基于布鲁氏菌的双重数字PCR方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体地说，涉及一种基于布鲁氏菌的双重数字PCR方法。

背景技术

布鲁氏菌是胞内寄生致病菌，其毒力基因在于四型分泌系统，布鲁氏菌的胞内运输是在VirB编码的四型分泌系统的调节下完成的，四型分泌系统可以转运蛋白质和/或DNA和/或蛋白复合物，跨越细胞膜建立一个转运的通道然后与靶细胞结合，使得分泌的蛋白到达靶细胞；布鲁氏菌的基因编码区有12个开放阅读框，分别为VirB1~VirB11以及VirB12，其中，VirB1~VirB11与以农杆菌的VirB编码区同源，VirB12与以农杆菌的VirB编码区没有同源性。在胞内运输时通过VirB8建立通道以供是VirB蛋白进入外膜，VirB12进入胞内起到布鲁氏菌的致病力作用，因此，对于布鲁氏菌致病力的研究中对于VirB8以及VirB12的检测是必不可少的。

现有技术中VirB8以及VirB12的检测方法有多种，其中PCR检测方法是最为常见的一种，硕士学位论文《布鲁氏菌VirB8-PCR诊断方法的建立与应用及Ery基因的克隆与序列分析》（吴冬玲，新疆农业大学，第12-25页）公开了一种布鲁氏菌VirB8-PCR方法，以布鲁氏菌致病因子VirB8基因为模板，设计引物，优化反应条件和程序，建立VirB8-PCR方法用于对VirB8致病因子的检测，通过PCR方法可以有效的对布鲁氏菌致病因子VirB8进行检测。另外，中国发明专利CN116183902A公开了一种鉴别布鲁氏菌A19-VirB12疫苗免疫动物与感染动物的血清学方法，具体的是，通过皮下注射的方式对犊牛接种A19-VirB12疫苗并且采集血清，通过对血清样品应用NH-AGID方法进行检测，当检测结果出现LPS和NH两条沉淀线或仅一条NH沉淀线即表明该血清为布鲁氏菌感染抗体阳性。

通过上述的方法可以对VirB8以及VirB12致病因子进行检测，但是，现有技术中在对VirB8以及VirB12致病因子进行检测的过程中还存在如下的缺陷：现有技术中的检测方法无法对VirB8以及VirB12致病因子同步进行检测，只能单一的分别对VirB8或VirB12致病因子进行单独检测，并且，无论通过PCR方法或NH-AGID方法进行检测时只能进行定性分析，无法进行定量分析，无法满足对布鲁氏菌的检测要求，因此，设计一种能够同时对VirB8以及VirB12致病因子进行检测的方法在对布鲁氏菌致病因子的研究中尤为重要。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

为解决现有技术中针对布鲁氏菌进行研究时无法对VirB8以及VirB12致病因子进行同步检测的问题，本发明采用如下的技术方案。

一种基于布鲁氏菌的双重数字PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：

DNA模板的提取：提取布鲁氏菌中的DNA模板，包括VirB8以及VirB12DNA模板；

PCR扩增：将VirB8以及VirB12DNA模板添加到PCR反应体系中进行微滴处理后进行PCR扩增；

定性定量分析：对PCR扩增后的体系进行定性定量分析。

优选地，上述的双重数字PCR方法中，PCR反应体系包括：

2×supermix反应液；VirB8-F引物；VirB8-R引物；VirB8-Probe探针；VirB12-F引物；VirB12-R引物；VirB12-Probe探针以及所述的VirB8以及VirB12DNA模板和DEPC水。

优选地，上述的双重数字PCR方法中，

VirB8-F引物的基因序列如SEQ NO.1所示；

VirB8-R引物的基因序列如SEQ NO.2所示；

VirB8-Probe探针的基因序列如SEQ NO.3所示；

VirB12-F引物的基因序列如SEQ NO.4所示；

VirB12-R引物的基因序列如SEQ NO.5所示；

VirB12-Probe探针的基因序列如SEQ NO.6所示。

优选地，上述的双重数字PCR方法中，

PCR反应体系包括：

2×supermix反应液15uL；

VirB8-F引物1.6uL；

VirB8-R引物1.6uL；

VirB8-Probe探针0.8uL；

VirB12-F引物1.6uL；

VirB12-R引物1.6uL；

VirB12-Probe探针0.8uL；

VirB8模板1uL；

VirB12DNA模板1uL；

DEPC水5uL。

优选地，上述的双重数字PCR方法中，微滴处理的步骤为：

将反应体系添加到DG8孔板的第一排8个孔中，并在DG8孔板的第二排中加入微滴生成油，通过微滴生成版胶垫密封，将含有上述反应体系以及微滴生成油的孔板置入微滴生成仪中进行微滴处理形成油包水微滴。

优选地，上述的双重数字PCR方法中，定性定量分析的步骤如下：

采用数字PCR微滴分析仪数字PCR微滴分析仪对孔板中的微滴进行FAM及VIC通道检测并记录阳性微滴的比例数；

其中FAM通道检测VirB8基因序列，VIC检测VirB12基因序列。

本发明另一方面还提供了上述双重数字PCR方法的灵敏度检测方法，包括如下步骤：

构建质粒：包括构建VirB8质粒和VirB12质粒；

质粒稀释：将上述的VirB8质粒或VirB12质粒等比例进行梯度稀释；

PCR检测：将稀释后的VirB8质粒或VirB12质粒进行数字PCR检测。

优选地，上述的灵敏度检测方法中，构建VirB8质粒的步骤如下：

以SEQ NO.7所示的基因序列质粒即PUC质粒为模板，将SEQ NO.8所示的VirB8基因序列插入 PUC质粒构建VirB8质粒。

优选地，上述的灵敏度检测方法中，构建VirB12质粒的步骤如下：

以SEQ NO.7所示的基因序列质粒即PUC质粒为模板，将SEQ NO.9所示的VirB12基因序列插入PUC质粒构建VirB12质粒。

优选地，上述的灵敏度检测方法中，稀释后VirB8质粒或VirB12质粒的浓度为：1.0×10

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明提供了一种基于布鲁氏菌的双重数字PCR方法，具体的是对布鲁氏菌中的VirB8以及VirB12进行检测，包括如下步骤：首先对VirB8以及VirB12进行PCR扩增，扩增后的体系置入数字PCR分析仪中进行双通道检测，分别对VirB8以及VirB12进行同步检测，进而能够实现同步检测VirB8以及VirB12的目的，另外，本发明中的检测方法可以对VirB8以及VirB12的阳性微滴的比例数进行记录，从而能够实现一方面对VirB8以及VirB12进行定性分析，另一方面也可以对VirB8以及VirB12进行定量分析。

本发明中的双重数字PCR方法在使用时还进行了灵敏性分析，对该方法的灵敏性进行检测，具体的是构建标准质粒并对标准浓度的质粒进行梯度稀释，通过对不同浓度的标准质粒进行PCR检测分析，从而能够得到该方法的检出限，因此，能够对该方法的灵敏度进行分析，使得该方法能够应用在不同检测需求的技术中，一方面保障了该方法的灵敏度，另一方面扩大了该方法的应用范围。

另外，本发明中的PCR方法还提供了一种特异性分析方法，具体的是，以大肠杆菌等其他菌种作为对照，通过该方法对布鲁氏菌以及其他对照菌进行分析检测，结果显示该方法能够有效检测布鲁氏菌，保障了该检测方法的准确度，明确了该检测方法的有效性。

附图说明

图1为本发明双重数字PCR灵敏性实验中的FAM散点图；

图2为本发明双重数字PCR灵敏性实验中的VIC散点图；

图3为本发明双重数字PCR特异性实验中的FAM散点图；

图4为本发明双重数字PCR特异性实验中的VIC散点图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。本发明提供了以下实施例。

本发明实施例提供了一种同步针对VirB8以及VirB12致病因子进行同步检测的方法，具体的是，采用数字PCR方法对VirB8以及VirB12致病因子进行同步检测，解决了现有技术中无法对VirB8以及VirB12致病因子进行同步检测的缺陷，该检测方法通过双重数字PCR方法对VirB8以及VirB12致病因子进行检测，具体的方法包括如下步骤：

首先，针对VirB8以及VirB12进行探针的设计与合成，具体的VirB8以及VirB12的引物探针序列如下：

VirB8-F: 5'-ACGAAACCGTAGGCATGTT-3'

VirB8-Probe: (FAM)5'-AAGCCAGTTCCAGGGCGATAAGG-3' (BHQ1)

VirB8-R: 5'-GCGCACATTTGAGCCATATT-3'

VirB12-F: 5'-GCCTGACGGACAACAACTC-3'

VirB12-Probe: (VIC)5'-CGTGCGCTGGCTATCTATAATTGGCT-3'(BHQ1)

VirB12-R: 5'-CGGGTACGCCTTGATTGAT-3'；

其次，对样品进行采集，具体的是，取感染布鲁氏菌的动物组织或病料放在2 mL离心管中，剪碎，并加入适量的灭菌PBS，放入钢珠，在振动频率为20-30 Hz的环境下进行振动，时间2 min，然后取出钢珠，接着将病料放置于-80 ℃冰箱内反复冻融3次，然后放入离心机内进行离心5min，其中，离心机的运行转速为10000 rpm，完成上述操作后把样品放在-80℃冰箱保存备用。

再者，对DNA模板进行数字PCR方法，该方法包括如下步骤：

第一步，对采集的样品进行提取DNA模板，将上述样品采用试剂盒法对布鲁氏菌的DNA进行提取，标记为DNA模板。

第二步，构建数字PCR反应体系，具体的是，将2×supermix反应液15uL、SEQ NO.1所示的VirB8-F引物1.6uL、SEQ NO.2所示的VirB8-R引物1.6uL、SEQ NO.3所示的VirB8-Probe探针0.8uL、SEQ NO.4所示的VirB12-F1.6uL、SEQ NO.5所示的VirB12 -R1.6uL、SEQNO.6所示的VirB12 -Probe探针0.8uL以及VirB8的DNA模板1uL、VirB12的DNA模板1uL和DEPC水5uL添加到灭菌PCR反应管中构建数字PCR反应体系，该反应体系的总体积为30uL。

第三步，微滴处理，将上述的反应体系添加到DG8孔板的第一排8个孔中，并在DG8孔板的第二排中加入180uL微滴生成油，然后采用微滴生成版胶垫盖好密封，将含有上述反应体系以及微滴生成油的孔板置入微滴生成仪中，通过电脑程序运行300s即可生成微滴，形成油包水微滴。

第四步，PCR扩增，按照表1所示的反应条件进行PCR扩增；

表1：PCR反应条件

第五步，将上述扩增反应后的体系进行定性定量分析，具体的是，将扩增完的DG8孔板置入数字PCR微滴分析仪，通过电脑程序进行微滴数据读取，数字PCR微滴分析仪会自动吸取孔板中的微滴进行FAM及VIC通道检测，其中FAM通道检测VirB8基因序列，VIC检测VirB12基因序列，能检测到的蓝色荧光信号为FAM阳性微滴，能检测到的绿色荧光信号为VIC阳性微滴，无蓝色荧光信号的为FAM阴性微滴，无绿色荧光信号的为VIC阴性微滴。软件会自动记录样品的阳性微滴的比例数，并根据泊松分布原理计算出检测浓度拷贝数。

通过该定性定量分析可以同步对VirB8以及VirB12致病因子进行定性定量检测，以满足对布鲁氏菌的检测要求。

本实施例一方面提供了上述同步对VirB8以及VirB12致病因子进行检测的方法，另一方面还提供了上述双重数字PCR方法进行灵敏性检测的方法，具体的包括如下步骤：

首先，构建质粒，以SEQ NO.7所示的基因序列质粒即PUC质粒为模板，将SEQ NO.8所示的VirB8基因序列插入 PUC质粒构建VirB8质粒；以SEQ NO.7所示的基因序列质粒即PUC质粒为模板，将SEQ NO.9所示的VirB12基因序列插入PUC质粒构建VirB12质粒。

其中，PUC质粒的基因序列为：

TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCTCGCGAATGCATCTAGATATCGGATCCCGGGCCCGTCGACTGCAGAGGCCTGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC；

VirB8插入PUC质粒基因的片段序列为：

ATGTTTGGACGCAAACAATCTCCACAGAAATCAGTAAAGAACGGGCAGGGCAATGCGCCTTCGGTATATGACGAAGCGTTGAACTGGGAGGCCGCGCACGTCCGGCTGGTCGAAAAATCCGAACGCCGCGCGTGGAAAATCGCCGGGGCTTTCGGCACCATTACCGTGCTGCTCGGGATCGGCATCGCCGGGATGTTACCGCTAAAGCAACATGTGCCCTACCTGGTGCGCGTCAACGCACAGACAGGTGCGCCTGATATCCTGACCTCGCTCGACGAGAAGAGTGTCAGCTACGACACTGTAATGGATAAATACTGGCTCTCGCAGTACGTGATAGCGCGTGAAACCTACGACTGGTACACGCTGCAAAAGGACTACGAAACCGTAGGCATGTTGTCGTCGCCGTCCGAAGGGCAGAGCTATGCAAGCCAGTTCCAGGGCGATAAGGCGCTTGACAAGCAATATGGCTCAAATGTGCGCACATCGGTAACGATCGTAAGCATCGTGCCGAACGGCAAGGGCATCGGCACGGTGCGCTTTGCGAAGACGACAAAGCGCACCAACGAGACCGGTGACGGCGAAACAACGCACTGGATCGCCACCATTGGCTACCAATACGTCAATCCCTCTTTGATGTCGGAATCGGCCCGCCTGACAAACCCGCTGGGTTTCAATGTCACGAGCTATCGCGTTGACCAGAAATGGGAGTGGTGCAATGA；

VirB12插入PUC质粒基因的片段序列为：

ATGCGCACATTGGTTATGGTCGCATGCGCTGTCTCTCTGGCCGCTTGTTCCAGCCCGCCGAAGCCGCCCACAGTCAGCGGACGCCACCGCATTCCGATAAACAGCCCGGCGGCACAAGAGGAACTGCGCTTGCAGGTTTTCCCGCAAGAACCCACCGCGCAAGCAACCATGTGGCCAGCACGGCCGCCCAAACAAACAGTCAACGTGTATTTTCCCCAGGATGTGACGGTATTCCGGCCAACATCCGCACAGATAAACCAACTCCACACACTGCTCTGGCCCGTGCCCAAGCATATCAACGTCAGGGGCCTGACGGACAACAACTGCCCTCCTCCCGGTGATACGCAAGTCGCGCGTGTCCGTGCGCTGGCTATCTATAATTGGCTGATCAATCAAGGCGTACCCGCCAGCAGGATCACCATAAGCTATGCCCCGGTAAAAGATTACGCATCAAATGCCCCCCTTTCACCGGGCCGCGTCCTGAACAGGCGCGTGGATATCGAAATTTTACGCAAGTAA。

分别以VirB8与VirB12质粒标准品为样本，统一稀释到1.0×10

表2 灵敏性检测结果

由表2可知，上述灵敏度检测方法在对VirB8进行检测时，当VirB8质粒标准品浓度为2.5copies/uL能够检出，当VirB12质粒标准品浓度为1.25copies/uL能够检出，因此，VirB8及VirB12检测灵敏度分别为2.5 copies/μL和1.25 copies/μL。

另外，本实施例还提供了一种双重数字PCR特异性实验方法，具体的如下：

将上述的VirB8和VirB12质粒标准品为样本，分别以大肠杆菌、沙门氏菌、结核杆菌为对照样本，PBS为阴性对照及空白对照，用上述方法进行对比，分别读取结果。该结果如表3所示。

表3 特异性结果

由上可知，采用如SEQ NO.1所示的VirB8-F引物、SEQ NO.2所示的VirB8-R引物、SEQ NO.3所示的VirB8-Probe探针、SEQ NO.4所示的VirB12-F引物、SEQ NO.5所示的VirB12-R引物、SEQ NO.6所示的VirB12 -Probe探针能够有效对VirB8及VirB12进行扩增表达，对大肠杆菌、结核杆菌以及沙门氏菌无表达结果。

以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。