一种生物降解塑料堆肥处理专用复配菌剂

技术领域

本发明涉及生物塑料降解技术领域，具体涉及一种生物降解塑料堆肥处理专用复配菌剂。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

受全球“限塑、禁塑”的影响，可降解塑料已经被世界各个国家视为实现环境可持续发展的重要途径之一，目前市场上可降解塑料的品种非常多，量大面广，涉及快递物流包装、一次性餐饮具、购物袋及地膜等领域。目前，各类可降解材料成为企业追逐的焦点，尤其是生物降解塑料，它是指在自然界如土壤和/或沙土等条件下，和/或特定条件如堆肥化条件下或厌氧消化条件下或水性培养液中，由自然界存在的微生物作用引起降解，并最终完全降解变成CO

生物降解塑料制品除满足使用性能外还要符合降解要求，目前生物降解是公认的分解彻底的降解途径，无论是哪种可降解塑料都会进入生物分解阶段，因此国际和国内上关于降解性能测试的标准体系都是围绕生物分解试验进行，根据降解环境是否有氧，生物降解分为有氧生物降解和厌氧生物降解两种方式，有氧生物分解产物为水、二氧化碳和无机矿物质，而厌氧环境下得到的产物是水、二氧化碳、甲烷和无机矿物质，从模拟降解环境、碳收集计算方式考虑有氧生物分解率测试方法更容易实现。目前我国采用 GB/T19277.1-2011《受控堆肥条件下材料最终需氧生物分解能力的测定采用测定释放的二氧化碳的方法第1部分：通用方法》作为测试生物分解率(相对生物分解率)的仲裁方法，该方法标准规定试验特定的堆肥材料、温度、湿度、pH值等试验条件，收集二氧化碳累计释放量，通过参比、空白实验验证实验有效性，根据产品材质，检验周期在45天至180天左右，检验周期长，试验环境要求繁琐苛刻。尽管试验过程考虑到空白、参比及平行试验来保证试验的重现性和平行性，但标准中未明确堆肥材料中使用的具体菌剂，而菌剂在堆肥降解过程中起到了关键作用，不同实验室使用不同的菌剂，导致同样的降解材料按照标准检测得到不同的降解周期，实验室间数据偏差太大。

在堆肥过程中，微生物会产生特定的水解酶降解原料中的有机物，纤维素酶、脲酶、蛋白酶、淀粉酶等是主要水解酶。有机质降解率与相应水解酶活呈正相关关系，堆体中微生物产酶活性直接影响堆肥品质及周期。

另外值得注意的是，堆肥生物学工艺过程，在堆肥过程不同的阶段对生物塑料降解起主要作用的微生物种类不同，在此过程中需要控制对微生物有影响的因素，其决定微生物的活动程度以及产酶活性，进而影响降解速率和质量。同时，塑料降解是受到光、热、湿度和化学条件以及生物活性等环境因素影响发生聚合物链断裂和化学转换等引起物化变化，最终引起聚合物性能、功能的恶化，因此其反应过程复杂，影响因素众多，不同的酶受其反应环境的影响，通过不用的机制起作用，在降解过程中发挥关键作用的菌株种类以及酶活性均存在不可预期性，而并不是自身具有高酶活性的菌株在生物降解过程中就能够保留其本身的性能，且不论堆肥发酵过程中的影响因素众多，再者无法起到关键降解过程的菌株即使具有高酶活性，也无法提高生物塑料的降解效率。只有两者同时具备，即在堆肥过程中对生物降解起重要作用的菌株还能够保持高活性特点，才有可能具有优异的生物塑料降解效果。

基于此，研制一种高效的针对生物降解材料的堆肥专用复配菌剂迫在眉睫。

发明内容

为了克服上述问题，本发明设计了一种提高生物塑料降解率的复配菌剂，建立高通量的生物降解塑料降解酶酶活检测平台，从降解酶方面评价了各菌株的功能信息。根据堆肥原料中生物降解塑料成分挑选出对应的高产酶菌株，构建了一种堆肥复合菌剂，并通过堆肥试验验证菌剂应用效果，验证构建微生物复合菌剂的方法是否可行，对复合菌剂构建方法的发展有重要意义。

本公开第一方面，提供一种高效堆肥复合菌剂，包括解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、副短短芽胞杆菌(Brevibacillus parabrevis)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、球形赖氨酸芽胞杆菌 (Lysinibacillus sphaericus)。

本公开第二方面，提供上述复合菌剂的制备方法，包括：配制培养基，向上述培养基中接种相应含量范围的菌株，在20-37℃下进行静置，进行菌种的扩大培养；进一步，所述培养基为红糖培养基，其包括磷酸氢二钾3.6g、磷酸二氢钾1g、氯化铵1g、七水合硫酸镁0.2g、氯化高铁4μM、红糖20g，121℃灭菌20min；所述接种量为3％-10％，更进一步，所述接种量为8％，所述静置温度为25℃。

本公开第三方面，提供上述堆肥复合菌剂的使用方法，包括：在堆肥环境中加入生物降解塑料制品，并添加扩大培养后的复合菌剂，形成待处理混合物料，进行堆肥试验；进一步，所述堆肥试验条件为：温度58℃，湿度100％，pH范围6～8。

本公开第四方面，提高上述堆肥复合菌剂在降解生物塑料方面的应用，进一步，所述生物塑料为PLA+PBAT+淀粉组成的生物塑料或PLA+PBAT+CaCO

本公开第五方面，提供上述堆肥复合菌剂在降解生活有机垃圾方面的应用，进一步，所述生活有机垃圾为厨余垃圾。

本公开第六方面，提供上述堆肥复合菌剂在日化产品上的应用，所述日化产品包括湿巾液、护理液等。

本公开一个或多个具体实施方式至少取得了以下技术效果：

本公开提供了一种高效堆肥复合菌剂，能够具有强烈的协同作用，在较短的时间内，即可以高效降解生物塑料。产生上述效果的原因在于：上述菌株的协同作用能够增加底物微生物的活动，实现功能互补和协同代谢，缩短发酵的前期时间，在较短的时间内就可以进入高温阶段，实现快速腐熟，从而提高降解效率和堆肥质量。

本公开筛查出适合生物降解塑料的堆肥用高效复配菌剂，并通过生物分解率测试对复配菌剂的配比进行了优化，大大缩短了降解时间，为实验室间标准化推广普及提供了数据支持。

本公开提供了一种高效堆肥复合菌剂，能够有效降解生活垃圾，特别是厨余垃圾，现有技术中厨余垃圾的处理方式大多采用填埋和焚烧，造成环境和土地的污染问题，本申请的复合菌剂能够实现快速降解厨余垃圾，降解率高达97.6％，且处理方式简单、实用性强。

本公开提供了一种高效堆肥复合菌剂，具有优异的抑菌性能，现有技术中的湿巾液等大多添加防腐剂进行抑菌，不仅抑菌作用有限且具有一定刺激性，本申请实现了无毒性的高抑菌性能，对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的抑菌性能分别能够达到96.8％和97.2％。

附图说明

构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。

图1为本发明实施例1中生物塑料PLA+PBAT+淀粉在商用菌剂条件下的a)CO2释放曲线及b)生物分解率曲线图；

图2为本发明实施例1中生物塑料PLA+PBAT+CaCO3在商用菌剂条件下的a)CO2 释放曲线及b)生物分解率曲线图；

图3为本发明实施例1中生物塑料PLA+PBAT+淀粉在高效BP菌剂条件下的 a)CO2释放曲线及b)生物分解率曲线图；

图4为本发明实施例1中生物塑料PLA+PBAT+CaCO3在高效BP菌剂条件下的 a)CO2释放曲线及b)生物分解率曲线图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/ 或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，现有技术中鲜有能够快速进入发酵温度阶段，缩短发酵前期时间，对生物降解过程能够筛选得到发挥关键作用且保持高活性菌株的报道。因此，本公开提出了一种提高生物塑料降解率的复配菌剂，能够有效解决现有技术中的技术问题。

本公开第一方面，提供一种高效堆肥复合菌剂，包括解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、副短短芽胞杆菌(Brevibacillus parabrevis)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、球形赖氨酸芽胞杆菌 (Lysinibacillus sphaericus)；

在一种典型实施方式中，所述高效堆肥复合菌剂还包括阿氏肠杆菌(Enterobacter asburiae)和地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)；进一步，还包括谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。

本公开使用的菌种均为农业部《关于微生物饲料生物安全通用技术准则》附录中所规定允许使用的生产菌种，优选的，解淀粉芽胞杆菌菌种编号CICC 10081，副短短芽胞杆菌菌种编号CICC 10343，蜡样芽胞杆菌菌种编号CICC 10041，沼泽红假单胞菌菌种编号CICC 23812，球形赖氨酸芽胞杆菌菌种编号CICC 23697，阿氏肠杆菌菌种编号 CICC10013，地衣芽胞杆菌菌种编号CICC 10092，谷氨酸棒杆菌菌种编号CICC 10058，均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

在本领域认知中，菌种编号CICC 10013的阿氏肠杆菌具有产2，3-丁二醇的作用，菌种编号CICC 10058的谷氨酸棒杆菌本身为一种产谷氨酸的菌，但发明人意外发现其与其他几种菌株进行复配后可以在后续生物塑料降解实验中显著提高降解效率，值得说明的是，阿氏肠杆菌、地衣芽胞杆菌和谷氨酸棒杆菌的加入可以将降解效率提高30％，说明这三种菌剂可以与上述五种菌株在堆肥发酵过程中表现出强烈的协同作用，在较短的发酵时间内，即可以高效降解生物塑料。即本公开提供了一种在生物降解塑料工艺过程中可以对其发挥关键降解作用的复合菌剂，且同时还能够保持高效酶活性，这也能够进一步说明上述菌株与堆肥过程中碳水化合物的分解、病原菌生长抑制有关。同时，在阿氏肠杆菌、地衣芽胞杆菌和谷氨酸棒杆菌这三种菌株中，通过降解结果验证得到谷氨酸棒杆菌可以发挥更为关键的作用，说明谷氨酸棒杆菌在生物塑料降解发酵产生的酶能够更为有效地协同其他酶，促进堆肥腐熟，缩短堆肥周期。

在一种典型实施方式中，包括以下质量组份的菌株：解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)：22％-35％，副短短芽胞杆菌(Brevibacillus parabrevis)：7％-15％，蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)：8％-12％，沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)：10％-15％，球形赖氨酸芽胞杆菌(Lysinibacillus sphaericus)：10％-15％；进一步，还包括阿氏肠杆菌(Enterobacter asburiae)：7％-14％，地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)：7％-14％，谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)：7％-14％；更进一步，包括以下质量组份的菌株：解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)：25％，副短短芽胞杆菌(Brevibacillus parabrevis)：10％，蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)：10％，沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)：12.5％，球形赖氨酸芽胞杆菌 (Lysinibacillus sphaericus)：12.5％，阿氏肠杆菌(Enterobacter asburiae)：10％，地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)：10％，谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)：10％。

在此过程中，含量的选择影响菌株发酵后酶的种类、含量和活性，不同配比的菌株在生物塑料降解过程中的作用方式肯定是不同的，这直接影响最终的降解效果。发明人经过不断筛选优化发现上述含量组合的菌株能够达到良好的作用方式，即可以实现快速腐熟。

在一种典型实施方式中，上述复合菌剂的筛选方法为：

(1)配制堆肥原料；

(2)高温降解菌筛选：包括初筛和复筛，所述初筛包括将步骤(1)中的样品经高温富集培养，用梯度稀释法分离得到耐高温纯菌株，随后将其接种至培养基中，判断菌株降解底物的能力，选择高降解能力的菌株，所述复筛包括将初筛得到的菌株进行培养，测定酶活性；

(3)将步骤(2)中复筛得到的菌株进行菌株鉴定。

在一种典型实施方式中，步骤(1)中，所述堆肥原料包括蛭石和培养液，两者的质量：体积比为1：3，所述培养液由矿物溶液、营养成分、尿素、玉米淀粉、纤维素和堆肥提取液组成，其比例为：500mL：13g：5.8g：20g：20g：500mL；进一步，所述矿物溶液由KH2PO4、MgSO4、CaCl2、NaCl和微量元素溶液组成，其比例为：1g：0.5g： 1mL：1mL：1mL，且CaCl2的溶解度为10％；更进一步，所述微量元素溶液由H3BO3、 KI、FeCl3、MnSO4、(NH4)6MO7O24和FeSO4组成，其比例为：500mg：100mg：200mg： 400mg：200mg：400mg。

在一种典型实施方式中，所述堆肥提取液为高效复合菌剂、红糖培养基和蒸馏水按 0.2：1：100质量比例配制得到。

在一种典型实施方式中，步骤(2)中，初筛过程中在60℃下高温富集培养，将其接种至水解培养基中，观察菌落周围是否出现透明水解圈；若出现水解圈说明该种底物已经被水解，菌株具有降解该种底物的能力，有机物降解能力大小按公式Up＝(D/d)

在一种典型实施方式中，步骤(2)中水解培养基包括纤维素刚果红培养基、蛋白质水解培养基和淀粉水解培养基，其中，纤维素刚果红培养基为：CMC-Na 2.0g， (NH

在一种典型实施方式中，步骤(2)中，在复筛过程中，将初筛得到的菌株接种至纤维素、淀粉和蛋白液体发酵培养基中，50℃静止培养72h后，取发酵液以5000r/min 的转速离心10min，得到粗酶液；分别用DNS法、改良的Yoo法和福林试剂法测定菌株的纤维素酶活性、淀粉酶活性和蛋白酶活性；测定结果用SAS软件进行主成分分析，对菌株降解能力进行综合评价。

进一步，所述纤维素发酵培养基为麸皮培养基，包括：粉碎后过100目筛的麸皮90.0g，NaCl 0.5g，K2HPO40.3g，FeSO4·7H2O0.1g，MgSO4·7H2O 0.1g，水1000mL，在121℃下灭菌20min；所述淀粉发酵培养基为：马铃薯葡萄糖琼脂培养基30g， H2O100mL，pH为7.0，在121℃下灭菌30min；所述蛋白液体发酵培养基为：蛋白胨 10g，植物凝胶15g，曲利苯蓝0.05～0.1g，H2O 1000mL，pH为7.0，在121℃下灭菌 30min。

在一种典型实施方式中，步骤(3)中，所述菌株鉴定包括形态学特征及部分生理生化特性、菌株生长特性和16Sr DNA鉴定，所述形态学特征及部分生理生化特性为：菌株纯化后，观察菌株在牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落特征并将培养24h的菌体进行结晶紫染色判定菌株的形态特征，并研究菌株的部分生理生化特征；或，所述菌株生长特性包括：将筛选得到的菌株种子液接种至牛肉膏蛋白胨培养基中，改变某一条件，并保持其他条件不变，通过测定菌液的OD600值来研究温度、pH、NaCl质量浓度、装液量对菌株生长的影响；或，所述16Sr DNA鉴定包括：以筛选得到的高效高温降解菌基因组DNA为模板，用一般细菌的通用引物27f、1492r进行PCR扩增；体系：ddH2O 37.5μL； 27f0.5μL；1492r0.5μL；10×Tap Buffer5μL；dNTP1μL；模板5μL；Tap酶0.5μL；程序： 94℃预变性10min；94℃变性10s；退火温度采用梯度温度，温度分别为52.1℃、53.5℃、54.7℃、55.6℃、56.9℃和58.1℃，退火40s；72℃延伸1.5min；共30个循环，循环结束后，72℃延伸10min。PCR产物进行序列测定：所得序列与GeneBank数据库中序列进行Blast分析比对，调出相似性最高的相关菌株的16Sr DNA基因序列。序列比对地址为：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。

本公开第二方面，提供上述复合菌剂的制备方法，包括：配制培养基，向上述培养基中接种上述含量范围的菌株，在20-37℃下进行静置，进行菌种的扩大培养；进一步，所述培养基为红糖培养基，其包括磷酸氢二钾3.6g、磷酸二氢钾1g、氯化铵1g、七水合硫酸镁0.2g、氯化高铁4μM、红糖20g，121℃灭菌20min；所述接种量为3％-10％，更进一步，所述接种量为8％，所述静置温度为25℃。

本公开第三方面，提供上述堆肥复合菌剂的使用方法，包括：在堆肥环境中加入生物降解塑料制品，并添加扩大培养后的复合菌剂，形成待处理混合物料，进行堆肥试验；进一步，所述堆肥试验条件为：温度58℃，湿度100％，pH范围6～8，所述堆肥环境为活化蛭石堆肥环境。

本公开第四方面，提高上述堆肥复合菌剂在降解生物塑料方面的应用，进一步，所述生物塑料为PLA+PBAT+淀粉组成的生物塑料或PLA+PBAT+CaCO3组成的生物塑料。

本公开第五方面，提供上述堆肥复合菌剂在降解生活有机垃圾方面的应用，进一步，所述生活有机垃圾为厨余垃圾。

本公开第六方面，提供上述堆肥复合菌剂在日化产品上的应用，所述日化产品包括湿巾液、护理液等。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。

实施例1

1、材料和方法

设备：生物分解测试系统(DA18，济南迪科瑞仪器公司)，总有机碳分析仪(德国元素)

1.1堆肥原料

实验用堆肥原料为蛭石，来源：河北；粒径3～6mm，根据GB/T19277.1-2011标准8.6条款要求配制。蛭石与培养液的比列为1:3(质量/体积)，表1为1L接种液的组分。堆肥提取液为高效复合菌剂、红糖培养基和蒸馏水按0.2∶1∶100质量比例配制得到。

表1 1升接种液的组分

表2 1升矿物溶液的组分

表3 1升微量元素溶液的组分

1.2微生物培养基

1)水解培养基，其中，纤维素刚果红培养基配方如下：CMC-Na 2.0g， (NH4)2SO42.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，K2HPO4 1.0g，NaCl 0.5g，刚果红0.4g，琼脂 20g，去离子水1000mL，pH 7.0。121℃灭菌30min。蛋白质水解培养基：水解酪蛋白琼脂培养基42g，加热溶解于1000mL蒸馏水中，121℃下灭菌15min。淀粉水解培养基为可溶性淀粉10g，蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，植物凝胶15g，曲利苯蓝 0.05～0.1g，H2O 1000mL，pH为7.0，在121℃下灭菌30min。

2)发酵培养基

麸皮培养基：粉碎后过100目筛的麸皮90.0g，NaCl 0.5g，K2HPO4 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.1g，MgSO4·7H2O 0.1g，水1000mL，121℃灭菌20min。

淀粉培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基30g，H2O 100mL，pH为7.0，在121℃下灭菌30min。

蛋白液体培养基：蛋白胨10g，植物凝胶15g，曲利苯蓝0.05～0.1g，H2O 1000mL，pH为7.0，在121℃下灭菌30min。

红糖培养基：磷酸氢二钾3.6g、磷酸二氢钾1g、氯化铵1g、七水合硫酸镁0.2g、氯化高铁4μM、红糖20g，121℃灭菌20min；

种子培养基：30g/L葡萄糖，6g/L胰蛋白酶，560mg/L K2HPO4，750mg/L NaH2PO4·2H2O，750mg/L Na2HPO4。

1.3高温降解菌筛选

1.3.1初筛

堆肥原料经60℃高温富集培养，用梯度稀释法分离得到耐高温纯菌株。将分离得到的菌株分别接种至水解培养基中，观察菌落周围是否出现透明水解圈。若出现水解圈说明该种底物已经被水解，菌株具有降解该种底物的能力，有机物降解能力大小按公式 Up＝(D/d)

1.3.2复筛

将初筛得到的菌株接种至纤维素、淀粉和蛋白液体发酵培养基中，50℃静止培养72h后，取发酵液5000r/min离心10min，得到粗酶液。分别用DNS法、改良的Yoo法和福林试剂法测定菌株的纤维素酶活性、淀粉酶活性和蛋白酶活性。测定结果用SAS 软件进行主成分分析，对菌株降解能力进行综合评价。

1.4菌种鉴定

1.4.1形态学特征及部分生理生化特性

菌株纯化后，观察菌株在牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落特征并将培养24h的菌体进行结晶紫染色判定菌株的形态特征，并研究菌株的部分生理生化特征。

1.4.2菌株生长特性

将筛选得到的菌株种子液接种至牛肉膏蛋白胨培养基中，改变某一条件，并保持其他条件不变，通过测定菌液的OD600值来研究温度、pH、NaCl质量浓度、装液量对菌株生长的影响。

1.4.3 16Sr DNA鉴定

以筛选得到的高效高温降解菌基因组DNA为模板，用一般细菌的通用引物27f、1492r进行PCR扩增。体系：ddH2O 37.5μL；27f 0.5μL；1492r0.5μL；10×Tap Buffer 5μL；dNTP1μL；模板5μL；Tap酶0.5μL。程序：94℃预变性10min；94℃变性10s；退火温度采用梯度温度，温度分别为52.1℃、53.5℃、54.7℃、55.6℃、56.9℃和58.1℃，退火 40s；72℃延伸1.5min；共30个循环，循环结束后，72℃延伸10min。PCR产物送至生物技术公司进行序列测定，所得序列与GeneBank数据库中序列进行Blast分析比对，调出相似性最高的相关菌株的16Sr DNA基因序列，序列比对地址为： http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。

1.5高效堆肥复合菌剂BP构建

测定CICC中15株菌株的生长曲线和发酵过程中的产酶特性，采用牛津杯抑菌法测试各菌株间两两拮抗作用，最终选择生长特性相似、拮抗作用弱的8株菌组成BP菌剂。组配比例与堆肥原料中对应的有机成分比例一致。

1.6复合菌剂BP发酵条件优化单因素实验

发酵培养基优化：选择常用的三种复合菌剂发酵培养基：红糖培养基、麸皮培养基和种子培养基，分别接种6％种子液，在25℃下，130r/min的摇床中培养48h，测定有效活菌数和产酶活性，选出最适复合菌剂发酵培养基。

发酵温度优化：选用最适发酵培养基，接种6％种子液，分别在20、25和30℃，130r/min的摇床中培养48h，测定有效活菌数和产酶活性，选出最适发酵温度。

接种量优化：选用最适发酵培养基，分别接种3％、6％和8％种子液，在25℃下，130r/min的摇床中培养48h，测定有效活菌数和产酶活性，选出最适接种量。

1.7BP菌剂堆肥应用研究

1.7.1测试材料

除了按1.1的要求配制空白试验外，针对典型的生物降解塑料类型选取2类生物降解塑料制品：①PLA+PBAT+淀粉，②PLA+PBAT+CaCO3，选取微晶纤维素(总有机碳含量＞40％)作为参比。

1.7.2堆肥实验

堆肥(活化蛭石)与参比、样品按照质量6:1放入3L堆肥容器中，空白、参比、试验各做3个平行，环境条件：温度58℃，湿度100％；测定二氧化碳方法：采用可降解塑料生物分解系统CO2传感器实时检测。

检验数据有效性依据：1、45d后参比材料的生物分解百分率超过70％；2、试验结束时每个堆肥容器的生物分解百分率之间的相对偏差不超过20％；3、在培养前10d内，空白容器中接种物产生50mg CO2/g挥发性固体(平均值)至150mg CO2/g挥发性固体(平均值)。

2结果和讨论

2.1高酶活菌株的挑选及鉴定

从中国工业微生物菌种保藏管理中心挑选15株高产水解酶活性的菌株并进行种属鉴定，结果见表4。

表4.菌株种属鉴定结果

测定上述15株菌之间的两两拮，发明人经过不断的摸索发现，在上述五种菌株中复合菌株阿氏肠杆菌、地衣芽胞杆菌以及谷氨酸棒杆菌能够明显提高生物塑料降解效率，这很大原因得益于上述八种菌株之间能够产生强烈的协同作用，在较短的发酵时间内能够快速进入高温阶段，缩短发酵时间，这也可以进一步说明上述菌株相互作用后能够产生最有利用生物塑料降解的高活性酶。

2.2高效生物降解塑料堆肥菌剂BP构建

按照表5所示配比构建高效堆肥菌剂BP。

表5.堆肥菌剂BP组成菌及配比

2.3 BP菌剂发酵条件优化

2.3.1培养基：适宜的培养基不仅利于菌株的分离、纯化和保存，还对微生物的生长代谢产生巨大影响。实验研究种子培养基、麸皮培养基、红糖培养基三种不同培养基对菌体生长和产酶能力的影响，根据复合菌剂中各菌株的生长曲线，选择培养时间为 48h。结果表明，BP菌剂在三种培养基中生长48h体系内有效活菌数为红糖>混合>麸皮。在三种培养基条件下，菌剂产酶活力值为种子培养基和红糖培养基较高，麸皮培养基较低。综合菌体生长情况和产酶能力，选择红糖培养基作为BP菌剂发酵培养基。

2.3.2温度：微生物的生长过程也是一系列酶促反应过程，细胞新陈代谢所有的化学反应几乎都是在催化下进行的。温度对酶活性有显著影响，越靠近最适温度，酶活性越强，而越远离最适温度，酶活性越弱，甚至失去活性。

BP菌剂在不同温度中生长48h体系内有效活菌数以及产酶能力的大小为

25℃>30℃>20℃，在本实验中，选择25℃作为BP菌剂发酵温度。

2.3.3接种量：此次接种为一级种子液接种，接种量是指接入种子液和发酵液的体积比。通常较大接种量可以提高菌体生长速率和菌体浓度，但如果接种量过多、菌体生长过快往往会溶解氧降低而影响某些发酵产物的合成。本发明研究了三个不同接种量对复合菌剂生长和产酶情况的影响，接种量分别为3％、6％和8％时，相同培养时间内，接种量越大，菌体有效活菌数越高。随着接种量的加大，菌体酶活亦在上升。因此，本实验选择8％接种量以备后续实验。

2.4堆肥试验结果

堆肥试验按照GB/T 19277.1-2011的实验环境要求，温度58℃，湿度100％，pH范围6～8，采用CO2红外传感器实时检测计算累积释放量。材料①PLA+PBAT+淀粉在高效BP菌剂条件下达到90％(标准要求)的生物分解率需要114天，②PLA+PBAT+CaCO3 在高效BP菌剂条件下达到90％(标准要求)的生物分解率需要113天，具有优异的降解效果。

实施例2

与实施例1不同的是，复合菌剂包括以下质量组份的菌株：解淀粉芽胞杆菌：35％，副短短芽胞杆菌：15％，蜡样芽胞杆菌：12％，沼泽红假单胞菌：14％，球形赖氨酸芽胞杆菌：15％，阿氏肠杆菌：8％，地衣芽胞杆菌：8％，谷氨酸棒杆菌：8％。

按照同样的堆肥实验条件得到，材料①PLA+PBAT+淀粉在高效BP菌剂条件下达到90％(标准要求)的生物分解率需要117天，②PLA+PBAT+CaCO3在高效BP菌剂条件下达到90％(标准要求)的生物分解率需要115天。

实施例3

厨余垃圾降解效果验证

将厨余垃圾中的骨头等大体积物质剔除，置于厨余垃圾降解处理机内，在其表面均匀加入上述复合菌剂，随后进行充分搅拌20min，所加入的厨余垃圾的质量与复合菌剂的质量比为500：1(两者总量为3kg)，进行发酵处理，开启运行两天，之后每天加入 0.5kg厨余垃圾，连续运行三个月，测定降解率，降解率计算公式如下：

C＝(A-B)/D

其中，C为厨余垃圾降解率，A为未处理厨余垃圾和降解处理机总质量，B为降解后的厨余垃圾和降解处理机总质量，D为投入的厨余垃圾总重量。经验证得到，3天后的降解率能够达到97.6％。说明本申请的复合菌剂能够实现快速有效降解厨余垃圾。

实施例4

抑菌效果验证

将复合菌剂添加到湿巾液中，湿巾液与复合菌剂的质量比为1000：5，按GB 15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》对50℃高温存储一个月以及室温存储三个月的湿巾液进行检测，经验证得到湿巾液中对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的抑菌效果分别达到了96.8％和97.2％，具有优异的抑菌性能。

对比例1

与实施例1不同的是，菌剂仅包括解淀粉芽胞杆菌和副短短芽胞杆菌，按照同样的堆肥实验条件得到，材料①PLA+PBAT+淀粉在高效BP菌剂条件下达到90％(标准要求)的生物分解率需要169天，②PLA+PBAT+CaCO3在高效BP菌剂条件下达到90％ (标准要求)的生物分解率需要167天，降解效率不高。

对比例2

与实施例1不同的是，菌剂仅包括解淀粉芽胞杆菌、副短短芽胞杆菌和沼泽红假单胞菌，按照同样的堆肥实验条件得到，材料①PLA+PBAT+淀粉在高效BP菌剂条件下达到90％(标准要求)的生物分解率需要153天，②PLA+PBAT+CaCO3在高效BP菌剂条件下达到90％(标准要求)的生物分解率需要152天，降解效率相比对比例1有些许改善。

对比例3

与实施例1不同的是，省略菌株阿氏肠杆菌、地衣芽胞杆菌和谷氨酸棒杆菌，按照同样的堆肥实验条件得到，材料①PLA+PBAT+淀粉在高效BP菌剂条件下达到90％(标准要求)的生物分解率需要148天，②PLA+PBAT+CaCO3在高效BP菌剂条件下达到 90％(标准要求)的生物分解率需要147天，其降解时间增加了30％，说明了上述三种菌株在堆肥发酵过程中起到了重要的腐熟作用。

对比例4

与实施例1不同的是，省略菌株谷氨酸棒杆菌，按照同样的堆肥实验条件得到，材料①PLA+PBAT+淀粉在高效BP菌剂条件下达到90％(标准要求)的生物分解率需要 132天，②PLA+PBAT+CaCO3在高效BP菌剂条件下达到90％(标准要求)的生物分解率需要130天，说明了菌株谷氨酸棒杆菌相比于阿氏肠杆菌和地衣芽胞杆菌能够发挥更关键的提高降解率作用。

对比例5

与实施例1不同的是，将谷氨酸棒杆菌替换为来自CICC菌种编号为CICC 2115的黑曲霉菌(Aspergillus niger)，按照同样的堆肥实验条件得到，材料①PLA+PBAT+淀粉在高效BP菌剂条件下达到90％(标准要求)的生物分解率需要143天，②PLA+PBAT+CaCO3在高效BP菌剂条件下达到90％(标准要求)的生物分解率需要 144天，这就说明并非任意组合的复合菌株均能够达到优异的降解效果，这取决于菌株之间能否产生降解生物塑料有效的协同作用。

对比例6

与实施例1不同的是，复合菌剂包括以下质量组份的菌株：解淀粉芽胞杆菌：40％，副短短芽胞杆菌：18％，蜡样芽胞杆菌：15％，沼泽红假单胞菌：20％，球形赖氨酸芽胞杆菌：20％，阿氏肠杆菌：2％，地衣芽胞杆菌：2％，谷氨酸棒杆菌：3％。

按照同样的堆肥实验条件得到，材料①PLA+PBAT+淀粉在高效BP菌剂条件下达到90％(标准要求)的生物分解率需要152天，②PLA+PBAT+CaCO3在高效BP菌剂条件下达到90％(标准要求)的生物分解率需要150天。上述结果直接反映出了菌株的含量对最终的降解效果具有直接而重要的影响。

对比例7

将培养菌剂与商用菌剂(有机肥专用菌剂)进行对照测试两种生物降解材料。分别得到参比和试样的二氧化碳累计释放曲线和生物分解率曲线，见图1～4，这几幅图中处于上方的曲线均为纤维素1、纤维素2和纤维素3重合的曲线，处于下方的曲线均为试样1、试样2和试样3重合的曲线，二氧化碳释放曲线和生物分解率曲线基本重合，证明试验的平行性良好。从中可以看出，两种典型生物降解塑料制品①②在商用有机肥专用菌剂配制的活化蛭石堆肥环境中相对生物分解率达到90％(标准要求)分别需要 147天和151天，而采用复配得到的高效生物降解塑料专用菌剂在同样条件下生物分解率达到90％分别需要114天、113天，缩短了1个月的堆肥时间，降解效率显著提高。

3结论

本发明筛查出适合生物降解塑料的堆肥用高效复配菌剂，并通过生物分解率测试对复配菌剂的配比进行了优化，大大缩短了降解时间，为实验室间标准化推广普及提供了数据支持。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。