度计上读取样品。>3.0的信号/背景比被视为阳性的。使用这种方法，大约需要5,000CFU才能产生阳性结果。

图4至图8涉及展示沙门氏菌属的检测的实施方案。图4显示了在接种了沙门氏菌属的火鸡绞肉中检测沙门氏菌属的结果。表3显示了未接种的对照样品，表4显示了接种的火鸡样品。使用不同的孵育和感染时间而重复进行所述测试。

图5A和图5B是根据图4中的数据生成的曲线图。图6A显示，接种了沙门氏菌属的火鸡样品在每次孵育和感染时间测试中都被检测为阳性。接种后，将火鸡样品在41℃生长24小时，然后用本申请中公开的方法进行测试。对于相对信号：0小时孵育，2小时感染>1小时孵育，0.5小时感染>0小时孵育，0.5小时感染。另外，RLU信号的比较表明，GloMax光度计的信号比Hygiena光度计的高得多。

图5B显示使用GloMax 20/20和GloMax光度计的检测对相同的样品产生相似的信号/背景比。虽然GloMax 20/20有更大的信号(图5A)，但背景明显高于GloMax。因此，当测定信号/背景时，两个光度计表现相似。

图6显示了在使用自给式设备进行测定之前，在已接种了沙门氏菌属的三个火鸡样品(样品21、24和26)中检测沙门氏菌属的数据。在检测信号之前，将样品感染如所指示的不同持续时间。

图7A-图7C是根据图6所示数据生成的曲线图。图7A-图7C显示了实验结果，其中三个接种的火鸡绞肉样品被富集24小时，并采集拭子样品和测定。样品24(图7B)和26(图7C)对于具有30分钟噬菌体感染的样品，在Hygiena手持光度计上没有显示信号，但对于具有2小时感染的样品显示了信号。GloMax 20/20和GloMax光度计生成的相对较低的信号。

图8A至图8C是由图6所示数据生成的曲线图。所述曲线图显示GloMax 20/20和GloMax都能够在感染30分钟后将样品21(图8A)和26(图8B)检测为阳性(信号/背景比>3.0为阳性)，但样品24(图8C)需要感染2小时才能显示阳性结果。GloMax 20/20和GloMax光度计结果相似。

图9显示了检测来自接种表面并富集了24小时的单核增生李斯特菌环境海绵样品的数据。

图10显示了使用该设备检测接种了沙门氏菌属的火鸡样品中的微生物。使用三种不同的光度计：GloMax、3M和Hygiena测量信号。

重组噬菌体测定随时间推移保持特异性。在多年针对例如大肠杆菌、克罗诺杆菌属(Cronobacter)、沙门氏菌属、李斯特菌属和金黄色葡萄球菌的重组噬菌体测定的开发和利用中的许多实施方案中，没有观察到宿主特异性的变化。这些实施方案包括超过25个重组萤光素酶报告子或指示剂噬菌体。另外，没有在本文所述的任何重组噬菌体中检测到报告子或指示剂(例如，萤光素酶)基因的缺失或失活。将重组噬菌体以多个等分储存和保存，以防止误操作。虽然噬菌体本质上是稳定的，但随着储存时间的延长，例如在4℃下储存数月或数年，滴度可能会有不同程度的下降。一般认为这是由于DNA从颗粒中丢失造成的；然而，活性噬菌体是通过铺板形成噬菌斑以获得更高的滴度来回收的。通过感染已知为阳性和阴性的不同细菌菌株，对每种重组噬菌体制剂进行特异性验证。

在用于测试样品的方法的一些实施方案中，使用大量过量的重组噬菌体需要将样品的任何未结合的细菌或其它更大的组分与过量的未结合的重组噬菌体分离。这可通过本领域普通技术人员公知的许多不同方式来实现。微生物细胞可以通过离心、按大小过滤或选择性固定来分离。在一些实施方案中，通过过滤器孔来实现按尺寸过滤。在其它实施方案中，磁性分离可用于选择性固定。例如，可在与重组噬菌体一起孵育之前或之后，通过0.45μm或0.22μm的膜过滤样品，以在固相支持物上捕获靶微生物(例如，细菌)。然后可将捕获的微生物在固相支持物上洗涤一次或多次，以确保仅保留特异性结合的重组噬菌体。或者可采用特异性或非特异性结合的机制将微生物捕获在微珠或另一固体表面上。用于分离样品组分的其它形式也是可能的。

可以使用多种固相支持物。在某些实施方案中，固相支持物可包括多孔板、过滤器、珠粒、侧流条、过滤条、过滤盘、滤纸或设计用于培养细胞的薄膜(例如，由3M生产的PetriFilm)。其它固相支持物也可以是合适的。例如，在一些实施方案中，测试样品微生物可以通过结合到拭子、板的表面或通过细菌过滤器(例如，0.45μm孔径的旋转过滤器或板过滤器)过滤样品来捕获。在一个实施方案中，将在过滤器或平板表面上捕获的微生物与重组噬菌体一起孵育，随后洗涤一次或多次以除去过量的未结合的重组噬菌体。

或者，在一些实施方案中，捕获步骤可以基于目标微生物的其它特征，诸如大小。在利用基于大小的捕获的实施方案中，固相支持物可以是旋转柱过滤器。在一些实施方案中，固相支持物包括96孔过滤板。或者，用于捕获的固相支持物可以是阵列上的位置，或者可以是移动载体，诸如珠粒。

在一些实施方案中，固相支持物用细胞结合组分包被，所述细胞结合组分以高亲和力结合样品中的目标微生物。这使得更多的细菌与固相支持物结合，并增加了测定灵敏度和特异度。

在一个实施方案中，当目标微生物是细菌时，重组噬菌体可以通过来自噬菌体的细胞结合结构域与细菌结合。例如，研究充分的大肠杆菌噬菌体包括T1、T2、T3、T4、T5、T7和λ；例如，可从ATCC保藏中心获得的其它大肠杆菌噬菌体包括phiX174、S13、Ox6、MS2、phiV1、fd、PR772和ZIK1。沙门氏菌属噬菌体包括SPN1S、10、ε15、SEA1和P22。李斯特菌属噬菌体包括LipZ5、P40、vB_LmoM_AG20、P70和A511。葡萄球菌属噬菌体包括P4W、病毒K、Twort、phi11、187、P68和phiWMY。

在一些实施方案中，可在测试之前通过在促进生长的条件下孵育来富集样品。在此类实施方案中，富集期可为1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时或长达8小时或更长，这取决于样品类型和大小。

在其它实施方案中，在固相支持物上捕获细菌后，可以富集样品。在此类实施方案中，富集期可为1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时或长达8小时或更长，这取决于样品类型和大小。

因此，在一些实施方案中，重组噬菌体包含可检测的指示剂部分，并且可以通过经由指示剂部分产生的放大信号来检测与单个致病细胞(例如，细菌)的结合。因此，所述方法可包括检测重组噬菌体的指示剂部分，其中检测到指示剂表明样品中存在目标细菌。

在本发明方法的一些实施方案中，可在不从样品中分离或纯化微生物的情况下检测微生物。例如，在某些实施方案中，包含一种或多种目标微生物的样品可以直接施加到测定容器，诸如旋转柱、微量滴定孔或过滤器，并且在该测定容器中进行测定。也就是说，微生物被捕获在孔径太小而不能让微生物通过的膜上。本文公开了此类测定的各种实施方案。

可将测试样品的等分试样直接分配到多孔板的孔中，可加入重组噬菌体，并且在足以结合的一段时间后，细胞可被捕获在固体表面诸如板、珠粒或过滤器基板上，从而过量的未结合的重组噬菌体可以在一个或多个后续的洗涤步骤中被去除。然后加入指示剂部分的底物(例如，对于萤光素酶指示剂为萤光素酶底物)，并测定以检测指示剂信号。所述方法的一些实施方案可在过滤板上进行。所述方法的一些实施方案可以在与重组噬菌体结合之前浓缩或不浓缩样品的情形下进行。

例如，在许多实施方案中，多孔板用于进行测定。板(或可在其中进行检测的任何其它容器)的选择可影响检测步骤。例如，一些板可能包括彩色或白色背景，这可影响光发射的检测。一般而言，白色板具有较高的灵敏度，但也会产生较高的背景信号。其它颜色的板可能会产生较低的背景信号，但灵敏度也稍低。另外，背景信号可能由光从一个孔泄漏到另一个相邻的孔而产生。一些板有白色的孔，而板的其余部分是黑色的，这样允许孔内存在高信号，同时防止孔与孔之间的光泄漏。白色孔与黑色板的这种组合可以降低背景信号。因此，平板或其它测定容器的选择可以影响测定的灵敏度和背景信号。在一些实施方案中，目标微生物的检测可以在不需要培养样品的情况下完成。例如，在某些实施方案中，检测所需的总时间少于12.0小时、11.0小时、10.0小时、9.0小时、8.0小时、7.0小时、6.0小时、5.0小时、4.0小时、3.0小时、2.5小时、2.0小时、1.5小时、1.0小时、45分钟或少于30分钟。最大限度地缩短获得结果的时间对于病原体的食品和环境测试至关重要。

与本领域已知的测定相反，本发明的方法可以检测单个微生物。因此，在某些实施方案中，所述方法可检测样品中存在的≤10个细胞的微生物(即1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个微生物)或≤20个、或≤30个、或≤40个、或≤50个、或≤70个、或≤80个、或≤90个、或≤100个、或≤200个、或≤500个、或≤1000个细胞的微生物。例如，在某些实施方案中，重组噬菌体对金黄色葡萄球菌、李斯特菌属、沙门氏菌属或大肠杆菌具有高度特异性。在一个实施方案中，重组噬菌体可以在100多种其它类型的细菌存在的情况下区分金黄色葡萄球菌、李斯特菌属、沙门氏菌属或大肠杆菌。在一个实施方案中，重组噬菌体可在100多种其它类型细菌存在的情况下区分一个细菌种内的特定血清型(例如，大肠杆菌O157:H7)。在某些实施方案中，重组噬菌体可用于检测样品中特定类型的单个细菌。在某些实施方案中，重组噬菌体检测样品中少至2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个或100个特定细菌。

因此，本发明的方面提供了通过报告子或指示剂部分检测测试样品中的微生物的方法。在一些实施方案中，当目标微生物是细菌时，指示剂部分可以与重组噬菌体缔合。指示剂部分可以与底物反应以发出可检测的信号，或者可以发射内在信号(例如，荧光蛋白)。当包含电子的荧光部分吸收光子时，荧光蛋白通过以光子形式发射能量而自然发出荧光(固有荧光或自发荧光)。荧光蛋白(例如，GFP)可以表达为融合蛋白。在一些实施方案中，检测灵敏度可以揭示测试样品中少至100个、50个、20个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个或2个目标微生物细胞的存在。在一些实施方案中，甚至单个细胞的目标微生物也可以产生可检测的信号。

特定指示剂部分的选择对本发明来说并不重要，但指示剂部分本身应该能够产生可检测的信号，或者是可用仪器检测的，或者是与一种或多种另外的信号产生性组分(诸如酶/底物信号产生性系统)结合而可检测的。通过改变重组噬菌体的指示剂部分或报告子，可以形成许多重组噬菌体；本领域技术人员应该理解，选择包括考虑待检测的微生物和所需的检测手段。

例如，一种或多种信号产生性组分可以与指示剂部分反应以产生可检测的信号。在一些实施方案中，指示剂可以是生物发光化合物。如果指示剂部分是酶，则通过使酶与一种或多种底物或另外的酶和底物反应产生可检测的反应产物来获得可检测信号的放大。在可选的信号产生系统中，指示剂可以是其中不需要对指示剂进行酶促处理来产生可检测信号的荧光化合物。荧光分子，包括例如荧光素和罗丹明及其衍生物和类似物，适合在这种系统中用作指示剂。在又一个替代实施方案中，指示剂部分可以是辅因子，然后通过使辅因子与酶和一种或多种底物或另外的酶和底物反应以产生可检测的反应产物来获得可检测信号的放大。在一些实施方案中，可检测信号是比色的。

可检测的指示剂部分是重组噬菌体的关键特征，其可以被直接或间接检测。指示剂部分提供可检测的信号，通过该信号监测结合反应，从而提供定性和/或定量测量。由经修饰的或发出信号的微生物产生的信号的相对数量和位置可用来指示微生物的存在和/或数量。指示剂部分也可用于诸如通过流动分选或使用磁性分离培养基来选择和分离经修饰的或发出信号的微生物。

在一些实施方案中，重组噬菌体的指示剂部分可以直接检测或在与底物孵育后检测。适合用作指示剂部分的许多不同类型的可检测生物分子在本领域中是已知的，并且许多是商购可得的。在一些实施方案中，重组噬菌体包含酶，所述酶用作指示剂部分。在一些实施方案中，重组噬菌体的指示剂或报告子编码可检测的酶。指示剂部分可以发光和/或可以通过颜色变化来检测。各种合适的酶都是商购可得的，诸如碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)、绿色荧光蛋白(GFP)或萤光素酶(Luc)。在一些实施方案中，这些酶可作为指示剂部分。在一些实施方案中，萤火虫萤光素酶是指示剂部分。在一些实施方案中，刺虾萤光素酶是指示剂部分。在一些实施方案中，

因此，在一些实施方案中，所述方法、系统或套件的重组噬菌体是用指示剂蛋白诸如荧光蛋白或萤光素酶蛋白的序列进行了遗传修饰的野生型噬菌体。

噬菌体能够感染并溶解特定的细菌。

检测指示剂可以包括检测光的发射。在一些实施方案中，光度计可用于检测指示剂(例如，萤光素酶)与底物的反应。RLU的检测可以用光度计实现，或者也可以使用其它机器或设备。例如，分光光度计、CCD照相机或CMOS照相机可以检测颜色变化和其它光发射。绝对RLU对于检测很重要，但信号与背景的比率也需要比较高(例如，>2.0，>2.5，或>3.0)，以便可靠地检测单细胞或低数量的细胞。

在一些实施方案中，指示剂部分(例如，萤光素酶)与底物的反应可以持续30分钟或更长时间，并且可能需要在不同时间点进行检测以优化灵敏度。例如，光度计读数可以在开始时以3分钟、5分钟、10分钟或15分钟的间隔进行，直至反应完成。

因此，在利用重组噬菌体的一些实施方案中，本发明包括检测目标微生物的方法，所述方法包括以下步骤：捕获至少一种样品细菌；将所述至少一种细菌与多种重组噬菌体一起孵育；留出时间与样品中的目标微生物结合；以及检测指示剂部分，其中检测到指示剂部分表明样品中存在所述细菌。

例如，在一些实施方案中，测试样品细菌可通过结合到板的表面来捕获，或者通过将样品通过细菌过滤器(例如，0.45μm孔径的旋转过滤器或平板过滤器)过滤来捕获。在一个实施方案中，将重组噬菌体以最小或适度的体积直接添加到过滤器上捕获的样品中。在一个实施方案中，将在过滤器或平板表面上捕获的微生物随后洗涤一次或多次，以除去过量的未结合的重组噬菌体。

在一些实施方案中，可将包含细菌的测试样品的等分试样施加到旋转柱上，并且在与重组噬菌体一起孵育并洗涤以除去任何过量的噬菌体之后，检测到的指示剂的量将与样品中存在的靶细菌的量成正比。

然后可以测量和定量结合到细菌上的指示剂(例如，萤光素酶)。在一个实施方案中，将溶液旋转通过过滤器，在加入指示剂酶的底物(例如，萤光素酶底物)后，将滤液收集在新的容器中(例如，光度计中)进行测定。或者，指示剂信号可以直接在过滤器上测量。

在一个实施方案中，微生物是细菌，重组噬菌体包括来源于噬菌体的指示剂部分。在一个实施方案中，指示剂部分是萤光素酶。因此，在一个替代性的实施方案中，指示剂底物(例如，萤光素酶底物)可以与保留在过滤器上或结合到平板表面的样品的部分一起孵育。因此，在一些实施方案中，固相支持物是96孔过滤板(或常规的96孔板)，并且可以通过将板直接放置在光度计中来检测底物反应。

例如，在一个实施方案中，本发明可包括用于检测目标病原菌的方法，所述方法包括以下步骤：用多个重组噬菌体结合捕获在96孔过滤板上的细胞；洗掉过量的重组噬菌体；以及通过添加底物并直接在96孔板中测量酶活性来检测指示剂(例如，萤光素酶)，其中检测到酶活性表明样品中存在目标细菌。

在另一个实施方案中，本发明可包括检测目标微生物诸如金黄色葡萄球菌的方法，所述方法包括以下步骤：用多个重组噬菌体在96孔板中结合液体溶液或悬浮液中的细胞；从具有结合的重组噬菌体的细胞中洗掉未结合的重组噬菌体；以及通过添加底物并直接在96孔板中测量酶活性来检测指示剂(例如，萤光素酶)，其中检测到酶活性表明样品中存在目标微生物，诸如金黄色葡萄球菌。在一些实施方案中，目标微生物可被捕获在固相支持物上，诸如珠粒或过滤器上。这种捕获可在与重组噬菌体一起孵育之前或之后进行。在一些实施方案中，捕获步骤不是必需的。

在一些实施方案中，液体溶液或悬浮液可以是可消耗的测试样品，诸如蔬菜洗涤物。在一些实施方案中，液体溶液或悬浮液可以是用浓缩LB肉汤、胰蛋白酶/胰蛋白胨大豆肉汤、蛋白胨水或营养肉汤强化的蔬菜洗涤物。在一些实施方案中，液体溶液或悬浮液可以是在LB肉汤中稀释的细菌。

在一些实施方案中，目标微生物细胞需要是完整的，以便正确检测。也就是说，细胞不一定是活的，但细胞壁必须在结构上是完整的。因此，在检测步骤之前使细菌的裂解降至最低程度是比较理想的。

在一些实施方案中，样品的初始浓缩步骤是有用的。也就是说，将样品中的任何微生物或其它相对较大的物质浓缩以除去过量的液体。然而，可以在不存在初始浓缩步骤的情况下进行测定。一些实施方案确实包括初始浓缩步骤，并且在一些实施方案中，该浓缩步骤允许较短的富集孵育时间。在其它实施方案中，浓缩期不是必需的。

测试方法的一些实施方案可以进一步包括确认测定。本领域中已知多种用于通常在稍后的时间点确认初始结果的测定。例如，可以培养样品(例如，

食品安全性检测的实施方案包括样品制备步骤。一些实施方案可包括富集时间。例如，根据样品类型和大小，可能需要富集1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时或8小时。在这些样品制备步骤之后，可以以多种测定形式，诸如图1所示的形式，进行与高浓度的包含报告子或指示剂的重组噬菌体的结合。

食品测定的实施方案可在对应于行业标准的样品大小中检测单一病原菌，根据样品类型和大小，获得结果的时间缩短至少20％，或至少30％，或至少40％，或至少50％，或至少60％。

因此，本发明的一些实施方案通过使用重组噬菌体方法来放大指示细菌存在的可检测信号，从而解决了这一需求。在某些实施方案中，检测少至单个细菌。本文应用的原理可以应用于多种微生物的检测。这样，本发明的实施方案甚至可以从目标微生物的单个细胞获得巨大的信号放大。

本发明的各方面利用能够与特定微生物结合的结合组分(诸如感染因子的识别和结合组分)的高特异性，作为检测和/或定量样品中特定微生物的手段。在一些实施方案中，本发明利用噬菌体的特异性。

本文公开和描述的本发明的一些实施方案利用了单个微生物在用重组噬菌体感染后能够产生大量指示剂的发现。该原理允许基于微生物的特异性识别从一个或数个细胞中放大指示剂信号。例如，通过将甚至细菌的单个细胞暴露于多个重组噬菌体，可以放大指示剂信号，从而可以检测单个细菌。

用重组噬菌体检测微生物的前所未有的速度和灵敏度是意想不到的结果。在一些实施方案中，本发明的方法需要少于12小时、11小时、10小时、9小时、8小时、7小时、6小时、5小时、4小时、3小时或2小时来检测目标微生物。这些时间比以前认为可能的时间范围要短。在一些实施方案中，所述方法可以检测少至100个、50个、20个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个或2个目标细菌细胞。在一些实施方案中，甚至细菌的单个细胞也是可检测的。在另外的实施方案中，本发明包括系统(例如，计算机系统、自动化系统或套件)，所述系统包括用于实施本文公开的方法和/或使用本文描述的重组噬菌体的部件。

现有的检测食品中病原菌的方案复杂、昂贵、缓慢、费力并且容易出现假阳性。此外，基于噬菌体的检测方法包括传染剂的额外复杂性和监管含义。用特异于给定病原体的重组噬菌体进行检测提供了有效、快速和简单的测试替代方案。

感染性因子对特定类型的生物体具有高度特异性。例如，噬菌体可能对特定的细菌属诸如李斯特菌属具有特异性。例如，A511噬菌体对李斯特菌属具有特异性。或者噬菌体可对细菌的特定种诸如大肠杆菌具有特异性。对于一些类型的细菌，噬菌体甚至可以高度特异性地识别该生物体的特定亚型。例如，CBA120噬菌体对大肠杆菌O157:H7具有高度特异性，而

在本文所述的重组噬菌体的一些实施方案中，重组噬菌体可源自T7、T4、T4样、ViI、ViI样、AR1、A511、A118、A006、A500、PSA、P35、P40、B025、B054,A97、phiSM101、phi3626、CBA120、SPN1S、10、ε15、P22、LipZ5、P40、vB_LmoM_AG20、P70、A511、P4W、K、Twort或SA97。重组噬菌体还包括指示剂部分，诸如荧光部分、荧光蛋白、生物发光蛋白或酶，其允许重组噬菌体产生信号。在重组噬菌体中，可将各种类型的报告子插入噬菌体基因组中，作为指示剂部分。在一些实施方案中，重组噬菌体包含酶，诸如萤光素酶，其只有在添加合适的底物时才可检测到。例如，萤光素酶、碱性磷酸酶和其它报告酶与合适的底物反应，以提供可检测的信号。重组噬菌体的一些实施方案包含野生型萤光素酶或工程化萤光素酶，诸如

在替代实施方案中，可以研究或复制细菌噬菌体、噬菌体、分支杆菌属噬菌体(诸如用于TB和副TB)、噬真菌体(诸如用于真菌)、支原体噬菌体以及任何其它能够侵入活细菌、真菌、支原体、原生动物、酵母和其它微生物活生物体的病毒，以靶向目标微生物。例如，研究充分的大肠杆菌噬菌体包括T1、T2、T3、T4、T5、T7和λ；例如，可从ATCC保藏中心获得的其它大肠杆菌噬菌体包括phiX174、S13、Ox6、MS2、phiV1、fd、PR772和ZIK1。沙门氏菌属噬菌体包括SPN1S、10、ε15、SEA1和P22。李斯特菌属噬菌体包括LipZ5、P40、vB_LmoM_AG20、P70和A511。葡萄球菌属噬菌体包括P4W、病毒K、Twort、phi11、187、P68和phiWMY。

本发明的一些实施方案利用重组噬菌体的结合特异性进行快速和灵敏的靶向，以结合目标细菌并促进其的检测。

在一些实施方案中，重组噬菌体源自对目标靶细菌特异的噬菌体，诸如源自T7、T4或另一种类似的噬菌体。重组噬菌体也可源自T4样、T7样、ViI、ViI样、AR1、A511、A118、A006、A500、PSA、P35、P40、B025、B054、A97、phiSM101、phi3626、CBA120、SPN1S、10、epsilon15、P22、LipZ5、P40、vB_LmoM_AG20、P70、A511、P4W、K、Twort或SA97。

在一些实施方案中，可能需要小的指示剂基因产物。OpLuc和

此外，所述指示剂应产生高的信号背景比，并应易于以适时的方式检测。Promega的

在一些重组噬菌体实施方案中，指示剂部分可以是多种生物分子中的任一种。指示剂可以是可检测的产物或产生可检测的产物的酶或产生可检测的产物的酶的辅因子。在一些实施方案中，重组噬菌体的指示剂部分是报告子，诸如可检测的酶。指示剂基因产物可以产生光并且/或者可以通过颜色变化来检测。各种合适的酶都是商购可得的，诸如碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)或萤光素酶(Luc)。例如，在一个实施方案中，指示剂是萤光素酶。可使用各种类型的萤光素酶。在替代实施方案中，如本文更详细描述的，萤光素酶是刺虾萤光素酶、萤火虫荧光素酶、Lucia萤光素酶、海肾萤光素酶或工程化的荧光素酶中的一种。在一些实施方案中，萤光素酶源自刺虾。在一些实施方案中，指示剂是经遗传修饰的萤光素酶，诸如

本发明的组合物可包含源自一种或多种野生型感染性因子(例如，噬菌体)和一种或多种指示剂部分的一种或多种重组噬菌体。在一些实施方案中，组合物可包含不同重组噬菌体的混合物，所述不同的重组噬菌体可产生相同或不同的指示剂信号。也就是说，用于检测微生物的组合物可包括所有相同或不同的重组噬菌体。

可使用前述的利用识别并结合特定细菌的重组噬菌体的测定。重组噬菌体测定可在常规实验室环境中或在设备例如如本文进一步描述的装置中进行。

重组噬菌体

如本文更详细描述的，本发明的装置、方法、系统和套件包含用于检测目标微生物的重组噬菌体。重组噬菌体包含在上文公开的装置的第一区室中。在一些实施方案中，本发明可包括含有重组噬菌体的组合物，所述重组噬菌体具有整合到噬菌体基因组中的指示剂基因。在一些实施方案中，所述指示剂基因与不是噬菌体天然启动子的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，所述指示剂基因与噬菌体的天然启动子可操作地连接。在本公开中，包含指示剂基因或报告基因的重组噬菌体也被称为指示剂噬菌体。

重组噬菌体可包括报告基因或指示剂基因。在噬菌体的某些实施方案中，指示剂基因不编码融合蛋白。例如，在某些实施方案中，在宿主细菌感染后的噬菌体复制过程中，指示剂基因的表达导致可溶性指示剂蛋白产物。在某些实施方案中，指示剂基因可以插入噬菌体的晚期基因区。晚期基因的表达水平通常比其它噬菌体基因的表达水平高，因为它们编码结构蛋白。晚期基因区可以是III类基因区，并且可包括主要衣壳蛋白的基因。

一些实施方案包括设计(和任选地制备)位于主要衣壳蛋白基因下游的用于同源重组的序列。其它实施方案包括设计(和任选地制备)位于主要衣壳蛋白基因上游的用于同源重组的序列。在一些实施方案中，所述序列包含密码子优化的报告基因，所述报告基因之前有非翻译区。非翻译区可包括噬菌体晚期基因启动子和核糖体进入位点。

在一些实施方案中，指示剂噬菌体源自A511、P100、李斯特菌属噬菌体LMTA-94、LMA4、LMA8、T7、T4或另一种类似的噬菌体。指示剂噬菌体也可源自p 100病毒、T4样、T7样、ViI、ViI样、克罗诺杆菌属特异性、沙门氏菌属特异性、李斯特菌属特异性或葡萄球菌属特异性噬菌体，或与77、T7样、T4、T4样、P100病毒、克罗诺杆菌属特异性、沙门氏菌属特异性、李斯特菌属特异性或葡萄球菌属特异性噬菌体、ViI或ViI样(或Vil病毒样，按照GenBank/NCBI)噬菌体具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的基因组的另一种噬菌体。在一些实施方案中，指示剂噬菌体源自对特定病原性微生物高度特异的噬菌体。遗传修饰可以避免野生型基因的缺失，因此与许多商购可得的噬菌体相比，经修饰的噬菌体可以保持与野生型噬菌体更相似。环境来源的噬菌体可对环境中发现的细菌更具特异性，因此在遗传上不同于商购可得的噬菌体。

此外，被认为非必需的噬菌体基因可能具有未被识别的功能。例如，看起来不重要的基因可能在提高裂解量方面有重要的作用，诸如在装配中的细微切割、装配或修剪功能。因此，缺失基因以插入指示剂可能是有害的。大多数噬菌体可以包装比其天然基因组大几个百分点的DNA。考虑到这一点，较小的指示剂基因可能是用于修饰噬菌体(尤其是基因组较小的噬菌体)的更合适的选择。OpLuc和

在一些指示剂噬菌体实施方案中，可将指示剂基因插入非翻译区以避免功能基因的破坏，保留野生型噬菌体基因完整，这可在感染非实验室菌株时导致更大的适应性。另外，在所有三个阅读框中包含终止密码子可有助于通过减少通读(也称为渗漏表达)来增加表达。这种策略还可以消除低水平产生融合蛋白的可能性，所述低水平可表现为不能与噬菌体分开的背景信号(例如，萤光素酶)。

指示剂基因可表达多种生物分子。指示剂基因是表达可检测的产物或产生可检测产物的酶的基因。例如，在一个实施方案中，指示剂基因编码萤光素酶。可使用各种类型的萤光素酶。在替代实施方案中，如本文更详细描述的，萤光素酶是刺虾萤光素酶、萤火虫萤光素酶、Lucia萤光素酶、海肾萤光素酶或工程化的萤光素酶中的一种。在一些实施方案中，萤光素酶基因源自刺虾。在一些实施方案中，指示剂基因是经遗传修饰的萤光素酶基因，诸如

因此，在一些实施方案中，本发明包含经遗传修饰的噬菌体，其在晚期(III类)基因区中包含非噬菌体指示剂基因。在一些实施方案中，非天然指示剂基因受晚期启动子控制。使用病毒晚期基因启动子能够确保报告基因(例如，萤光素酶)不仅像病毒衣壳蛋白一样以高水平表达，而且不像内源细菌基因或甚至早期病毒基因一样被关闭。

在一些实施方案中，晚期启动子是P100病毒启动子、T4启动子、T7启动子或ViI样启动子，或类似于在所选野生型噬菌体(即，无遗传修饰)中发现的另一种噬菌体启动子。晚期基因区可以是III类基因区，噬菌体可源自T7、T4、T4样、ViI、ViI样、克罗诺杆菌属特异性、沙门氏菌属特异性、葡萄球菌属特异性、李斯特菌属特异性或金黄色葡萄球菌特异性噬菌体，或具有与T7、T4、T4样、ViI、ViI样或克罗诺杆菌属特异性、沙门氏菌属特异性、葡萄球菌属特异性、李斯特菌属特异性或金黄色葡萄球菌特异性噬菌体有至少70％、75％、80％、85％、90％或95％同源性的基因组的另一种天然噬菌体。

噬菌体的遗传修饰可包括核酸小片段、基因大部分或整个基因的插入、缺失或取代。在一些实施方案中，插入或取代的核酸包含非天然序列。可将非天然的指示剂基因插入噬菌体基因组，使其处于噬菌体启动子的控制之下。在一些实施方案中，非天然指示剂基因不是融合蛋白的一部分。也就是说，在一些实施方案中，可将遗传修饰设计成所述指示剂蛋白产物不包含野生型噬菌体的多肽。在一些实施方案中，所述指示剂蛋白产物是可溶性的。在一些实施方案中，本发明包括检测目标细菌的方法，所述方法包括将测试样品与这种重组噬菌体一起孵育的步骤。

在一些实施方案中，宿主细菌感染后，指示剂基因在子代噬菌体中的表达产生游离的可溶性蛋白质产物。在一些实施方案中，非天然指示剂基因不与编码结构噬菌体蛋白的基因相邻，因此不产生融合蛋白。与采用检测部分与衣壳蛋白的融合物(即，融合蛋白)的系统不同，本发明的一些实施方案表达可溶性指示剂或报告子(例如，可溶性萤光素酶)。在一些实施方案中，指示剂或报告子理想地不含噬菌体结构。也就是说，指示剂或报告子未附着在噬菌体结构上。因此，指示剂基因或报告基因不与重组噬菌体基因组中的其它基因融合。这可极大地提高测定的灵敏度(低至单个细菌)，并简化测定，对于一些实施方案，允许测定在不到一小时内完成，而不是因产生可检测融合蛋白的构建体需要额外纯化步骤中需要的几个小时。另外，由于例如蛋白质折叠限制(其可能改变酶活性位点的构象或对底物的接近)，融合蛋白可能比可溶性蛋白的活性低。

此外，根据定义，融合蛋白限制了附着于噬菌体中蛋白质亚基的部分的数量。例如，使用被设计成用作融合蛋白平台的商购可得系统将产生约415个拷贝的融合部分，对应于每个T7噬菌体颗粒中约415个拷贝的基因10B衣壳蛋白。没有这种限制，可以预期被感染的细菌表达的检测部分(例如，萤光素酶)的拷贝数比安装在噬菌体上的多得多。另外，大的融合蛋白，诸如衣壳-萤光素酶融合蛋白，可以抑制噬菌体颗粒的组装，从而产生较少的噬菌体子代。因此，可溶性非融合指示剂基因产物可以是优选的。

在一些实施方案中，指示剂噬菌体编码报告子，诸如可检测的酶。指示剂基因产物可以产生光并且/或者可以通过颜色变化来检测。各种合适的酶都是商购可得的，诸如碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)或萤光素酶(Luc)。在一些实施方案中，这些酶可作为指示剂部分。在一些实施方案中，萤火虫萤光素酶是指示剂部分。在一些实施方案中，刺虾萤光素酶是指示剂部分。在一些实施方案中，

在一些实施方案中，可溶性检测部分的使用消除了从被感染的样品细胞的裂解物中去除污染性亲代噬菌体的需要。利用融合蛋白系统，任何用于感染样品细胞的噬菌体都将附着有检测部分，并且与也含有检测部分的子噬菌体无法区分。由于样品细菌的检测依赖于新产生的(从头合成的)检测部分的检测，因此使用融合构建体需要额外的步骤来将旧的(亲代)部分与新产生的(子噬菌体)部分分开。这可通过以下过程来实现：在完成噬菌体生命周期之前多次洗涤被感染的细胞，在感染后通过物理或化学方法灭活过量的亲代噬菌体，并且/或者用结合部分(诸如生物素)化学修饰亲代噬菌体来实现，然后可结合所述结合部分并将其分离。然而，即使进行了所有这些去除的尝试，当使用高浓度的亲代噬菌体来确保感染少量样品细胞时，亲代噬菌体仍可保留，从而产生背景信号，可能会使来自被感染的细胞后代噬菌体的信号的检测变得模糊。

相比之下，对于本发明的一些实施方案中表达的可溶性检测部分，从最终裂解物中纯化亲代噬菌体是不必要的，因为亲代噬菌体不具有任何附着的检测部分。因此，感染后出现的任何检测部分必须是重新产生的，表明存在一个或多个被感染的细菌。为了利用这种益处，亲代噬菌体的生产和制备可包括从在细菌培养物中产生亲代噬菌体期间产生的任何游离检测部分中纯化噬菌体。标准噬菌体纯化技术，诸如蔗糖密度梯度离心、氯化铯等密度梯度离心、HPLC、尺寸排阻色谱和透析或衍生技术(诸如Amicon牌浓缩器–Millipore,Inc.)，可用于纯化根据本发明的噬菌体的一些实施方案。氯化铯等密度超速离心可用作本发明重组噬菌体制备的一部分，以将亲代噬菌体颗粒与在细菌宿主中繁殖噬菌体时产生的污染性萤光素酶蛋白分离。这样，本发明的亲代重组噬菌体基本上不含细菌生产过程中产生的任何萤光素酶。当重组噬菌体与测试样品一起孵育时，去除噬菌体原液中存在的残留萤光素酶可以显著降低观察到的背景信号。

在经修饰的噬菌体的一些实施方案中，晚期启动子(III类启动子，例如来自李斯特菌属特异性噬菌体、T7、T4或ViI)对同一噬菌体的RNA聚合酶具有高亲和力，所述RNA聚合酶转录组装到噬菌体颗粒中的结构蛋白的基因。这些蛋白质是噬菌体制造的最丰富的蛋白质，因为每个噬菌体颗粒包含数打或数百个这些分子的拷贝。病毒晚期启动子的使用可以确保萤光素酶检测部分的最佳高水平表达。来源于、特异于指示剂噬菌体所源自的原始野生型噬菌体或在其下具有活性的晚期病毒启动子(例如，李斯特菌属特异性噬菌体、T4、T7或ViI晚期启动子和基于T4、T7或ViI的系统)的使用，可进一步确保检测部分的最佳表达。标准细菌(非病毒/非噬菌体)启动子的使用在一些情况下可能对表达有害，因为这些启动子在噬菌体感染期间通常被下调(以便噬菌体优先考虑细菌资源用于噬菌体蛋白质生产)。因此，在一些实施方案中，优选通过置于基因组中不会将表达限制为噬菌体结构组分的亚单位数量的位置而将噬菌体工程化成编码和高水平表达可溶性(游离)指示剂部分。

本发明的组合物可包含一种或多种野生型或经遗传修饰的噬菌体(例如，噬菌体)和一种或多种指示剂基因。在一些实施方案中，组合物可包括不同指示剂噬菌体的混合物，其可编码和表达相同或不同的指示剂蛋白。在一些实施方案中，噬菌体混合物包含至少两种不同类型的重组噬菌体。

检测微生物的设备或装置

本发明的实施方案涉及使用自给式装置检测目标微生物的方法。在一些实施方案中，所述装置包括固相支持物，其可用于收集包含目标微生物的样品。在一些实施方案中，根据本发明的装置包括具有独立区室的管，所述区室或者按顺序排列或者以分支构型(例如，管上的“耳”)排列。所述装置可包括多个区室，所述区室可被配置用于不同的试剂混合和方法步骤的时间安排。在一些实施方案中，所述装置包括至少两个区室。在一些实施方案中，管的最上面或上面的区室包含重组噬菌体，底物区室在噬菌体区室的下面。在一些实施方案中，管包含生长培养基。

在一些实施方案中，所述装置包括至少两个区室，包括第一区室，其包含具有插入噬菌体基因组的遗传构建体的重组噬菌体，其中所述构建体包含启动子和报告(指示剂)基因；进入第一区室的入口，用于向重组噬菌体中加入至少一部分测试样品；和第二区室，其包含底物或显影剂，其中所述底物或显影剂允许检测报告(指示剂)基因。在一些实施方案中。

在一个实施方案中，第一区室包含重组噬菌体，第二区室包含底物或显影剂。在一些此类实施方案中，将两种试剂同时与样品混合。在其它实施方案中，最初将样品添加到第一区室以引发感染。一段时间后，打开通向第二区室的导管，以允许将底物或显影剂加入到被感染的样品中并混合。

在一个替代实施方案中，第一区室包含冻干的传染剂(例如，冻干的重组噬菌体)，第二区室包含底物或显影剂。在一些此类实施方案中，将两种试剂同时与样品混合(任选地，其中来自样品的微生物被捕获在固相支持物上)。在其它实施方案中，最初将样品添加到第一区室中。一段时间后，打开通向第二区室的导管，以允许将底物或显影剂加入到被感染的样品中并混合。

在一些实施方案中，密封件将相邻的区室隔开，用户破坏所述密封件，底物和噬菌体同时碰到拭子。随着萤光素酶产生并与底物反应，产生可检测的信号。

在一些实施方案中，底物区室可位于培养基区室与重组噬菌体区室之间。在其它实施方案中，所述设备不包括培养基区室，并且所述设备不含培养基。当用户破坏密封件以将试剂施加到捕获在固相载体上的样品上时，两种试剂可以同时施加。

在替代实施方案中，底物区室可位于培养基区室与重组噬菌体区室之间。在其它实施方案中，所述设备不包含培养基区室，并且所述设备不含培养基。当用户破坏密封件以将试剂施加到捕获在固相载体上的样品上时，两种试剂可以同时施加。

在一些实施方案中，将固相支持物添加到管中，其中底物或显影剂在管的底部；将固相支持物推入底部，开始酶与底物或其它报告子与配对试剂之间的反应。可将固相支持物附着至柄上以便于操作。

在一些实施方案中，固相支持物包含包被有特异性捕获目标微生物的分子(例如，抗体或细胞结合蛋白)的珠粒。在其它实施方案中，固相支持物包括拭子或其它非特异性捕获机构。

或者，在本文描述的任何实施方案中，所述设备不含培养基。

以下附图提供了本发明实施方式的说明性实例。

在一个实施方案中，本公开提供了自给式微生物检测装置系统。图11A、图11B和图11C示出了装置100的一个实施方案。所述装置包括固相支持物16和包括三个区室的容器。每个区室由快动式密封件隔开。第一区室10包含噬菌体，第二区室12包含底物，第三区室14包含培养基。该装置允许噬菌体和底物与样品同时孵育。在一些实施方案中，所述装置不含培养基(图11C)。

图12A、图12B和图12C示出了装置200的第二实施方案。所述装置包括固相支持物26和包括三个区室的容器。每个区室由快动式密封件隔开。第一区室20包含噬菌体，第二区室22包含培养基，第三区室24包含底物。在实施方案中，使用图12A中描绘的装置，在与底物一起孵育之前，首先将样品与噬菌体一起孵育。在使用图12B中描绘的装置的进一步实施方案中，在收集样品之前，用培养基浸泡固相支持物。在一些实施方案中，所述装置不含培养基(图12C)。

图13A、图13B和图13C描绘了装置300的第三实施方案。所述装置包括固相支持物36和包括三个区室的容器。每个区室由快动式密封件隔开。第一区室30包含培养基，第二区室32包含噬菌体，第三区室34包含底物。在实施方案中，使用图13A中描绘的装置，在与底物一起孵育之前，首先将样品与噬菌体一起孵育。在使用图13B中描绘的装置的进一步实施方案中，固相支持物在收集样品之前是干燥的。在一些实施方案中，所述装置不含培养基(图13C)。

图14A、图14B、图14C示出了装置400的第四实施方案。所述装置包括固相支持物46和包括三个区室的容器。每个区室由快动式密封件隔开。第一区室40包含培养基，第二区室42包含噬菌体，第三区室46包含底物。所述设备具有用于试剂分阶段混合的止动锁定机构。在实施方案中，使用图14A中描绘的装置，在与底物一起孵育之前，首先将样品与噬菌体一起孵育。在使用图14B中描绘的装置的进一步实施方案中，在收集样品之前，用培养基浸泡固相支持物。在一些实施方案中，所述装置不含培养基(图14C)。

图15A、图15B和15C描绘了装置500的第五实施方案。所述装置包括固相支持物56和包括三个区室的容器。每个区室由快动式密封件隔开。第一区室50包含培养基，第二区室52包含噬菌体，第三区室54包含底物。所述设备具有用于试剂分阶段混合的止动锁定机构。在实施方案中，使用图15A中描绘的装置，在与底物一起孵育之前，首先将样品与噬菌体一起孵育。在使用图15B中描绘的装置的进一步实施方案中，固相支持物在收集样品之前是干燥的。在一些实施方案中，所述装置不含培养基(图15C)。

图16描绘了装置600的第六实施方案。所述装置包括固相支持物64和包括两个区室的容器。每个区室由快动式密封件隔开。第一区室60包含噬菌体，第二区室62包含底物。在实施方案中，使用图16中描绘的装置，在与底物孵育之前，首先将样品与噬菌体一起孵育。

图17描绘了用于检测微生物的方法的一个实施方案，所述方法包括(i)过夜富集样品，(ii)使用来自自给式装置的固相支持物收集已过夜富集的样品，(iii)用包含在自给式装置的区室内的噬菌体感染样品，以及(iv)通过读取/检测由感染步骤产生的信号来检测微生物的存在。

在一些实施方案中，包含在中心管的突出部或分支中的区室允许来自超过两个方向(例如,以“耳”的形式)的试剂混合。例如，可使用两个挤压球将培养基以及然后噬菌体依次或同时添加到主区室中，或者添加其它试剂。其它区室相对于中心区室的各种布置允许将不同的试剂添加和混合到更大的相邻区室中。

使用装置检测微生物的方法

如本文所述，在某些实施方案中，本发明可包括检测微生物的方法，该方法包括将样品与固相支持物接触，使得所述微生物被捕获在固相支持物上，通过例如破坏第一室的快动式密封件，使来自第一区室的重组噬菌体与捕获在固相支持物上的微生物接触。在感染期间和/或之后，噬菌体表达指示剂基因以产生指示剂，所述指示剂可以被各种检测装置检测到。在一些实施方案中，指示剂的检测可能需要添加底物，所述底物与指示剂反应以产生可检测的信号。信号的存在表明样品中存在所述微生物。

在一个替代实施方案中，本发明可包括检测微生物的方法，所述方法包括使样品与固相支持物接触，使得微生物被捕获在固相支持物上，通过例如破坏第一区室的快动式密封件，使来自第一区室的重组噬菌体与捕获在固相支持物上的微生物接触。重组噬菌体的指示剂部分可通过各种检测设备来检测。在一些实施方案中，指示剂的检测可能需要添加底物，所述底物与指示剂反应以产生可检测的信号。信号的存在表明样品中存在所述微生物。

在一些实施方案中，样品可以直接用于本发明的检测方法，而无需制备、浓缩或稀释。例如，液体样品，包括但不限于牛奶和果汁，可以直接进行测定。在其它实施方案中，样品可被稀释或悬浮在溶液中，所述溶液可包括但不限于缓冲溶液或细菌培养基。固体或半固体样品可通过将固体在液体中绞碎、混合或将固体浸渍在液体中而悬浮在液体中。在一些实施方案中，应将样品保持在促进噬菌体附着于宿主细菌细胞的pH值范围内。在一些实施方案中，优选pH值范围可以是适合于噬菌体附着于细菌细胞的范围。样品还应含有适当浓度的二价和一价阳离子，包括但不限于Na

优选地，在整个检测测定中，在保持样品中存在的任何病原体细胞的生存力的温度下保持样品。在其中噬菌体附着于细菌细胞的步骤中，优选在促进噬菌体活性的温度下保持样品。此类温度至少约为25℃，但不超过约45℃。在一些实施方案中，使样品保持在约37℃。在一些实施方案中，在噬菌体结合或附着过程中使样品经历温和的混合或摇动。

测定可包括各种适当的对照样品。例如，无细菌的对照样品，例如食物样品，可被作为背景信号水平的对照进行测定。

取样可使用多种方式进行。在一些实施方案中，首先液化样品(例如，食物样品)，并将固相支持物(例如，固相支持物或珠粒)浸入液体样品中。在一些实施方案中，在取样之前，首先将固相支持物浸泡在管中的培养基中。在一些实施方案中，固相支持物在取样前是干燥的。在一些实施方案中，首先将液体样品培养例如短于24小时、短于12小时的一段时间(“培养富集”)，短于9小时或更少、8小时或更少、7小时或更少、6小时或更少、5小时或更少、4小时或更少、3小时或更少、或2小时或更少的富集期。

在其它实施方案中，在固相支持物上捕获微生物后，可以富集样品。在一些实施方案中，可将具有微生物的固相支持物在装置的第三区室中的生长培养基中孵育，以允许微生物在数量上扩增。这一步骤被称为孵育富集。在此类实施方案中，富集期可为1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时或长达8小时或更长，这取决于样品类型和大小。

在本发明方法的一些实施方案中，可以在不从样品中分离或纯化微生物的情况下检测微生物。例如，在某些实施方案中，含有一种或多种目标微生物的样品可被直接施加到固相支持物上，并且在该装置中进行测定。

本文公开的方法包括操作装置以使重组噬菌体接触目标微生物。接触微生物后，噬菌体复制并表达指示剂基因或报告基因。参见标题为“重组噬菌体”的部分。感染时间，即样品第一次与噬菌体接触时的时间点与底物被加入混合物时的时间点之间的时间段，可以根据噬菌体的类型和样品中微生物的浓度而变化。使用其中细菌被捕获在固相支持物上的装置可以显著减少感染所需的时间，例如，感染时间可以是1小时或更少，而在不使用固相支持物来捕获细菌的标准测定中，感染通常是至少4小时。在某些实施方案中，本文公开的方法的感染时间少于6.0小时、5.0小时、4.0小时、3.0小时、2.5小时、2.0小时、1.5小时、1.0小时、45分钟或少于30分钟在一些实施方案中，感染时间为约1小时、约2小时或约3小时。

可以使用本领域技术人员公知的方法检测由指示剂基因表达产生的指示剂。例如，一种或多种信号产生性组分可以与指示剂反应以产生可检测的信号。在一些实施方案中，指示剂可以是生物发光化合物。如果指示剂是酶，那么通过使酶与一种或多种底物或另外的酶和底物反应以产生可检测的反应产物来获得可检测信号的放大。在可选的信号产生系统中，指示剂可以是其中不需要对指示剂进行酶促处理来产生可检测信号的荧光化合物。荧光分子，包括例如荧光素和罗丹明及其衍生物和类似物，适合在这种系统中用作指示剂。在又一个替代实施方案中，指示剂部分可以是辅因子，然后通过使辅因子与酶和一种或多种底物或另外的酶和底物反应以产生可检测的反应产物来获得可检测信号的放大。在一些实施方案中，可检测信号是比色的。注意，特定指示剂的选择对本发明来说并不重要，但该指示剂本身能够产生可检测的信号，或者是仪器可检测的，或者是与一种或多种附加信号产生性组分诸如酶/底物信号产生性系统结合而可检测的。

在一些实施方案中，检测步骤将需要添加底物以使指示剂酶起作用。底物可以以多种方式添加。在一些实施方案中，底物包含在装置的第二区室中，并且破坏快动式密封件导致噬菌体(在装置的第一区室中)和底物同时接触微生物(捕获在固相支持物上的)。参见图12。在一些实施方案中，快动式密封件被依次破坏，导致微生物在接触底物之前接触噬菌体。参见图13A和图13B。在一些实施方案中，所述方法包括操作止动锁以实现分阶段混合，使得微生物在接触底物之前接触噬菌体。

在一些实施方案中，指示剂(例如，萤光素酶)与底物的反应可以持续30分钟或更长时间，并且在不同时间点的检测对于优化灵敏度可能是理想的。在一些实施方案中，光度计读数可以在最初以3分钟、5分钟、10分钟或15分钟的间隔进行，直到反应完成。

检测由指示剂产生的信号可包括检测光的发射。在一些实施方案中，底物与测试样品在其中混合的装置的区室是透明的，使得由感染和随后与底物的孵育产生的任何信号都是可见的。在这种情况下，信号可以通过区室的壁来检测。在一些实施方案中，包含反应的样品的装置被插入到用于检测所产生的信号的仪器中。在其它实施方案中，检测仪器用于扫描包含反应的样品的装置。

在一些实施方案中，可使用光度计来检测指示剂(例如，萤光素酶)，例如来自Promega(Madison,WI)的

本发明的系统和套件

在一些实施方案中，本发明包括系统(例如，自动化系统)或套件，其包括用于执行本文公开的方法的部件。在一些实施方案中，所述装置包括在根据本发明的系统或套件中。本文描述的方法也可以利用此类系统或套件。鉴于执行所述方法所需的最少量的试剂和材料，本文所述的一些实施方案特别适用于自动化和/或套件。在某些实施例中，套件的每个组分可包括自给式单元，该单元可以从第一位置输送到第二位置。

在一些实施方案中，本发明包括用于快速检测样品中的目标微生物的系统或套件。在某些实施方案中，该系统或套件可以包括：如上所述的装置，和信号检测部件，其中信号检测部件可以检测由用重组噬菌体感染样品而产生的指示剂基因产物。在一些实施方案中，信号检测部件是手持设备。在一些实施方案中，信号检测部件是手持式光度计。

因此，在某些实施方案中，本发明可以包括用于快速检测样品中的目标微生物的系统或套件，其包括：装置，其包括：包含重组噬菌体的第一区室，所述重组噬菌体具有插入噬菌体基因组的遗传构建体，其中所述构建体包含启动子和指示剂基因。所述系统或套件还可包括包含底物的第二区室，和/或包含培养基的第三区室。这些区室中的一个或多个被密封，并通过快动式密封件与装置的其它部分隔开，并且快动式密封件的破坏导致区室中的内容物离开区室并与样品混合。

在一些实施方案中，所述系统可包括用于从样品中的另外的组分中分离目标微生物的部件。

在一些系统和/或套件中，同一部件可以用于多个步骤。在一些系统和/或套件中，步骤是自动化的或由用户通过计算机输入控制，并且/或者其中液体处理机器人执行至少一个步骤。在计算机化的系统中，所述系统可以是全自动、半自动的，或者由用户通过计算机(或其某种组合)来指导。

本发明的这些系统和套件包括各种部件。如本文中所用，术语“部件”被广义地定义，并且包括适于执行所述方法的任何合适的装置或装置的集合。所述部件不需要以任何特定的方式整体连接或相对于彼此定位。本发明包括各部件相对于彼此的任何合适的布置。例如，部件不必在同一个房间中。但在一些实施方案中，各部件在一个整体单元中相互连接。在一些实施方案中，相同的部件可以执行多种功能。

计算机系统和计算机可读介质

在某些实施方案中，本发明可包括系统。所述系统可包括至少一些本发明的组合物。此外，所述系统可包括至少一些用于执行该方法的部件。在某些实施方案中，所述系统被配制成套件。因此，在某些实施方案中，本发明可包括用于快速检测样品中的目标微生物的系统。所述系统可包括至少一些本发明的组合物。此外，所述系统可包括至少一些用于执行该方法的部件。在某些实施方案中，所述系统被配制成套件。因此，在某些实施方案中，本发明可包括用于快速检测样品中的目标微生物的系统，所述系统包括如上所述的装置。例如，所述装置可包括第一区室，其包含重组噬菌体，所述重组噬菌体具有插入噬菌体基因组的遗传构建体，其中所述构建体包含启动子和指示剂基因；其中固相支持物包含细胞结合组分。在一些实施方案中，所述系统还包括手持检测设备。

如本技术或其任何部件中所描述的，所述系统可以以计算机系统的形式来体现。计算机系统的典型实例包括通用计算机、编程微处理器、微控制器、外围集成电路元件以及能够实现构成本技术的方法的步骤的其它设备或设备布置。

计算机系统可包括计算机、输入设备、显示单元和/或互联网。计算机还可包括微处理器。微处理器可以连接到通信总线。计算机还可以包括存储器。存储器可包括随机存取存储器(RAM)和只读存储器(ROM)。计算机系统还可包括存储设备。存储设备可以是硬盘驱动器或可移动存储驱动器，诸如软盘驱动器、光盘驱动器等。存储设备也可以是用于将计算机程序或其它指令加载到计算机系统中的其它类似装置。计算机系统还可包括通信单元。通信单元允许计算机通过I/O接口连接到其它数据库和互联网。通信单元允许向其它数据库传输数据，也允许从其它数据库接收数据。通信单元可包括调制解调器、以太网卡或使计算机系统能够连接到数据库和网络诸如LAN、MAN、WAN和互联网的任何类似设备。因此，计算机系统可以方便用户通过输入设备的输入，通过I/O接口访问该系统。

计算设备通常包括为该计算设备的一般管理和操作提供可执行程序指令的操作系统，并且通常包括存储指邻的计算机可读存储介质(例如，硬盘、随机存取存储器、只读存储器等)，所述指令当由服务器的处理器执行时，允许计算设备执行其预期功能。操作系统和计算设备的一般功能的合适实现是已知的或商购可得的，并且由本领域普通技术人员特别地根据本文的公开内容容易地实现。

计算机系统执行存储在一个或多个存储元件中的一组指令，以便处理输入数据。存储元件也可以根据需要保存数据或其它信息。存储元件可以以存在于处理机中的信息源或物理存储元件的形式存在。

如上所述，该环境可以包括各种数据存储以及其它存储器和存储介质。这些可以驻留在各种位置，诸如在一个或多个计算机本地(和/或驻留在其中)的存储介质上，或者远离网络上的任何或所有计算机。在一组特定的实施方案中，信息可以驻留在本领域技术人员熟悉的存储区域网络(“SAN”)中。类似地，在适当情况下，可以本地和/或远程存储用于执行属于计算机、服务器或其它网络设备的功能的任何必要文件。在系统包括计算设备的情况下，每个这样的设备可以包括可以经由总线电耦合的硬件元件，所述元件包括例如至少一个中央处理单元(CPU)、至少一个输入设备(例如，鼠标、键盘、控制器、触摸屏或小键盘)和至少一个输出设备(例如，显示设备、打印机或扬声器)。这种系统还可以包括一个或多个存储设备，诸如磁盘驱动器、光存储设备和固态存储设备，诸如随机存取存储器("RAM")或只读存储器("ROM")，以及可移动介质设备、存储卡、闪存卡等。

此类设备还可包括计算机可读存储介质读取器、通信设备(例如，调制解调器、网卡(无线或有线)、红外通信设备等)，以及如上所述的工作存储器。计算机可读存储介质读取器可以与代表远程、本地、固定和/或可移动存储设备的计算机可读存储介质以及用于临时和/或更永久地包含、存储、传输和检索计算机可读信息的存储介质连接，或者被配置为接收所述计算机可读存储介质。所述系统和各种设备通常还将包括位于至少一个工作存储器设备内的许多软件应用、模块、服务或其它元件，包括操作系统和应用程序，诸如客户端应用或网络浏览器。应当理解，替代实施方案可以具有与上述不同的许多变化。例如，也可以使用定制的硬件并且/或者特定元件可以以硬件、软件(包括便携式软件，诸小程序)或两者中来实现。另外，可使用与诸如网络输入/输出设备的其它计算设备的连接。

用于包含代码或代码部分的非瞬态存储介质和计算机可读介质可包括本领域中已知或使用的任何适当的介质，包括存储介质和通信介质，诸如但不限于以用于存储和/或传输诸如计算机可读指令、数据结构、程序模块或其它数据的信息的任何方法或技术实现的易失性和非易失性、可移动和不可移动介质，包括RAM、ROM、EEPROM、闪存或其它存储技术、CD-ROM、数字多功能盘(DVD)或其它光存储器、盒式磁带、磁带、磁盘存储器或其它磁存储设备，或可用于存储所需信息并可由系统设备访问的任何其它介质。基于本文提供的公开内容和教导，本领域普通技术人员将理解实现各种实施方案的其它方式和/或方法。

计算机可读介质可包括但不限于能够向处理器提供计算机可读指令的电子、光学、磁性或其它存储设备。其它实例包括但不限于软盘、CD-ROM、DVD、磁盘、存储芯片、ROM、RAM、SRAM、DRAM、内容可寻址存储器("CAM")、DDR、诸如NAND闪存或NOR闪存等的闪存、ASIC、配置的处理器、光存储器、磁带或其它磁存储器，或者计算机处理器可从中读取指令的任何其它介质。在一个实施方案中，计算设备可包括单一类型的计算机可读介质，诸如随机存取存储器(RAM)。在其它实施方案中，计算设备可包括两种或更多种类型的计算机可读介质，诸如随机存取存储器(RAM)、磁盘驱动器和高速缓存。计算设备可以与一个或多个外部计算机可读介质诸如外部硬盘驱动器或外部DVD或蓝光驱动器通信。

如上所述，所述实施方案包括处理器，所述处理器被配置为执行计算机可执行程序指令和/或访问存储在存储器中的信息。指令可以包括由编译器和/或解释器从用以任何合适的计算机编程语言编写的代码生成的处理器专用指令，所述计算机编程语言包括例如C、C++、C#、Visual Basic、Java、Python、Perl、JavaScript和ActionScript(AdobeSystems,Mountain View,Calif.)。在实施方案中，计算设备包括单个处理器。在其它实施方案中，所述设备包括两个或更更多个处理器。此类处理器可包括微处理器、数字信号处理器(DSP)、专用集成电路(ASIC)、现场可编程门阵列(FPGA)和状态机。此类处理器还可包括可编程电子设备，诸如PLC、可编程中断控制器(PIC)、可编程逻辑器件(PLD)、可编程只读存储器(PROM)、电子可编程只读存储器(EPROM或EEPROM)或其它类似设备。

计算设备包括网络接口。在一些实施方案中，网络接口被配置为通过有线或无线通信链路进行通信。例如，网络接口可以允许通过以太网、IEEE 802.11(Wi-Fi)、802.16(Wi-Max)、蓝牙、红外线等在网络上进行通信。作为另一个实例，网络接口可以允许在诸如CDMA、GSM、UMTS或其它蜂窝通信网络等网络上的通信。在一些实施方案中，网络接口可以允许诸如通过通用串行总线(USB)、1394FireWire、串行或并行连接或类似的接口与另一个设备点对点连接。合适的计算设备的一些实施方案可包括用于在一个或多个网络上通信的两个或更多个网络接口。在一些实施方案中，除了网络接口之外或代替网络接口，计算设备可以包括数据存储。

合适的计算设备的一些实施方案可包括多个外部或内部设备或与其通信，所述外部或内部设备是诸如鼠标、CD-ROM、VD、键盘、显示器、音频扬声器、一个或多个麦克风或任何其它输入或输出设备。例如，计算设备可以与各种用户接口设备和显示器通信。显示器可使用任何合适的技术，包括但不限于LCD、LED、CRT等。

由计算机系统执行的指令集可以包括指示处理机执行特定任务诸如构成本技术的方法的步骤的各种命令。指令集可呈软件程序的形式。此外，软件可呈独立程序的集合、具有较大程序的程序模块或程序模块的一部分的形式，如在本技术中那样。软件还可包括呈面向对象编程形式的模块化编程。处理机对输入数据的处理可以响应用户命令、先前处理的结果或由另一处理机产生的请求。

虽然已经参照某些实施方案公开了本发明，但在不脱离如所附权利要求中限定的本发明的范围和精神的情况下，可以对所描述的实施方案进行许多修改、变更和改变。因此，本发明旨在不限于所描述的实施方案，而是具有由所附权利要求及其等同物的语言定义的全部范围。

实施例

以下实施例描述了在获得结果的缩短的时间内对少量细胞、甚至单个细菌的检测，并且是为了说明而不是限制本发明。

实施例1.细菌培养物中的目标微生物的检测

本实施例展示了使用成功检测细菌培养物中存在的细菌的装置的检测方法的性能。

将100μL A511/P100噬菌体混合物(1.2x10

将单核增生李斯特菌在摇动培养箱中于BHI培养基(Becton Dickinson,Sparks,MD,USA)中过夜生长。然后将过夜培养物在37℃下于BHI培养基中继代培养至对数期。然后将对数期细胞稀释至适当数量的细胞(见图2)。从装置中取出固相支持物，将稀释的培养物以指定的CFU水平加标到固相支持物上。将加有细菌或仅培养基(对照)的固相支持物放回装置管中，轻轻摇动管以混合内容物。(图2，表1)

在类似的实验中，对2个固相支持物用10CFU每种细菌加标。使用未接种的样品作为对照。将这些样品在35℃下孵育过夜，以在感染和接触底物之前扩增细菌数量(图2，表2)

然后用拇指和食指牢牢抓住固相支持物并破坏阀门，从而破坏速动阀。通过挤压固相支持物管顶部的球形物向下排出噬菌体(200μL，6x10

使用了三种检测方法。将固相支持物管插入Hygiena手持式光度计。将1mL感染混合物取出并转移到1.5mL微量离心管中，在GloMax 20/20光度计(“GloMax 20/20”)上读取，并将150μl感染混合物转移到96孔板中，在GloMax光度计(“GloMax”)上读取，

然后用浸泡在培养基中过夜的固相支持物进行检测，感染时间为2小时。结果如图2、表1和表2所示，结果的图形表示如图3A和图3B所示。结果表明，在没有生长富集的情况下(在用固相支持物捕获之前未对样品进行过夜培养)，该测试足够灵敏，可以在Hygiena手持式光度计上检测25,000CFU(图3A)-接种了细菌的样品的读数均高于阳性样品的10个相对发光单位(RLU)标准的检测阈值，并在GloMax 20/20或GloMax上检测到约5,000CFU(图3B)。

实施例2.火鸡样品中的沙门氏菌属的检测

如实施例1所述组装装置，不同之处在于顶部球状物装有100μLSEA1/TSP1噬菌体混合物(1.2x10

将沙门氏菌属培养物生长过夜，并如下所述稀释高和低CFU样品

将25g测试部分的火鸡绞肉分成三组：未接种组(5个样品)、高接种组(5个样品)和低接种组(20个样品)。高组的每个25g样品接种2-10CFU的沙门氏菌属，低组的每个样品接种0.2-2CFU的沙门氏菌属。然后将样品放入过滤的样品袋中，在4℃下储存48-72小时。

将预温热的TSB培养基(41℃)以1:3的样品与培养基比添加到每个样品中。然后对于高组，将样品在

通过将固相支持物浸入每个富集的样品中并旋转10秒以吸收最大量的样品来获得测试样品。将固相支持物放入装有TSB培养基的装置管中。轻轻摇动管以混合管中的内容物，然后立即感染或在感染前在37℃下再放置一小时。

然后，通过牢牢抓住固相支持物并用拇指和食指破坏阀门，破坏装有噬菌体的区室的速动阀。通过挤压装置管顶部的球形物，将噬菌体(200μL的6x10

结果表明，所用的三种检测设备的每一种均能够检测出24小时培养富集后沙门氏菌属呈阳性的所有火鸡样品。来自GloMax和GloMax20/20的信号比Hygiena光度计高得多。孵育时间(即，感染前用培养基孵育已捕获细菌的固相支持物)和感染时间是可影响信号强度的因素。在测试的各种额外孵育时间和感染时间中，0小时孵育时间和2小时感染时间导致最高的RLU，其次是具有1小时孵育时间和0.5小时感染时间的样品，然后是具有0小时孵育时间和0.5小时感染时间的样品。结果还表明，0小时孵育和2小时感染具有最低的背景信号。

实施例3.测试感染时间对测定灵敏度的影响的附加研究

如实施例2所述设置实验，不同之处在于在将固相支持物浸入细菌火鸡样品后，将固相支持物置于培养基中并立即进行感染，即固相支持物上的细菌没有培养时间进行生长。感染时间从30分钟至2小时不等。如上所述检测信号。三个样品的结果如图6所示，并将数据绘制在图7A至图7C中。结果表明，2小时的感染可以增加信号，如样品24和26在Hygiena中在30分钟感染时没有显示信号、但在2小时感染时显示了信号的结果所示。

图8A至图8C显示了GloMax与GloMax 20/20不同设备之间的比较。GloMax和GloMax20/20显示了相似的结果。

实施例4.测试单核增生李斯特菌19115环境海绵样品

将单核增生李斯特菌接种到瓷砖表面，并使其在室温下静置干燥18-24小时。用样品海绵擦拭瓷砖，并将海绵放入袋中于35℃下富集24小时。然后如实施例2所述使用固相支持物对富集的样品进行取样。使用100μL李斯特菌属噬菌体(浓度为1.2x10

实施例5.不同的检测设备

如实施例2所述设置实验。噬菌体感染时间为在37℃下1小时。在GloMax(一种3M手持式光度计(“3M”))和Hygiena上读取信号，结果如图10所示。表明3M在检测信号方面更灵敏。