一种可快速检测罗非鱼无乳链球菌的试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明属于试剂盒制备技术领域，尤其涉及一种可快速检测罗非鱼无乳链球菌的试剂盒及其制备方法。

背景技术

目前，无乳链球菌是一种人畜共患、危害多种动物的重要病菌，在中国目前其主要危害罗非鱼养殖业。据世界粮农组织(FAO)统计，2008年中国罗非鱼养殖量达706585吨，占世界总产量的50％，罗非鱼成为名符其实的“水禽”。据统计，1980年后淡水鱼、海水鱼类中的链球菌感染在多个国家相继有爆发的报道，鱼类链球菌在世界范围内开始广泛流行。迄今为止，该病的流行区域已经涵盖欧洲、非洲、澳大利亚、亚洲以及北非、南非6个大陆的15个国家的淡水鱼和海洋鱼类。由于罗非鱼无乳链球菌的危害已不得不大量减少罗非鱼的养殖量，这给中国罗非鱼产业造成了重创。

无乳链球菌病危害严重、具有极强的传染性，目前我国针对罗非鱼链球菌病的防控并无商品化疫苗，只能依赖严格的生产管理和抗生素治疗，因此建立快速有效的疾病早期诊断方法并对疫情进行监测是当前要解决的关键技术问题。但是现有技术中进行罗非鱼无乳链球菌检测的方法操作复杂，且用时长，进行规模化检测不方便。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术中进行罗非鱼无乳链球菌检测的方法操作复杂，且用时长，进行规模化检测不方便。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种可快速检测罗非鱼无乳链球菌的试剂盒及其制备方法。

本发明是这样实现的，一种可快速检测罗非鱼无乳链球菌的试剂盒的制备方法，所述可快速检测罗非鱼无乳链球菌的试剂盒的制备方法包括以下步骤：

步骤一，采用聚碳酸酯为主要材料进行试剂盒上壳体与下壳体的制备，所述下壳体为上端开口的半密封壳体，所述下壳体为下端开口且上端有两个开口的壳体；

步骤二，将底板粘贴在试剂盒下壳体内部的下端位置，并在底板上对样品滴加区与结果显示区对应的区域进行标记；所述样品滴加区与结果显示区与上壳体的两个开口相对应；

步骤三，进行聚酯膜的选择，并将选择得到的聚酯膜切割成规格为8～10mm宽、4～5cm长的长条；将切割好的长条作为反应试纸条，对反应试纸条的边缘进行修剪处理；

步骤四，将罗非鱼经3～5次免疫后，收集全血；在室温自然析出血清，离心分离取上清液得到血清；用PBS液稀释进行2～3倍稀释后，离心，进行血清IgM蛋白的分离，纯化，浓缩，得罗非鱼血清IgM；

步骤五，将纯化罗非鱼IgM蛋白和等量体积的佛氏完全佐剂进行乳化后，在小鼠皮下多点注射，进行小鼠免疫，重复免疫2～3次后，再次用罗非鱼IgM蛋白对小鼠直接腹腔和静脉进行加强免疫；

步骤六，取加强免疫2～5天后的小鼠细胞，预热至30～40℃后，加入细胞融合剂和预热到35～40℃的DMEM培养基，离心，置于固体培养基中进行细胞培养融合；当细胞生长到孔底一半时，开始筛查，获得抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株；

步骤七，选择使用NC膜作为胶体金免疫层析试纸条上质控线和检测线的承载体，所述质控线为C线，所述检测线为T线；将NC膜进行准确切割，得到胶体金免疫层析试纸条基体；

步骤八，将步骤六获取的抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株包被至所述胶体金免疫层析试纸条基体的检测线上，将羊抗小鼠免疫球蛋白抗体包被至所述胶体金免疫层析试纸条基体的质控线上；

步骤九，进行胶体金溶液的配制，将包被抗体后的胶体金免疫层析试纸条基体置于胶体金溶液中浸泡2～5min，使用磷酸缓冲液进行稀释，后进行印膜、干燥，得到胶体金免疫层析试纸条；

步骤十，将胶体金免疫层析试纸条置于壳体中，得到可快速检测罗非鱼无乳链球菌的试剂盒。

进一步，步骤六中，所述离心的方法为：将含有小鼠细胞、细胞融合剂和DMEM培养基的混合物置于800～1200rpm的离心机中离心15～20min。

进一步，步骤八中，所述抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株的包被浓度为0.5～0.8mg/mL。

进一步，步骤八中，所述羊抗小鼠免疫球蛋白抗体的包被浓度为1.0～2.0mg/mL。

进一步，步骤十中，所述将胶体金免疫层析试纸条置于壳体，包括：

(1)确定样品滴加区与结果显示区的相对位置，按照确定的相对位置进行胶体金免疫层析试纸条的摆放；

(2)将摆放好的胶体金免疫层析试纸条与底板的样品滴加区与结果显示区相对应，并将其覆盖在底板上；

(3)对底板与胶体金免疫层析试纸条连接处进行压紧使其平整，并进行封闭胶水的制备；

(4)将上壳体与下壳体连接，使用封闭胶水进行连接处的涂擦，凝固得到可快速检测罗非鱼无乳链球菌的试剂盒。

进一步，所述按照确定的相对位置进行胶体金免疫层析试纸条的摆放，包括：将胶体金免疫层析试纸条按照样品滴加区在左，结果显示区在右，结果显示区内检测线在左，质控线在右的顺序进行摆放；或是将胶体金免疫层析试纸条按照样品滴加区在右，结果显示区在左，结果显示区内质控线在左，检测线在右的顺序进行摆放。

本发明的另一目的在于提供一种应用所述的可快速检测罗非鱼无乳链球菌的试剂盒的制备方法制备得到的可快速检测罗非鱼无乳链球菌的试剂盒，所述可快速检测罗非鱼无乳链球菌的试剂盒包括：

试剂盒壳体和试剂盒内部组件，所述试剂盒壳体包括试剂盒上壳体与试剂盒下壳体，所述试剂盒上壳体表面设置样品滴加区与结果显示区。

进一步，所述样品滴加区与所述结果显示区为镂空区域。

进一步，所述样品滴加区为圆孔状区域，所述结果显示区为方形区域。

进一步，所述试剂盒内部组件包括底板、胶体金免疫层析试纸条；所述胶体金免疫层析试纸条上设置有质控线、检测线。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的可快速检测罗非鱼无乳链球菌的试剂盒，利用罗非鱼单克隆抗体和胶体金技术建立的罗非鱼无乳链球菌抗体的检测方法，制备的试剂盒进行检测操作简单，不需要专业知识的检验人员，并可以现场检测，养殖者在使用时不需要具备的专门知识，只需要简单的检测培训就能使用。同时，本发明提供的的试剂盒进行检测能把实验室复杂漫长和专业的检测过程直接转化为简单的现场检测，为疫病的早期控制争得宝贵的时间。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的可快速检测罗非鱼无乳链球菌的试剂盒示意图；

图中：1、试剂盒壳体；2、试剂盒内部组件；3、样品滴加区；4、结果显示区。

图2是本发明实施例提供的试剂盒内部组件示意图；

图中：5、底板；6、胶体金免疫层析试纸条；7、质控线；8检测线。

图3是本发明实施例提供的可快速检测罗非鱼无乳链球菌的试剂盒的制备方法流程图。

图4是本发明实施例提供的使用获取的罗非鱼非头部组织进行罗非鱼无乳链球菌的单克隆抗体的制备方法流程图。

图5是本发明实施例提供的将胶体金免疫层析试纸条置于壳体中的方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种可快速检测罗非鱼无乳链球菌的试剂盒及其制备方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。

如图1所示，可快速检测罗非鱼无乳链球菌的试剂盒包括：试剂盒壳体1和试剂盒内部组件2，所述试剂盒壳体1包括试剂盒上壳体与试剂盒下壳体，所述试剂盒上壳体表面设置样品滴加区3与结果显示区4；

所述样品滴加区3与所述结果显示区4为镂空区域；

所述样品滴加区3为圆孔状区域，所述结果显示区4为方形区域。

如图2所示，本发明实施例提供的试剂盒内部组件包括底板5、胶体金免疫层析试纸条6；所述胶体金免疫层析试纸条6上设置有质控线7、检测线8。

如图3所示，本发明实施例提供的可快速检测罗非鱼无乳链球菌的试剂盒的制备方法包括以下步骤：

S101，采用聚碳酸酯为主要材料进行试剂盒上壳体与下壳体的制备，所述下壳体为上端开口的半密封壳体，所述下壳体为下端开口且上端有两个开口的壳体；

S102，将底板粘贴在试剂盒下壳体内部的下端位置，并在底板上对样品滴加区与结果显示区对应的区域进行标记；所述样品滴加区与结果显示区与上壳体的两个开口相对应；

S103，进行聚酯膜的选择，并将选择得到的聚酯膜切割成规格为8～10mm宽、4～5cm长的长条；将切割好的长条作为反应试纸条，对反应试纸条的边缘进行修剪处理；

S104，进行罗非鱼血清IgM蛋白的分离，纯化，浓缩，得罗非鱼血清IgM；将纯化罗非鱼IgM蛋白和等量体积的佛氏完全佐剂进行乳化后，进行小鼠免疫；对小鼠细胞进行融合，获得抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株；

S105，选择使用NC膜作为胶体金免疫层析试纸条上质控线和检测线的承载体，所述质控线为C线，所述检测线为T线；将NC膜进行准确切割，得到胶体金免疫层析试纸条基体；

S106，将S104获取的抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株包被至所述胶体金免疫层析试纸条基体的检测线上，将羊抗小鼠免疫球蛋白抗体包被至所述胶体金免疫层析试纸条基体的质控线上；

S107，进行胶体金溶液的配制，将包被抗体后的胶体金免疫层析试纸条基体置于胶体金溶液中浸泡2～5min，使用磷酸缓冲液进行稀释，后进行印膜、干燥，得到胶体金免疫层析试纸条；

S108，将胶体金免疫层析试纸条置于壳体中，得到可快速检测罗非鱼无乳链球菌的试剂盒。

如图4所示，本发明实施例提供的步骤S104中，获得抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株，包括：

S201，将罗非鱼经3～5次免疫后，收集全血；在室温自然析出血清，离心分离取上清液得到血清；用PBS液稀释进行2～3倍稀释后，离心，进行血清IgM蛋白的分离，纯化，浓缩，得罗非鱼血清IgM；

S202，将纯化罗非鱼IgM蛋白和等量体积的佛氏完全佐剂进行乳化后，在小鼠皮下多点注射，进行小鼠免疫，重复免疫2～3次后，再次用罗非鱼IgM蛋白对小鼠直接腹腔和静脉进行加强免疫；

S203，取加强免疫2～5天后的小鼠细胞，预热至30～40℃后，加入细胞融合剂和预热到35～40℃的DMEM培养基，离心，置于固体培养基中进行细胞培养融合；当细胞生长到孔底一半时，开始筛查，获得抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株。

本发明实施例提供的抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株为单克隆抗体细胞株2C10，分类命名：杂交瘤细胞，于2016年3月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏编号为CCTCC NO：C201644。

本发明实施例提供的步骤S201中，所述离心的方法为：将含有小鼠细胞、细胞融合剂和DMEM培养基的混合物置于800～1200rpm的离心机中离心15～20min。

本发明实施例提供的步骤S106中，所述抗罗非鱼IgM单克隆抗体细胞株的包被浓度为0.5～0.8mg/mL。

本发明实施例提供的步骤S106中，所述羊抗小鼠免疫球蛋白抗体的包被浓度为1.0～2.0mg/mL。

如图5所示，本发明实施例提供的步骤S108中，将胶体金免疫层析试纸条置于壳体中，包括：

S301，确定样品滴加区与结果显示区的相对位置，按照确定的相对位置进行胶体金免疫层析试纸条的摆放；

S302，将摆放好的胶体金免疫层析试纸条与底板的样品滴加区与结果显示区相对应，并将其覆盖在底板上；

S303，对底板与胶体金免疫层析试纸条连接处进行压紧使其平整，并进行封闭胶水的制备；

S304，将上壳体与下壳体连接，使用封闭胶水进行连接处的涂擦，凝固得到可快速检测罗非鱼无乳链球菌的试剂盒。

本发明实施例提供的按照确定的相对位置进行胶体金免疫层析试纸条的摆放，包括：将胶体金免疫层析试纸条按照样品滴加区在左，结果显示区在右，结果显示区内检测线在左，质控线在右的顺序进行摆放；或是将胶体金免疫层析试纸条按照样品滴加区在右，结果显示区在左，结果显示区内质控线在左，检测线在右的顺序进行摆放。

以上所述，仅为本发明较优的具体的实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。