一种鞘磷脂转运的新检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，是一种鞘磷脂转运的新检测方法，此方法以鞘磷脂翻转酶ATP13A2为主要原料合成人工脂质膜为基础。

背景技术

帕金森(Parkinson’s disease，PD)是当今发生最为广泛的一类神经退行性疾病。随着年龄增长，PD患病率逐年升高，55岁以上的人群中患病率超过1％，65岁以上高达2％。大多数病人表现为活动失调及静止时不自主的颤抖，还有许多病人表现出烦躁、抑郁或精神失常，产生巨大的经济和社会负担。

2006年，Ramirez等人报道ATP13A2基因是常染色体隐性遗传性青壮年帕金森综合征的致病基因。在青年帕金森、痴呆综合征患者中发现了多种ATP13A2基因突变。最近，基因与疾病关联性研究表明，ATP13A2基因突变与遗传性痉挛性截瘫(spastic paraplegia,SPG)有关，与神经元蜡样脂褐素病(neuronal ceroidlipofuscinoses,NCL)有关，还与肌萎缩侧索硬化症或渐冻症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)有关。但是，ATP13A2基因突变与以上这些运动性疾病的因果关系、以及如何靶向干预在防治策略方面尚不清楚。研究报道ATP13A2蛋白与细胞内脂类的稳态调节密切相关，ATP13A2蛋白N端具有磷脂酸(PA)和磷脂酰肌醇(3,5)二磷酸[PI(3,5)P2]的结合域，但是并未提出ATP13A2蛋白具有调节鞘磷脂转运和再循环的重要新功能。

鞘磷脂是神经髓鞘及细胞膜结构的主要成分，是合成鞘糖脂如脑苷脂(cerebroside)和神经节苷脂(ganglioside)、及产生其它鞘脂(如神经酰胺、鞘氨醇)的主要磷脂。目前，已知鞘磷脂由内质网合成并经高尔基体运输到细胞膜，再经溶酶体降解。但是，溶酶体内的鞘磷脂的转运、囤积紊乱和再循环利用机制还不清楚，鞘磷脂转运的检测方法还未见报道。本发明发现ATP13A2蛋白具有转运鞘磷脂的作用，是一种新型的鞘磷脂翻转酶，在此基础上建立了一种检测鞘磷脂翻转的新方法。

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有技术中存在的问题，建立一种新的检测鞘磷脂翻转的方法，鞘磷脂翻转酶ATP12A2的基因序列和蛋白质序列如数据库Uniprot所示。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种人工脂质膜，以鞘磷脂翻转酶ATP13A2、鞘磷脂翻转酶ATP13A2突变体、NBD荧光标记的鞘磷脂NBD SM，二油酰磷脂酰胆碱DOPC为原料，体外制备人工脂质膜。

所述人工脂质膜的具体制备如下：

S1：将4μmol二油酰磷脂酰胆碱DOPC和40nmol NBD标记的鞘磷脂SM溶解于1ml氯仿中并旋转蒸发干燥制备成多泡脂质体，经200nm聚碳酸酯过滤器处理形成大的单层囊泡，然后利用3mM正十二烷基β-麦芽糖苷DDM对单层囊泡去稳定，得到去稳定后的单层脂质体；

S2：将纯化的鞘磷脂翻转酶ATP13A2加入去稳定后的单层脂质体中得到重组混合物，常温混合15min，搅拌，每1ml重组混合物中加入0.3g湿洗过的生物珠，4℃旋转孵育16h，静置2min。

作为优选，所述重组混合物中ATP13A2蛋白质的体积为总混合物体积的10％。

作为优选，所述的NBD荧光标记的鞘磷脂为酰基链长度不同的两种鞘磷脂NBD C6-SM和NBD C12-SM。

作为优选，所述的常温为23-30℃。

第二方面，本发明提供一种鞘磷脂转运的检测方法，具体是：

使用鞘磷脂翻转酶ATP13A2、鞘磷脂翻转酶ATP13A2突变体、NBD荧光标记的鞘磷脂(NBD SM)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)为原料，体外制备人工脂质膜。检测不同鞘磷脂翻转酶ATP13A2剂量、底物鞘磷脂浓度和反应温度对鞘磷脂翻转效率的影响，检测ATP13A2对不同脂质底物的翻转特异性，筛选鞘磷脂翻转相关的ATP13A2特异性氨基酸位点。

作为优选，通过突变ATP13A2蛋白的氨基酸位点L247A，Y271A，V429A，A467E，L477A，D508N，H554A，S633A，Y935A，Y947A和T341A中的一个或多个调控鞘磷脂翻转活性。

作为优选，通过突变ATP13A2蛋白的氨基酸位点G499R，K509E，G528R，G872R和L1054R中的一个或多个调控鞘磷脂的翻转活性效率。

作为优选，ATP13A2蛋白浓度与鞘磷脂翻转效率呈正相关。

本发明的有益效果是：

本发明发现ATP13A2蛋白具有转运鞘磷脂的作用，是一种新型的鞘磷脂翻转酶，在此基础上建立了一种检测鞘磷脂翻转的新方法。鞘磷脂翻转酶ATP13A2具有特异性转运鞘磷脂的活性，对其他磷脂类(磷脂酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸)和神经酰胺没有转运活性。本发明从不同角度试验验证了此检测方法的可靠性，为今后的鞘磷脂的翻转检测及神经退行性疾病研究提供技术参考。

附图说明

图1为检测鞘磷脂翻转方法的原理图；

图2为鞘磷脂翻转酶ATP13A2对鞘磷脂翻转效率的时间曲线图；

图3为不同温度和酰基链长度的鞘磷脂对鞘磷脂翻转效率的影响图；

图4为不同浓度鞘磷脂翻转酶ATP13A2对鞘磷脂翻转效率的影响图；

图5为不同浓度鞘磷脂底物对鞘磷脂翻转效率的影响图；

图6为检测ATP13A2对不同脂类底物(磷脂酸、磷脂酰胆碱PC、磷脂酰乙醇胺PE、磷脂酰丝氨酸PS、神经酰胺Cer和鞘磷脂)的翻转特异性图；

图7为通过鞘磷脂翻转活性检测，在鞘磷脂翻转酶ATP13A2上筛选得到11个对鞘磷脂翻转有重要作用的氨基酸位点；

图8为ATP13A2上与临床Kufor-rakeb综合症相关的突变体对鞘磷脂翻转效率的影响图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述，实施例仅用于说明本发明，而不应试为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生成厂商者，均为可以通过市购常规产品。

实施例1：

实验对象：体外人工制备的脂质体。

实验方法：将4μmol DOPC和40nmol NBD标记的鞘磷脂SM溶解于1ml氯仿中并旋转蒸发干燥制备成多泡脂质体，经200nm聚碳酸酯过滤器处理形成大的单层囊泡。

将纯化的鞘磷脂翻转酶ATP13A2加入3mM正十二烷基β-麦芽糖苷(DDM)去稳定后的单层脂质体中得到重组混合物，其中添加ATP13A2蛋白质的体积为总混合物体积的10％。室温混合15min，温和搅拌，每1ml重组混合物中加入0.3g湿洗过的生物珠，4℃旋转孵育16h，静置约2min，移液收集蛋白脂质体溶液。

将100μl蛋白脂质体与1.9ml分析缓冲液，分析缓冲液中含有5mM MgCl

计算翻转鞘磷脂的百分比为(F1-F2)/(F1-F0)×100，ATP依赖性NBD荧光标记鞘磷脂翻转百分比的计算公式为P(ATP/Mg

结果显示：如图1，连二亚硫酸盐荧光猝灭法检测鞘磷脂翻转方法的原理图。如图2，在人工制备的脂质体中，鞘磷脂翻转酶ATP13A2具有高效的鞘磷脂翻转活性，转运过程需要ATP和Mg

实施例2：

实验对象：人宫颈癌细胞Hela，体外人工制备的脂质体。

实验方法：Hela细胞(1x10

Hela细胞(1x10

在鞘磷脂翻转活性检测实验中，将4μmol DOPC和40nmol NBD标记的鞘磷脂SM溶解于1ml氯仿中并旋转蒸发干燥制备成多泡脂质体，经200nm聚碳酸酯过滤器处理形成大的单层囊泡。将纯化的鞘磷脂翻转酶ATP13A2加入3mM正十二烷基β-麦芽糖苷(DDM)去稳定后的单层脂质体中，添加ATP13A2(野生型和突变体)蛋白质的体积为总混合物体积的10％。室温混合15min，温和搅拌，每1ml重组混合物中加入0.3g湿洗过的生物珠，4℃旋转孵育16h，静置约2min，移液收集蛋白脂质体溶液。将100μl蛋白脂质体与1.9ml分析缓冲液，分析缓冲液中含有5mM MgCl

结果显示：如图7，通过单个氨基端突变，筛选到11个(L247A，Y271A，V429A，A467E，L477A，D508N，H554A，S633A，Y935A，Y947A和T341A)与鞘磷脂翻转密切相关的氨基酸位点，其中477位亮氨酸突变和磷酸化相关的活性位点508位天冬氨酸突变后鞘磷脂翻转酶ATP13A2转运鞘磷脂活性丧失。如图8，ATP13A2特定氨基酸突变与临床Kufor-rakeb综合症密切相关，检测发现5个KRS(G499R，K509E，G528R，G872R和L1054R)相关突变会显著降低鞘磷脂的翻转活性。