一种用于在体诊断的分子影像纳米探针及其制备方法和用途
文献发布时间:2024-01-17 01:27:33
技术领域
本发明涉及生物医学领域,特别是涉及一种用于在体诊断的分子影像纳米探针及其制备方法和用途。
背景技术
结直肠癌在世界范围内发病率排在所有癌症的第三位,致死率也排在前三位,面临诊断治疗形势严峻。结直肠癌发病机制主要遵循着“腺瘤-癌序列”,往往需要十余年的发展时间。APC基因的突变是早期结直肠癌发生的必要步骤之一,而致癌基因KRAS的激活突变及肿瘤抑制基因TP53的失活突变显著的推动了“腺瘤-癌序列”的发展进程。在诊断过程中对结直肠癌进行准确的分期是至关重要的,也是后续选择综合性治疗方案的前提。结直肠癌遵循局部浸润深度(T期),淋巴结转移程度(N期)及存在远端转移(M期)分期,早期阶段病人五年生存率高于90%,而晚期病人的五年生存率仅为10%。尽管病情相对发展缓慢,但在肿瘤分期和个体化治疗方案制定方面存在着困难。虽然依靠肠镜及粪便潜血实验能够诊断结直肠癌,却不能通过对结直肠癌病灶区域的精确勾画而实现其准确分期,指导后续的个体化治疗方案的制定。
在影像学诊断方面,常规的计算机断层扫描(CT)成像和磁共振成像(MRI)是用于结直肠癌诊断的主要成像手段。以PET,SPECT为代表的核医学成像,以及将核医学与常规成像技术结合的SPECT-CT,PET-CT,PET-MRI等成像技术,在临床结直肠癌诊断方面发挥着越来越重要的作用。Niekel等人对比了3391例未接受治疗的结直肠癌及其肝转移病人的CT成像,MRI成像和FDG-PET成像结果,对肿瘤病灶区域的图像检测灵敏率分别达到了83.6%,88.2%,和94.1%。其中针对小于10mm的病灶,MRI由于其具有超高的软组织分辨率,比CT成像有着更为显著的优势,而PET成像表现出更高的检测灵敏度,由于其自身所具备的实时动态的定量优势,是结直肠癌及其转移癌成像的最佳手段。最新PET-MRI多模态成像技术,在保留核医学成像的高灵敏度,无组织深度限制及实时定量的优势的同时,又结合了常规MRI成像能够提供超高软组织分辨率解剖学重建图像的特性,势必能够满足结直肠癌诊断的分期并指导后续个体化治疗方案的要求。
使用PET-MRI多模态成像技术必须选择适当的PET-MRI显像探针。目前[18F]-2-脱氧葡萄糖(FDG)作为肿瘤常规临床评价的主要PET显像剂,其原理是由于肿瘤病灶区域葡萄糖代谢比较旺盛,和正常组织相比,肿瘤病灶区域对葡萄糖摄取量高,因而18F-FDG能够在肿瘤病灶区域蓄积并释放出较强的18F放射性信号,从而实现病灶区域的PET显像。然而在结直肠癌的诊断过程中,当病灶区域较小,葡萄糖代谢较慢时,不利于高剂量蓄积PET显像剂,因而无法提供基于较高18F放射性信号的肿瘤区域轮廓图像。而当体内有炎症发生时(非癌症引发炎症),炎症部位也能够蓄积较高浓度的18F-FDG,从而形成高代谢PET成像区域,可能造成临床对于结直肠癌的误判,影响患者的诊断和后续治疗。尽管PET-MRI多模态成像技术中MRI图像提供的解剖学信息能够大大减少上述误判的可能性,但碍于肿瘤早期阶段,组织学病变不明显或者病灶尺寸较小,MRI可能无法提供足够的组织解剖学图像信息,所以引入能够提高肿瘤区域MRI信号对比度的分子探针就显得尤为必要。因而考虑到上述因素,采用PET-MRI多模态成像技术用于肿瘤诊断并指导后续治疗,发展能够在肿瘤区域特异性高剂量累积并实现病理区域精确勾画的,既能够提供PET信号又可以增强MRI信号的多模态诊疗一体化探针有迫切的临床需求。北京大学医学同位素研究中心的史继云等人通过用偶联剂HYNIC在蛙皮素表面标记放射性99mTc,构建出SPECT探针,能够在人源结肠癌荷瘤鼠模型肿瘤区域的特异性蓄积并提供SPECT图像。但该探针在体内容易被清除,成像时间较短,影响后续肿瘤区域的定位与定量。伦敦国王大学药学院的Rebecca Klippstein等人通过使用DTPA将放射性111In标记在装载姜黄素的PEG-PLGA纳米胶囊上,实现了结直肠癌荷瘤鼠模型的SPECT-CT特异性成像,并且利用探针的内放疗作用抑制了肿瘤的生长。然而该诊疗一体化纳米胶囊主要在肝脾部累积,其内放疗作用可能会造成上述器官的放射性损伤。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种分子影像纳米探针及其制备方法和用途,用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的,本发明提供一种探针,所述探针至少包括金属纳米材料和修饰于金属纳米材料表面的多巴胺或多巴胺衍生物、放射性核素、磁共振成像物质、肿瘤微环境酸响应的配体。
本发明还提供所述纳米探针的制备方法,包括如下步骤:
1)将放射性核素、磁共振成像物质以及多巴胺或多巴胺衍生物与金属纳米材料混合,以使放射性核素、磁共振成像物质以及多巴胺或多巴胺衍生物包裹于金属纳米材料;
2)将步骤1)的产物表面接枝肿瘤微环境响应性配体,获得所述纳米探针。
本发明还提供所述纳米探针在制备医学成像产品例如(CT显像产品、PET/CT显像产品、PET/MRI显像产品)、疾病诊断产品、疾病预后评估产品、疾病治疗产品或疾病治疗增强产品中的用途。
如上所述,本发明的用于早期结直肠癌诊断的分子影像纳米探针及其制备方法和用途,具有以下有益效果:
制备了超小(10nm以下)金纳米棒探针,并修饰了肿瘤微环境酸响应的高分子配体能够特异性的在肿瘤区域高剂量自团聚,提升探针在肿瘤区域的滞留能力,实现对肿瘤区域的动态影像学监控。首次实现PET信号放射性核素
附图说明
图1显示为本发明的诊疗一体化探针
图2显示为本发明的诊疗一体化探针
图3显示为本发明的超小金纳米棒合成示意图。
图4显示为本发明的
图5显示为本发明的超小金纳米探针
图6显示为本发明的pH响应的
图7.探针在荷瘤鼠体内实时动态MRI成像及分布研究。A:尾静脉注射含有0.1mmol钆的探针在荷瘤鼠体内特异性蓄积的实时动态的MRI成像,其中生理盐水注射组为对照组。B:MRI图像肿瘤区域的磁共振平均信号强度。
图8探针在荷瘤鼠体内实时动态PET/CT成像及分布研究。
图9肿瘤的免疫组化分析和探针在肿瘤区域的定位。PET/CT成像后组织区域的银染色和HE染色照片。标尺尺寸:100μm。
具体实施方式
考虑到结直肠癌肿瘤区域微环境区别于其他正常组织的特性(如较高的血管密度,新生血管发育不完全,较低的pH值,较低的含氧量和较高的组织压强等特性),用于结直肠癌诊断的探针应具有较好的生物安全性,具备既能够特异性响应肿瘤区域微环境,能够在肿瘤区域大剂量蓄积,又不容易被生物体内皮网状系统所捕获从而被肝脾等器官过滤从血液中清除,有较长的体内循环时间,能够滞留在靶部位提供稳定的组织学信息等特性。
本发明针对结直肠癌诊断过程中病灶部位经常难以准确勾画,肿瘤分期存在困难,放疗增敏治疗对周围健康组织存在辐射损伤,疗效不够理想等问题提供解决方案。
本发明提供一种探针,所述探针至少包括金属纳米材料和修饰于金属纳米材料表面的多巴胺或多巴胺衍生物以及放射性核素、磁共振成像物质和肿瘤微环境酸响应的配体。
所述金属纳米材料的材质选自金。
所述金属纳米材料为棒状或球状。所述金属纳米材料的尺寸例如棒状的长度或球状的直径为20nm以下。优选的为4~10nm。具体的,金属纳米材料的尺寸选自以下任一范围:4~10nm、10~15nm、15~20nm。
在本发明的某些实施方式中,所述金属纳米材料为棒状,即所述金属纳米材料为金属纳米棒,所述金属纳米棒的长度为20nm以下。
在本发明的某些实施方式中,所述多巴胺衍生物选自盐酸多巴胺。
所述放射性核素选自镓-68、铜-64、锆-89中的一种或多种。
所述磁共振成像物质为T1造影剂或T2造影剂,选自Gd
所述肿瘤微环境响应性配体选自肿瘤微环境pH响应性配体或肿瘤微环境酶响应性配体。
在本发明的某些实施方式中,所述肿瘤微环境pH响应性配体为酸响应性配体。肿瘤微环境酸响应性配体选自11-巯基十一烷基三甲胺及12-巯基十二烷酸,或10-巯基十烷基三甲胺和11-巯基十一烷酸。
所述肿瘤微环境酶响应性配体中酶例如为基质金属蛋白酶(MMP)。基质金属蛋白酶(MMP)属于锌依赖性内肽酶家族,是常见肿瘤微环境高表达的酶之一。
所述探针为用于医学成像的探针。所述医学成像选自核医学成像(例如PET-CT)、磁共振成像(MRI)、CT成像中的任一种或多种。例如所述探针可以作为PET-MRI显像探针、PET-CT显像探针。
在本发明的某些实施方式中,所述探针的结构示意图如图1所示。
本发明还提供所述纳米探针的制备方法,包括如下步骤:
1)将放射性核素、磁共振成像物质以及多巴胺或多巴胺衍生物与金属纳米材料混合,以使放射性核素、磁共振成像物质以及多巴胺或多巴胺衍生物包裹于金属纳米材料;
2)将步骤1)的产物表面接枝肿瘤微环境响应性配体,获得所述纳米探针。
在本发明的某些实施方式中,步骤1)中金属纳米材料采用一步法合成或通过商业途径购买金属纳米材料。
在本发明的某些实施方式中,步骤1)中金属纳米材料为金纳米棒,以金属纳米棒为例介绍金纳米棒的合成步骤包括:将氯金酸与添加剂、还原剂混合反应得到金纳米棒。所述添加剂包括十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、盐酸、银离子、对苯二酚。以反应体系的总体积为基准,所述氯金酸的终浓度为0.3~3mM;CTAB的终浓度为0.05~0.5M;盐酸终浓度1.0~5.0mM;银离子终浓度为0.3~1.5mM,;对苯二酚终浓度为2~10mM;还原剂终浓度为20~60μM。氯金酸和CTAB的终摩尔浓度比值为0.5:(90~110)。在一种实施方式中,以反应体系的总体积为基准,所述氯金酸的终浓度为0.5mM,CTAB的终浓度为0.1M,盐酸终浓度2.7mM,银离子终浓度为0.75mM,,对苯二酚终浓度为5mM,硼氢化钠终浓度为40μM。在一种实施方式中,金属纳米材料制备步骤中银离子由硝酸银提供。还原剂为硼氢化钠。
在一种实施方式中,金属纳米材料制备步骤中将氯金酸与添加剂的反应时间为10~20分钟。氯金酸与添加剂反应结束后,再添加还原剂。加入还原剂后反应时间为16~24小时。反应时间例如为16~18小时、18~20小时、20~24小时。
在本发明的某些实施方式中,步骤1)中可以将放射性核素、磁共振成像物质、以及多巴胺或多巴胺衍生物与金属纳米材料直接混合后进行反应。
在本发明的某些优选的实施方式中,步骤1)为:将放射性核素Ga
具体的,步骤1)中按照如下顺序混合:
1A)将金属纳米材料与多巴胺或多巴胺衍生物混合以使金属纳米材料全部或部分表面上包覆多巴胺或多巴胺衍生物层;
1B)将放射性核素、磁共振成像物质与步骤1A)的产物混合。
按照该顺序混合反应的优点是反应产生的杂质少,而且可以分别创造更有利于多巴胺或多巴胺衍生物包覆金属纳米材料的环境,以及放射性核素、磁共振成像物质标记金属纳米材料的环境(即磁共振成像物质可以离子形式均匀分散在体系中,并结合在多巴胺包裹层表面)。
步骤1)中,无论是以上哪种实施方式,即无论是将所有反应物同时混合,还是按照步骤混合,这两种方式体系中各反应物的终浓度相同。
在本发明的某些实施方式中,步骤1)中将金属纳米材料与多巴胺或多巴胺衍生物在弱碱性(pH8.2~8.8)条件下混合。在本发明的某些实施方式中,弱碱性条件由Tris-buffer、NaOH溶液、氨水提供。在一种具体的实施方式中,将多巴胺或多巴胺衍生物用弱碱性溶液溶解形成多巴胺或多巴胺衍生物溶液,再将多巴胺或多巴胺衍生物溶液与金属纳米材料混合。或将固体多巴胺或多巴胺衍生物与金属纳米材料混合后,再用弱碱性溶液溶解。金属纳米材料与多巴胺或多巴胺衍生物的混合时间为10-40分钟。
在弱碱性条件下,多巴胺或多巴胺衍生物可以通过表面自聚集的方式在金属纳米材料表面形成包覆层。
多巴胺或多巴胺衍生物的量相对于金属纳米材料按照摩尔量计通常是过量的。在本发明的某些实施方式中,以步骤1)中反应体系的总体积为基准,多巴胺的终浓度为0.05~0.4mg/mL。例如为0.05~0.1mg/mL、0.1~0.2mg/mL、0.2~0.3mg/mL、0.3~0.4mg/mL。
在本发明的某些实施方式中,1毫克每毫升的金属纳米材料上能够标记放射性核素的最大量为1.18μg,和/或,标记磁共振成像物质的最大量为9.63μg。向反应体系中加入放射性核素和磁共振成像物质时,可以超过前述金属纳米材料所能标记的最大量,即反应体系中,放射性核素和磁共振成像物质是过量的。
在本发明的某些实施方式中,步骤1)中以反应体系的总体积为基准,磁共振成像物质的终浓度为0.01~0.2mol/L。
在本发明的某些实施方式中,步骤1)放射性核素、磁共振成像物质与金属纳米材料或包覆有多巴胺或多巴胺衍生物层的金属纳米材料的混合时间为10-40分钟。
在本发明的某些实施方式中,步骤1)的反应温度为15~35℃。
在本发明的某些实施方式中,所述顺磁性金属离子为Gd
在本发明的某些实施方式中,以反应体系的总体积为基准,步骤2)中肿瘤微环境响应性配体的终浓度为0.1~1mg/ml。
在本发明的某些实施方式中,步骤2)中肿瘤微环境响应性配体中12-巯基十二酸和11-硫基十一烷基三甲胺的摩尔比为1比1;或10-巯基十烷基三甲胺和11-巯基十一烷酸的摩尔比为1比1。
在本发明的某些实施方式中,步骤2)的反应温度为20~35℃,和/或,反应时间为10-30分钟。
在本发明的某些实施方式中,步骤2)反应在溶剂中进行。本领域技术人员可以选择合适的溶剂种类和用量,以使反应物可以在反应体系中充分分散。所述溶剂可以是水或有机溶剂。优选的溶剂为水。
在本发明的某些实施方式中,步骤2)反应结束后还包括超滤、分离步骤。
以如图2为例,所述纳米探针的制备方法包括如下步骤:
将金纳米棒探针在弱碱性条件下与多巴胺衍生物、放射性核素
本发明还提供所述纳米探针在制备医学成像产品例如(CT显像产品、PET/CT显像产品、PET/MRI显像产品)、疾病诊断产品、疾病预后评估产品、疾病治疗产品或疾病治疗增强产品中的用途。
在本发明的某些实施方式中,所述疾病选自肿瘤。所述肿瘤为富血供肿瘤。所述肿瘤选自结直肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、脑胶质瘤、胰腺癌、肾癌、子宫内膜癌、卵巢癌等上皮性肿瘤。
所述疾病诊断产品为疾病在体诊断产品。
本发明的探针为针对结直肠癌的诊疗一体化探针
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式,本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用,本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用,在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前,应理解,本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围;在本发明说明书和权利要求书中,除非文中另外明确指出,单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时,应理解,除非本发明另有说明,每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义,本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外,根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载,还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1纳米探针的制备
首先使用一步法制备出超小金纳米棒:将氯金酸(5mL 0.5mM)与5mL 0.2M十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)混合,加入30μL浓盐酸和0.01M硝酸银,加入对苯二酚(0.05M)后反应15分钟,最终将0.03mL冰浴的(0.01M)硼氢化钠快速加入至混合溶液中,1200rpm搅拌3分钟后,静置16小时获得超小金纳米棒(如图3所示)。
将锗镓发生器淋洗出的放射性核素
8.5的Tris-buffer,室温下搅拌0.5小时,将产物转移到5mL水溶液中,将12-巯基十二酸和11-硫基十一烷基三甲胺(1mg)以摩尔配比1比1加入体系中室温下反应0.5小时,后超滤并用超滤管分离获得产物pH响应的
实施例2纳米探针的表征
超小金纳米棒(UGNRs)探针形貌如图5所示。通过种子生长法所制备出的超小金纳米棒探针经TEM透射电镜选区测量,长径为15-20nm,短径为3-5nm,形貌较为均一(图5A-B)。而其水合粒径测量结果约为3nm左右(图5E)。在采用多巴胺包覆并共标记
材料的紫外可见吸收峰如图5F,制备的金种在生长成超小金纳米棒之后,在700nm左右出现了一个显著的吸收峰,而包裹了多巴胺之后,材料的紫外可见吸收峰红移到800nm处,证明多巴胺包覆层修饰在了超小金纳米棒上。
为了进一步确定超小金纳米棒探针对放射性核素
取100μLpH响应的
测试pH响应的
探针的细胞毒性通过CCK-8法测定。HCT116细胞以10000个细胞/每孔的密度,用96孔板铺板。用50μg/mL金浓度的pH响应的
通过配置一系列不同pH的溶液(pH=5.5、6、6.5、7、7.5),将50μg金质量的pH响应的
实施例3纳米探针用于PET/CT早期结直肠癌诊断
步骤如下:
将实施例1制备得到的PET/MR显像探针溶解于生理盐水,通过尾静脉注射给药;以20g动物体重为计,给药浓度为1mM;给药体积为100-200μL;实验动物为MC38结直肠癌肿瘤细胞构建的荷瘤裸鼠。实验分为三组进行MR成像,分别为
T1加权MRI图像显示,在注射pH sensitive
为了进一步印证探针可用于结直肠癌的PET/CT诊断,观察探针在荷瘤鼠体内实时动态的PET/CT成像。小鼠通过尾静脉注射40mg Au/kg b.w.剂量的探针,
为了组织学上进一步印证上述成像结果,PET/CT成像后,处死这些模型小鼠,摘除肿瘤并进行银染色和免疫组化染色。结果如图9所示,pH sensitive
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案,并不能理解为对本发明的限制。此外,本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化,在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述,但应当理解,本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上,各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
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