一种利用微生物发酵产物制备载药生物膜的方法

技术领域：

本发明涉及医用材料领域，特别是涉及一种利用微生物发酵产物制备载药生物膜的方法。

技术背景：

随着医疗科学技术的不断发展，各种新药层出不穷，虽然不同药物的作用机理和代谢机理各有不同，但其最终对于人体细胞的和疾病位点的作用中，对于药物缓释、增加药物定向效果、降低药物毒副作用的目标是一致的。随着生物材料、高分子材料的不断研发和创新，把安全高效的高分子用于载药以达到此目标是当下医药领域研究的热门课题。

如中国专利，申请号为201110005612.6，专利名称为：一种制备载药生物膜的方法。该专利公开了一种利用胶原蛋白作为载药生物膜的制备方法。

早在20世纪60年代，化学家们就设想和提出利用高分子材料应用在医药领域，制备高分子载体成为改善药物最有效的方法。从此高分子药物载体研究越来越广泛，作为药物载体的安全性高分子材料一直是医用领域研究中最热门的话题。缓控释系统是指药物能在指定的时间内按预定的速度释放在指定的位置，它可以控制药物在体内的释放速度，使药物能保持有效浓度，减少副作用的发生。

作为药物的缓释载体，其必须具备以下特点(1)良好的生物相容性；(2)能保持细胞正常生长、分化、增殖能力和分泌机制；(3)具有可控的讲解时间(4)材料及讲解产物对人体无毒副作用；(5)具备可消毒性。

基于以上要求，天然高分子材料由于其具备稳定、无毒、成膜性好等特点，符合以上要求，成为21世纪医药科学领域的研究热点。

但是由于药物缓释性并不能解决药物在体内对非靶点细胞的损伤，无法解决定向释放的问题，无法解决达到同样效果而降低药物剂量的效果，从而无法在解决药物对正常细胞的毒副作用，尤其诸如一些本身细胞毒性较大的抗肿瘤药物，如果能够解决药物定向释放的问题，那可以让普通药物实现一定程度靶向富集的药物属性。

酵母菌、嗜热栖热菌等微生物是近十年以来研究十分热门的菌种，其发酵产物为一种安全系数很高的生物膜结构，和人体的生物相容性和毒副作用很小，已经广泛应用于化妆品领域。由于这类微生物发酵产物的膜结构中，有着和人体细胞很相似的结构，因此能够更好的与人体细胞相容。而且由于其安全系数高，生物降解性好的特性，如果应用于药物载体中，那将释放出优异的性能，并且在实现同等药物效果而降低药物使用浓度具有十分广阔的前景。

在实验过程中发现，其发酵产物和药物负载的过程中，由于其生物膜结构与药物分子结构中亲水性基团的相容性影响，出现负载药物分布不均衡等缺陷，为解决这个缺陷，通过在包载过程中，在发酵产物中加入一定浓度的糖类或者多元醇类物质进行稀释分散，如：葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖醇、甘露醇、山梨醇，能够分离提取得到改良型的生物膜结构，对药物的包载和分散起到显著的效果。

发明内容：

本发明的目的是提供一种利用微生物发酵产物制备载药生物膜的方法，并利用多糖、多元醇分散体系改进载药生物膜结构。为了实现上述目的，本发明制备方法，包括下述步骤：

1)菌种复苏：将-80℃微生物接种到100ml的液体培养基中，置于温度37℃，转速100rpm的摇床中避光培养，作为菌种基液；

2)将微生物菌种基液按照一定比例接入液体培养基中，摇床中避光培养；

3)在上述步骤2)的菌种基液中，加入0.5％-20％的糖类或者多元醇类物质的水溶液，放入离心瓶中，离心，弃去上清液，保留少量液体重悬沉淀；

4)将液体重悬沉淀移至离心管中，离心弃去上清液后，加入适量磷酸缓冲盐溶液(PBS溶液)，并转移到灭菌过的烧杯中，利用细胞破碎仪冰浴超声破碎；

5)将超声破碎后样品转移至离心管中，离心后取上清液保留，弃去沉淀，得到改良型生物膜结构；

6)将步骤5)得到的生物膜结构加入P45AT型号转子配套离心管中，利用PBS溶液排空离心管内气泡，之后在35000rpm(离心力144000G)，4℃条件下离心45min，留取沉淀中质地较软的红棕色固体，弃去黑色固体，利用50％甘油重悬红棕色液体放入-20℃冰箱保存；

7)取用上述红棕色固液体5ml，利用PBS溶液稀释5倍，利用细胞破碎仪冰浴超声破碎2h(超声5s，停5s，功率390W)，在超声破碎开始后利用注射器缓慢滴加加入浓度为30mg/ml的药物溶液1.5ml；超声破碎后将液体转移至离心管中，在6750rpm(离心力5000G)，4℃条件下离心30min，取上清用作后续检测，弃去沉淀，得到载药生物膜。在上述一种利用微生物发酵产物制备载药生物膜的方法中，步骤1)中摇床避光培养时间为12-60小时。

在上述一种利用微生物发酵产物制备载药生物膜的方法中，步骤2)中微生物菌种基液和培养基液的容积比例为1：1-1：10

在上述一种利用微生物发酵产物制备载药生物膜的方法中，步骤2)中液体培养基的培养温度为20℃-110℃。

在上述一种利用微生物发酵产物制备载药生物膜的方法中，步骤1)、2)培养基类型为酵母浸膏-胰蛋白胨培养基。

在上述一种利用微生物发酵产物制备载药生物膜的方法中，步骤3)中加入的多元醇或者糖类为葡萄糖、果糖、麦芽糖、木糖醇、甘露醇、山梨醇中的一种。

在上述一种利用微生物发酵产物制备载药生物膜的方法中，步骤3)加入的糖类或者多元醇类物质的水溶液为培养液容积的的0.5％-8％。

在上述一种利用微生物发酵产物制备载药生物膜的方法中，步骤4)、6)、7)中选择磷酸缓冲盐溶液(PBS溶液)的PH为5.6-7.8。

在上述一种利用微生物发酵产物制备载药生物膜的方法中，步骤7)中所述药物溶液为丙酮溶剂、乙醇溶剂、甲醇溶剂的一种。

在上述一种利用微生物发酵产物制备载药生物膜的方法中，步骤7)中所述药物为姜黄素、顺铂、卡铂、伊立替康、拓扑替康、羟基喜树碱、阿霉素、表阿霉素、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、依托泊苷的一种。

本发明通过利用当下热门的酵母菌、大肠杆菌、嗜热栖热菌、长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌等微生物发酵产物形成的生物膜，在磷酸缓冲盐溶液(PBS溶液)中，将一定浓度的药物进行包载，如：神经系统药物、循环系统药物、消化系统药物、呼吸系统药物、免疫系统药物、运动系统药物、泌尿系统药物、生殖系统药物、感觉器官药物、皮肤药物、抗肿瘤药、抗感染药、抗寄生虫药、激素制剂和解毒剂，形成具有缓释作用、靶向富集、药物毒副作用低的载药制剂，在解决药物安全性领域有着广阔的应用前景。在利用生物膜载药的同时，本发明重点解决了以下问题，产生了显著的优异性：

1.药物和生物膜包载过程中，由于生物膜和药物的相容性和生物膜结构问题，导致药物容易包载不均匀，通过加入化学相容性鉴于药物和生物膜之间的糖类或者多元醇类物质进行稀释分散，让药物在生物膜中包载均匀，稳定性高，化学分散性好的特点。

2.本发明选取的多糖和多元醇类物质具备生物安全性强，对人体副作用低，并且是广泛用于注射液的物质，由于多元醇或者多糖体系中生物活性官能团以羟基为主，并不会和包载药物发生化学反应而导致活性药物性能下降或者失效。

3.本制备方法选取的生物膜和人体细胞具有很强的生物相容性，由生物膜作为媒介，药物能够更好的与细胞结合，减少无效性的游离量，在保证药物产生同等效果下，有效降低的药物的使用剂量，降低了药物的毒副作用，尤其对一些本身具有较大生物毒性的药物，产生了十分良好的效果，可以作为进一步研究，加强此类药物靶向富集的功效。

具体实施方式下面通过实际案例，对本发明的具体实施方式做进一步详细描述。以下面实施例用于说明本发明，但不用做限制本发明范围。

实施例1：姜黄素载药生物膜的制作方法

1.材料和设备：

1.1.嗜酸乳杆菌：(国药集团化学试剂有限公司)

1.2.液体培养基：(自制)

1.3.葡萄糖：(国药集团化学试剂有限公司)

1.4.磷酸缓冲盐溶液(PBS缓冲盐溶液)：(自制)

1.5.姜黄素-丙酮溶液：(自制)

1.6.摇床

1.7.离心机

1.8.细胞破碎仪

2.制作方法：

2.1.菌种复苏：将-80℃嗜酸乳杆菌菌种接种到100ml的酵母浸膏-胰蛋白胨培养基中，置于温度37℃，转速100rpm的摇床中避光培养12小时，作为菌种基液

2.2.将嗜酸乳杆菌菌种基液按照1：1的比例接入酵母浸膏-胰蛋白胨培养基中，摇床中避光培养，培养温度为20℃；

2.3.在上一步的菌液中，加入0.5％的葡萄糖水溶液，放入离心瓶中，离心，弃去上清液，保留少量液体重悬沉淀。

2.4.将液体重悬沉淀移至离心管中，离心弃去上清液后，加入50毫升磷酸缓冲盐溶液(PBS溶液)(pH＝5.6)，并转移到灭菌过的烧杯中，利用细胞破碎仪冰浴超声破碎。

2.5.将破碎后样品转移至离心管中，离心后取上清保留，弃去沉淀，得到改良型生物膜结构；

2.6.将上步保留样品加入P45AT型号转子配套离心管中，利用PBS溶液(pH＝5.6)排空离心管内气泡，之后在35000rpm(离心力144000G)，4℃条件下离心45min，留取沉淀中质地较软的红棕色固体，弃去黑色固体，利用50％甘油重悬红棕色液体放入-20℃冰箱保存；

2.7.取用红棕色液体5ml，利用PBS溶液(pH＝5.6)稀释5倍，利用细胞破碎仪冰浴超声2h(超声5s，停5s，功率390W)，在超声开始后利用注射器缓慢滴加加入浓度为30mg/ml的姜黄素-丙酮溶液1.5ml。超声后将液体转移至离心管中，在6750rpm(离心力5000G)，4℃条件下离心30min，取上清用作后续检测，弃去沉淀，得到载药生物膜。

实施例2：依托泊苷载药生物膜的制作方法

1.材料和设备：

1.1.嗜热栖热菌：DSM579(国药集团化学试剂有限公司)

1.2.液体培养基：(自制)

1.3.山梨醇：(国药集团化学试剂有限公司)

1.4.磷酸缓冲盐溶液(PBS缓冲盐溶液)：(自制)

1.5依托泊苷-乙醇溶液：(自制)

1.6.摇床

1.7.离心机

1.8.细胞破碎仪

2.制作方法：

2.1.菌种复苏：将-80℃嗜热栖热菌菌种接种到100ml的酵母浸膏-胰蛋白胨培养基中，置于温度37℃，转速100rpm的摇床中避光培养60小时，作为菌种基液

2.2.将嗜热栖热菌菌种基液按照1：10的比例接入酵母浸膏-胰蛋白胨培养基中，摇床中避光培养，培养温度为65℃；

2.3.在上一步的菌液中，加入8％的山梨醇水溶液，放入离心瓶中，离心，弃去上清液，保留少量液体重悬沉淀。

2.4.将菌液移至离心管中，离心弃去上清液后，加入50毫升磷酸缓冲盐溶液(PBS溶液)(pH＝7.8)，并转移到灭菌过的烧杯中，利用细胞破碎仪冰浴超声破碎。

2.5.将破碎后样品转移至离心管中，离心后取上清保留，弃去沉淀，得到改良型生物膜结构；

2.6.将上步保留样品加入P45AT型号转子配套离心管中，利用PBS溶液(pH＝7.8)排空离心管内气泡，之后在35000rpm(离心力144000G)，4℃条件下离心45min，留取沉淀中质地较软的红棕色固体，弃去黑色固体，利用50％甘油重悬红棕色液体放入-20℃冰箱保存；

2.7.取用红棕色液体5ml，利用PBS溶液(pH＝7.8)稀释5倍，利用细胞破碎仪冰浴超声2h(超声5s，停5s，功率390W)，在超声开始后利用注射器缓慢滴加加入浓度为30mg/ml的依托泊苷-乙醇溶液1.5ml。超声后将液体转移至离心管中，在6750rpm(离心力5000G)，4℃条件下离心30min，取上清用作后续检测，弃去沉淀，得到载药生物膜。

实施例3：羟基喜树碱载药生物膜的制作方法

1.材料和设备：

1.1.嗜热栖热菌：DSM579(国药集团化学试剂有限公司)

1.2.液体培养基：(自制)

1.3.麦芽糖：(国药集团化学试剂有限公司)

1.4.磷酸缓冲盐溶液(PBS缓冲盐溶液)：(自制)

1.5羟基喜树碱-丙酮溶液：(自制)

1.6.摇床

1.7.离心机

1.8.细胞破碎仪

2.制作方法：

2.1.菌种复苏：将-80℃嗜热栖热菌菌种接种到100ml的酵母浸膏-胰蛋白胨培养基中，置于温度37℃，转速100rpm的摇床中避光培养42小时，作为菌种基液

2.2.将嗜热栖热菌菌种基液按照1：5的比例接入酵母浸膏-胰蛋白胨培养基中，摇床中避光培养，培养温度为45℃；

2.3.在上一步的菌液中，加入4％的麦芽糖水溶液，放入离心瓶中，离心，弃去上清液，保留少量液体重悬沉淀。

2.4.将菌液移至离心管中，离心弃去上清液后，加入50毫升磷酸缓冲盐溶液(PBS溶液)(pH＝6.8)，并转移到灭菌过的烧杯中，利用细胞破碎仪冰浴超声破碎。

2.5.将破碎后样品转移至离心管中，离心后取上清保留，弃去沉淀，得到改良型生物膜结构；

2.6.将上步保留样品加入P45AT型号转子配套离心管中，利用PBS溶液(pH＝6.8)排空离心管内气泡，之后在35000rpm(离心力144000G)，4℃条件下离心45min，留取沉淀中质地较软的红棕色固体，弃去黑色固体，利用50％甘油重悬红棕色液体放入-20℃冰箱保存；

2.7.取用红棕色液体5ml，利用PBS溶液(pH＝6.8)稀释5倍，利用细胞破碎仪冰浴超声2h(超声5s，停5s，功率390W)，在超声开始后利用注射器缓慢滴加加入浓度为30mg/ml的羟基喜树碱-丙酮溶液1.5ml。超声后将液体转移至离心管中，在6750rpm(离心力5000G)，4℃条件下离心30min，取上清用作后续检测，弃去沉淀，得到载药生物膜。

实施例4：伊立替康载药生物膜的制作方法

1.材料和设备：

1.1.酵母菌：(国药集团化学试剂有限公司)

1.2.液体培养基：(自制)

1.3.果糖：(国药集团化学试剂有限公司)

1.4.磷酸缓冲盐溶液(PBS缓冲盐溶液)：(自制)

1.5伊立替康-甲醇溶液：(自制)

1.6.摇床

1.7.离心机

1.8.细胞破碎仪

2.制作方法：

2.1.菌种复苏：将-80℃酵母菌菌种接种到100ml的酵母浸膏-胰蛋白胨培养基中，置于温度37℃，转速100rpm的摇床中避光培养12小时，作为菌种基液

2.2.将酵母菌菌种基液按照1：5的比例接入酵母浸膏-胰蛋白胨培养基中，摇床中避光培养，培养温度为95℃；

2.3.在上一步的菌液中，加入0.5％的果糖水溶液，放入离心瓶中，离心，弃去上清液，保留少量液体重悬沉淀。

2.4.将菌液移至离心管中，离心弃去上清液后，加入50毫升磷酸缓冲盐溶液(PBS溶液)(pH＝6.8)，并转移到灭菌过的烧杯中，利用细胞破碎仪冰浴超声破碎。

2.5.将破碎后样品转移至离心管中，离心后取上清保留，弃去沉淀，得到改良型生物膜结构；

2.6.将上步保留样品加入P45AT型号转子配套离心管中，利用PBS溶液(pH＝6.8)排空离心管内气泡，之后在35000rpm(离心力144000G)，4℃条件下离心45min，留取沉淀中质地较软的红棕色固体，弃去黑色固体，利用50％甘油重悬红棕色液体放入-20℃冰箱保存；

2.7.取用红棕色液体5ml，利用PBS溶液(pH＝6.8)稀释5倍，利用细胞破碎仪冰浴超声2h(超声5s，停5s，功率390W)，在超声开始后利用注射器缓慢滴加加入浓度为30mg/ml的伊立替康-甲醇溶液1.5ml。超声后将液体转移至离心管中，在6750rpm(离心力5000G)，4℃条件下离心30min，取上清用作后续检测，弃去沉淀，得到载药生物膜。

实施例5：表阿霉素载药生物膜的制作方法

1.材料和设备：

1.1.嗜热栖热菌：DSM579(国药集团化学试剂有限公司)

1.2.液体培养基：(自制)

1.3.甘露醇：(国药集团化学试剂有限公司)

1.4.磷酸缓冲盐溶液(PBS缓冲盐溶液)：(自制)

1.5表阿霉素-丙酮溶液：(自制)

1.6.摇床

1.7.离心机

1.8.细胞破碎仪

2.制作方法：

2.1.菌种复苏：将-80℃嗜热栖热菌菌种接种到100ml的酵母浸膏-胰蛋白胨培养基中，置于温度37℃，转速100rpm的摇床中避光培养42小时，作为菌种基液

2.2.将嗜热栖热菌菌种基液按照1：1的比例接入酵母浸膏-胰蛋白胨培养基中，摇床中避光培养，培养温度为20℃；

2.3.在上一步的菌液中，加入6％的甘露醇水溶液，放入离心瓶中，离心，弃去上清液，保留少量液体重悬沉淀。

2.4.将菌液移至离心管中，离心弃去上清液后，加入50毫升磷酸缓冲盐溶液(PBS溶液)(pH＝5.8)，并转移到灭菌过的烧杯中，利用细胞破碎仪冰浴超声破碎。

2.5.将破碎后样品转移至离心管中，离心后取上清保留，弃去沉淀，得到改良型生物膜结构；

2.6.将上步保留样品加入P45AT型号转子配套离心管中，利用PBS溶液(pH＝5.8)排空离心管内气泡，之后在35000rpm(离心力144000G)，4℃条件下离心45min，留取沉淀中质地较软的红棕色固体，弃去黑色固体，利用50％甘油重悬红棕色液体放入-20℃冰箱保存；

2.7.取用红棕色液体5ml，利用PBS溶液(pH＝5.8)稀释5倍，利用细胞破碎仪冰浴超声2h(超声5s，停5s，功率390W)，在超声开始后利用注射器缓慢滴加加入浓度为30mg/ml的表阿霉素-丙酮溶液1.5ml。超声后将液体转移至离心管中，在6750rpm(离心力5000G)，4℃条件下离心30min，取上清用作后续检测，弃去沉淀，得到载药生物膜。

实施例6：5-氟尿嘧啶载药生物膜的制作方法

1.材料和设备：

1.1.长双歧杆菌：(国药集团化学试剂有限公司)

1.2.液体培养基：(自制)

1.3.木糖醇：(国药集团化学试剂有限公司)

1.4.磷酸缓冲盐溶液(PBS缓冲盐溶液)：(自制)

1.5 5-氟尿嘧啶-丙酮溶液：(自制)

1.6.摇床

1.7.离心机

1.8.细胞破碎仪

2.制作方法：

2.1.菌种复苏：将-80℃长双歧杆菌菌种接种到100ml的酵母浸膏-胰蛋白胨培养基中，置于温度37℃，转速100rpm的摇床中避光培养24小时，作为菌种基液

2.2.将长双歧杆菌菌种基液按照1：10的比例接入酵母浸膏-胰蛋白胨培养基中，摇床中避光培养，培养温度为40℃；

2.3.在上一步的菌液中，加入6％的木糖醇水溶液，放入离心瓶中，离心，弃去上清液，保留少量液体重悬沉淀。

2.4.将菌液移至离心管中，离心弃去上清液后，加入50毫升磷酸缓冲盐溶液(PBS溶液)(pH＝7.8)，并转移到灭菌过的烧杯中，利用细胞破碎仪冰浴超声破碎。

2.5.将破碎后样品转移至离心管中，离心后取上清保留，弃去沉淀，得到改良型生物膜结构；

2.6.将上步保留样品加入P45AT型号转子配套离心管中，利用PBS溶液(pH＝7.8)排空离心管内气泡，之后在35000rpm(离心力144000G)，4℃条件下离心45min，留取沉淀中质地较软的红棕色固体，弃去黑色固体，利用50％甘油重悬红棕色液体放入-20℃冰箱保存；

2.7.取用红棕色液体5ml，利用PBS溶液(pH＝7.8)稀释5倍，利用细胞破碎仪冰浴超声2h(超声5s，停5s，功率390W)，在超声开始后利用注射器缓慢滴加加入浓度为30mg/ml的5-氟尿嘧啶-丙酮溶液1.5ml。超声后将液体转移至离心管中，在6750rpm(离心力5000G)，4℃条件下离心30min，取上清用作后续检测，弃去沉淀，得到载药生物膜。

实施例7：表阿霉素载药生物膜的制作方法

1.材料和设备：

1.1.嗜酸乳杆菌：(国药集团化学试剂有限公司)

1.2.液体培养基：(自制)

1.3.甘露醇：(国药集团化学试剂有限公司)

1.4.磷酸缓冲盐溶液(PBS缓冲盐溶液)：(自制)

1.5表阿霉素-乙醇溶液：(自制)

1.6.摇床

1.7.离心机

1.8.细胞破碎仪

2.制作方法：

2.1.菌种复苏：将-80℃嗜酸乳杆菌菌种接种到100ml的酵母浸膏-胰蛋白胨培养基中，置于温度37℃，转速100rpm的摇床中避光培养42小时，作为菌种基液

2.2.将嗜酸乳杆菌菌种基液按照1：1的比例接入酵母浸膏-胰蛋白胨培养基中，摇床中避光培养，培养温度为60℃；

2.3.在上一步的菌液中，加入6％的甘露醇水溶液，放入离心瓶中，离心，弃去上清液，保留少量液体重悬沉淀。

2.4.将菌液移至离心管中，离心弃去上清液后，加入50毫升磷酸缓冲盐溶液(PBS溶液)(pH＝5.8)，并转移到灭菌过的烧杯中，利用细胞破碎仪冰浴超声破碎。

2.5.将破碎后样品转移至离心管中，离心后取上清保留，弃去沉淀，得到改良型生物膜结构；

2.6.将上步保留样品加入P45AT型号转子配套离心管中，利用PBS溶液(pH＝5.8)排空离心管内气泡，之后在35000rpm(离心力144000G)，4℃条件下离心45min，留取沉淀中质地较软的红棕色固体，弃去黑色固体，利用50％甘油重悬红棕色液体放入-20℃冰箱保存；

2.7.取用红棕色液体5ml，利用PBS溶液(pH＝5.8)稀释5倍，利用细胞破碎仪冰浴超声2h(超声5s，停5s，功率390W)，在超声开始后利用注射器缓慢滴加加入浓度为30mg/ml的表阿霉素-乙醇溶液1.5ml。超声后将液体转移至离心管中，在6750rpm(离心力5000G)，4℃条件下离心30min，取上清用作后续检测，弃去沉淀，得到载药生物膜。