一种多重氨基酸修饰ZIF-8的仿生酶材料的制备方法与应用

技术领域

本发明涉及仿生酶生物材料领域，具体涉及一种多重氨基酸修饰ZIF-8的仿生酶材料及其制备方法与应用。

背景技术

随着全球工业化的不断发展，化石燃料的过度消耗使得大气中CO

碳酸酐酶作为生物酶也同样受限于pH值敏感性高、热和化学稳定性低、价格高昂和难以回收等问题生物酶工业应用中存在的共性难题。为此，很多研究者尝试基于合成碳酸酐酶纳米酶，利用纳米材料本身的高结构稳定性、利于回收和价格较低廉的优势开展CO

发明内容

本发明针对目前合成的碳酸酐酶纳米酶与天然碳酸酐酶相比其催化反应速率依然较低的问题，通过组氨酸/苏氨酸对ZIF-8的多重修饰，构建具有类碳酸酐酶一级和二级分子结构的微环境，制备出对CO

本发明的目的通过如下技术方案实现：

(1)ZIFs金属源化合物溶液的制备：将Zn(NO

(2)ZIFs有机配体和碳酸酐酶活性配体溶液的制备：将ZIFs有机配体和碳酸酐酶活性配体溶解于水中，标记为溶液B；所述的ZIFs有机配体为2-甲基咪唑，所述的碳酸酐酶活性配体为组氨酸和苏氨酸；ZIFs有机配体与碳酸酐酶活性配体的摩尔比为6:6-8；组氨酸与苏氨酸的摩尔比为8-10:2-4；

(3)多重氨基酸修饰ZIF-8仿生酶材料的制备：将溶液A加入溶液B中搅拌混合均匀，随后将混合溶液放置在超声反应釜中反应，反应后将其进行离心，用甲醇洗涤，静置，重复离心洗涤，最后进行真空干燥，所得的白色粉末即为多重氨基酸修饰ZIF-8仿生酶材料ZIF-HT。

作为方案的技术优选，所述步骤(1)的有机溶剂为甲醇，有机溶液的加入量为每毫摩尔Zn(NO

作为方案的技术优选，所述步骤(2)中每升水中溶解500-800mmol的总配体物质。

作为方案的技术优选，所述步骤(3)中的超声功率为200-300W，每超声6-12min后停2-5min为一个周期，总的超声反应时间为6-18h；静置时间为6-18h；重复离心洗涤次数为2-5次。

作为方案技术优选，所述步骤(3)中的离心速率均为5000-10000r/min，离心时间为6-10min。

作为方案的技术优选，所述步骤(3)的真空干燥均采用程序干燥箱，具体控温过程为：

(a)升温过程：以1-5℃/min的升温速率升至100-120℃；

(b)恒温过程：置于100-120℃保持8-12h；

(c)降温过程：以1-5℃/min的降温速率降至室温后即可取出材料。

本发明制备得到的多重氨基酸修饰ZIF-8仿生酶材料具有高孔隙结构，其比表面积为550-750m

本发明制备得到的多重氨基酸修饰ZIF-8仿生酶材料可应用于对CO

ZIFs是一类由Zn

本发明的原理：先将沸石咪唑骨架类ZIFs的金属源化合物Zn(NO

本发明的制备方法是基于ZIF-8骨架植入多重碳酸酐酶活性中心的特定氨基酸，在超声的反应条件下诱发金属与配体的配位作用，强化构建能仿生碳酸酐酶二级氢键网络结构的碳酸酐酶仿生酶材料。本发明以ZIF-HT为代表合成仿生碳酸酐酶纳米酶，该材料不仅加快了H

与现有技术相比，本发明优势之处在于：

(1)本发明提出了以ZIF-8为基础构建了碳酸酐酶的一级/二级活性中心结构，且材料制备的条件温和，操作简便。

(2)本发明所制备的多重氨基酸修饰的碳酸酐酶仿生酶ZIF-HT具有高孔隙结构，其比表面积为550-750m

(3)本发明采用组氨酸与苏氨酸来反馈调控修饰ZIF-8材料，使得产品多重氨基酸修饰ZIF-8仿生酶材料催化CO

(4)本发明通过在ZIF-8上原位生长仿生碳酸酐酶功能单元，使其在ZIF-8的结构中以氢键连接，得到的碳酸酐酶仿生酶与其他材料相比表现出更高的类酶催化活性。

附图说明

图1为实施例1制备的ZIF-8的SEM图。

图2为实施例2制备的单种氨基酸修饰的碳酸酐酶仿生酶(ZIF-H)的SEM图。

图3为实施例3制备的多重氨基酸修饰的碳酸酐酶仿生酶(ZIF-HT)的SEM图。

图4为实施例1、实施例2和实施例3制备的多重氨基酸修饰的碳酸酐酶仿生酶的XRD图。

图5为实施例1、实施例2和实施例3制备的多重氨基酸修饰的碳酸酐酶仿生酶的催化CO

图6为实施例1、实施例2和实施例3制备的多重氨基酸修饰的碳酸酐酶仿生酶的酯酶法测定催化活性图。

图7为实施例1、实施例2、实施例3制备的多重氨基酸修饰的碳酸酐酶仿生酶催化p-NPA转化2h转化率图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的描述，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。

实施例1

一种ZIF-8仿生酶材料的制备方法，包括如下步骤：

(1)ZIFs金属源化合物溶液的制备：称取0.4464g(1.5mmol)的Zn(NO

(2)ZIFs有机配体溶液的制备：称取0.7389g(9mmol)2-甲基咪唑，加入15mL的超纯水进行溶解，所得溶液标记为溶液B。

(3)ZIF-8仿生酶材料的制备：将溶液A加入溶液B中机械搅拌混合均匀，随后将混合溶液放置在超声反应釜中，在250W的功率下进行超声，每超声7min后停3min为一个周期，总的超声反应时间为10h，反应后将其在6000r/min的转速下离心10min，随后用甲醇洗涤，静置12h，再重复离心洗涤静置操作共四次，最后在110℃下进行真空干燥9h，所得的白色粉末即为ZIF-8仿生酶材料。

真空干燥均采用程序控温干燥箱进行干燥：

(a)升温过程：以1-5℃/min的升温速率升至110℃；

(b)恒温过程：置于110℃保持9h；

(c)降温过程：以1-5℃/min的降温速率降至室温后即可取出材料。

以下实例皆是如此。

实施例2

一种氨基酸修饰ZIF-8的仿生酶材料的制备方法，包括如下步骤：

(1)ZIFs金属源化合物溶液的制备：称取0.4464g(1.5mmol)的Zn(NO

(2)ZIFs有机配体和碳酸酐酶活性配体溶液的制备：分别称取0.7389g(9mmol)2-甲基咪唑，1.3963g(9mmol)的组氨酸(His)，加入15mL的超纯水进行溶解，所得溶液标记为溶液B。(2-甲基咪唑与His的摩尔比为1:1)

(3)氨基酸修饰ZIF-8仿生酶材料的制备：将溶液A加入溶液B中机械搅拌混合均匀，随后将混合溶液放置在超声反应釜中，在250W的功率下进行超声，每超声7min后停3min为一个周期，总的超声反应时间为10h，反应后将其在6000r/min的转速下离心10min，随后用甲醇洗涤，静置12h，再重复离心洗涤静置操作共四次，最后在110℃下进行真空干燥9h，所得的白色粉末即为氨基酸修饰ZIF-8的仿生酶材料ZIF-H。

实施例3

一种多重氨基酸修饰ZIF-8的仿生酶材料的制备方法，包括如下步骤：

(1)ZIFs金属源化合物溶液的制备：称取0.4464g(1.5mmol)的Zn(NO

(2)ZIFs有机配体和碳酸酐酶活性配体溶液的制备：分别称取0.7389g(9mmol)2-甲基咪唑，1.3964g(9mmol)的组氨酸(His)和0.1788g(1.5mmol)的苏氨酸(Thr)，加入15mL的超纯水进行溶解，所得溶液标记为溶液B。(2-甲基咪唑与His和Thr之和的摩尔比为6:7，His和Thr的摩尔比为6:1)

(3)多重氨基酸修饰ZIF-8仿生酶材料的制备：将溶液A加入溶液B中机械搅拌混合均匀，随后将混合溶液放置在超声反应釜中，在250W的功率下进行超声，每超声7min后停3min为一个周期，总的超声反应时间为10h，反应后将其在6000r/min的转速下离心10min，随后用甲醇洗涤，静置12h，再重复离心洗涤静置操作共四次，最后在110℃下进行真空干燥9h，所得的白色粉末即为多重氨基酸修饰ZIF-8的仿生酶材料ZIF-HT。

材料性能测试

将实施例制备的产品进行表征分析和性能测试。

(一)材料的表面形貌

采用日本日立公司生产的Hitachi SU8220型扫描电子显微镜对本发明实施例1-3得到的材料进行表面形貌的表征，如图1-图3所示。通过对比可以看出实施例2和3晶体形貌相较于实施例1有明显差异，这主要是氨基酸的加入会导致与配体二甲基咪唑间的竞争配位，从而抑制ZIF-8骨架生长，从而产生不同形貌。

(二)材料的XRD表征

采用日本株式会社理学公司生产的SMARTLAB3KW型粉末X射线衍射仪对本发明实施例1-3得到的材料进行晶体结构表征，检测结果如图4所示。由图4可以看出，实施例3相较于实施例1和实施例2的碳酸酐酶仿生酶材料的晶面衍射峰来说，其强度有所下降，这是因为Thr的-OH、-COOH、-NH

(三)材料的比表面积及孔结构参数表征

采用美国麦克仪器公司的ASAP2460型比表面积及孔隙度分析仪对本发明的实施例1-3得到的材料进行比表面积及孔隙结构表征，检测结果如表1所示。实施例3的比表面积显著下降，但介孔比表面积有所上升，Thr的掺杂降低了比表面积并形成少量缺陷中孔，暴露出的缺陷位可增大材料的催化活性。

表1材料的比表面积和孔结构参数

(四)材料的CO

设4个反应器中分别加入8g实施例1、实施例2、实施例3材料和一个空白对照不添加材料，分别通入CO

(五)材料的酶活测试

分别配置500mM的p-NPA乙腈溶液A和0.7mM的实例1产品、实例2产品、实例3产品的DMF分散液，取3mL乙腈溶液加入267mLHEPEs Buffer溶液，搅拌充分混匀，加入30mL各实例分散液，25℃下以500rpm磁力搅拌30min后，取混合液在402nm下检测吸光度，从而确定材料的催化活性，检测结果如图6所示。经计算得出实施例3的ZIF-HT的催化反应初始速度为0.45mM/min，高于其他两种实施例以及目前所报道的碳酸酐酶仿生酶材料。

(六)材料催化性能表征

采用实施例1-3所制备出来的仿生酶材料对p-NPA进行催化转化2h转化率的检测。

分别配置500mM的p-NPA乙腈溶液A和0.7mM的实例1产品、实例2产品、实例3产品的DMF分散液B。取3mL乙腈溶液加入267mLHEPEs Buffer溶液中，搅拌充分混匀，再加入30mL各实例分散液，25℃下以500rpm磁力搅拌2h后，通过检测p-NPA的剩余量来计算得到其转化率的大小，结果如图7所示，实施例3转化率为55.86％，高于其他两种实施例以及目前所报道的碳酸酐酶仿生酶材料。

本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员而言，在上述说明的基础上还可以作其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。