一种催化合成L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的环糊精转移酶的高通量筛选方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种催化合成L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的环糊精转移酶的高通量筛选方法。

背景技术

目前L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷(AA-2G)合成中，世界领先的是日本企业“株式会社林原”，使用的酶为CGTase，即“环糊精转移酶”，该酶在工业上大规模用于β-环糊精的合成。为了提高催化合成AA-2G的效率，有必要筛选具有更高活性的环糊精转移酶。对于该酶的筛选，通常使用的方法有“酚酞变色圈法”及“甲基橙法”。其基于的原理在于通过细菌产生CGTase酶把淀粉转化成环糊精，利用环糊精包裹酚酞或甲基橙，使溶液褪色，来达到评价酶活性的目的。很显然，这种方式并非直接评价AA-2G的合成活性，不能真实体现利用该酶来合成AA-2G的水平。

因此，如何获得一种直接评价环糊精转移酶催化合成AA-2G的活性的方法，将其应用于高通量筛选，用于从饱和突变库中快速、准确地得到有益的突变菌株是本领域技术人员亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的在于一种基于直接评价环糊精转移酶催化合成L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷活性的高通量筛选方法。为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案：

本发明一方面涉及一种催化合成L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的环糊精转移酶的高通量筛选方法，包括如下步骤：

在待筛选菌株的培养体系中加入β-环糊精和抗坏血酸，调节pH至5.0-6.0进行催化反应；

催化反应之后去除菌株，加入氧化剂进行氧化反应；

氧化反应之后加入L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的显色剂进行显色。

本发明通过氧化反应，使得未反应的抗坏血酸被氧化，而L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷在此过程中未受到破坏，通过L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的显色剂进行显色从而可以定量的检测出L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的含量。

在本发明的一个优选实施方式中，所述β-环糊精和抗坏血酸的添加重量比为1：1-2。

本发明的一个优选实施方式中，所述氧化剂为过氧化氢、臭氧、Fe

在本发明的一个优选实施方式中，所述显色剂为磷钼酸，加热到70-90℃进行显色。AA-2G在显色过程中被分解成抗坏血酸及葡萄糖，从而使磷钼酸显蓝绿色，并且由于体系已经不存在游离状态的抗坏血酸，因此对该显色过程不造成影响；而且，经过验证葡萄糖本身不会对反应体系造成干扰。

在本发明的一个优选实施方式中，所述显色反应之后通过酶标仪检测吸光度，通过吸光度数据定量确定L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷的含量。

本发明通过预氧化的策略，使未反应的抗坏血酸得以去除，再加入能与AA-2G显色的物质，在一定条件下进行反应，并且反应后可以方便地在酶标仪进行检测，从而准确定量反应液体系中AA-2G的含量，为高通量筛选突变菌株带来便利。

附图说明

图1为0小时样品谱图；

图2为反应2.0小时后样品谱图；

图3为反应7.0小时后样品谱图；

图4为反应24.0小时后样品谱图；

图5为加热前溶液照片；

图6为加热后溶液照片；

图7为AA-2G消耗量与吸光度的关系；

图8为加热反应前照片；

图9为80℃加热反应后照片。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但是下述实施例只是用于对本发明的内容进行阐述，而不是限制，因此在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

实施例1

(1)催化反应：在96孔板中，培养大肠杆菌，到OD＝7后，将配置好的50微升β-环糊精(50克/L)与50微升抗坏血酸(50克/L)加入其中，并用0.1M氢氧化钠调节pH＝5.0-5.5，保温37℃，200rpm震荡反应24h。

(2)预氧化反应：通过离心除去菌体后，加入30％双氧水10微升进行预氧化反应，升温至50℃继续反应24h，实验结果如图1-4所示，随着时间的延长，体系中L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷几乎保持不变，而抗坏血酸逐步降低，至24小时样品中几乎消失不见。

(3)显色反应：加入47.62mg/g的磷钼酸80微升，保温80℃反应1h。转移至酶标仪，检测660nm吸光度。在该波长下吸光度越大，则表示体系生成的AA-2G越多。对显色反应之后的样品还进行了液相色谱的检测，实验结果如表1所示，实验结果显示，采用本发明的方法可以实现与液相色谱相似的检测结果，但本发明的方法相比于液相色谱更简单，成本更低，为高通量筛选突变菌株带来便利。

液相色谱的检测条件：色谱柱：C18，150*4.6mm，5um；流动相：A：10mMol/L十二烷基三甲基氯化铵水溶液，pH3.0；B：甲醇(A:B的体积比为85：15)；柱温：35℃，波长：260nm；流速：1ml/min。

表1：显色实验实验酶标仪结果与液相色谱结果的比较

验证实验1：磷钼酸加热显色反应实验

(1)在试管中分别加入5克浓度为0.1mg/g、0.25mg/g、0.5mg/g、0.75mg/g和1mg/gAA-2G，并加入4.762mg/g的磷钼酸溶液10克，加热前的溶液照片如图5所示。

(2)保温80℃反应1h，反应之后的溶液照片如图6所示，可以看到，通过加入磷钼酸，以及加热的情况下，AA-2G可以与磷钼酸发生反应从而导致颜色的差异，这种差异甚至是可以被肉眼识别的。

(3)将加热反应的样品转移至酶标仪，检测660nm吸光度，实验结果如表2和图7所示，实验结果显示，磷钼酸分光光度计法有很好的线性及准确度，可以用于菌株的高通量筛选。

表2吸光度检测结果

验证实验2：葡萄糖对反应体系的干扰实验：

磷钼酸母液(47.62mg/g)：取1g磷钼酸加入20g水溶解；

Vc母液(2mg/g)：取0.1g VC加入50mL水溶解。

1、磷钼酸母液进行10倍稀释，溶液呈淡黄色；

2、依次向稀释后的磷钼酸溶液中加入①Vc母液(10滴左右)、②无水葡萄糖固体(0.03g)、③AA-2G固体(0.014g)；结果如图8所示，③号溶液瞬间由淡黄色变为蓝绿色；而葡萄糖和AA-2G体系无变化，仍为淡黄色；

3、80℃加热后，结果如图9所示，①号由淡黄色变为蓝绿色，②号仍为淡黄色，③号仍为蓝绿色，实验结果表明，AA-2G和葡萄糖对反应体系不会产生干扰。

以上描述了本发明优选实施方式，然其并非用以限定本发明。本领域技术人员对在此公开的实施方案可进行并不偏离本发明范畴和精神的改进和变化。