一种卵巢癌靶向的聚合物纳米粒及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医学材料领域，尤其涉及一种卵巢癌靶向的聚合物纳米粒及其制备方法和应用。

背景技术

卵巢癌是一种常见的妇科恶性肿瘤疾病，是全球女性癌症相关死亡的主要原因。由于其起病隐匿且进展缓慢，大多数卵巢癌患者通常在诊断时已处于疾病晚期。迄今为止，紫杉醇(PTX)是一种通过稳定微管发挥作用的天然抗癌药物，几十年来一直是卵巢癌治疗的一线抗肿瘤药物。然而，由于疾病耐药和复发，基于紫杉醇的化疗方案仍然未能显着提高卵巢癌患者的5年生存率。此外，严重的副作用是紫杉醇的另一个重要问题。近年来，白蛋白结合型紫杉醇(Abraxane)作为紫杉醇的新型制剂用于临床多种类型肿瘤患者的安全治疗，但其仍存在成本高、体内半衰期短等缺陷。有鉴于此，寻求卵巢癌安全且高效的治疗新方式具有重要意义。

纳米药物递送体系可通过改善药物溶解性、肿瘤被动靶向等方式大大提高药物疗效并降低其全身性毒副反应。同时，由于纳米药物低免疫原性、高生物相容性和生物可降解的特性，基于纳米药物的递送策略正在生物制剂领域和临床应用中越来越受到关注。例如，Genexol-PM是一种聚合物体纳米制剂，在临床实践中，与紫杉醇相比，Genexol-PM可增加药物在肿瘤部位的递送，且对患者毒性更小。尽管如此，该药物由聚合物载体直接将紫杉醇掺入其中制备而成，因此临床应用中仍有不足之处，包括包载药物的过早释放和无法进行主动肿瘤靶向递送。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明第一个方面提出一种卵巢癌靶向的聚合物纳米粒，能够靶向治疗卵巢癌，并且在优化药物疗效的同时降低不良反应事件。

本发明的第二个方面提出了第一方面所述的卵巢癌靶向的聚合物纳米粒的制备方法。

本发明的第三个方面提出了第一方面所述的卵巢癌靶向的聚合物纳米粒在制备治疗CD44高表达卵巢癌药物中的应用。

根据本发明的第一个方面，提出了一种卵巢癌靶向的聚合物纳米粒，所述聚合物纳米粒为核壳结构，包括紫杉醇前药分子内核和外壳；所述外壳包括可降解聚合物和一端连接肿瘤靶分子的可降解聚合物。

在本发明中，可降解聚合物可延长纳米粒的循环稳定性，而肿瘤靶分子可赋予其对CD44高表达卵巢癌的靶向递送并促进细胞对药物的摄取，同时减少药物在正常组织的分布，降低药物毒副作用。

在本发明的一些实施方式中，所述聚合物纳米粒为球状或类球状，平均粒径为40nm～50nm。

在本发明的一些实施方式中，所述紫杉醇前药分子由聚乳酸与紫杉醇共价偶联制备。

在本发明中，紫杉醇前药中紫杉醇通过聚乳酸共价修饰，使其可被包裹材料稳定包载，避免在体内应用时由于稳定性差而提前释放药物分子。

在本发明的一些实施方式中，所述紫杉醇前药分子中紫杉醇的负载量为所述前药分子总重量的5％～10％。

在本发明的一些实施方式中，所述可降解聚合物选自聚乙二醇-聚乳酸、聚乙二醇-聚己内酯、聚乙二醇-聚谷氨酸、聚乙二醇-壳聚糖中的任一种。

在本发明的一些实施方式中，所述肿瘤靶分子能够与CD44分子结合。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述肿瘤靶分子选自透明质酸、RP-1多肽、A6短肽中的任意一种，优选透明质酸。

在本发明中，透明质酸(HA)是一种亲水性聚合物，它可与CD44受体结合，CD44是一种跨膜糖蛋白，在卵巢癌在内的多种恶性肿瘤中高表达。将HA对聚合物纳米粒进行表面修饰，将有助于提高药物靶向递送到卵巢癌中，在优化药物疗效的同时降低不良反应事件。

根据本发明的第二个方面，提出了一种第一方面所述的卵巢癌靶向的聚合物纳米粒的制备方法，包括如下步骤：

将可降解聚合物、一端连接肿瘤靶分子的可降解聚合物和紫杉醇前药分子与有机溶剂混合，滴加至水中，搅拌，透析，得到所述卵巢癌靶向聚合物纳米粒。

在本发明的一些实施方式中，所述可降解聚合物、一端连接肿瘤靶分子的可降解聚合物与所述紫杉醇前药分子中的紫杉醇的质量比为(4.5～9.5):(4.5～9.5):1。

在本发明的一些实施方式中，所述有机溶液为丙酮、乙醇、异丙醇中的任一种。

在本发明的一些实施方式中，所述水为双蒸水、去离子水、超纯水中的任一种。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述搅拌的时间为20min～40min。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述搅拌之后还包括旋转蒸发除去有机溶剂，所述旋转蒸发的温度为45℃～55℃。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述透析的截留分子量为5kDa～10kDa。

在本发明的一些更优选的实施方式中，所述透析之后还包括用超滤管洗涤浓缩截留液。

本发明的第三个方面，提出了第一方面所述的卵巢癌靶向的聚合物纳米粒在制备治疗CD44高表达卵巢癌药物中的应用。

本发明的有益效果为：

本发明的聚合物纳米粒具有长循环稳定性，并可以减少药物在正常组织的分布，降低药物毒副作用，与临床剂型紫杉醇Taxol相比，可改善其在细胞水平的抗卵巢癌活性。此外，由于本发明使用紫杉醇前药，该前药中紫杉醇通过聚乳酸共价修饰，使其可被包裹材料稳定包载，更加避免在体内应用时由于稳定性差而提前释放紫杉醇药物分子。

本发明的聚合物纳米粒制备方法简单，原料易得，可规模化生产。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明实施例1和对比例制备的聚合物纳米粒的粒径分布和电镜扫描结果；A和B图分别为通过DLS测量得到的对比例制备的聚合物纳米粒(PLA-PTX NPs)和实施例1制备的聚合物纳米粒(HA-PLA-PTX NPs)的粒径分布；图C和D分别为PLA-PTX NPs和HA-PLA-PTX NPs的电镜扫描图。

图2为在不同时间点用纳米粒度分析仪分别检测本发明实施例1(HA-PLA-PTXNPs)和对比例(PLA-PTX NPs)制备的聚合物纳米粒的粒径及多分散指数(PDI)。

图3为临床剂型紫杉醇(Taxol)、本发明对比例制备的聚合物纳米粒(PLA-PTXNPs)、实施例1制备的聚合物纳米粒(HA-PLA-PTX NPs)对不同CD44表达水平的卵巢癌细胞系的抑制情况；A为对CD44低表达细胞系A2780的增殖抑制情况；B为对CD44高表达细胞系SKOV3的增殖抑制情况。

图4为本发明实施例1制备的聚合物纳米粒在人卵巢癌细胞A2780及人卵巢腺癌细胞SKOV3中的摄取情况；A为实施例1聚合物纳米与A2780细胞孵育1和4小时的荧光显微图像；B为实施1聚合物纳米与SKOV3细胞孵育1和4小时的荧光显微图像；C为实施例1聚合物纳米粒与A2780细胞孵育1和4小时的流式细胞术检测结果；D为实施例1聚合物纳米粒与SKOV3细胞孵育1和4小时的流式细胞术检测结果。

图5为本发明实施例1和对比例制备的聚合物纳米粒对卵巢癌细胞SKOV3增殖功能的影响；A、B分别为SKOV3细胞在实施例1、对比例纳米粒处理24小时后的细胞增殖图像及统计图；图C、D分别为SKOV3细胞在实施例1、对比例纳米粒处理24小时后的细胞凋亡情况及统计图，*为P<0.5，**为P<0.01，***为P<0.001。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

以下实施例和对比例中的紫杉醇前药分子均用公开发明专利CN109562187A所述方法合成，具体涉及说明书[0028]、[0033]、[0038]-[0039]段。

实施例1

本实施例制备了一种卵巢癌靶向聚合物纳米粒，具体过程为：

精密称取9.5mg聚乙二醇-聚乳酸、9.5mg聚乳酸-聚乙二醇-透明质酸及1mg紫杉醇等效量的紫杉醇前药分子，加入2mL的丙酮充分溶解并分散，随之将其缓慢滴入至10mL双蒸水中，室温搅拌30min。随后，在45℃～55℃水浴下旋蒸除去有机溶剂。之后将溶液用10kDa透析膜在纯水中透析过夜并经常更换纯水，除去游离包裹材料。最后，用Amicon Ultra-4(10k MWCO，Millipore Corp.)超滤管浓缩，得到所述卵巢癌靶向的聚合物纳米粒(缩写为HA-PLA-PTX NPs)。

实施例2

本实施例制备了一种卵巢癌靶向聚合物纳米粒，具体过程为：

精密称取4.5mg聚乙二醇-聚乳酸、4.5mg聚乳酸-聚乙二醇-透明质酸及1mg紫杉醇等效量的紫杉醇前药分子，加入2mL的丙酮充分溶解并分散，随之将其缓慢滴入至10mL双蒸水中，室温搅拌30min。随后，在45℃～55℃水浴下旋蒸除去有机溶剂。之后将溶液用10kDa透析膜在纯水中透析过夜并经常更换纯水，除去游离包裹材料。最后，用Amicon Ultra-4(10k MWCO，Millipore Corp.)超滤管浓缩，得到所述卵巢癌靶向的聚合物纳米粒(缩写为HA-PLA-PTX NPs)。

实施例3

本实施例制备了一种卵巢癌靶向聚合物纳米粒，具体过程为：

精密称取9.5mg聚乙二醇-聚乳酸、9.5mg聚乳酸-聚乙二醇-透明质酸及1mg紫杉醇等效量的紫杉醇前药分子，加入2mL的乙醇充分溶解并分散，随之将其缓慢滴入至10mL双蒸水中，室温搅拌30min。随后，在45℃～55℃水浴下旋蒸除去有机溶剂。之后将溶液用10kDa透析膜在纯水中透析过夜并经常更换纯水，除去游离包裹材料。最后，用Amicon Ultra-4(10k MWCO，Millipore Corp.)超滤管浓缩，得到所述卵巢癌靶向的聚合物纳米粒(缩写为HA-PLA-PTX NPs)。

对比例

本对比例制备了一种聚合物纳米粒，与实施例1的主要区别在于，聚乳酸-聚乙二醇一端未连接透明质酸，具体过程为：

精密称取19mg聚乙二醇-聚乳酸及1mg紫杉醇等效量的紫杉醇前药分子，加入2mL的丙酮充分溶解并分散，随之将其缓慢滴入至10mL双蒸水中，室温搅拌30min。随后，在45℃～55℃水浴下旋蒸除去有机溶剂。之后将溶液用10kDa透析膜在纯水中透析过夜并经常更换纯水，除去游离包裹材料。最后，用Amicon Ultra-4(10k MWCO，Millipore Corp.)超滤管浓缩，得到所述聚合物纳米粒(缩写为PLA-PTX NPs)。

试验例

1.采用纳米粒度分析仪和透射扫描电镜分别检测实施例1和对比例制备的聚合物纳米粒的形貌和粒径分布，结果见图1，其中，A和B分别为通过DLS测量得到的对比例制备的非靶向聚合物纳米粒(PLA-PTX NPs)和实施例1制备的靶向聚合物纳米粒(HA-PLA-PTXNPs)的粒径分布；图C和D分别为PLA-PTX NPs和HA-PLA-PTX NPs的电镜扫描图。

从图1A、B可看出，非靶向聚合物纳米粒(PLA-PTX NPs)和靶向聚合物纳米粒(HA-PLA-PTX NPs)均具有较好的水合粒径，两者的尺寸均在50nm以下，在体内具备通过高通透性和滞留(EPR)效应实现肿瘤部位蓄积的能力。同时，两种纳米粒都具有良好的多分散性，因其多分散性指数(PDI)均小于0.2。从图1C、D可看出，PLA-PTX NPs和HA-PLA-PTX NPs呈现出球形的形貌，证明纳米颗粒的成功制备。

2.在不同时间点(0h，2h，4h，8h，12h，24h，48h，96h)用纳米粒度分析仪分别检测PLA-PTX NPs及HA-PLA-PTX NPs的粒径及多分散指数(PDI)，结果见图2。

从图2可看出，随着时间的延长，两种纳米粒子的粒径及PDI均未显示明显的变化，说明聚乳酸修饰的紫杉醇前药分子在制备成纳米粒后，可以更加稳定地被包裹和储存，具有良好的稳定性，从而为药物用于临床时的储存与运输奠定基础。

3.采用细胞活力实验评估不同聚合物纳米粒对不同CD44表达量的卵巢癌细胞的杀伤潜力。将CD44高表达卵巢癌SKOV3细胞和CD44低表达卵巢癌A2780细胞以5×10

表1 Taxol、PLA-PTX NPs、HA-PLA-PTX NPs对CD44低表达卵巢癌细胞A2780和CD44高表达卵巢癌细胞SKOV3的IC

从表1可看出，在CD44高表达的卵巢癌细胞SKOV3中，HA-PLA-PTX NPs的IC

4.癌细胞摄取聚合物纳米粒的情况

首先用尼罗红(NR)标记聚合物纳米粒，用于反应细胞对纳米粒的摄取情况。将A2780和SKOV3细胞以8×10

通过荧光标记技术测定实施例1制备的聚合物纳米粒在人卵巢癌细胞A2780及人卵巢腺癌细胞SKOV3中的摄取情况，如图4所示，其中图A显示了尼罗红(NR)标记的聚合物纳米粒(HA-PLA-PTX NPs)与A2780细胞孵育1h和4h的荧光显微图像；图B显示了尼罗红(NR)标记的聚合物纳米粒与SKOV3细胞孵育1h和4h的荧光显微图像；图C、D分别为用流式细胞仪测量A2780和SKOV3细胞对尼罗红标记的HA-PLA-PTX NPs的摄取情况。

从图4中可以看出，随着孵育时间的增加，两细胞系中的荧光强度逐渐增加。值得注意的是，4小时后SKOV3中所检测到的荧光强度明显高于A2780中的荧光信号。通过流式细胞术检测孵育1和4小时各细胞内的荧光信号情况，结果显示，在孵育4小时后通过流式细胞数测量的平均荧光强度与荧光照片的结果一致，说明透明质酸修饰的纳米粒能更好地将药物递送至CD44高表达的卵巢癌细胞内。

5.聚合物纳米粒对卵巢癌细胞功能的影响

使用5-乙炔基-2-脱氧尿苷(EdU)增殖实验来量化细胞在不同药物处理后的增殖程度。将细胞接种(3×10

通过EdU细胞增殖实验分别评价实施例1和对比例制备的聚合物纳米粒对卵巢癌细胞SKOV3增殖的影响，结果见图5，其中，图A、B分别显示了20nmol/L的HA-PLA-PTX NPs和PLA-PTX NPs治疗24小时后的细胞增殖情况。结果表明，HA-PLA-PTX NPs和PLA-PTX NPs处理后的细胞增殖率分别为28.83％和34.63％，均比对照组的41.63％明显降低，同时有HA-PLA-PTX NPs的SKOV3细胞便显出更低的增殖率，表明CD44靶向可赋予纳米粒更强的肿瘤增殖抑制能力。

用Annexin V/PI双染法检测SKOV3细胞在药物处理后的凋亡情况。将SKOV3细胞(3×10

结果如图5C、D所示，HA-PLA-PTX NPs作用于SKOV3细胞系24小时后的细胞凋亡是对照组的6.08倍，而PLA-PTX NPs处理组的凋亡仅为对照组的3.76倍，表明HA-PLA-PTX NPs对CD44阳性卵巢癌具有更强的杀伤效果。

上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。