用于产生具有最小化的生物质副产物的植物的方法及其相关的植物

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年3月5日提交的美国临时申请号62/985,778的优先权权益，其通过引用整体并入本文用于所有目的。

背景技术

在美国，商业城市农业主要通过建筑物，船运集装箱或未使用空间的控制环境农业而兴起。城市中心区的食物增长有许多好处，包括减少运输成本，全年当地生产新鲜食物，以及增加城市居民的食物可及性。通常将这些系统设计成具有垂直堆叠的植物生长区域，以便减小占地面积的尺寸。这也降低了植物必须生长的可用高度，最终限制了可以在这些系统中栽培的作物的尺寸。

延长空间上的植物可以为工作人员提供新鲜的食物和营养物来源，CO

在这两种情况下，大多数带有果实和蔬菜的植物太大，并且产生太多不可食用的生物质而不能在这些建造的环境中实施。因此，这些系统中的许多仅产生有限种类的小的、快速生长的作物，例如绿色叶菜类蔬菜，例如莴苣。收获指数，一种用于描述作物的可食用和不可食用组分之间的生物质相对分布的植物生产力量度(Hay,1995)，需要被最大化。因为植物在这些建造的环境中没有进行针对生长而进行的优化，所以有许多机会开发与这些新的约束相匹配的新的植物性状。

简要概述

本发明至少部分地基于这样的发现，即破坏植物中编码酶，即聚(腺苷5’-二磷酸(ADP)-核糖)聚合酶(PARP)(例如PARP2)的基因，例如可以以对于受限和/或受控生长理想的方式，例如在航天应用或其它环境中改变其发育周期。这种遗传修饰的植物可以具有最少量的叶和/或以较快的进展发育果实。此外，当与野生型植物相比时，所述植物可以具有使得它们理想地用于在受限的、受控的、垂直的、异养的和/或自动化的(例如作物管理和/或收获的机器人技术的那些)环境中栽培的若干性状：1)小尺寸，2)产生少量的不可食用生物质，3)更快地产生果实的能力，4)在每种植物整个生命周期中在不同收获时间产生在重量和/或尺寸上更一致的果实的能力，5)产生相同或接近相同量的果实的能力，6)例如由于上述任何一种，对水和/或垂直和/或水平空间的利用较少，和/或7)产生更多种子的能力。

这些期望的性状，在本文中称为“SPACE”，其可以代表“用于空间延伸的小植物”或“用于受限环境中的农业的小植物”或“用于受控环境中的农业的小植物”或“用于农业受控环境的小植物”。具有这些期望性状的特定品系的植物在本文中被称为“SPACE”、“SPACE番茄”、“M#”，例如“M3”或“PARP2突变体”。这些SPACE性状可以通过添加化学抑制剂或在一些实施方案中通过基因破坏来诱导。使植物矮化的大多数其它突变在很大程度上保持叶状，不可食用材料与可食用果实的比例相同。NASA先前已经研究了几种用于在航天期间栽培的矮化番茄，但是没有一种是这种极端的。除了小外，SPACE性状迫使植物快速地通过发育周期以产生果实，而不必发育成整株植物。这导致产生具有高比例生物质的果实的极小植物。将SPACE性状引入植物，例如番茄、马铃薯、柑橘、草莓、胡椒和蓝莓，扩大了可以在受控环境农业系统中栽培的新鲜产品的范围。在一些实施方案中，例如，在遗传修饰的番茄中，植物具有较少的叶和花，并且以较快的进展发育果实。在一些实施方案中，与野生型植物相比，植物另外产生更多数量的种子，例如增加2至3倍。

因此，本文提供了经遗传修饰以破坏PARP2基因并抑制蛋白质表达的植物。

附图的简要说明

图1.T1代，即，转化后在土壤中生长的PARP2基因被破坏的90日龄的成熟番茄植物的第一代。

图2.在体外生长的PARP2基因被破坏的番茄植物。

图3.在体外生长的野生型番茄植物。

图4.在土壤中生长的T1成熟野生型番茄植物。

图5A-5C.5A：通过PCR对PARP2基因被破坏的番茄植物中的Cas9转基因的T2检测；5B：对PARP2基因被破坏的番茄植物中的NPTII基因表达的T2 RT-PCR分析；5C：对PARP2基因被破坏的番茄植物的T2基因分型。

图6A和6B.6A：野生型番茄植物的T2生物质和果实产量(收获指数＝0.60)；6B：野生型(收获指数＝0.6)和PARP2基因被破坏的植物(收获指数＝0.77)的T2生物质和果实产量。

图7.不同植物物种中存在的番茄PARP2基因的直系同源物。

图8.用于产生PARP2基因被破坏的植物的pKEE401双元载体的物理图谱。

图9.番茄PARP2基因的结构基序。

图10A-10C.10A：在开花和结果期间，PARP2基因被破坏的番茄植物的T2群体；10B：在开花和结果期间，PARP2基因被破坏的成熟番茄植物的T3群体的透视俯视图；10C：在开花和结果期间，PARP2基因被破坏的成熟番茄植物的T3群体的透视侧视图。

图11A-11C.11A：T2野生型开花的番茄植物；11B:PARP2基因被破坏的T2纯合番茄植物，其表现出过早的开花和结果；10B：在开花和结果期间，PARP2基因被破坏的成熟番茄植物的T3群体的透视俯视图；10C：在开花和结果期间，PARP2基因被破坏的成熟番茄植物的T3群体的透视侧视图。

图12A-12F.12A:成熟T3野生型番茄植物和PARP2基因被破坏的番茄植物的茎高；12B：成熟T3野生型番茄植物和PARP2基因被破坏的番茄植物的产量；12C：成熟T3野生型番茄植物和PARP2基因被破坏的番茄植物的收获指数；12D：成熟T3野生型番茄植物和PARP2基因被破坏的番茄植物的番茄重量平均值；12E：成熟T3野生型番茄植物和PARP2基因被破坏的番茄植物的番茄重量标准差；12F：成熟T2野生型番茄植物和PARP2基因被破坏的番茄植物的每个果实的平均种子。

图13.来自T3野生型番茄植物和PARP2基因被破坏的番茄植物的番茄。

图14.在体外生长的最新一代的PARP2基因被破坏的植物。

图15.T3野生型番茄植物和PARP2基因被破坏的植物的味道试验。

图16.对T3和T4野生型番茄植物和PARP2基因被破坏的植物的Southern印迹分析。

发明的详细描述

术语

如本文所用，术语“聚(腺苷5’-二磷酸(ADP)-核糖)聚合酶”或“PARP”基因是指编码PARP酶的基因。聚(ADP-核糖基化)(PARylation)是一种重要的翻译后修饰，其调节植物中的DNA修复、基因转录、胁迫响应和发育过程。聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)通过将来自NAD+的ADP-核糖部分连续添加到靶蛋白上的氨基酸受体残基来催化PARylation。拟南芥(Arabidopsis)具有三个典型的PARP成员，并且已经证明这些成员中的两个，AtPARP1和AtPARP2调节DNA修复和胁迫响应过程。PARP2在拟南芥中对PARP活性贡献最大。PARP2样蛋白在不同的植物分类群中广泛保守，而PARP1在植物和动物中广泛保守。植物PARP2酶通常包含在N-末端区中赋予DNA结合活性的一个或多个SAP结构域、WGR结构域、PARP调节结构域和PARP催化结构域，例如参见Gu等人，BMC Plant Biol.19:364,2019。拟南芥PARP1和PARP2在其催化核心中具有典型的H-Y-E催化三联体。植物中的内源性PARP基因，包括PARP2基因，可以基于保守结构域和PARP标签基序的存在来鉴定。PARP在多肽的C末端具有催化结构域，这是所有PARP蛋白家族的共同特征。PARP还具有由两个螺旋-环-螺旋结构重复组成的调节结构域，其通常与C末端催化结构域相关。WGR结构域存在于许多PARP中(图9)。

参照生物体使用的“内源”或“天然”基因或蛋白质序列是指在生物体的基因组中天然存在的基因或蛋白质序列。

多核苷酸或多肽序列如果来自外来物种，则对于生物体来说是“异源的”或是第二多核苷酸序列，或者如果来自相同物种，则是从其原始形式修饰的。例如，当认为启动子与异源编码序列可操作地连接时，这意味着该编码序列来源于一种物种，而该启动子序列来源于另一种不同的物种；或者，如果两者都来相同物种，则编码序列不是与启动子天然关联的(例如，是遗传工程改造的编码序列，例如，来自相同物种中的不同基因，或来自不同生态型或品种的等位基因)。

本文所用的术语“启动子”是指能够驱动编码序列在细胞中转录的多核苷酸序列。因此，启动子可以包括参与调节或调整基因的转录时机和/或速率的顺式作用转录控制元件和调节序列。例如，启动子可以是参与转录调节的顺式作用转录控制元件，包括增强子、启动子、转录终止子、复制起点、染色体整合序列、5’和3’非翻译区或内含子序列。这些顺式作用序列通常与蛋白质或其它生物分子相互作用以进行(例如，开启/关闭、调节、调整等)基因转录。“组成型启动子”是能够在几乎所有组织类型中启动转录的启动子，而“组织特异性启动子”仅在一种或几种特定组织类型中启动转录。

术语“可操作地连接”是指核酸表达控制序列(如启动子或转录因子结合位点阵列)和第二核酸序列之间的功能连接，其中表达控制序列指导对应于第二序列的核酸的转录。

术语“植物”包括整株植物、芽营养器官和/或结构(例如叶、茎和块茎)、根、花和花器官(例如苞叶、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药)、胚珠(包括卵和中央细胞)、种子(包括合子、胚、胚乳和种皮)、果实(例如，成熟的子房)、幼苗、植物组织(例如，维管组织、基本组织等)、细胞(例如，保卫细胞、卵细胞、毛状体等)及其后代。可用于本发明方法的植物种类通常与适于转化技术的高等和低等植物种类一样广泛，包括被子植物(单子叶植物和双子叶植物)、裸子植物、蕨类植物和多细胞藻类。它包括各种倍性水平的植物，包括非整倍体、多倍体、二倍体、单倍体和半合子。“遗传修饰的植物”包括具有被工程改造到亲本植物中的遗传修饰的植物的后代。

短语“核酸”或“多核苷酸序列”是指从5’到3’末端读取的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。核酸还可以包括修饰的核苷酸，其允许通过聚合酶正确地读取，和/或形成双链的双链体，并且不显著改变由该核酸编码的多肽的表达。

短语“编码…核酸序列”是指编码RNA的核酸，所述RNA又可以是非编码的(例如，gRNA)或编码特定多肽的核酸，例如RNA或mRNA。核酸序列包括可以转录成RNA的DNA链序列和可以翻译成蛋白质的RNA序列。核酸序列包括全长核酸序列以及来源于全长序列的非全长序列。还应当理解，所述序列包括天然序列或可被引入以在特定宿主细胞中提供密码子偏好的序列的简并密码子。

在两条或更多条核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同的”或“同一性”百分比是指当在比较窗内进行最大对应性比较和比对时，使用以下序列比较算法之一或通过手动比对和目测检查所测量的，相同的或具有指定百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基的两条或更多条序列或子序列。当如下所述进行最大对应性比对时，如果两条核酸序列或多肽中的核苷酸或氨基酸残基的序列分别是相同的，则认为两条序列是“相同的”。当在蛋白质或肽中使用序列同一性的百分比时，可以认识到，不相同的残基位置经常由于保守氨基酸取代而不同，在保守氨基酸取代中，氨基酸残基取代了具有类似化学特性(例如，电荷或疏水性)的其它氨基酸残基，因此不改变分子的功能特性。当序列在保守取代方面不同时，可以向上调整序列同一性百分比以校正取代的保守性质。用于进行这种调整的方式是本领域技术人员公知的。通常，这涉及将保守取代记为部分而不是完全的错配，从而增加序列同一性百分比。因此，例如，当给予相同的氨基酸的分数为1且给予非保守取代的分数为0时，给予保守取代的分数为0至1。保守取代的评分根据例如Meyers&Miller,ComputerApplic.Biol.Sci.4:11-17(1988)来计算，例如如在程序PC/GENE(Intelligenetics,Mountain View,California,USA)中所实施的。

“表达盒”是指当引入宿主细胞时，分别导致RNA或多肽转录和/或翻译的核酸构建体。

“RNA-引导的核酸酶”是指与sgRNA组合的靶向DNA序列以进行切割的核酸酶。通常，在没有sgRNA的情况下，核酸酶是无活性的，并且不会在靶位点处切割DNA。此类核酸酶的实例包括例如Cas9和本文CRISPR上下文中讨论的其它核酸酶。

基因组编辑

可以使用任何数量的修饰，缺失或插入核酸序列到基因组DNA中的基因组编辑技术来进行对内源性植物PARP基因(例如PARP2基因)的修饰，从而抑制该基因的表达。这种方法的实例包括使用序列特异性核酸酶。在一些实施方案中，基因组编辑的方法可以使用单链寡核苷酸在植物基因组中引入精确的碱基对修饰，如Sauer等人，Plant Physiol.170:917-1928,2016所描述的。

在一些实施方案中，使用用于基因编辑的核酸酶系统。可以使用能够靶向特定基因组序列以诱导序列特异性切割并因此允许靶向诱变的任何核酸酶。在本发明中，“被引导的核酸酶”是指例如通过单独的小向导RNA(sgRNA)或靶向DNA序列的融合蛋白序列，靶向特定基因组DNA序列的DNA核酸酶。可以使用任何递送方法来递送核酸酶和向导分子。在一些实施方案中，核酸酶和向导RNA通过相同的机制递送。在一些实施方案中，核酸酶通过一种机制递送至植物，而sgRNA通过第二种机制递送至植物。

示例性核酸酶包括，例如，工程改造的或天然的大范围核酸酶、TALE内切核酸酶(TALEN)、锌指蛋白(ZFP)、锌指核酸酶(ZFN)、DNA引导的多肽，例如格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi)Argonaute(NgAgo)和RNA引导的内切核酸酶，例如，规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas9系统、CRISPR/Cpfl系统、CRISPR/CasX系统、CRISPR/Casy系统、CRISPR/Cascade系统。其它CRISPR/Cas RNA引导的多肽Cms1、MAD7等。

CRISPR/Cas系统已经被修饰用于原核和真核系统，以用于基因组编辑和转录调控。“CRISPR/Cas”系统是指用于防御外来核酸的一类广泛分布的细菌系统。CRISPR/Cas系统在广泛的真细菌和古生物生物体中被发现。CRISPR/Cas系统包括型I型、II型和III型亚型。野生型HCRISPR/Cas系统利用RNA介导的核酸酶Cas9与向导和活化RNA的复合物来识别和切割外来核酸。Cas9同系物在多种真细菌中被发现，包括但不限于以下分类群的细菌：放线菌门(Actinobacteria)、产水菌门(Aquificae)、拟杆菌门-绿细菌门(Bacteroidetes-Chlorobi)、衣原体门-疣微菌门(Chlamydiae-Verrucomicrobia)、Chroflexi、Cvanobacteria、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、螺旋菌门(Spirochaetes)和热袍菌门(Thermotogae)。示例性的Cas9蛋白是化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9蛋白。Cas9蛋白及其同系物的其它非限制性实例已在文献中描述。在一些实施方案中，RNA引导的核酸酶是Cpf1核酸酶或Cas9核酸酶。如所指出的，在该系统中，核酸酶在由sgRNA编程的靶区域处产生双链断裂，这导致可引起抑制性突变以破坏PARP基因(例如PARP2基因)的表达的修复。在一些实施方案中，启动子突变可以被引入植物中，例如使用CRISPR/Cas核酸酶系统，以通过突变启动子来破坏PARP基因，例如PARP2基因的表达。

在一方面，本文提供了工程改造的、非天然存在的规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)-CRISPR相关(Cas)(CRISPR-Cas)系统以及向导核酸，例如RNA，以引入抑制PARP基因(例如PARP2基因)的一种或多种改变。在一些实施方案中，CRISPR-Cas系统包括一种或多种载体，所述载体包含：(a)在植物细胞中可操作地与至少一条编码CRISPR-Cas系统向导RNA的核苷酸序列可操作地连接的第一调节元件，所述CRISPR-Cas系统向导RNA与靶序列例如靶PARP2基因序列杂交，和(b)在植物细胞中可操作地与编码II型Cas9或Cpf1蛋白的核苷酸序列可操作地连接的第二调节元件，其中组分(a)和(b)位于系统的相同或不同的载体上，由此向导RNA靶向PARP基因序列并且Cas9蛋白切割DNA分子。

可以在植物中表达将核酸酶引导至靶PARP基因组序列的向导核酸，例如一种或多种sgRNA。可以进行向导RNA序列的选择，例如，如PCT公开号WO2018107028中所描述的。

在一些实施方案中，目的基因中的靶序列可以与sgRNA的向导区互补。在一些实施方案中，sgRNA的向导区与其在目的基因中的相应靶序列之间的互补性或同一性的程度可以是约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，其中更高或100％的同一性是避免脱靶效应最期望的。在一些实施方案中，sgRNA的向导区和目的基因的靶区域可以是100％互补的或相同的。在其它实施方案中，sgRNA的向导区和目的基因的靶区域可以含有至少一个错配。例如，sgRNA的向导区和目的基因的靶序列可含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个错配，其中靶序列的总长度为至少约17、18、19、20或更多个碱基对。在一些实施方案中，sgRNA的向导区和目的基因的靶区域可以含有1-6个错配，其中向导序列包含至少约17、18、19、20个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，sgRNA的向导区和目的基因的靶区域可含有1、2、3、4、5或6个错配，其中向导序列包含约20个核苷酸。5’末端可以包含不被认为是向导区(即，不起引导Cas9或另一核酸酶蛋白至靶核酸(例如，目标基因)的作用)的核苷酸。

如上所述，也可以使用基于CRISPR的核酸酶的替代物。在例如Lloyd等人，Frontiers in Immunology,4(221),1-7(2013)中描述了ZFN、TALE、和TALEN的实例。

在一些实施方案中，DNA靶向分子包含一种或多种以序列特异性方式结合DNA并且与核酸酶融合的锌指蛋白(ZFP)或其结构域。ZFP或其结构域是较大蛋白质内的蛋白质或结构域，其通过一个或多个锌指以序列特异性方式结合DNA，所述锌指是结合结构域内氨基酸序列的区域，其结构通过锌离子的配位而稳定。术语“锌指DNA结合蛋白”通常缩写为锌指蛋白或ZFP。

在ZFP中有靶向特定DNA序列(通常9-18个核苷酸长)的人工ZFP结构域，其由各个指的组装产生。ZFP包括其中单指结构域长度为约30个氨基酸并且含有α螺旋，并且具有两个，三个，四个，五个或六个指的那些，所述α螺旋含有通过锌与单个β转角的两个半胱氨酸配位的两个不变的组氨酸残基。通常，ZFP的序列特异性可以通过在锌指识别螺旋上的四个螺旋位置(-1、2、3和6)进行氨基酸取代来改变。因此，在一些实施方案中，ZFP或含ZFP的分子是非天然存在的，例如被工程改造以结合所选择的靶位点。参见例如Beerli等人(2002)Nature Biotechnol.20:135-141；Pabo等人(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313-340；Isalan等人(2001)Nature Biotechnol.19:656-660；Segal等人(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637；Choo等人(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416；美国专利号6,453,242；6,534,261；6,599,692；6,503,717；6,689,558；7,030,215；6,794,136；7,067,317；7,262,054；7,070,934；7,361,635；7,253,273；以及美国专利公开号2005/0064474；2007/0218528；2005/0267061，所有通过引用以其整体并入本文。

在一些实施方案中，DNA靶向分子是或包含与DNA切割结构域融合以形成靶向核酸酶的锌指DNA结合结构域、TALEN或其它DNA靶向蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白包含来自至少一种IIS型限制性酶的切割结构域(或切割半结构域)以及一种或多种DNA靶向蛋白。在一些实施方案中，切割结构域来自IIS型限制性内切核酸酶FokI。FokI通常在一条链上距其识别位点9个核苷酸处，和在另一条链上距其识别位点13个核苷酸处催化DNA的双链切割。参见，例如，美国专利号5,356,802；5,436,150和5,487,994；以及Li等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4275-4279；Li等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2764-2768；Kim等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:883-887；Kim等人(1994)J.Biol.Chem.269:31,978-31,982。

在一些实施方案中，内切核酸酶选自大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、Argonaute(Argonaute蛋白的非限制性实例包括嗜热栖热菌(Thermus thermophilics)Argonaute(TtAgo)、强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)Argonaute(PfAgo)、格氏嗜盐碱杆菌Argonaute(NgAgo))、RNA引导的核酸酶，例如CRISPR相关核酸酶(CRISPR相关核酸酶的非限制性实例包括Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(还已知为Csnl和Csxl2)、CaslO、Csyl、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、CsxlO、Csxl6、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4、Cpfl、CasX、CasY、Mad7，以上的同系物，或以上的修饰形式)。

核酸酶的引入以及在基于CRISPR的方法或其它需要单独的向导分子的方法的情况下，核酸酶和单独的向导分子的引入可以根据需要以任何方式实现。在一些实施方案中，通过瞬时方法将核酸酶、向导分子或两者引入植物中，所述瞬时方法不会导致将核酸酶或向导核酸的编码序列引入植物基因组中。在一些实施方案中，通过相同的机制引入核酸酶和向导分子。例如，CRISPR核酸酶和sgRNA可以以核糖核蛋白复合物的形式引入植物，或由引入植物的DNA或RNA编码，其中核酸酶和任选的sgRNA由引入的DNA或RNA表达。或者，在一些实施方案中，可以将编码核酸酶的表达盒引入植物基因组中，并且如果使用的核酸酶需要的话，可以瞬时引入单独的向导分子。用于引入核酸酶和向导分子的多种方法描述于例如Cermak,T.等人，The Plant Cell,Vol.29:1196–1217(2017年6月)。

在一些实施方案中，核酸酶和任选的向导分子可以从组成型或基本上普遍存在的启动子表达。例如，启动子或启动子片段可用于指导核酸酶在植物的所有或基本上所有(例如，在许多组织中并且包括芽分生组织)组织中的表达。这种启动子在本文中被称为“组成型”启动子，并且在大多数环境条件和发育状态或细胞分化下是有活性的。组成型启动子的实例包括花椰菜花叶病毒(CaMV)35S转录起始区、来源于根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumafaciens)的T-DNA的1’-启动子或2’-启动子、欧芹UBI启动子(Kawalleck等人,PlantMol Biol.(1993年2月)21(4):673-84)、RPS5(Hiroki Tsutsui等人，Plant and CellPhysiology(2016))；2X35SΩ(Belhaj,Khaoula等人，Plant methods 9.1(2013):39)；AtUBI10(Callis J等人，Genetics 139:921–939(1995))；SlUBI10(Dahan-Meir,Tal等人，The Plant Journal(2018))；G10-90(Ishige,Fumiharu等人，The Plant Journal 18.4(1999):443-448)和来自本领域技术人员已知的各种植物基因的其它转录起始区。

如本文所用，在修饰植物基因组的上下文中的短语“修饰”是指在靶基因组区域诱导基因组序列的结构变化。例如，修饰可以采取从细胞基因组中缺失核苷酸序列的形式。这种修饰可以通过，例如，在靶基因组区域内诱导双链断裂，或者在相对的链上和在靶基因组区域侧翼诱导一对单链缺口来进行。

所得到的DNA断点可以通过细胞的DNA修复机制(例如，通过非同源末端连接)来修复，这将经常在断点处引入一个或多个插入或缺失，从而损害或消除所编码的蛋白质或RNA的活性。在一些实施方案中，可将核酸模板分子引入细胞(在与向导RNA在相同或不同的载体上)，使得核酸模板分子被细胞用作通过同源定向修复(HDR)进行DNA修复的同源模板。如果核酸模板分子是同源的但与细胞染色体DNA相比含有一个或多个核苷酸变化，则修复将引入这些核苷酸变化作为修复的一部分，从而向靶DNA引入特异性的靶向变化。

用于表达核酸酶，向导分子或两者的表达盒可以是引入植物的病毒复制子或非病毒载体的一部分。可以使用具有或不具有病毒复制子的任何载体。示例性的植物病毒复制子载体包括来自例如DNA病毒(如菜豆黄矮病毒、小麦矮化病毒、甘蓝曲叶病毒和马铃薯病毒X(PVX))和RNA病毒(例如烟草脆裂病毒)的部分。参见，例如，Zaidi等人，Front PlantSci.2017；8:539(2017)和Lacomme等人，Curr Protoc Microbiol.2008年2月；Chapter 16:Unit 16I。

将向导分子递送至植物的任何另外的方法都是可以考虑的。例如，代替使用病毒复制子载体，可以直接作为核糖核蛋白(RNP)递送核酸酶和RNA复合物。在另一实施方案中，可以使用粒子枪轰击将向导分子，核酸酶或两者，或编码核酸酶和/或向导分子的核酸直接引入植物。

或者，可以将DNA构建体与合适的T-DNA侧翼区组合，并引入常规的根瘤农杆菌宿主载体。当细胞被细菌感染时，根瘤农杆菌宿主的毒力功能将指导T-DNA转移到植物细胞中。根瘤农杆菌介导的转化技术，包括解毒(disarming)和使用双元载体，在科学文献中有充分的描述。参见例如Horsch等人，Science 233:496-498(1984)和Fraley等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803(1983)。

也可以使用显微注射技术。这些技术在本领域中是公知的，并且在文献中有充分的描述。使用聚乙二醇沉淀引入DNA构建体描述于例如Paszkowski等人EMBO J.3:2717-2722(1984)中。电穿孔技术描述于例如Fromm等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:5824(1985)中。弹道转化技术描述于例如Klein等人Nature 327:70-73(1987)中。在一些实施方案中，使用碳化硅晶须介导的植物转化(参见，例如，Asad和Arshad(2011).SiliconCarbide Whisker-mediated Plant Transformation,Properties and Applications ofSilicon Carbide,Prof.Rosario Gerhardt(编辑),ISBN:978-953-307-201-2)。

可以使用已知的技术筛选包含设计用于破坏或以其他方式抑制PARP基因表达的遗传修饰的植物。在一些实施方案中，可以检测修饰基因的存在。在一些实施方案中，筛选可以基于表型变化来进行，例如，可以选择小尺寸的植物，例如，与对照野生型植物相比尺寸更小的植物；当与对照野生型植物相比时，与可食用生物质相比不可食用生物质的量减少的植物，例如，基于以下标准进行选择：每株植物能够更快地产生可收获的果实；对于番茄，具有0.60-0.84或更高的收获指数；对于番茄，果实产量大于或等于28克；对于番茄，果实的平均重量大于或等于3.79克并且尺寸更一致；对于番茄，产量大于或等于39克；和/或茎高小于或等于6厘米。“对照野生型植物”是指与经修饰的植物相同株系或栽培种但不具有PARP破坏的PARP破坏植物的对应物。

在一些实施方案中，具有破坏或以其他方式抑制PARP基因(例如PARP2基因)的表达的修饰的植物可以小于对照野生植物，例如其具有与对照野生型植物的尺寸相比，尺寸的75％或更小的尺寸，或在一些实施方案中，在相同的时间点测量时，例如在对照植物的最佳生长期期间，与对照野生型植物的尺寸相比，尺寸的70％或更小、或尺寸的65％或更小、或尺寸的60％或更小或尺寸的55％或更小、或尺寸的50％或更小的尺寸。在一些实施方案中，具有破坏或以其他方式抑制PARP基因(例如PARP2基因)的表达的修饰的植物可以具有比对照野生型植物高20％或更高的收获指数。

植物类型

可以靶向任何植物物种以破坏PARP基因。图7提供了各种PARP2直系同源物的登记号的汇总。在一些实施方案中，植物产生果实或蔬菜。在一些实施方案中，植物是番茄、油菜(canola)、甜菜、马铃薯、柑橘、草莓、胡椒、蓝莓、稻、小麦或大麦。

在一些实施方案中，经遗传修饰以破坏PARP基因的植物可具有另外的突变，诸如矮化(d)基因或自然整枝(self-pruning)(sp)基因中的突变。例如，经修饰以破坏PARP基因的植物，例如番茄植物，也可具有已知的d和/或sp基因突变(参见，例如，Kobayashi等人，Plant&Cell Physiology55：445-54，2014)，或其他矮化基因或参与营养生长的基因。在一些实施方案中，植物，例如番茄植物，可以在SIGLK2基因中具有突变(参见，例如，Powell等人，Science 336：1711-1715，2012)。在其它植物中的示例性矮化1基因包括稻(Ashikari等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA96:10284–10289,1999)、大麦(Xu等人，BMC Plant Biology17:2–10,2017)；和油菜(Muangprom和Osborn,Theor Appl Genet 108:1378-1384,2004)。

在一些实施方案中，所述植物是以下属的植物物种：秋葵属(Abelmoschus)、葱属(Allium)、芹菜属(Apium)、苋属(Amaranthus)、花生属(Arachis)、拟南芥属(Arabidopsis)、天门冬属(Asparagus)、颠茄属(Atropa)、燕麦属(Avena)、冬瓜属(Benincasa)、菾属(Beta)、芸薹属(Brassica)、大麻属(Cannabis)、荠属(Capsella)、Cica、菊苣属(Cichorium)、柑橘属(Citrus)、西瓜属(Citrullus)、辣椒属(Capsicum)、红花属(Carthamus)、椰子属(Cocos)、咖啡属(Coffea)、黄瓜属(Cucumis)、南瓜属(Cucurbita)、Cynasa、胡萝卜属(Daucus)、二行芥属(Diplotaxis)、薯蓣属(Dioscorea)、Elais、芝麻菜属(Eruca)、茴香属(Foeniculum)、草莓属(Fragaria)、大豆属(Glycine)、棉属(Gossypium)、向日葵属(Helianthus)、Heterocallis、大麦属(Hordeum)、莨菪属(Hyoscyamus)、甘薯属(Ipomea)、莴苣属(Lactuca)、葫芦属(Lagenaria、独行菜属(Lepidium)、亚麻属(Linum)、黑麦草属(Lolium)、丝瓜属(Luffa)、地杨梅属(Luzula)、番茄属(Lycopersicon)、苹果属(Malus)、木薯属(Manihot)、Majorana、苜蓿属(Medicago)、Momodica、芭蕉属(Musa)、烟草属(Nicotiana)、木犀榄属(Olea)、稻属(Oryza)、黍属(Panicum)、欧防风属(Pastinaca)、Pennisetum)、鳄梨属(Persea)、Petroselinium、菜豆属(Phaseolus)、酸浆属(Physalis)、松属(Pinus)、豌豆属(Pisum)、杨属(Populus)、梨属(Pyrus)、李属(Prunus)、萝卜属(Raphanus)、甘蔗属(Saccharum)、黑麦属(Secale)、千里光属(Senecio)、胡麻属(Sesamum)、白芥属(Sinapis)、茄属(Solanum)、高粱属(Sorghum)、菠菜属(Spinacia)、可可属(Theobroma)、Trichosantes、胡芦巴属(Trigonella)、小麦属(Triticum)、旗竿芥属(Turritis)、Valerianelle、葡萄属(Vitis)、豇豆属(Vigna)或玉米属(Zea)。在一些实施方案中，所述植物选自以下物种：甘蓝型油菜(Brassica napus)、甜瓜(Cucumis melo)、西葫芦(Cucurbita pepo)、胡萝卜(Daucus carota)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、大豆(Glycine max)、向日葵(Helianthus annuus)、亚麻(Linum usitatissimum)、罂粟(Papaver somniferum)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、番茄(Solanum lycopersicum)、菠菜(Spinacia oleracea)或豇豆(Vigna unguiculata)。

实施例

实施例1.CRISPR工程改造的番茄植物的增加的发育速度和收获指数。

本实施例采用CRISPR/Cas9基因编辑来灭活植物生长和胁迫反应中编码聚(腺苷5’-二磷酸(ADP)-核糖)聚合酶(PARP)的关键基因(Akhari,2013)。本实施例说明携带PARP2基因突变的植物，例如番茄植物，可以通过它们的发育周期快速地发展以产生果实。快速的发展可以导致很少的非果实生物质的产生。与对照野生型植物相比，这些植物还可以产生更多的种子并表现出更高的收获指数。该基因受损的植物的表型(例如，图1)可用于在构建的环境中生长的作物，例如SPACE植物。

方法.CRISPR/Cas9系统用于产生携带非功能性PARP2基因的番茄植物。用于遗传修饰的栽培种是Micro-Tom栽培种。种子从Ballseed,Lot#2018230301获得。使用在httpssite crispr.dbcls.jp可获得的CRISPRdirect程序选择PARP基因中的靶向位点。将选择的sgRNA靶序列装配在质粒pKEE401的T-DNA中(Wang等人，Genome Biol.16:144,2015；从Addgene获得，如图8所示；该载体具有pCambia主链并且含有Cas9基因，空的gRNA支架，和用于细菌和植物中卡那霉素抗性选择的nptII基因)，质粒pKEE401含有针对高等植物密码子优化的并由CaMV35S启动子驱动的Cas9内切核酸酶基因，在U6聚合酶启动子控制下的gRNA和赋予卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶(NPTII)选择标记基因(图5B)。构建体组装使用Golden gate方法(Weber等人，2011)来进行。CRISPR/Cas9-gRNA表达盒使用在我们的实验室中常规使用的农杆菌介导的转化方案转化到番茄中(Garcia等人，2015)。

简言之，将刚刚从种皮露出的子叶切开并预培养2天，然后用含有目的CRISPR/Cas9构建体的根瘤农杆菌菌株GV3101接种。共培养2天后，将子叶段转移到补充有100mg/l卡那霉素，250mg/l头孢噻肟和500mg/l羧苄青霉素的选择性再生培养基中。当芽高为0.5cm时，将它们转移到还含有50mg/l卡那霉素的选择性生根培养基中，并且仅将生根的植物转移到温室中(Garcia等人，2015)。

使用标准鲸蜡基-三甲基-溴化铵方案和RNeasy Plant Mini试剂盒(QIAGEN)提取总RNA和基因组DNA。使用设计用于扩增跨越35S启动子的3’末端和Cas9的5’末端的区域的引物对每株植物进行Cas9-sgRNA构建体的存在的基因分型。还使用RT-PCR进行PARP2基因表达分析。扩增子也用PARP2基因中CRISPR/Cas9靶区域侧翼的引物产生。引物序列列于表1中。所有PCR产物在1％(w/v)琼脂糖凝胶上分离。将选择的PCR产物切下并纯化以克隆到pSC-A-amp/kan载体(Strategene)中。使用M13F和M13R引物对每个PCR产物的最少3个克隆进行测序。使用MacVector软件包中的ClustalW进行比对。为了测试种系传递和遗传力，在含有100mg/l卡那霉素的选择性培养基上对来自T1和T2植物的种子进行体外萌发，并提取DNA。通过PCR对每个幼苗进行Cas9的存在和突变的遗传的基因分型。

结果.使用CRISPR-Cas9系统产生携带被破坏的PARP2基因的转基因番茄植物。Cas9-sgRNA基因通过农杆菌介导的转化进行转化。使用末端PCR和RT-PCR分析，在T0初级转化体以及T1和T2代选择的转化体中确定转基因的存在(图5A-B)。对PARP2基因中靶区域的测序表明存在单个或双核苷酸缺失，这将引起翻译移码，从而导致产生截短的非功能性蛋白质。携带突变的植物显著小于野生型，例如比较图1和4。另外，在PARP2基因中具有突变的植物比野生型早10天开花和结果(图11A-B)，并且比野生型植物每个果实产生更多的种子(图12F)。

收获指数是用于描述作物的可食用和不可食用组分之间的生物质相对分布的植物生产力度量(Hay,1995)。如图6A-B所示，与野生型植物相比，PARP突变体将更多的生物质向导果实。对于T2实验，野生型(图6A和11A)的平均收获指数是0.60，而携带PARP2破坏基因的植物的平均收获指数是0.77(图6B和11B)。

PARP2基因被破坏的所有番茄植物品系中，茎高，即初级茎高显著更短(图11C和12A)。与野生型番茄植物(图12B)相比，该性状允许PARP2基因被破坏的番茄植物更好地利用垂直空间(图1、10B-C、11A-C、12A)，同时产生相同或更高的果实产量，当通过利用架子(例如一个架子(图10B-C))和/或充满植物的垂直生长塔的垂直农场生长作物时，这是特别有价值的。通过在体外生长的PARP2基因被破坏的外植体证明了有效的垂直和水平空间利用的极端实例(图2和14)。此外，与野生型番茄植物相比，PARP2基因被破坏的所有番茄植物品系在尺寸上具有显著更一致的番茄并且其更快地成熟，即，番茄重量的标准偏差更小并且平均番茄重量相同(图12D-E，13)。相比不可食用生物质，PARP突变体似乎能够将更多的资源引导至可食用生物质，从而允许它们的果实更快的生长和成熟，以及它们的果实的尺寸更均匀。这些性状是重要的，因为番茄种植者习惯于使他们的第一次收获是他们最有消费者销路的收获，因为随后的收获会产生较小的果实，其通常必须作为其它收入较低的生产产品(例如动物饲料，调味汁等)的一部分销售。

参照图15，在野生型番茄植物和具有SPACE性状的番茄植物之间的味道特征方面没有统计学上显著的差异。

参照图16,Southern印迹分析揭示，含有具有基因(例如nptII基因)的标记和用于在转化期间生成表现出SPACE性状(例如通过编辑基因的CRISPR/Cas9系统)的植物的CRISPR/Cas9系统的T-DNA插入，可以例如通过T3和T4代分离出来。

参照表1，营养分析表明，在不同生长背景下，野生型番茄植物和具有SPACE性状的番茄植物之间的营养特性没有显著性差异。

本文引用的所有参考文献，包括出版物，登记号，专利申请和专利，在此通过引用并入，其目的在于与单独和具体地指出每篇参考文献通过引用并入相同的程度被引用。

说明性序列

番茄(S.lycopersicum)PARP2(Solyc08g074730)编码序列(用于向导RNA的序列加下划线)

ATGGCCACCATTACCAATTTTAATGTCGATGAATTTGACTCAATGAATGTTGTGGAGGAGTATAAGAAGATAAGTGTTAATGATCCGGTGAACTTTTATACTTGGTCGAAGAAAAAATTTGTTGACAGGCTTTGTGCTGTTGCTAATTTACAGATTGACGATCATCTACCAGTTGGAGATGAAGGCAAGACAGAGAAATTGGTCACAGCAACAAAGAAGGGTGCAGCTGTTTTGGATCAATATCTGTCAGATGAAATCAAGGCATTATACCATGTCCTGCATCAAGGAAATGATATTTATGAGGCCACATTGAACCAAACAAATGTTGAGAACAACGATAACGAATTTTATATCATTCAAGTTCTAGAGAATGATTGTGGTGGGAATTTCCTTCTTTACACTAGATGGGGTAGAGTTGGTGAAAAGGGAGAAA

pHEE401E PARP2(具有一个加下划线的sg RNA)

CGACTTGCCTTCCGCACAATACATCATTTCTTCTTAGCTTTTTTTCTTCTTCTTCGTTCATACAGTTTTTTTTTGTTTATCAGCTTACATTTTCTTGAACCGTAGCTTTCGTTTTCTTCTTTTTAACTTTCCATTCGGAGTTTTTGTATCTTGTTTCATAGTTTGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGCATCGAACCTTCAAGAATTTGATTGAATAAAACATCTTCATTCTTAAGATATGAAGATAATCTTCAAAAGGCCCCTGGGAATCTGAAAGAAGAGAAGCAGGCCCATTTATATGGGAAAGAACAATAGTATTTCTTATATAGGCCCATTTAAGTTGAAAACAATCTTCAAAAGTCCCACATCGCTTAGATAAGAAAACGAAGCTGAGTTTATATACAGCTAGAGTCGAAGTAGTGATTG