一种二氧化钛纳米管及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物医用纳米材料技术领域，更具体地说，它涉及一种二氧化钛纳米管及其制备方法与应用。

背景技术

随着社会快速发展、人口老龄化进程加快，各种高能量骨创伤及慢性骨病不断增多，已然成为威胁人民健康和致伤致残的主要原因之一。在医疗生物技术高速发展的前提下，骨科内植物应运而生，并在骨科疾病的治疗中发挥着至关重要的作用，无论是对骨科植入物研发投入的人力物力或是骨科植入物的使用量都呈明显上升趋势。因为涉及到骨本身的修复、肢体功能重建、假体返修及术后感染控制等复杂问题，所以对内植物性能的研究始终是骨科临床乃至整个医疗行业面临的巨大挑战。

钛金属材料因具有强度高及生物相容性好等特性，是骨科临床最常用的植入物材料之一。传统对于多孔钛金属植入物的研究主要集中在合金成分改良、支架孔径大小、孔隙连通率控制以及金属表面改性等方面，增加植入物-宿主骨界面骨整合。对于钛金属物理形变与骨组织再生的研究少有报道。研究证明钛金属在适当应力刺激下会发生非线性弹性形变，这种形变受弹性模量、形态、直径、立体构架等物理要素的影响，在负重行走或弹跳等过程中，循环往复的应力会导致钛金属支架产生极其细微的弹性形变，而成骨细胞及干细胞是力学信号敏感或响应的细胞，研究证明在细胞与基底间的各种力学信号可通过干细胞表面受体激活特定的力转导途径进而调节干细胞的分化。即使在缺乏生物化学刺激的情况下，力学因素也能调控干细胞自我更新和谱系分化。

而钛金属弹性形变所引起的力学信号是否会导致粘附在其表面细胞骨架改变进而影响细胞分化及如何控制这种信号使细胞向有利于骨再生的方向分化至今未见报道。

发明内容

为解决现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种二氧化钛纳米管及其制备方法与应用。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

第一方面，提供了一种二氧化钛纳米管，所述二氧化钛纳米管的高度为1.8μm-2.2μm，内径为74nm-148nm，粗糙度为50-110nm，在加载速率为0.5mm/min、直径为3mm的金属棒推出测试下弹性形变量为0.3-0.9％。

优选的，所述二氧化钛纳米管的高度为2μm，内径为128nm，粗糙度为84nm，在加载速率为0.5mm/min、直径为3mm的金属棒推出测试下弹性形变量为0.9％。

优选的，所述二氧化钛纳米管的高度为2μm，内径为92nm，粗糙度为64nm，在加载速率为0.5mm/min、直径为3mm的金属棒推出测试下弹性形变量为0.3％。

第二方面，提供了如第一方面中任意一项所述的一种二氧化钛纳米管的制备方法，包括以下步骤：

将预处理样品固定为阳极，同时在0.15MNH4F和90％乙二醇的电解质水溶液中使用铂片作为阴，保持阴极与工作电极的间距为40mm；

在30V-70V的直流电源电压下，电解液中对阳极钛片进行阳极氧化1小时，水浴池温度为20度；

阳极氧化后用去离子水冲洗30分钟，在超声波清洗机中用无水醇清洗15分钟；

清洗后的样品用120°的高压灭菌消毒1h，得到二氧化钛纳米管。

第三方面，提供了如第一方面所述的一种二氧化钛纳米管在成骨生长中的应用。

第四方面，提供了如第一方面所述的一种二氧化钛纳米管在促进干细胞向成骨细胞分化中的应用。

优选的，所述二氧化钛纳米管对骨桥素、成骨细胞分泌蛋白、RUNX2基因的表达同时提高。

优选的，所述二氧化钛纳米管对成骨基因RUNX2、ALP、氰酸盐和OSX的表达提高。

优选的，所述二氧化钛纳米管基团中f-肌动蛋白被上调。

第五方面，提供了如第一方面所述的一种二氧化钛纳米管在促进干细胞向脂肪细胞分化中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明所制备的二氧化钛纳米管的高度为2μm，内径为128nm，粗糙度为84nm，在加载速率为0.5mm/min、直径为3mm的金属棒推出测试下弹性形变量为0.9％时具有促进干细胞向成骨细胞分化的指向性作用；

2、所制备的二氧化钛纳米管的高度为2μm，内径为92nm，粗糙度为64nm，在加载速率为0.5mm/min、直径为3mm的金属棒推出测试下弹性形变量为0.3％时具有促进干细胞向脂肪细胞分化的指向性作用；

3、本发明为有效控制钛金属弹性形变及其所产生的力学信号应用提供了基础，同时为不依赖于诸如生长因子等化学刺激而单独发生成骨作用提供的条件；

4、本发明提供的二氧化钛纳米管对新生组织有效力学支撑的同时，能够将外部循环应力造成的支架弹性形变转变为有利于细胞分化、增殖的细胞骨架改变，帮助实现对钛金属支架的生物力学仿生制作。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1为本发明实施例中不同恒压下制备的纳米管扫描电镜图；

图2为本发明实施例中不同恒压下制备的纳米管管径大小示意图；

图3为本发明实施例中TiO

图4为本发明实施例中不同管径的TiO

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例1：制备不同管径的TiO

阳极氧化法是利用钛阳极氧化原理，利用钛表面氧化层的生成速度与溶解的平衡，制备纳米管。相较于模板法和水热法，阳极氧化法能直接在钛电极表面形成固定的纳米管，并且能通过参数调节，控制纳米管的直径，成本比较低廉，可操作性强。

共分六组，第一组在钛片预处理后在30V电压下进行阳极氧化，第二组在钛片预处理后在40V电压下进行阳极氧化，第三组在钛片预处理后在50V电压下进行阳极氧化，第四组在钛片预处理后在60V电压下进行阳极氧化，第五组在钛片预处理后在70V电压下进行阳极氧化，对照组为第六组，试件只进行常规的钛片预处理，不进行阳极氧化。

纯钛片(纯度99.9％，3.5*3.5cm，厚度2mm)作为基底，用No.碳化硅砂纸抛光400粒和1500粒度。然后用丙酮、无水醇、去离子水顺序清洗样品，最后在室温下干燥3h。

调配和混合电解液作为制备体系；将预处理样品固定为阳极，同时在0.15MNH4F和90％乙二醇的电解质水溶液中使用铂片作为反阳极。控制直流电源电压，分别在30V、40V、50V、60V、70V电压下在电解液中对阳极钛片分别进行阳极氧化1小时。阳极氧化后用去离子水冲洗30分钟，在超声波清洗机中用无水醇清洗15分钟。最后，所有样品用120°的高压灭菌消毒1h，然后在使用前湿润培养基。在钛片的阳极氧化的过程中控制水浴池温度在20度，保持阴极与工作电极的间距为40mm。通过改变低温水浴池的水浴温度来控制系统的反应温度。

试样的表征：用不同电压制备的样品用乙醇和去离子水冲洗15分钟，然后在室温下干燥。扫描电子显微镜被用于表征表面结构，并测量镀上薄层金样品后纳米管的内径和高度。同时，通过x射线能量色散分析，分析了纳米管的元素组成。利用原子力显微镜研究样品的表面形态和表面粗糙度。从每个样本中选择三个不同区域，重复三次。

不同恒定电压(30、40、50、60、70V)下的氧化钛片设备1h。用扫描电子显微镜观察到了一个均匀分布的自组装纳米管阵列。如图1所示，本发明中所有样品中的纳米管的高度约为2μm，而纳米管的内径约为74nm(30V)、92nm(40V)、112nm(50V)、128nm(60V)和148nm(70V)。然后进行了X射线能量色散分析，分析了纳米管的元素组成。表明，纳米管中只有两种元素，O和Ti。用原子力显微镜(AFM)检测纳米管结构，测量纳米管轮廓的算术平均偏差为表面粗糙度(Ra)。数据表明，纳米管表面粗糙度随直径(即阳极氧化电压)的增加而增大，如图2所示。

实施例2：不同管径的TiO2纳米管对骨髓间充质干细胞功能的影响

原代细胞提取：四周龄雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠源自上海第九人民医院实验动物中心。从股骨和胫骨中无菌分离大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs。骨髓间充质干细胞在含有10％(v/v)胎牛血清FBS、100mg/m链霉素Gibco和100U/mL青霉素Gibco的α-最小必需培养中进一步纯化和扩增，并在由95％空气和5％CO

细胞传代：培养基每2天更新一次，细胞胰蛋白酶化，80％汇合传代。本发明中使用的所有细胞均在第3代和第5代之间。成骨诱导培养基由生长培养基配以100nM地塞米松、10mMβ甘油磷酸盐和50mM抗坏血酸组成。先用3mlPBS洗漆细胞，然后加2ml胰酶消化液，显微镜下观察细胞呈云雾状时，加入小牛血清1ml终止消化反应，反复吹打细胞，混匀后移入刻度离心管，1500rpm，5min离心，弃上清。用完全培养基重悬细胞，吹打混匀后加入新培养瓶，调节完全培养基量至5ml/瓶。

细胞冻存：取对数生长期细胞，PBS洗涤，胰酶消化。加小牛血清中断消化反应，离心，1500rpm，5min。弃上清，加入DMEM完全培养基2ml重悬细胞。逐滴加入冻存液2ml，分装，封口，标记。放入冻存盒，-20℃1小时后，放入-150℃保存。

钛片的处理：参考上述，共分六组，第一组在钛片预处理后在30V电压下进行阳极氧化，第二组在钛片预处理后在40V电压下进行阳极氧化，第三组在钛片预处理后在50V电压下进行阳极氧化，第四组在钛片预处理后在60V电压下进行阳极氧化，第五组在钛片预处理后在70V电压下进行阳极氧化，对照组为第六组，试件只进行常规的钛片预处理，不进行阳极氧化。

细胞接种：分别将骨髓间充质干细胞接种于内置有试验组和对照组钛片的培养皿中，常规胎牛血清培养基培养，将培养皿放于CO

扫描电镜检测：将接种了骨髓间充质干细胞与6组试件复合培养，在培养1d后进行扫描电镜检测。观测细胞在材料表面的生长状况和细胞形态。

ALP检测：碱性磷酸酶是一类广泛存在于动物体内的酶。正常成骨细胞在成熟过程中会不断分泌，作为成骨细胞成骨功能的一种标志物，其含量多少可在一定程度上表示成骨细胞矿化沉积过程，是一类在成骨细胞培养及检测中常用的重要参数，用于检测细胞的分化能力，可以直接表征材料对于成骨细胞的生物相容性。

Westernblot检测：五组试件接种骨髓间充质干细胞，复合培养3d、7d、14d后弃去培养液，用4℃预冷PBS冲洗骨髓间充质干细胞，将细胞用胰酶消化，离心，洗涤2-3次，将细胞收集于EP管中。细胞用PBS洗涤三次，用RIPA缓冲液溶解，加蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒在冰上溶解30分钟。在12000转下离心收集裂解液，在4℃下离心15min。根据说明指示，用双辛酸(BCA)蛋白测定试剂盒(Beyotime)测定上清液中总蛋白的浓度。在蛋白质样品中加入负载缓冲液，然后在95℃煮15分钟。在Westernblotting分析中，将10μL蛋白质制剂加载到12.5％的SDSPAGE凝胶上，在120V下电泳1h，然后在250mA下电转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上2h。然后用5-10％脱脂干牛奶在TBST中在室温下在摇床上阻滞1小时，并在稀释缓冲液(Beyotime)中稀释一次抗体在4℃过夜。接着，用TBST洗涤三次5分钟后，将稀释缓冲液稀释的荧光共轭二次抗体添加到膜，在室温下孵育1h。蛋白带由双色红外荧光成像系统检测检测。如果内部参考蛋白的条带被统一，该膜就会被剥离并用另一种主要抗体重新检测，然后进行同样的过程。

(1)蛋白提取：在细胞中加入RIPA裂解液及液，充分混匀，冰上静置10min。12000rpm，离心10min。转移上清于另一EP管。测定蛋白质浓度，-20℃贮存备检。

(2)蛋白样品制备及点样：将每份蛋白样品按比例加入5×SDS上样缓冲液，混匀，95℃加热5min，12000rpm离心2min，吸取上清加入凝胶上样孔，调节蛋白浓度至20ul/孔，其中一孔加入10ul预染蛋白分子量marker。

(3)电泳：将电泳装置与电源相接，40V电泳30min左右，至染料条带进入分离胶后电压改为60V，恒压继续电泳90min，直至溴酷蓝约达到凝胶底部为止，关闭电源。

(4)转膜：将电泳后的蛋白质凝胶置于足量转移缓冲液中平衡15min。剪下所需大小的PVDF膜，甲醇中浸泡30秒，超纯水振荡洗涤5分钟，置于足量转移缓冲液中平衡15分钟。转膜：按以下顺序制作“三明治”：阴极-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-阳极。将制好的“三明治”放入转移槽，加入足量的转移缓冲液使其完全浸泡于液体中，接上源，300mA，4℃，转移50-60min。取出PVDF膜，同时将凝胶用考马斯亮蓝染色观察转移效果。

(5)封闭：将PVDF膜置于杂交袋中，加入足量封闭液，室温振荡孵育一小时后去掉封闭液，用足量洗液振荡洗漆3次。

(6)一抗孵育：将一抗，按1:1000用一抗稀释液稀释后，加入杂交袋，4℃冰箱内振荡孵育过夜。移去一抗孵育液，用足量PBS洗液振荡洗涤5次，每次10min。

(7)二抗孵育：将HRP标记的二抗按1:5000用封闭液稀释(总体积为5ml)，加入杂交袋，室温振荡孵育1小时。移去二抗孵育液，用足量洗液振荡洗涤3×10min，TBS洗10min。显色处理。

成骨诱导7天后，首先进行ALP染色，以评价MSCs的成骨分化。染色结果表明，在TiO2纳米管上培养的MSCs比在光滑的钛基板(对照组)上培养的细胞具有更高的ALP活性如图3A所示。染色区域的统计分析表明，与对照组相比，纳米管诱导成骨分化的能力显著增强。同时，我们观察到在本实验的直径范围内，TiO2纳米管的直径越大，诱导成骨分化的能力越强如图3B所示。因此，在随后的实验中使用了70V组，以更好地显示结果。接下来，分析了成骨基因在第3天和第7天的表达。与对照组相比，在二氧化钛纳米管上培养3天和7天的骨髓间质干细胞均显示成骨基因(RUNX2、ALP、氰酸盐和OSX)的表达有显著促进如图3D所示。Westernblot结果证实，RUNX2和OSX的蛋白表达也在增加。如图3C所示。同时发现f-肌动蛋白在二氧化钛纳米管基团中被上调。因此，二氧化钛纳米管指向成骨细胞分化，这与纳米管的直径有关。研究结果还表明，F-肌动蛋白参与了这一过程。二氧化钛纳米管促进了多发间质干细胞的成骨分化。图3中：A，对光滑钛衬底和五种不同的纳米管衬底进行ALP染色。成骨培养基诱导细胞7d。B，使用ImageJ对染色区域进行统计分析。在第7天，用Westernblotting分析MSCs中C成骨相关蛋白(RUNX2和OSX)和F-actin。应用qRT-PCR方法检测小鼠第3、7天RUNX2(D)、ALP(E)、OCN(F)、OSX(G)mRNA表达。纳米管组。数据代表三个样本的平均SD。*P<0.05,**P<0.01,and***P<0.001。

实施例3：不同管径纳米管钛种植体的成骨作用

通过在成年大鼠股骨近端构建动物模型，成功植入表面具有不同尺度纳米管的钛棒种植体；通过Micro-CT扫描、力学测试、形态学以及免疫组化的方法，研究植入动物体内的种植体——骨界面的骨愈合状态和特点，在组织层面对纳米化种植体的成骨促进作用以及界面结合进行探讨。

种植体制备：动物试验用的种植体共分为五组。第一组在钛棒预处理后在30V电压下进行阳极氧化，第二组在钛棒预处理后在50V电压下进行阳极氧化，第三组在钛棒预处理后在70V电压下进行阳极氧化，第四组在钛棒预处理后在90V电压下进行阳极氧化，对照组为第五组，试件只进行常规的钛棒预处理，不进行阳极氧化。

物模型的建立：试验中选用动物为健康成年SD大鼠，共30只，每组各6只。分别植入30V电压氧化的钛棒、50V电压氧化的钛棒、70V电压氧化的钛棒、90V电压氧化的钛棒及未进行氧化的钛棒。

种植体植入的步骤：腹腔注射麻醉成年健康SD大鼠，将其以俯卧位固定于手术台；去除双侧后肢手术切口附近毛发，常规碘伏酒精消毒，切开皮肤、筋膜；逐层钝性分离肌肉，翻起筋膜和骨膜，显露股骨上段；以低速球钻破除一侧皮质并定位，逐级备洞，并与髓腔贯通；备洞时用生理盐水冷却，防止温度过高造成的骨组织灼伤；每侧股骨制备1个孔，分别植入一枚钛棒。分层缝合关闭伤口，术后三天内予以青霉素肌注，每日两次。术后分不同的时间点时处死动物，连同股骨一起整体取种植体标木，根据不同实验内容和目的，分别用4％甲醛进行固定标本。

种植体与骨结合强度测试结果：五组试件的力学测试结果都有大幅度上升，实验组的钛种植体与骨结合强度仍明显高于对照组，提示纳米化的表面在新骨形成，基质矿化和机械嵌合等方面仍有优势。

种植体周围组织形态学检查：在种钛棒植体植入大鼠股骨后2周、4周、6周三个时间点进行处死和取材，通过染色观察种植体骨界面的细胞生长、胶原分泌、类骨质沉积和新骨形成的情况。种植体在植入到体内2周、4周、6周后，五组种植体的表面均查见新骨的形成；其中70V和90V组表面的新骨形成较完整，局部形成骨小梁结构，中间有骨细胞存在；而对照组表面仅有薄层新骨样结构出现，厚度较小，连续性不足。

扫描电镜结果：试验组种植体与自体骨之间布满网状的新骨结构，呈编织状充填与旧骨吸收后形成的间隙区域，新骨有向骨髓腔延伸的趋势；70V和90V组的种植体与旧骨之间无明显的间隔，种植体与骨形成紧密接触；对照组可见种植体与自体骨之间仍存在微小间隙，间隙中仅有靠近骨髓腔区域有少量的新骨沉积。

Micro-CT检测结果：动物手术后2w、4w和6w处死大鼠并取材进行Micro-CT检测，经过机载软件建立的三维重建图像能观察到，随着时间的延长，每组黄色的新生骨量都是持续增加的，但是在每个时间点，实验组的新生骨在钛棒上的覆盖面积明显多于对照组。根据机载软件的测量数据，进行的统计学分析，随着钛棒植入时间的延长，两组的BV/TV(骨体积/总体积)、Tb.Th(骨小梁厚度)和TbN(骨小梁数量)都在持续增加，特别是从4w到6w升高非常显著，而且每个时间点实验组的上述三个参数都高于对照组(P<0.05)。相反，虽然随着植入时间的延长，每组的BS/BV(骨体积中的骨表面积)和Tb.Sp(骨小梁间距)都在下降，但是每个时间点上实验组下降的幅度明显低于对照组(P<0.05)。表明经过阳极氧化形成纳米管的钛棒能够更好的促进其周围骨组织的形成及再生。

实施例:4：钛片弹性形变对细胞生物学行为的影响

进行弹性形变试验，60V电压下制备的二氧化钛纳米管：高度为2μm，内径为128nm，粗糙度为84nm，在加载速率为0.5mm/min、直径为3mm的金属棒推出测试下弹性形变量为0.9％。40V电压下制备的二氧化钛纳米管：高度为2μm，内径为92nm，粗糙度为64nm，在加载速率为0.5mm/min、直径为3mm的金属棒推出测试下弹性形变量为0.3％。上述两种二氧化钛纳米管分别接种细胞(hMSCs)，并进行相关检测。

结果显示，对细胞成骨分化的影响：检测成骨相关标志物OPN(骨桥素)、OCN(成骨细胞分泌蛋白)、RUNX2的表达情况。如图4所示，0.3％和0.9％组较对照组OPN、OCN、RUNX2的表达均不同程度升高，且0.9％组OPN、OCN、RUNX2的表达升高幅度较明显，表明弹性形变量为0.9％的二氧化钛纳米管具有较强的指向性：促进干细胞向成骨细胞分化。而弹性形变量为0.3％的二氧化钛纳米管也具有较强的指向性：促进干细胞向脂肪细胞分化。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。