一种肠溶型纳豆激酶微囊及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种肠溶型纳豆激酶微囊及其制备方法和应用。

背景技术

纳豆激酶(Nattokinase，NK)来源于纳豆，是一种丝氨酸蛋白酶。纳豆激酶作为一种微生物酶，对于血栓、高血压、高血脂及动脉粥样硬化等心脑血管疾病的预防及治疗具有良好的功效，常用其口服给药的制剂形式。

但纳豆激酶口服给药过程中容易在胃部受到化学氧化、胃酸破坏等影响，发生降解或直接变性失活，较难通过胃部后透过肠道达到吸收的目的，应用局限性较大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肠溶型纳豆激酶微囊及其制备方法和应用，本发明提供的肠溶型纳豆激酶微囊有效避免了纳豆激酶受到胃酸破坏，将其传递至肠部充分释放发挥作用，显著提高了纳豆激酶口服生物利用度。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种肠溶型纳豆激酶微囊，包括肠溶材料包衣和包裹于所述肠溶材料包衣中的若干载药微球；所述载药微球包括多孔细菌纤维素微球以及负载于所述多孔细菌纤维素微球孔道中的纳豆激酶。

优选的，所述多孔细菌纤维素微球的粒径为100～250μm。

优选的，所述多孔细菌纤维素微球的制备方法包括以下步骤：

将细菌纤维素水相溶液和有机相溶液混合乳化，得到油包水型细菌纤维素乳液；所述细菌纤维素水相溶液包括细菌纤维素、致孔剂和水相溶剂；所述有机相溶液包括乳化剂和有机溶剂，所述有机溶剂为与水不互溶或难互溶的有机溶剂；

将所述油包水型细菌纤维素乳液和沉淀溶剂混合，固液分离得到细菌纤维素微球；

将所述细菌纤维素微球和洗脱剂混合，洗去致孔剂，固液分离得到所述多孔细菌纤维素微球。

优选的，所述细菌纤维素水相溶液中细菌纤维素的质量百分含量为0.1～10％；

所述致孔剂为碳酸盐，所述致孔剂与所述细菌纤维素的质量比为(0.05～5):(0.1～10)。

优选的，所述乳化剂包括司盘-80、聚乙二醇和司盘-60中的一种或多种；所述有机溶剂包括正己烷、正十六烷和氯仿中的一种或多种，所述有机相溶液中乳化剂的质量百分含量为0.1～5％。

优选的，所述细菌纤维素水相溶液和有机相溶液的体积比为1:(2～30)。

优选的，所述沉淀溶剂包括乙醇和/或丙酮；所述油包水型细菌纤维素乳液和沉淀溶剂的体积比为(1～20):(1～20)；

所述洗脱剂为酸性水溶液；所述细菌纤维素微球和洗脱剂的固液比为1:(0.5～40)。

本发明提供了上述技术方案所述的肠溶型纳豆激酶微囊的制备方法，包括以下步骤：

将多孔细菌纤维素微球、纳豆激酶和溶剂混合，固液分离得到载药微球；

将所述载药微球分散于肠溶包衣材料溶液中，得到载药微球悬浮液；

将所述载药微球悬浮液和肠溶包衣材料的不良溶剂混合，固液分离得到所述肠溶型纳豆激酶微囊。

优选的，所述肠溶包衣材料溶液中的肠溶包衣材料包括虫胶、苯二甲酸醋酸纤维素、海藻胶、聚乙烯醇醋酸苯二甲酸酯、丙烯树脂、羟丙基甲基纤维素酞酸酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸和丙烯酸丁酯中的一种或多种；所述肠溶包衣材料溶液的质量浓度为4～100mg/mL。

优选的，所述载药微球的质量与所述肠溶包衣材料溶液的体积之比优选为1g:(1～50)mL；所述载药微球悬浮液和肠溶包衣材料的不良溶剂的体积比为(1～10):(1～40)。

本发明提供了一种肠溶型纳豆激酶微囊，包括肠溶材料包衣和包裹于所述肠溶材料包衣中的若干载药微球；所述载药微球包括多孔细菌纤维素微球以及负载于所述多孔细菌纤维素微球孔道中的纳豆激酶。本发明以多孔细菌纤维素微球作为纳豆激酶的载体，利用所述多孔细菌纤维素微球中的细菌纤维素表面具有负电性，对呈带正电性的纳豆激酶(中性条件下)进行高效吸附形成了载药微球，实现了对纳豆激酶的有效负载，且负载量高；然后通过最外层的肠溶材料包衣进一步对负载有纳豆激酶的载药微球进行包裹，有效避免了纳豆激酶受到胃酸破坏，能够将纳豆激酶传递至肠部后再充分释放发挥作用，显著提高了纳豆激酶口服生物利用度。同时本发明中细菌纤维素具有良好的可降解性、生物相容性，作为口服制剂的载体材料具有很好的生物安全性。

本发明提供了上本发明提供了上述技术方案所述的肠溶型纳豆激酶微囊的制备方法，包括以下步骤：将多孔细菌纤维素微球、纳豆激酶和溶剂混合，固液分离得到载药微球；将所述载药微球分散于肠溶包衣材料溶液中，得到载药微球悬浮液；将所述载药微球悬浮液和肠溶包衣材料的不良溶剂混合，固液分离得到所述肠溶型纳豆激酶微囊。本发明提供的制备方法具有操作简单，制备周期短，成本低，易于扩大，易于产业化的优点。

附图说明

图1为本发明实施例使用的纳豆激酶原粉的扫描电镜图；

图2为本发明实施例1制备的多孔细菌纤维素微球的扫描电镜图；

图3为本发明实施例1制备的肠溶型纳豆激酶微囊扫描电镜图；

图4为本发明实施例1纳豆激酶原粉和肠溶型纳豆激酶微囊在胃肠液中释放率；

图5为本发明实施例1纳豆激酶原粉和肠溶型纳豆激酶微囊在胃肠液中酶活性。

具体实施方式

本发明提供了一种肠溶型纳豆激酶微囊，包括肠溶材料包衣和包裹于所述肠溶材料包衣中的若干载药微球；所述载药微球包括多孔细菌纤维素微球以及负载于所述多孔细菌纤维素微球孔道中的纳豆激酶。

在本发明中，若无特殊说明，所有制备原料/组分均为本领域技术人员熟知的市售产品。

本发明提供的肠溶型纳豆激酶微囊包括肠溶材料包衣。

在本发明中，所述肠溶材料包衣的肠溶材料包括虫胶、苯二甲酸醋酸纤维素、海藻胶、聚乙烯醇醋酸苯二甲酸酯、丙烯树脂、羟丙基甲基纤维素酞酸酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸和丙烯酸丁酯中的一种或多种。

本发明提供的肠溶型纳豆激酶微囊包括包裹于所述肠溶材料包衣中的若干载药微球。

在本发明中，所述载药微球包括多孔细菌纤维素微球以及负载于所述多孔细菌纤维素微球孔道中的纳豆激酶。

在本发明中，所述多孔细菌纤维素微球的粒径优选为100～250μm，更优选为110～230μm。

在本发明中，所述多孔细菌纤维素微球的制备方法优选包括以下步骤：

将细菌纤维素水相溶液和有机相溶液混合乳化，得到油包水型细菌纤维素乳液；所述细菌纤维素水相溶液包括细菌纤维素、致孔剂和水相溶剂；所述有机相溶液包括乳化剂和有机溶剂，所述有机溶剂为与水不互溶或难互溶的有机溶剂；

将所述油包水型细菌纤维素乳液和沉淀溶剂混合，固液分离得到细菌纤维素微球；

将所述细菌纤维素微球和洗脱剂混合，洗去致孔剂，固液分离得到所述多孔细菌纤维素微球。

本发明将细菌纤维素水相溶液和有机相溶液混合乳化，得到油包水型细菌纤维素乳液；所述细菌纤维素水相溶液包括细菌纤维素、致孔剂和水相溶剂；所述有机相溶液包括乳化剂和有机溶剂，所述有机溶剂为与水不互溶或难互溶的有机溶剂。

在本发明的具体实施例中，所述致孔剂优选为碳酸盐，具体优选为碳酸钠，更优选为无水碳酸钠。

本发明优选采用无水碳酸钠作致孔剂，与高分子聚合物致孔剂相比，具有毒性小、易去除且成本低廉的优势。

在本发明中，所述水相溶剂具体优选为能够溶解所述细菌纤维素的离子液体。

在本发明中，所述能够溶解所述细菌纤维素的离子液体包括1-烯丙基-3-甲基氯化咪唑、1,3-二甲基-2-咪唑啉酮或四丁基氯化铵。

在本发明中，所述细菌纤维素水相溶液中细菌纤维素的质量百分含量优选为0.1～10％，更优选为0.2～8％。

在本发明中，所述致孔剂与所述细菌纤维素的质量比优选为(0.05～5):(0.1～10)，更优选为(0.1～4.5):(0.2～8)。

在本发明中，所述乳化剂优选为油包水型(W/O型，即亲油型)乳化剂。

在本发明中，所述乳化剂优选包括司盘-80、聚乙二醇和司盘-60中的一种或多种；所述聚乙二醇具体优选为聚乙二醇-4000。

在本发明中，所述有机溶剂优选包括正己烷、正十六烷和氯仿中的一种或多种。

在本发明中，所述有机相溶液中乳化剂的质量百分含量优选为0.1～5％，更优选为0.2～4.5％。

在本发明中所述细菌纤维素水相溶液和有机相溶液的体积比优选为1:(2～30)，更优选为1:(2.5～25)。

在本发明中，所述混合乳化优选为：在搅拌的条件下，将所述细菌纤维素水相溶液滴加至所述有机相溶液中混合乳化。在本发明中，所述搅拌的转速优选为9000r/min。

得到油包水型细菌纤维素乳液后，本发明将所述油包水型细菌纤维素乳液和沉淀溶剂混合，固液分离(以下称为第一固液分离)得到细菌纤维素微球。

在本发明中，所述沉淀溶剂优选为溶于水，但不溶解纤维素的有机溶剂。

在本发明中，所述沉淀溶剂优选包括乙醇和/或丙酮，更优选为乙醇或丙酮。

在本发明中，所述油包水型细菌纤维素乳液和沉淀溶剂的体积比优选为(1～20):(1～20)，更优选为(1.5～18):(1.5～18)。

本发明对所述第一固液分离的具体实施方式没有特殊要求。

得到细菌纤维素微球后，本发明将所述细菌纤维素微球和洗脱剂混合，洗去致孔剂，固液分离(以下称为第二固液分离)得到所述多孔细菌纤维素微球。

在本发明中，所述洗脱剂优选为酸性水溶液。在本发明中，所述酸性水溶液的质量百分含量优选为15～25％。

在本发明中，所述洗脱剂优选包括盐酸溶液、醋酸溶液、磷酸溶液、硫酸溶液或硝酸溶液，更优选包括盐酸溶液、醋酸溶液或硫酸溶液。在本发明中，所述盐酸溶液的质量百分含量优选为25％；所述醋酸溶液的质量百分含量优选为20％；所述硫酸溶液的质量百分含量优选为15％。

在本发明中，所述细菌纤维素微球和洗脱剂的固液比优选为1:(0.5～40)，更优选为1:(1～35)。

本发明对所述第二固液分离的具体实施方式没有特殊要求。

在本发明中，所述纳豆激酶由纳豆芽孢杆菌发酵产生的是一种具有强烈溶栓功能的碱性丝氨酸蛋白酶，其固体呈淡黄色，能溶于水。

在本发明中，所述肠溶型纳豆激酶微囊中，所述纳豆激酶的质量百分含量优选为3.21～7.61％。

本发明提供了上述技术方案所述的肠溶型纳豆激酶微囊的制备方法，包括以下步骤：

将多孔细菌纤维素微球、纳豆激酶和溶剂混合，固液分离得到载药微球；

将所述载药微球分散于肠溶包衣材料溶液中，得到载药微球悬浮液；

将所述载药微球悬浮液和肠溶包衣材料的不良溶剂混合，固液分离得到所述肠溶型纳豆激酶微囊。

本发明将多孔细菌纤维素微球、纳豆激酶和溶剂混合，固液分离(以下称为第三固液分离)得到载药微球。

在本发明中，所述纳豆激酶具体优选为纳豆激酶原粉。所述纳豆激酶原粉微观形貌呈现表面皱缩的球形颗粒，结构紧密，尺寸分布优选在50～100μm。

在本发明中，所述溶剂为能够溶解所述纳豆激酶的溶剂。在本发明中的具体实施例中，所述溶剂优选为水。

在本发明中，所述多孔细菌纤维素微球、纳豆激酶和溶剂混合优选包括以下步骤：将所述纳豆激酶溶解于溶剂中，得到纳豆激酶溶液；将所述多孔细菌纤维素微球和纳豆激酶溶液混合。在本发明中，所述纳豆激酶溶液的质量百分含量优选为50％。

本发明对所述第三固液分离的具体实施过程没有特殊要求。

得到载药微球后，本发明将所述载药微球分散于肠溶包衣材料溶液中，得到载药微球悬浮液。

在本发明中，所述肠溶包衣材料溶液中的肠溶包衣材料优选包括虫胶、苯二甲酸醋酸纤维素、海藻胶、聚乙烯醇醋酸苯二甲酸酯、丙烯树脂、羟丙基甲基纤维素酞酸酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸和丙烯酸丁酯中的一种或多种。

在本发明中，所述肠溶包衣材料溶液中的溶剂优选为能够溶解所述肠溶包衣材料的溶剂。在本发明中，所述能够溶解所述肠溶包衣材料的溶剂包括丙酮、乙醇、二氯甲烷和乙醚中的一种或多种。

在本发明中，所述肠溶包衣材料溶液的质量浓度优选为4～100mg/mL，更优选为5～80mg/mL。

在本发明中，所述载药微球的质量与所述肠溶包衣材料溶液的体积之比优选为1g:(1～50)mL，更优选为1g:(5～45)mL。

本发明对所述载药微球分散于肠溶包衣材料溶液的配比没有特殊要求，确保所述肠溶包衣材料溶液浸渍所述载药微球即可。

得到载药微球悬浮液后，本发明将所述载药微球悬浮液和肠溶包衣材料的不良溶剂混合，固液分离(以下称为第四固液分离)得到所述肠溶型纳豆激酶微囊。

在本发明中，所述肠溶包衣材料的不良溶剂为对肠溶材料溶解性差的溶剂。

在本发明中，所述肠溶包衣材料的不良溶剂优选为含有表面活性剂的水溶液；在本发明中，所述含有表面活性剂的水溶液中的表面活性剂优选包括聚乙烯醇(PVA)、硬脂酸、十二烷基苯磺酸钠、卵磷脂、甜菜碱和聚山梨酯中的一种或多种。在本发明中，所述含有表面活性剂的水溶液的质量百分含量优选为0.1～5％。

在本发明中，所述载药微球悬浮液和肠溶包衣材料的不良溶剂的体积比优选为(1～10):(1～40)，更优选为(2～8):(3～38)。

在本发明中，所述载药微球悬浮液和肠溶包衣材料的不良溶剂混合时，本发明优选将所述载药微球悬浮液滴加至所述肠溶包衣材料的不良溶剂中。

在本发明中，所述第四固液分离的具体实施方式优选包括离心分离法、过滤法、重力沉降法或倾析法。本发明对所述离心分离法、过滤法、重力沉降法或倾析法的具体实施方式没有特殊要求。

在本发明中，所述第四固液分离得到固体产物，本发明优选对所述固体产物进行干燥，得到所述肠溶型纳豆激酶微囊。

本发明涉及一种肠溶型纳豆激酶微囊的制备方法。与以往纳豆激酶微囊不同，本发明提供了一种以绿色原料细菌纤维素为基体，通过模板法结合酸碱反向悬浮再生法制备多孔细菌纤维素微球，并以多孔细菌纤维素微球为载体对纳豆激酶进行吸附，再经过肠溶材料进行包衣处理，制备为肠溶型纳豆激酶微囊。本发明得到的微囊有效避免了纳豆激酶受到胃酸破坏，将其传递至肠部充分释放发挥作用，显著提高了纳豆激酶口服生物利用度。此外，本发明中使用的工艺具有操作简单，制备周期短，成本低，易于扩大，易于产业化的优点。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

配制5mL质量浓度为0.5％的细菌纤维素离子液体溶液，向其中加入200mg无水碳酸钠微粒，将细菌纤维素溶液在高速搅拌的条件下逐滴加入50mL溶有司盘-80的正己烷(司盘-80的质量百分含量为0.1％)中，形成55mL的油包水型细菌纤维素乳液，再向乳液中加入5mL乙醇，制备细菌纤维素微球；分离得到细菌纤维素微球，向1g细菌纤维素微球中加入5mL，25wt％盐酸溶液，洗去无水碳酸钠，获得多孔细菌纤维素微球；

将多孔细菌纤维素微球置于8mL纳豆激酶水溶液(质量百分含量为50％)中，充分吸附纳豆激酶溶液，制备纳豆激酶微球；再将纳豆激酶微球置于10mL肠溶包衣材料溶液(肠溶包衣材料为海藻胶，质量浓度为4mg/mL)中分散，其中，纳豆激酶微球的质量和肠溶包衣材料溶液的体积之比为1g:50mL；将表面吸附有肠溶材料溶液层的纳豆激酶微球悬浮液，滴加至20mL不良溶剂(其中不良溶剂为PVA水溶液，PVA水溶液的质量百分含量为0.1％)中，使肠溶材料在纳豆激酶微球表面形成包衣层，分离、干燥，获得肠溶型纳豆激酶微囊。

实施例2

配制5mL质量浓度为1.5％的细菌纤维素离子液体溶液，向其中加入500mg无水碳酸钠微粒，将细菌纤维素溶液在高速搅拌的条件下逐滴加入25mL溶有聚乙二醇-4000的正十六烷(聚乙二醇-4000的质量百分含量为0.1％)中，形成30mL油包水型细菌纤维素乳液，再向乳液中加入6mL丙酮，制备细菌纤维素微球；分离得到细菌纤维素微球，向1g细菌纤维素微球中加入3mL，15wt％硫酸溶液，洗去无水碳酸钠，获得多孔细菌纤维素微球；

将多孔细菌纤维素微球置于5mL纳豆激酶水溶液(质量百分含量为50％)中，充分吸附纳豆激酶溶液，制备纳豆激酶微球，再将纳豆激酶微球置于5mL肠溶包衣材料溶液(肠溶包衣材料为海藻胶，质量浓度为4mg/mL)中分散，其中，纳豆激酶微球的质量和肠溶包衣材料溶液的体积之比为1g:50mL；将表面吸附有肠溶材料溶液层的纳豆激酶微球，滴加至15mL不良溶剂(其中不良溶剂为PVA水溶液，PVA水溶液的质量百分含量为5％)中，使肠溶材料在纳豆激酶微球表面形成包衣层，分离、干燥，获得肠溶型纳豆激酶微囊。

实施例3

配制20mL质量浓度为2.5％的细菌纤维素离子液体溶液，向其中加入2g无水碳酸钠微粒，将细菌纤维素溶液在高速搅拌的条件下逐滴加入80mL溶有司盘-60的氯仿(司盘-60的质量百分含量为0.1％)中，形成100mL的油包水型细菌纤维素乳液，再向乳液中加入10mL丙酮，制备细菌纤维素微球；分离得到细菌纤维素微球，向1g细菌纤维素微球中加入20mL，20％醋酸溶液，洗去无水碳酸钠，获得多孔细菌纤维素微球；

将多孔细菌纤维素微球置于15mL纳豆激酶水溶液(质量百分含量为50％)中，充分吸附纳豆激酶溶液，制备纳豆激酶微球，再将纳豆激酶微球置于30mL肠溶包衣材料溶液(肠溶包衣材料为海藻胶，质量浓度为4mg/mL)中分散，其中，纳豆激酶微球的质量和肠溶包衣材料溶液的体积之比为1g:50mL；将表面吸附有肠溶材料溶液层的纳豆激酶微球，滴加至90mL不良溶剂(其中不良溶剂为PVA水溶液，PVA水溶液的质量百分含量为3％)中，使肠溶材料在纳豆激酶微球表面形成包衣层，分离、干燥，获得肠溶型纳豆激酶微囊。

测试例1

对实施例1中纳豆激酶原粉、多孔细菌纤维素微球和肠溶型纳豆激酶微囊进行形貌观察，具体如下：

图1为纳豆激酶原粉的SEM图。纳豆激酶由纳豆芽孢杆菌发酵产生的是一种具有强烈溶栓功能的碱性丝氨酸蛋白酶，其固体呈淡黄色，能溶于水。由图1可以看出，纳豆激酶原粉微观形貌呈现表面皱缩的球形颗粒，结构紧密，尺寸分布在50～100μm。

图2为多孔细菌纤维素微球扫描电镜图，由图2可知，采用模板法结合酸碱反向悬浮再生法制备多孔细菌纤维素微球呈多孔球形颗粒，粒径分布在100～250μm，表面光滑但有许多微小的孔洞，大量孔洞的存在为纳豆激酶的负载提供了充足的空间。

图3肠溶型纳豆激酶微囊扫描电镜图，由图3可知，经肠溶材料包衣处理后，数个负载了纳豆激酶的细菌纤维素微球团聚在一起，形成尺寸为毫米级别的肠溶型纳豆激酶微囊表面光滑的颗粒。

测试例2

对实施例1制备的肠溶型纳豆激酶微囊进行体外释放率和酶活性测定，具体如下：

1、释放率测定，具体步骤如下：

人工胃液组：准确量取3.84mL的浓盐酸，5mL的吐温-80，100mg的α-淀粉酶和糖化酶加入至500mL去离子水中，再加入去离子水定容至1000mL，用1moL/L的稀盐酸调节酸碱度至pH＝1.5配制成人工胃液，备用。准准确称取20mg的纳豆激酶原粉和含有20mg纳豆激酶的肠溶型纳豆激酶微囊溶于50mL人工胃液中，置于37℃摇床中孵育2h，于5000r/min离心15min，收集沉淀，并采用BCA试剂盒测定沉淀中纳豆激酶的含量，计算得未释放的纳豆激酶，m

人工肠液组：准确称取6.8g的磷酸二氢钾，100mg的α-淀粉酶和糖化酶加入500mL的去离子水中，加入5mL吐温-80，加去离子水稀释定容至1000mL，用1moL/L的氢氧化钠调节酸碱度至pH＝7.4配制成人工肠液，备用。准确称取20mg的纳豆激酶原粉和含有20mg纳豆激酶的肠溶型纳豆激酶微囊溶于50mL人工肠液中，置于37℃摇床中孵育2h，于5000r/min离心15min，收集沉淀，并采用BCA试剂盒测定沉淀中纳豆激酶的含量，计算得未释放的纳豆激酶，m

图4为纳豆激酶原粉和肠溶型纳豆激酶微囊在胃肠液中释放率测定结果，由图4可知，由于纳豆激酶水溶性很好，其原粉在人工胃液中(2h，pH2.0)释放率达到98.28％，在肠液中(2h，pH7.0)释放率达到99.75％。肠溶型纳豆激酶微囊在人工胃液中(2h，pH2.0)的累积释放率为4.79±2.89，在人工肠液中(2h，pH7.0)累计释放率可达到74.15±2.21。说明经过微囊化的纳豆激酶在胃液中保护效果良好，可以有效避免胃液对纳豆激酶活性的破坏，同时在肠道阶段又具有良好的溶出效果，可以保证纳豆激酶得到充分的释放。

2、酶活性测定，具体步骤：

酶活性标准曲线的绘制：将标准酶活为2500IU/mL的尿激酶进行梯度稀释，得到酶活分别为2500、1250、625、312.5、156.25、78.13、39.06IU/mL的尿激酶溶液；用37℃磷酸盐缓冲液(pH7.4)配制质量浓度0.5％的牛纤维蛋白原溶液，并至于37℃水浴锅中保温备用；接着用磷酸盐缓冲液(pH7.4)配制质量浓度3％的琼脂糖溶液，置于微波炉中加热至沸腾，取出后置于40℃水浴锅中冷却至40℃后，然后将两种溶液等体积混合快速混合均匀，并至于40℃水浴锅中保温，最后用5mL移液枪注入一次性平皿中，每平皿注入15mL并防止产生气泡，水平放置冷却至室温；将冷却凝固后的平板进行打孔，每个平皿5个孔，带孔平板制备好之后倒置于4℃的冰箱冷却30min后取出，用移液枪将孔中渗出的液体吸掉；接着向每个孔中加入10μL一系列酶活梯度的尿激酶溶液，水平放置于27℃恒温培养箱中，16h后取出，用游标卡尺测定溶解圈的直径D(mm)，每个溶解圈测定三次取平均值，计算得到溶解圈面积s(mm

胃液中酶活性测定：将微胶囊加入至人工胃液，在37℃条件下于摇床中180r/min振荡2h后测定酶活性。

肠液中酶活性测定：经模拟胃液处理后的微胶囊加入至人工肠液,在37℃条件下于摇床中180r/min振荡4h后测定酶活性。

图5纳豆激酶原粉和肠溶型纳豆激酶微囊在胃肠液中酶活性测定结果。由图5可知，纳豆激酶原粉的活性为5870.49±465.49IU/mL，经过人工胃液处理后(2h，pH2.0)，纳豆激酶原粉基本完全失活，肠溶型纳豆激酶活性为5517.26±231.25IU/mL，胃液处理后的微胶囊再加入至人工肠液(4h，pH2.0)，纳豆激酶原粉基本完全失活，肠溶型纳豆激酶活性为42182.12±71.22IU/mL。结果证明，经过微囊化处理可以很好的增强纳豆激酶在口服过程中的稳定性，保护酶活性。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。