富集扩培PHA混合菌群的方法、装置与应用

技术领域

本发明涉及微生物培养及PHA生产技术领域，具体地说，涉及富集扩培PHA混合菌群的方法、装置与应用。

背景技术

聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，PHA)是由很多细菌合成的一种胞内聚合物，作为一种微生物合成的高分子材料，具有传统化学合成塑料的物理特性和生物可降解性，PHA可以作为传统石油基塑料的替代品被人们广泛关注。但是PHA的工业生产主要通过纯细菌培养或基因工程菌进行生产，需要严格的无菌条件和使用特定的碳源，因此运营成本较高。

为了降低目前PHA的生产成本，目前开发了混合微生物培养技术，作为纯培养的替代品。然而，与纯菌生产工艺的PHA生物量(60～200g/L)相比，混合菌群的生物量大部分仅为1.2～8g/L，导致PHA生产工艺整体产率低，大大限制了PHA的规模化生产。同时，单独的混合菌群扩大培养会导致PHA菌群微生物群落结构显著变化，导致菌群的PHA合成能力大幅降低。

因此，有必要开发一种具有扩大培养PHA混合菌群和保持菌群长期稳定的反应器和操作方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生物量高、相对丰度可基本不变的PHA混合菌群的培养方法、装置及其应用。

为了实现该目的，本发明的技术方案如下：

一种富集扩培PHA混合菌群的方法，以厌氧发酵产酸液作为底物进行PHA混合菌群的富集扩陪，其在PHA混合菌群富集扩大培养装置中加入负载材料，并通过丰盛饥饿培养模式进行所述PHA混合菌群的富集扩陪；所述丰盛饥饿培养模式为将微生物群落优势菌属均为PHA合成菌的混合菌群先在丰盛培养期进行培养，再在饥饿期进行培养；

所述丰盛培养期分为三个阶段，每个阶段的培养时间相同，在所述丰盛培养期开始后的第一阶段和结束前的第三阶段，通过动态流加的方式对所述底物中的碳元素进行控制，在位于所述第一阶段和第三阶段之间的第二阶段，通过动态流加的方式对所述底物中的氮元素进行控制。

本发明以微生物群落优势菌属均为PHA合成菌的混合菌群作为菌源，通过在PHA混合菌群富集扩大培养装置(序批式生物膜反应器)中加入负载材料，用以在培养时使菌群动态负载并附膜生长，配合动态分批补料耦合丰盛饥饿的培养模式保持了PHA菌群的群落结构长期相对稳定的同时(在扩大培养过程中的相对丰度保持不变)，显著提高了反应器中PHA混合菌群的生物量。解决了传统“三段式”中富集工艺的菌群生物量低，导致PHA批次产量低的生产问题，以及连续流扩培工艺中PHA菌群不稳定，积累能力显著下降的问题。若将本发明提出的富集扩培方法替换传统的“三段式”富集方法中的菌群富集环节，能显著提高整体工艺的PHA体积转化率和PHA批次产率，相较于传统的“三段式”生产工艺能提高约2～3倍，实现城市有机废物生产PHA工艺的规模化和产业化。

本发明方法中，扩大培养阶段在营养物质丰盛时(丰盛培养期)微生物在负载材料上容易合成EPS并形成紧密生物膜，此时PHA混合菌群能快速附膜生长繁殖，同时合成大量PHA。在营养物质匮乏时(饥饿期)生物膜内侧微生物死亡，在曝气条件下容易脱落，此时PHA菌群消耗内源合成的PHA进行繁殖形成小絮体颗粒，而非PHA菌群大量死亡。因此，能长时间保持选择压筛选PHA混合菌群，保持PHA优势合成菌属的相对丰度基本不变。生物量不断升高的PHA菌群结合动态变化的进料负荷既能保证生长繁殖所需的营养物质，也能在丰盛期-饥饿期交替下筛选PHA混合菌群。

本发明的方法中，在开始富集扩陪前，所述混合菌群的生物量为100-1000毫克/升，优选为140-160毫克/升(本领域技术人员可按照扩培所需生物量和扩培时间进行常规调整)；

所述第一阶段和第三阶段中，通过动态流加所述厌氧发酵产酸液来对所述底物中的碳元素进行控制，使所述底物的负荷以0.3-1.2升/分钟(优选0.7-0.9升/分钟)的速率逐渐提升至3～10mg COD/mg VSS·d(优选5～6mg COD/mg VSS·d)；

和/或，所述第二阶段中，通过动态流加补充液的方式对所述底物中的氮元素进行控制，使所述底物中氮源的浓度保持在600～1000毫克/升(优选600～800毫克/升)。

以本发明的具体动态补料控制方式，可有利于PHA混合菌群的富集与扩陪。

优选，在第二阶段控制氮源的同时进行常规维生素的补充，所需种类和用量本领域可根据具体生物量进行常规选择，以保证PHA混合菌群具有充足的维生素为宜(避免因维生素缺乏而影响PHA混合菌群的生长发育)。

本发明的方法中，所述丰盛培养期和所述饥饿期的培养条件为：pH为5-8(优选pH为7±0.5)，室温(20-30℃，优选25±1℃)培养，通过曝气和搅拌维持溶氧为7～8毫克/升；所述饥饿期不进行营养物质的补加；

和/或，所述丰盛培养期和所述饥饿期的时间相同，均为4-10小时，优选5.8-6.2小时，更优选为6小时。

本发明经研究发现，丰盛培养期和饥饿期的时间相同时，可有利于PHA富集和扩陪效率的实现。

在丰盛培养期为6小时时，第一至第三阶段均为2小时。

本发明的方法中，在所述饥饿期结束后，进行排补料操作；所述排补料操作包括：停止曝气和搅拌，待所述PHA混合菌群富集扩大培养装置中的菌群沉淀后，排出所述PHA混合菌群富集扩大培养装置中的上清液体积的7/10至3/4(优选3/4)，之后进行补料，使底物环境恢复到开始所述丰盛培养期之前。

本发明在排补料操作环节，排走反应器中不易利用的碳源物质(非挥发性脂肪酸物质)和饥饿期筛选掉的非PHA合成细菌，并补充底物养分(补充厌氧发酵产酸液和水，恢复至反应器原体积)，为进行下一次丰盛培养期、饥饿期和排补料操作的循环打下基础。

本发明的方法中，重复进行所述丰盛培养期、所述饥饿期和所述排补料操作，待沉淀的所述菌群的生物量和相对丰度基本不变时，在所述饥饿期之后增加排泥的步骤，优选，排出2/25至3/25体积的菌泥，SRT保持在5-10天，优选4.8-5.2天，更优选，排出1/10体积的菌泥，SRT保持在5天。

本发明的方法中，待沉淀的所述菌群的生物量和相对丰度基本不变时，可持续重复进行所述丰盛培养期、所述饥饿期和所述排补料操作，并于每一次饥饿期结束后进行排泥，用以后续PHA合成段批次生产。

本发明的方法中，所述负载材料具有多个空隙，所述空隙的大小为1～2微米，所述负载材料的空隙率为0.1～0.2cm

本发明的负载材料可提高富集扩培过程中微生物沉降性能和筛选效率。在一个丰盛培养期和饥饿期结束后，利用所加入的负载材料(优选为多孔生物膜材料)携带混合菌群快速沉淀，帮助PHA菌群快速沉淀。本发明方法中由于生物膜大量脱落而且能快速沉降到反应器底部，避免了排水-补料过程中生物量的流失。

本发明的方法中，所述负载材料为依次经强酸、2,2,6,6-四甲基哌啶-氮-氧化物改性后的细菌纤维素膜；优选，经所述强酸改性后的细菌纤维素膜与所述2,2,6,6-四甲基哌啶-氮-氧化物的质量体积比为1：(9-11)克/毫升。

本发明的负载材料的空隙适于微生物大小且能容纳大量微生物，可利于高生物量的细菌附着，有利于PHA混合菌群的富集与扩陪。

优选，本发明使用经特殊改性后的细菌纤维素膜作为负载材料，其亲水性和吸水性能强，能保证微生物大量接触并附膜生长，而且易于在停止曝气后携带大量脱落的微生物絮体一起快速沉淀，保留反应器中大量的微生物不被排水操作排出，有利于提高扩大培养过程中微生物的生物量。

本发明的方法中，所述厌氧发酵产酸液中挥发性脂肪酸的浓度为50～70mgCOD/mgCOD，多糖和蛋白质的浓度为0.15～0.25gCOD/gCOD，氨氮的浓度为600～1000毫克/升；所述挥发性脂肪酸包括乙酸、丙酸和丁酸；优选，所述挥发性脂肪酸中包括25％～30％的乙酸、20～25％的丙酸和45％～55％的丁酸；

和/或，所述混合菌群中PHA合成菌的相对丰度为60～70％，所述PHA合成菌包括巨单胞菌属(Meganema)，陶厄氏菌属(Thauera)，黄杆菌属(Flavobacterium)和副球属(Paracoccus)；优选，所述混合菌群中巨单胞菌属的相对丰度为5～10％，陶厄氏菌属的相对丰度为10～15％，黄杆菌属的相对丰度为2～5％、副球属的相对丰度为10～15％。

本发明的厌氧发酵产酸液为城市有机废弃物产酸液，可通过本领域常规方法进行制备，城市有机废弃物可为活性污泥，餐厨废物和其他有机废水。

本发明限定的厌氧发酵产酸液，其C/N比能为高浓度的PHA混合菌群(20±2g/L)生长繁殖提供充足的碳源和氮源，有利于PHA混合菌群的富集与扩陪。

本发明中，混合菌群的微生物群落优势菌属均为PHA合成菌。混合菌群可通过本领域常规方法通过对污泥进行驯化获得。

作为一个最优选方案，本发明通过控制负载材料性能并控制培养工艺各种参数，同时动态调控丰盛培养期与饥饿期的时间比例，使得快速提高PHA菌群生物量且保持PHA优势菌种的稳定性效果最佳，从而可更好地实现提高PHA生产工艺的生产效率，降低PHA的生产成本的效果。

本发明还提供一种PHA混合菌群富集扩大培养装置，其包括培养罐体、搅拌装置、曝气装置和负载材料；所述搅拌装置、所述曝气装置和所述负载材料位于所述培养罐体内；所述搅拌装置用于保持所述培养罐体内的物料和溶氧的均匀性，所述曝气装置用于向所述培养罐体内提供气体，所述负载材料用于负载PHA混合菌；所述负载材料如上所述。

本发明另提供一种上述富集扩培PHA混合菌群的方法或PHA混合菌群富集扩大培养装置在生产PHA中的应用。

本发明的有益效果至少在于：

1、本发明提出的混合菌群的培养方法可以实现PHA生物量的大幅提高，其最大生物量远大于目前所报道的PHA混合菌群的生物量。且PHA混合菌群的丰度基本不变，进一步保证了菌群的PHA合成能力。

2、本发明基于上述培养方法所设计的PHA菌群扩大培养生物膜反应器(PHA混合菌群富集扩大培养装置)，可用于提高PHA混合菌群的富集和扩培效果。

3、当将本发明提出的PHA菌群扩大培养方法/装置嵌入传统的“三段式”PHA生产工艺(有机废物厌氧酸化、菌群富集和PHA积存)后，能显著提高批次PHA产量，相比原工艺PHA产量提高约为2～3倍。并能显著提高后续合成阶段生产的效率，PHA体积产率相比传统工艺约提高了2～2.5倍。

附图说明

图1为本发明的PHA混合菌群富集扩大培养装置示意图。

图2为以对照方法富集的PHA合成菌进行生产和应用本发明的PHA混合菌群富集扩大培养方法获得的PHA合成菌进行生产的结果比较图。

附图标记：1、PHA混合菌群富集扩大培养装置；2、负载材料；3、曝气装置。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到或按本领域常规方法制备。

实施例1

本实施例提供一种PHA混合菌群富集扩大培养装置1，其可用于进行PHA混合菌群的培养。

PHA混合菌群富集扩大培养装置1由培养罐体、搅拌装置、曝气装置3和负载材料2组成，搅拌装置、曝气装置3和负载材料2位于培养罐体内。在PHA混合菌群培养时，搅拌装置用于保持培养罐体内的物料/溶氧均匀性，曝气装置3用于为培养环境提供气体，负载材料2用于负载菌体。结构示意图见图1。

负载材料2为经改性后的细菌纤维素膜，具体制备方法如下：

1、将50g细菌纤维膜(购自益达食品工业有限公司)用10mol/L的浓度盐酸浸泡2小时时间，去除载体中的杂质。

2、以2,2,6,6-四甲基哌啶-氮-氧化物(TEMPO)50mg/L的500mL溶液对细菌纤维膜进行旋转搅拌12小时获得的负载材料2的内部空隙为微米级大小(1～2μm)，空隙率为0.1～0.2cm

3、将处理后的细菌纤维素膜裁剪成5cm×5cm的小块，备用。

本实施例还提供一种本发明的PHA混合菌群富集扩大培养方法，具体包括：

步骤1：

在上述PHA混合菌群富集扩大培养装置1中加入上述制备的小块负载材料2和厌氧发酵产酸液(1.5L)。所述厌氧发酵产酸液为将餐厨垃圾通过厌氧发酵后进行离心去除杂质后获得的产酸液。厌氧发酵产酸液中挥发性脂肪酸占比为55mgCOD/mgCOD，主要挥发性脂肪酸包括乙酸(25％)，丙酸(20％)和丁酸(45％)，其中多糖和蛋白浓度占比为0.25gCOD/gCOD，氨氮浓度为850mg/L。

同时接种混合菌群(高度富集的PHA混合菌群)作为菌源，其中混合菌群的微生物群落优势菌属均为PHA合成菌，相对丰度达到60％，混合菌群初始生物量为150mg/L，主要以Meganema(相对丰度10％),Thauera(相对丰度15％),Flavobacterium(相对丰度5％)和Paracoccus(相对丰度15％)为主。本实施例中混合菌群为长期利用乙酸纯底物驯化的菌群。

驯化方法为：以乙酸为碳源，NH

步骤2：通过丰盛-饥饿方式进行发酵富集

丰盛期：在pH为7±0.5，温度为25±1℃下进行培养，通过曝气和搅拌维持溶氧为7～8mg/L，具体曝气强度为40L/min。

随发酵时生物量的升高，通过动态间歇补料方式逐步提高厌氧发酵产酸液的负荷。总的丰盛期培养时间为6小时(分为3个阶段，每个阶段2小时)，在开始培养的前2小时，动态流加步骤1中的厌氧发酵产酸液，使培养液负荷以0.8L/min的速率从初始的1.5mgCOD/mg VSS·d逐渐提升至6.0mg COD/mg VSS·d。之后的2小时，补充氮源以及其它微生物所需微量元素，具体地，加入500毫升的维生素水溶液(含0.5g的复合维生素(购于Cenovis公司)和0.1g的FeCl

在丰盛期，营养物质丰盛，在搅拌和曝气下，负载材料2悬浮在培养液中，大部分的微生物在负载材料2上容易合成EPS并形成紧密生物膜，此时PHA混合菌群能快速附膜生长繁殖，同时合成大量PHA。

饥饿期：在pH为7±0.5，温度为25±1℃下进行培养，通过曝气和搅拌维持溶氧为7～8mg/L，具体曝气强度为40L/min，不补加营养物质。总的饥饿期培养时间为6小时。在营养物质匮乏时(饥饿期)生物膜内侧微生物死亡在曝气条件下容易脱落，此时PHA菌群消耗内源合成的PHA进行繁殖形成小絮体颗粒，而非PHA菌群因营养缺乏而大量死亡。

步骤3：在饥饿期后，停止曝气和搅拌，负载材料2上的微生物进一步脱落到溶液中，同时负载材料2携带大量微生物沉淀到PHA混合菌群富集扩大培养装置1的底部，帮助PHA菌群快速沉淀。将上清液进行排水操作，排掉培养装置体积3/4的上清液，之后以上述有机废物产酸液进行补料和补充水，恢复至原培养体积和步骤1中开始培养前的底物环境。

步骤4：以步骤2和步骤3为一个循环周期，共连续重复进行14个周期(7天)。在进行14个循环周期(7天)后，对生物量进行测试，生物量能达到20g/L，而且微生物群落保持高度富集，相对丰度和接种时相比基本保持不变，混合菌群中主要以Meganema(10％),Thauera(15％),Flavobacterium(5％)和Paracoccus(15％)为主。

按上述方法不断重复培养至20个稳定周期(10天)后，在第21个周期进行到PHA菌群快速沉淀后，进行排泥操作(生物量和相对丰度与14个循环周期后的结果基本相同)，具体排泥1/10体积可用于PHA合成段批次生产，SRT保持在5天。

本实施例在进行上述PHA混合菌群富集扩大培养的同时检测PHA的生产情况。另设对照方法作为对比。对照方法与上述PHA混合菌群富集扩大培养方法相同，区别仅在于不在培养装置中加入负载材料。

扩大培养反应运行80天的数据图如图2所示，其中，横坐标为PHA合成反应时间，单位为天；左侧纵坐标为PHA浓度，单位为mg/L。反应器1(R1)为对照方法，反应器2(R2)为本发明上述方法。

实施例2

本实施例提供一种PHA混合菌群的培养方法。具体方法与实施例1基本相同，区别仅在于：

1、提高了接种物的起始生物量至1000mg/L，用以加快起始的微生物菌群的扩大培养速率；

2、在丰盛期动态流加厌氧发酵产酸液时，使培养液负荷逐渐提升至10mg COD/mgVSS·d。在动态流加补充液时，使氮源控制在1000mg/L。本实施例相比实施例1提高了碳源，和氮源的进料负荷，用以加快PHA菌群的扩培速率。

结果，本实施例微生物扩培速率相比实施例1没有太大提升，每个周期排水中存在未全部利用完的营养基质。故若结合生产成本和效率的综合考量，则优选实施例1的方案。

对比例1

本对比例提供一种PHA混合菌群的培养方法。具体方法与实施例1基本相同，区别仅在于：

1、以PE多孔材料替代实施例1中的负载材料2；

2、在丰盛期不进行实施例1中记载的动态间歇补料，将负荷固定为4000mg COD/L/day；

3、丰盛期的时间是4小时，饥饿期的时间是8小时，以此循环筛选PHA菌群30天。

根据观察，在饥饿期停止曝气后，PE材料浮在PHA混合菌群富集扩大培养装置1上层，无法携带微生物沉淀，本对比例进行了60个周期实验，每次排水阶段损失大概0.2～0.5g的目标微生物，无法达到混合菌群扩大培养的目的。

对比例2

本对比例提供一种PHA混合菌群的培养方法。具体方法与实施例1基本相同，区别仅在于：

1、直接以实施例1中的未经改性的市售细菌纤维膜替代实施例1中的负载材料2；

2、在丰盛期不进行实施例1中记载的动态间歇补料，将负荷固定保持为4000mgCOD/L/day；

3、丰盛期的时间是2小时，饥饿期的时间是10小时，以此循环筛选PHA菌群30天。

在饥饿期停止曝气后，负载材料2携带大量微生物沉淀到PHA混合菌群富集扩大培养装置1的底部，将上清液进行排水操作，上清液中的非VFA物质和非PHA菌群被排走，不断筛选后PHA菌群保持稳定，生物量快速增长，但是由于生物量的提高与底物基质和溶氧量的配合不佳，导致继续运行30天，生物仍仅可保持在10～11g/L，无法进一步提高生物量。混合菌群中主要以Meganema(5％),Thauera(10％),Flavobacterium(5％)和Paracoccus(15％)为主，相对丰度有所下降。

对比例3

本对比例提供一种PHA混合菌群的培养方法。具体方法与实施例1基本相同，区别仅在于：

1、直接以实施例1中的未经改性的市售细菌纤维膜替代实施例1中的负载材料2，载体平均比表面积为120m

2、丰盛期的时间是3小时(每个阶段1小时，各阶段具体补料方式与实施例1相同)，饥饿期的时间是9小时，以此循环筛选PHA菌群60天；

3、在丰盛期动态流加厌氧发酵产酸液时，使培养液负荷逐渐提升至4mg COD/mgVSS·d，在动态流加补充液时，氮源控制在600mg/L。

饥饿期时，停止曝气后，细菌纤维素膜上的微生物大量脱落到溶液中，同时细菌纤维素膜携带大量微生物沉淀到反应器底部，将上清液进行排水操作，上清液中的非VFA物质和非PHA菌群被排走，不断筛选后PHA菌群保持稳定，生物量快速增长，而且微生物群落保持高度富集，相对丰度和接种时相比基本保持不变，但连续培养20天后生物量才达到20g/L，培养效率降低。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。